CN113973810A - 一种牙周膜干细胞保存液及保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液90‑100份、梣桐1.5‑3.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯1‑5份、番茄苷2‑5份、大豆分离蛋白0.5‑1份、乳酸钠0.4‑0.8份、磷酸氢二钾5‑10份。本发明提供的牙周膜干细胞保存液中梣桐的渗透性较好，添加羟丙基二淀粉磷酸酯和梣桐协同作用，有效维持细胞膜的形态，避免因保存影响牙周膜干细胞的代谢功能。番茄苷有助于牙周膜干细胞在保存液中保持较低活性，避免细胞凋亡。大豆分离蛋白提高保存液的稳定性，降低细胞结团率，上述成分协同作用，无需超低温，提高保存效率。本发明还提供了一种牙周膜干细胞的保存方法，可在4‑6℃下将牙周膜干细胞保存12‑24h，保存过程易于操作，为科研及临床应用提供便利。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞保存液及保存方法。
背景技术
近年来，细胞治疗逐渐代替传统药物治疗，在各大疾病领域上发挥重要的作用。细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。
牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下，牙周组织具有自身的更新和修复能力，其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界刺激时，通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年Seo等从拔除的第三磨牙牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(Periodontal Ligament Sem Cells，PDLSCs)。研究表明，PDLSCs具有多向分化能力，可体外分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，在维持牙周组织的稳态，维护牙槽骨的新陈代谢过程中发挥了重要作用。因此，PDLSCs有望成为牙周组织再生的首选种子细胞。
临床上制备的PDLSCs经常需要在保存液中保存待用。常规的细胞保存液含有DMSO，即二甲基亚砜，用含DMSO 的保存液保存细胞时，要求超低温保存，对保存条件要求较高。对一些仅需要短期保存的细胞来说操作繁琐，并且细胞复苏过程漫长，不能满足临床应用的需求。因此，有必要研发一种PDLSCs，提高细胞的保存效率，无需超低温即能在一定时间内保证细胞活性，便于PDLSCs的科研及临床应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙周膜干细胞保存液，不含动物血清，成分安全，保存期间能充分保证牙周膜干细胞的活性。
本发明的目的之二在于提供一种牙周膜干细胞的保存方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液90-100份、梣桐1.5-3.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯1-5份、番茄苷2-5份、大豆分离蛋白0.5-1份、乳酸钠0.4-0.8份、磷酸氢二钾5-10份。
进一步地，所述牙周膜干细胞保存液由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液95份、梣桐2份、羟丙基二淀粉磷酸酯2份、番茄苷3份、大豆分离蛋白0.8份、乳酸钠0.5份、磷酸氢二钾8份。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种牙周膜干细胞的保存方法，采用上述的保存液。
进一步地，牙周膜干细胞在保存液中的含量为2-5×107个/mL。
进一步地，保存温度为4-6℃，保存时间为12-24h。
进一步地，保存温度为4℃，保存时间为12h。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供一种牙周膜干细胞保存液，在氯化钠溶液中添加梣桐、羟丙基二淀粉磷酸酯、番茄苷和大豆分离蛋白，梣桐的渗透性较好，添加羟丙基二淀粉磷酸酯和梣桐协同作用，有效维持细胞膜的形态，避免因保存影响牙周膜干细胞的代谢功能。番茄苷有助于牙周膜干细胞在保存液中保持较低活性，避免细胞凋亡，使细胞在转移出保存液中能迅速恢复活力，保证临床和科研的应用效果。大豆分离蛋白提高保存液的稳定性，降低牙周膜干的细胞结团率，上述成分协同作用，无需超低温，实现了牙周膜干细胞在4-6℃下保存，提高保存效率。
2、本发明还提供了一种牙周膜干细胞的保存方法，采用本发明提供的保存液，在4-6℃下可将牙周膜干细胞保存12-24h，保存过程易于操作，为科研及临床应用提供便利。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液95份、梣桐2份、羟丙基二淀粉磷酸酯2份、番茄苷3份、大豆分离蛋白0.8份、乳酸钠0.5份、磷酸氢二钾8份。
一种牙周膜干细胞的保存方法，包括以下步骤：将P4代牙周膜干细胞重悬于上述保存液中，保存液的体积为2mL，牙周膜干细胞的数量为3×107个/mL，将含有细胞的保存液置于灭菌的西林瓶中，在4℃的冰箱中保存12h。
实施例2
一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液90份、梣桐1.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯1份、番茄苷2份、大豆分离蛋白0.5份、乳酸钠0.4份、磷酸氢二钾5份。
一种牙周膜干细胞的保存方法，包括以下步骤：将P4代牙周膜干细胞重悬于上述保存液中，保存液的体积为2mL，牙周膜干细胞的数量为2×107个/mL，将含有细胞的保存液置于灭菌的西林瓶中，在4℃的冰箱中保存24h。
实施例3
一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶100份、梣桐3.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯5份、番茄苷5份、大豆分离蛋白1份、乳酸钠0.8份、磷酸氢二钾10份。
一种牙周膜干细胞的保存方法，包括以下步骤：将P4代牙周膜干细胞重悬于上述保存液中，保存液的体积为2mL，牙周膜干细胞的数量为5×107个/mL，将含有细胞的保存液置于灭菌的西林瓶中，在6℃的冰箱中保存12h。
实施例4
一种牙周膜干细胞保存液，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶98份、梣桐2.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯4份、番茄苷3份、大豆分离蛋白0.7份、乳酸钠0.6份、磷酸氢二钾7份。
一种牙周膜干细胞的保存方法，包括以下步骤：将P4代牙周膜干细胞重悬于上述保存液中，保存液的体积为2mL，牙周膜干细胞的数量为5×107个/mL，将含有细胞的保存液置于灭菌的西林瓶中，在6℃的冰箱中保存24h。
对比例1
对比例1提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去梣桐，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去羟丙基二淀粉磷酸酯，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去羟丙基二淀粉磷酸酯，将梣桐的用量调整为4份，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：将羟丙基二淀粉磷酸酯替换为羟乙基淀粉，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去番茄苷，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种牙周膜干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去大豆分离蛋白，其余均和实施例1相同。
将实施例1至4，对比例1至6中保存后的细胞取样，采用0.4%台盼兰染色法，用Countstar全自动细胞计数仪进行计数，计算细胞的存活率，结果如表1所示。
表1
| 样品 | 保存条件 | 存活率 |
| 实施例1 | 4℃，12h | 98.42% |
| 实施例2 | 4℃，24h | 94.79% |
| 实施例3 | 6℃，12h | 96.12% |
| 实施例4 | 6℃，24h | 90.27% |
| 对比例1 | 4℃，12h | 82.45% |
| 对比例2 | 4℃，12h | 84.70% |
| 对比例3 | 4℃，12h | 81.15% |
| 对比例4 | 4℃，12h | 85.89% |
| 对比例5 | 4℃，12h | 83.87% |
| 对比例6 | 4℃，12h | 84.43% |
由表1可以看出，实施例1至4中，经保存后的牙周膜干细胞细胞存活率在90%以上，可以满足使用需求。对比例1至6中改变了保存液的成分，在和实施例1相同的条件下保存细胞，可以看出细胞的存活率和实施例1相比有不同程度的下降。
对比例1和对比例2中分别省去了梣桐和羟丙基二淀粉磷酸酯，牙周膜干细胞的存活率分别只有82.45%和84.70%。对比例3中省去羟丙基二淀粉磷酸酯，并且增加了梣桐的用量，牙周膜干细胞的存活率低于对比例1，说明增加梣桐的用量不利于牙周膜干细胞的保存，只有选择合适用量的梣桐和羟丙基二淀粉磷酸酯协同作用才能发挥较好的保存效果。对比例4中将羟丙基二淀粉磷酸酯替换为羟乙基淀粉，和对比例1至3相比，细胞存活率有轻微提高，但和实施例1相比下降显著，说明改变和梣桐复配使用的成分后，原料之间的协同作用变差，进而影响细胞的保存效果。由对比例1至4可知本发明在保存液中添加梣桐和羟丙基二淀粉磷酸酯协同作用，有效维持细胞膜的形态，避免因保存影响牙周膜干细胞的代谢功能，提高细胞的存活率。
对比例5和对比例6中分别省去了番茄苷和大豆分离蛋白，牙周膜干细胞的存活率也有不同程度的下降，说明本发明添加的番茄苷有助于牙周膜干细胞在保存液中保持较低活性，避免细胞凋亡。大豆分离蛋白提高保存液的稳定性，降低牙周膜干的细胞结团率，上述成分协同作用，无需超低温，实现了牙周膜干细胞在4-6℃下保存，提高保存效率。
将实施例1至4，对比例1至6中保存后的细胞取样，添加0.4%台盼兰混匀，取20微升混匀液用Countstar全自动细胞计数仪进行细胞结团率检测，结果如表2所示。
表2
| 样品 | 保存条件 | 结团率 |
| 实施例1 | 4℃，12h | 0.00% |
| 实施例2 | 4℃，24h | 0.03% |
| 实施例3 | 6℃，12h | 0.04% |
| 实施例4 | 6℃，24h | 0.06% |
| 对比例1 | 4℃，12h | 0.12% |
| 对比例2 | 4℃，12h | 0.09% |
| 对比例3 | 4℃，12h | 0.15% |
| 对比例4 | 4℃，12h | 0.08% |
| 对比例5 | 4℃，12h | 0.13% |
| 对比例6 | 4℃，12h | 0.21% |
由表2可以看出，实施例1至4中牙周膜干细胞的结团率较低或者无细胞结团出现，出现结团的细胞均可在外力晃动下自动散开，重新形成细胞悬液。对比例1至6中细胞结团率均有不同程度的增加，尤其是对比例6中结团率较高，这是因为大豆分离蛋白有助于提高保存液的稳定性，降低牙周膜干的细胞结团率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种牙周膜干细胞保存液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液90-100份、梣桐1.5-3.5份、羟丙基二淀粉磷酸酯1-5份、番茄苷2-5份、大豆分离蛋白0.5-1份、乳酸钠0.4-0.8份、磷酸氢二钾5-10份。
2.根据权利要求1所述牙周膜干细胞保存液，其特征在于，由以下重量份的原料组成：质量浓度0.9%的氯化钠溶液85份、梣桐2份、羟丙基二淀粉磷酸酯2份、番茄苷3份、大豆分离蛋白0.8份、乳酸钠0.5份、磷酸氢二钾8份。
3.一种牙周膜干细胞的保存方法，其特征在于，采用权利要求1至2任一项所述的保存液。
4.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的保存方法，其特征在于，牙周膜干细胞在保存液中的含量为2-5×107个/mL。
5.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的保存方法，其特征在于，保存温度为4-6℃，保存时间为12-24h。
6.根据权利要求3所述牙周膜干细胞的保存方法，其特征在于，保存温度为4℃，保存时间为12h。
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