CN113068686A - 生物样品冷冻保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞保存液领域，具体而言，涉及一种生物样品冷冻保护剂。该生物样品冷冻保护剂包括如下活性成分：抗氧化物质：谷胱甘肽1.3g/L～1.7g/L、L‑肌肽0.45g/L～0.65g/L、亚精胺0.12g/L～0.18g/L以及根皮素0.03g/L～0.07g/L；氧化三甲胺55g/L～65g/L，以及聚维酮K30 18g/L～22g/L。上述成分彼此配合，能够有效减少细胞在冻存过程中的氧化应激反应，提高细胞回收率。

Description

生物样品冷冻保护剂

技术领域

本发明涉及细胞保存液领域，具体而言，涉及一种生物样品冷冻保护剂。

背景技术

现有细胞冻存液多以基础培养基、血清及DMSO作为保护剂，这些物质可以最大限度的保持冻存细胞在复苏后的活力。在细胞冻存过程中，DMSO可以穿透细胞膜，降低冰点，同时增加细胞膜对水的通透性，在冷冻过程中使细胞内水分渗到细胞外，减少细胞在冻存过程中细胞内部冰晶形成，从而减少冷冻过程中的细胞器损伤，提高细胞复苏后存活率。

由于DMSO含有细胞毒性，以DMSO为冻存保护剂的冻存液保存的细胞在复苏后，会出现生长抑制，影响细胞生长。在细胞治疗中，以DMSO为冻存保护剂的冻存液保存的细胞注入人体后会引起恶心、呕吐及过敏等不良反应。

在冷冻过程中，在提供必要的防护效果的前提下，避免对细胞有毒害的冷冻保护剂成分的使用或降低其浓度，并减小冷冻过程中的应力和损伤是本领域亟待解决的技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种生物样品冷冻保护剂，包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.3g/L～1.7g/L、L-肌肽0.45g/L～0.65g/L、亚精胺0.12g/L～0.18g/L以及根皮素0.03g/L～0.07g/L；

·氧化三甲胺55g/L～65g/L，以及

·聚维酮K30 18g/L～22g/L。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.4g/L～1.6g/L、L-肌肽0.50g/L～0.60g/L、亚精胺0.13g/L～0.17g/L以及根皮素0.04g/L～0.06g/L；

·氧化三甲胺58g/L～62g/L，以及

·聚维酮K30 19g/L～21g/L。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，所述生物样品冷冻保护剂还包括细胞生长培养基。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，所述细胞生长培养基为RPMI-1640培养基。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，所述RPMI-1640培养基的浓度为9g/L～11g/L。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，还包括至少一种额外的冷冻保护剂。

可选的，如上所述的生物样品冷冻保护剂，还包括能够在0℃～-196℃下维持pH＝7.0～7.4的缓冲试剂。

本发明的第二目的在于提供一种冷冻保存组合物，包含生物样品和如上所述的生物样品冷冻保护剂。

本发明的第三目的在于提供一种冷冻保存生物样品的方法，包括如下步骤：

将被冷冻保存的生物样品与如上所述的生物样品冷冻保护剂接触，从而获得冷冻保存组合物，降低所述冷冻保存组合物的温度至冷冻保存温度。

可选的，如上所述的方法，所述生物样品包括器官、组织或细胞，或它们的组合物。

本发明的有益效果为：

本方案中，用聚维酮K30作为细胞外冷冻保护剂，在冻存过程中减少溶液中自由水的含量，使冰点降低，减轻细胞损伤。用氧化三甲胺代替DMSO作为细胞内冷冻保护剂，减少DMSO对细胞的毒性及临床使用中的不良反应。且加入了谷胱甘肽、L-肌肽、亚精胺和根皮素等抗氧化物质，具有很好的抗氧化效果。上述成分彼此配合，能够有效减少细胞在冻存过程中的氧化应激反应，提高细胞回收率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中经过冻存复苏后的细胞形态结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明的涉及一种生物样品冷冻保护剂，其包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.3g/L～1.7g/L、L-肌肽0.45g/L～0.65g/L、亚精胺0.12g/L～0.18g/L以及根皮素0.03g/L～0.07g/L；

·氧化三甲胺55g/L～65g/L，以及

·聚维酮K30 18g/L～22g/L。

本方案中，用聚维酮K30作为细胞外冷冻保护剂，在冻存过程中减少溶液中自由水的含量，使冰点降低，减轻细胞损伤。用氧化三甲胺代替DMSO作为细胞内冷冻保护剂，减少DMSO对细胞的毒性及临床使用中的不良反应。且加入了谷胱甘肽、L-肌肽、亚精胺和根皮素等抗氧化物质，具有很好的抗氧化效果。上述成分彼此配合，能够有效减少细胞在冻存过程中的氧化应激反应，提高细胞回收率。

在一些实施方式中，所述的生物样品冷冻保护剂包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.4g/L～1.6g/L、L-肌肽0.50g/L～0.60g/L、亚精胺0.13g/L～0.17g/L以及根皮素0.04g/L～0.06g/L；

·氧化三甲胺58g/L～62g/L，以及

·聚维酮K30 19g/L～21g/L。

在一些实施方式中，所述的生物样品冷冻保护剂包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.45g/L～1.55g/L、L-肌肽0.53g/L～0.57g/L、亚精胺0.14g/L～0.16g/L以及根皮素0.045g/L～0.055g/L；

·氧化三甲胺59g/L～61g/L，以及

·聚维酮K30 19.5g/L～20.5g/L。

在一些实施方式中，所述的生物样品冷冻保护剂包括如下活性成分：

·基础培养基；

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.5g/L、L-肌肽0.55g/L、亚精胺0.15g/L以及根皮素0.05g/L；

·氧化三甲胺60g/L，以及

·聚维酮K30 20g/L。

所述生物样品冷冻保护剂可以是固体(例如冻干粉或喷雾干燥粉)或溶液；

当其为溶液时，所述生物样品冷冻保护剂可以进一步包括溶剂例如无菌水。在一方面，溶液包括从10w/w％到90w/w％的所述生物样品冷冻保护剂，如从40w/w％至65w/w％或从50w/w％到60w/w％的所述生物样品冷冻保护剂。

当其为溶液时，通常以工作浓度或母液的形式被包装。在本发明中，“工作浓度”用于限定所述生物样品冷冻保护剂在处理生物样品时主要活性组分的比例，所述生物样品冷冻保护剂中主要活性组分的浓度可以为工作浓度，也可以为能够稀释为该浓度的母液(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍浓缩的母液)。

所述生物样品冷冻保护剂是有效的生物样品例如器官、组织或细胞的冷冻保护试剂，并且经过冷冻保存的所述生物样品仍然是有功能的。一般来说，“冷冻保护剂”是指与没有冷冻保护剂的冷冻效果相比，当组织冷却至零下温度时能够使细胞/组织/器官中的冰晶形成最小化并且在加热后基本上不对细胞/组织/器官造成损伤的物质。但需要注意的是，基于上述原理，生物样品“冷冻保护剂”并不能够局限地被认为是冻存液，还应当包括冻存过程中所采用的平衡液，或者解冻液。

本文所使用的术语与样品相关的“冷冻保存后是有功能的”通常意味着，样品例如器官、细胞或组织在冷冻保存后保留在冷冻保存后可接受的和/或所需的功能。在一方面，样品在冷冻保存后保存其所有功能。在另一方面，样品，例如细胞，至少保留50％的所需的功能，例如至少60％的所需的功能，例如至少70％的所需的功能，例如至少80％的所需的功能，例如至少90％的所需的功能，例如至少95％的所需的功能，例如100％所需的功能，作为关于细胞的例子，将被保存的重要功能是细胞的生存力。作为关于器官的另一个实例，将被保存的重要功能是所述器官的生理功能，如心脏泵血功能。作为关于组织的另一个实例，在移植的情况下，将被保存的重要功能是保持这样的组织与周围组织(如皮肤)整合的能力。作为关于细胞的另一个实例，如干细胞，则包括其分化为其他细胞的能力等。

在一些实施方式中，所述的生物样品冷冻保护剂，还包括至少一种额外的冷冻保护剂。

在一些实施方式中，所述额外的冷冻保护剂选自乙酰胺、琼脂、海藻酸盐或酯、异麦芽糖寡糖、1-苯胺、白蛋白、氨基酸、醋酸铵、丁二醇、硫酸软骨素、氯仿、胆碱、二甘醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、赤藓糖醇、乙醇、乙二醇、甲酰胺、葡萄糖、甘油、α-甘油磷酸盐或酯、单乙酸甘油、透明质酸、甘氨酸、羟乙基淀粉、肌醇、乳糖、氯化镁、硫酸镁、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、甲醇、甲基乙酰胺、甲基甲酰胺、甲基脲、水凝胶、糊精、葡聚糖、苯酚、普流尼克多元醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、脯氨酸、丙二醇、丝氨酸、溴化钠、氯化钠、碘化钠、吡啶N-氧化物、核糖、硝酸钠、蔗糖、海藻糖、硫酸钠、山梨糖醇、三甘醇、乙酸三甲基胺、脲、缬氨酸和木糖中的至少一种。

在一些实施方式中，所述额外的冷冻保护剂还可以选择上述化合物的衍生物。

在一些实施方式中，所述额外的冷冻保护剂的添加浓度低于100g/L，例如90g/L、80g/L、70g/L、60g/L、50g/L、40g/L、30g/L、20g/L、10g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L。

而特别的，在一些实施方式中，所述生物样品冷冻保护剂基本不含有DMSO，一般理解为DMSO含量少于0.01w/w％。

在一些实施方式中，所述生物样品冷冻保护剂还可以在生物样品冷冻保存后是有功能的前提下包括适当浓度的某些离子，例如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子，这对于本领域技术人员是容易确定的。

所述生物样品冷冻保护剂可以包括其它物质以提高样品的可行性。这样物质的实施例可以由以下构成，IAPs(凋亡抑制剂)，对rho相关蛋白激酶(ROCK)信号通路(signalingpathway)抑制剂，生长因子例如EGF，FGF，PDGF，IGF，EPO，BDNF，TGF，TNF，VEGF。在另在一方面，可以提到的是，所述生物样品冷冻保护剂可以包括人，牛，马，犬来源的任何血清成分。

冷冻保护试剂或组合物还可以含有生长培养基。在一方面，可以使用的是包括以下的生长培养基，连环蛋白/P300拮抗剂和活化蛋白/TGFP配体，例如与活化蛋白和TGFI3结合的ID-8。这类培养基特别适用于多能干细胞，特别是胚胎干细胞的培养，例如在WO 2013/054112中所描述的。

在一些实施方式中，所述细胞生长培养基为动物细胞培养基础培养基，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI 1640、199等。培养基中可以包含常规量的血清。

在一些实施方式中，所述细胞生长培养基为RPMI-1640培养基。

在一些实施方式中，所述细胞生长培养基的浓度为9g/L～11g/L，又例如9.4g/L，9.6g/L，10g/L，10.4g/L，10.8g/L，10.9g/L。

在一些实施方式中，所述生物样品冷冻保护剂还包括能够在低的温度下维持大致中性的pH缓冲试剂。

本文所使用的术语“低的温度”或“冷冻保存温度”通常意指如下的温度：从零下到-196℃，如从0℃至-196℃，如从-50℃至-196℃，如从-80℃至-196℃，例如低于-55℃，例如低于-60℃，例如低于-65℃，例如低于-70℃，例如低于-75℃，例如低于-80℃，例如低于-85℃，例如低于-90℃，例如低于-95℃，例如低于-100℃，例如低于-105℃，例如低于-110℃，例如低于-115℃，例如低于-120℃，例如低于-125℃，例如低于-130℃，例如低于-135℃，例如低于-140℃，例如低于-145℃，例如低于-150℃，例如低于-155℃，例如低于-160℃，例如低于-165℃，例如低于-170℃，例如低于-175℃，例如低于-180℃，例如低于-185℃，例如低于-190℃的温度。

如本文使用的术语“pH缓冲试剂”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。pH缓冲试剂一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH。本发明所采用的缓冲试剂应当维持所冷冻保护的生物样品是有功能的pH，这样的pH通常为“大致中性”的，例如6.8～7.6，或者7.0～7.4，或者7.1～7.3左右。

一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及冷冻保存组合物，其包含生物样品和如上所述的生物样品冷冻保护剂。

所述冷冻保存组合物是在预备冷冻保存的过程中(例如平衡过程)、被冷冻保存的过程中、已经被冷冻保存或在解冻过程过程中。

在所述冷冻保存组合物中存在的生物样品冷冻保护剂的量通常是1至99.9％w/w，如99％w/w、95％w/w、90％w/w、80％w/w、70％w/w、60％w/w、50％w/w、40％w/w、30％w/w、20％w/w、10％w/w、5％w/w、1％w/w。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及冷冻保存生物样品的方法，包括如下步骤：

将被冷冻保存的生物样品与如上所述的生物样品冷冻保护剂接触，从而获得冷冻保存组合物，降低所述冷冻保存组合物的温度至冷冻保存温度。

降低所述冷冻保存组合物的温度至冷冻保存温度的手段为本领域技术人员所公知的，优选为梯度降温。

例如，冷冻保存组合物置于4℃10min→-20℃30min→-80℃16-18小时(或过夜，最长放置时间不要超过一个月)→转移至液氮长期储存。

例如，冷冻保存组合物置于细胞冻存盒(需要提前预冷至4℃)后放于-80℃冰箱16-18小时(或过夜，最长放置时间不要超过一个月)→转移至液氮长期储存。

例如，冷冻保存组合物置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率降至-100℃后，→转移至液氮长期保存。

或者可通过其他本领域公知的方法进行降温。

所述生物样品的种属来源可以选择为动物，也可以为植物或具有细胞结构的微生物。优选包括人类及所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

根据本发明任一项实施方式，所述器官、组织选自：脾、心脏、肝脏、脑和其它神经组织、肾、肺、胰腺、乳房、脐带、皮肤、胎盘、卵巢、输卵管、子宫、前列腺、扁桃体、胸腺、胃、睾丸、气管、软骨、腱、骨、骨骼肌、平滑肌、肠、膀胱、尿道、眼、胆囊、角膜、皮肤、瓣膜、静脉、动脉、脐带、胎盘、来自细胞培养物和肿瘤的器官样结构中的任一种，或它们所组成的组。

在一些实施方式中，所述生物样品包括器官、组织或细胞，或它们的组合物。

根据本发明任一项实施方式，所述细胞选自来自脊椎动物组织或无脊椎动物组织的细胞，优选上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、肝细胞、肝星形细胞、心肌细胞、足细胞、角质形成细胞、黑素细胞、红细胞、神经元细胞(包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞)、白细胞【包括树突细胞、嗜中性白细胞、精子、卵细胞、受精卵、巨噬细胞和淋巴细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞和先天性淋巴样1-3型细胞)】、组织干细胞(包括间充质干细胞和以上提及的细胞的祖细胞)中的任一种，或它们所组成的组。

根据本公开任一项实施方式，所述器官、组织为胚胎。

根据本公开任一项实施方式，所述细胞为诱导性多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞。

根据本公开任一项实施方式，所述细胞选自骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、周边血干细胞、脂肪干细胞、心脏干细胞、胎盘亚全能干细胞和羊膜干细胞中的任一种，或它们所组成的组。

根据本公开任一项实施方式，所述细胞为胚胎细胞，例如胚胎肾细胞。

根据本公开任一项实施方式，所述细胞为生殖细胞。

根据本公开任一项实施方式，所述细胞为精子、卵细胞、受精卵或其任意组合。

根据本发明任一项实施方式，其中所述细胞可以是被分离的单个细胞，也可以为同质或异质的细胞团聚物，或者是含有细胞的体液，例如血液(如脐带血，外周血)，羊水，精液，脑脊液，骨髓抽出物和月经液。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

细胞冻存液的配制(以1L为基本量)

(1)按照下表中的组份配制。

基础组份	1L需要量
		1640培养基干粉	10.4g
谷胱甘肽	1.5g
		L-肌肽	0.55g
亚精胺	0.15g
		根皮素	0.05g
氧化三甲胺	60g
		聚维酮K30	20g

a.称量准确，用500mL注射用水溶解。

b.将上述液体经过0.22μm滤膜过滤。

c.加入组分中的氧化三甲胺、聚维酮K30，搅拌至溶解。

d.加注射用水定容至1000mL。

e.测量溶液的渗透压以及pH值，此时溶液渗透压为1800-2000mOsm/Kg,pH值为7.0～7.4。

f.将上述溶液再次经过0.22μm滤膜过滤。取一定样品进行测试实验，检测指标1)20～25度条件下pH:7.0～7.4；2)渗透压：1800～2000mOsm/Kg；3)内毒素＜0.25EU/mL；4)无菌。

g.将配置好的冻存液无菌分装，2～8度保存。

(2)pH值测量

在室温25℃下，三次各取冻存液20mL测量pH值分别为7.21、7.21、7.22，平均值为7.21，处于7.0～7.4的范围。

(3)渗透压测量

三次各取冻存液100μl，测量渗透压分别为1894mOsm/Kg、1902mOsm/Kg、1905mOsm/Kg，平均值为1900mOsm/Kg，处于1800～2000mOsm/Kg范围。

(4)细菌内毒素检测

采用鲎试剂凝胶法进行检测，结果为阴性对照和样品均为阴性，阳性对照和样品阳性对照为阳性。内毒素含量合格。

(5)无菌检查

经无菌检查，结果为14天后无菌生长，无菌合格。

所述冷冻保护剂所用组分商品信息如下：

1640培养基干粉：Sigma，R8755

谷胱甘肽：Sigma，V900456

L-肌肽：Sigma，V900370

亚精胺：上海信裕生物科技有限公司，XY26020

根皮素：上海信裕生物科技有限公司，XY20450

根皮素：北京孚博生物科技有限公司，62637-96-8

聚维酮K30：BASF，50485993

实验例

对比例设置：

1.市售含DMSO冻存液；

2.实施例和对比例按照下表中的组份配制，配制方式同实施例。

上述实施例1为正常组，实施例2及实施例3分别为三种专利保护组分L-肌肽、亚精胺、根皮素的低剂量组和高剂量组，对比例1、对比例2、对比例3为分别缺少三种组分中的一种的对照组，对比例4为不加三种组分的对照组。

(1)细胞活率试验

用脐带间充质干细胞，分别用本发明冻存液实施例1～3、对比例1～4与某市售含DMSO冻存液的冻存效果进行对比，复苏后，利用台盼蓝拒染法检测细胞活率。经检测，细胞活率如下表所示：

(2)细胞贴壁试验

复苏后的细胞加α-MEM培养基重悬后置于培养箱中培养(37℃，5％CO₂)，24h后每个样品在倒置显微镜下取随机视野记录细胞形态及贴壁细胞数量。结果如图1所示，图中实验组为本方案实施例1冻存液，对照组为市售含DMSO冻存液，可以看出实验组和对照组细胞贴壁能力及形态无明显差别。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.生物样品冷冻保护剂，其特征在于，包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.3g/L～1.7g/L、L-肌肽0.45g/L～0.65g/L、亚精胺0.12g/L～0.18g/L以及根皮素0.03g/L～0.07g/L；

·氧化三甲胺55g/L～65g/L，以及

·聚维酮K30 18g/L～22g/L。

2.根据权利要求1所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，包括如下活性成分：

·抗氧化物质：谷胱甘肽1.4g/L～1.6g/L、L-肌肽0.50g/L～0.60g/L、亚精胺0.13g/L～0.17g/L以及根皮素0.04g/L～0.06g/L；

·氧化三甲胺58g/L～62g/L，以及

·聚维酮K30 19g/L～21g/L。

3.根据权利要求1所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，所述生物样品冷冻保护剂还包括细胞生长培养基。

4.根据权利要求3所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，所述细胞生长培养基为RPMI-1640培养基。

5.根据权利要求4所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，所述RPMI-1640培养基的浓度为9g/L～11g/L。

6.根据权利要求1～5任一项所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，还包括至少一种额外的冷冻保护剂。

7.根据权利要求1所述的生物样品冷冻保护剂，其特征在于，还包括能够在0℃～-196℃下维持pH＝7.0～7.4的缓冲试剂。

8.冷冻保存组合物，其特征在于，包含生物样品和权利要求1～7任一项所述的生物样品冷冻保护剂。

9.冷冻保存生物样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将被冷冻保存的生物样品与权利要求1～7任一项所述的生物样品冷冻保护剂接触，从而获得冷冻保存组合物，降低所述冷冻保存组合物的温度至冷冻保存温度。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物样品包括器官、组织或细胞，或它们的组合物。

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