CN117378599A - 太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存和激活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存和激活方法，属于精子超低温保存技术领域。其中，本发明采用液氮面直接降温的方法冻存四倍体精子，操作简便、效率高，适宜大规模冻存精子，完全可以满足实际生产的需要；本发明采用二步升温的方法复苏冻存的四倍体精子，冻存的精子温度在30s内即可迅速达到25℃，有效防止了因冰晶生成而引起的细胞损伤。在冻存四倍体精子时，使用了由基础液、质膜保护剂和微管稳定剂组成的精子冷冻保存液，有效保护了四倍体精子；在激活四倍体精子时，使用了由基础液、钙镁离子和二甲双胍组成的精子激活液，有效保证了四倍体精子的活力。
Description
技术领域
本发明涉及一种精子的超低温冻存和激活方法，具体涉及一种太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存和激活方法，属于精子超低温保存技术领域。
背景技术
三倍体牡蛎具有生长快、不育等优良养殖性状，一年四季均可供应市场，又称“四季肥”牡蛎，在贝类养殖中占据重要地位，拥有很高的市场价值和经济价值。目前，三倍体牡蛎主要来自于四倍体牡蛎和二倍体牡蛎的杂交，因此，三倍体牡蛎商业化应用的核心是四倍体牡蛎。四倍体牡蛎拥有4套染色体，但性腺发育特征与二倍体相似，随季节发育并排卵排精，这使三倍体牡蛎的育苗生产受到季节限制。为了进行三倍体牡蛎苗种的四季生产和供应，需要保证四倍体牡蛎成熟精子的长期供应。
采用超低温冷冻保存的方法可以在雄性四倍体牡蛎性腺发育的最佳时期，将优质四倍体精子进行批量冷冻保存，并在需要的时候随时解冻投入育苗生产。同时，超低温保存的精子也方便运输，利于不同区域苗种生产的需要。
目前，太平洋牡蛎、香港牡蛎的二倍体精子超低温冷冻保存研究已经展开，在专利CN201310087708和CN201310314722中均有介绍，但是还没有关于四倍体牡蛎精子超低温保存方法的报导。有研究表明，因染色体加倍，在同样的条件下，四倍体牡蛎精子的存活能力明显弱于二倍体牡蛎精子的存活能力，四倍体牡蛎精子的活跃水平也低于二倍体牡蛎精子的活跃水平。因此，需要采用更加有效的冻存和复苏方法以提升复苏后四倍体精子的存活率和活力水平。
研究表明，精子的质膜是低温环境中最易受损的关键结构，冻融后的精子会出现精子头部质膜褶皱、破裂、内膜和核膜分离、线粒体膜受损等现象，尾部易出现头尾断裂、打折卷曲等情况，尾部鞭毛的主要结构—微管在低温条件下很不稳定，易发生解聚，这些损伤大大降低了精子的运动水平和受精能力，因此在冷冻过程中加大对精子质膜和微管结构的保护将会有效提高复苏后的精子质量。
发明内容
为解决太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存问题，提高精子冻存后的成活率、活力水平及授精能力，本发明旨在提供一套操作流程简便难度小、适宜大规模存储、较为经济的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存和激活方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，包括以下步骤：
步骤1：挑选肥满且精子活跃度佳的四倍体太平洋牡蛎置于4℃冷藏；
步骤2：用蒸馏水配制基础液，各物质的浓度分别如下：NaCl 8g/L，KCl 0.4g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaH2PO4·H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.35g/L；
步骤3：用基础液配制精子冷冻保存液，各物质的浓度分别如下：肌肽 5.0mmol/L，脯氨酸 50mmol/L，6-DMAP 1.5mmol/L；
步骤4：用基础液配制精子激活液，各物质的浓度分别如下：CaCl2 0.14g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，二甲双胍 300μmol/L；
步骤5：将四倍体太平洋牡蛎的雄性生殖腺挤成浆状，除杂后置于冻存管中，并向冻存管中加入预冷的精子冷冻保存液，混匀后4℃平衡20min；
步骤6：向保温罐中加入液氮，将装有四倍体精子的冻存管置于保温罐中，熏蒸20min；
步骤7：向保温罐中继续加入液氮，再熏蒸10min；
步骤8：打开保温盖，迅速将冻存管从保温罐中取出并装入液氮罐中存储。
优选的，在步骤2中，精子冷冻保存液置于4℃冷藏过夜，精子激活液置于25℃保存。
优选的，在步骤5中，精子冷冻保存液与四倍体精子按2：1的体积比混合。
优选的，在步骤6中，冻存管与液氮面的垂直距离为15cm。
优选的，在步骤7中，冻存管与液氮面的垂直距离为5cm。
一种如前面所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法的激活方法，包括复苏和激活步骤，其中：
（1）复苏步骤具体如下：从液氮罐中迅速取出冻存管，置于37℃水浴中迅速搅动15s，再在25℃水浴中迅速搅动15s，使冻存管内的四倍体精子温度升至25℃；
（2）激活步骤具体如下：向复苏后的四倍体精子中加入预热至25℃的精子激活液，充分混合，5min后用同样的方法进行第二次激活。
优选的，在复苏步骤中，冻存管在水浴中的搅动速度为4次/s。
优选的，在激活步骤中，精子激活液与四倍体精子按10：1体积比混合。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明提供的精子冷冻保存液由基础液、质膜保护剂和微管稳定剂组成，其中，基础液保证了精子所处环境的渗透压与pH 值稳定；质膜保护剂由肌肽和脯氨酸组成，肌肽是一种细胞膜稳定剂和保护剂，不仅保护细胞外膜，对线粒体膜也有保护作用，已被证实可清除在氧化应激过程中形成的活性氧自由基（ROS）以及α-β不饱和醛，防止细胞质膜过度氧化，脯氨酸是一种理想的渗透调节物质，可作为细胞质膜和酶的保护物质及自由基清除剂，稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，降低凝固点，防止细胞脱水，从而在低温逆境下对精子起到保护作用；微管稳定剂使用的是6-DMAP，6-DMAP是一种蛋白质磷酸化的抑制剂，通过抑制成熟促进因子（MPF）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化从而稳定微管结构，防止发生解聚。
（2）本发明提供的精子激活液由基础液、钙镁离子和二甲双胍组成，其中，基础液保证了精子所处环境的渗透压与pH值稳定；钙镁离子在激活精子过程中是十分必要的；二甲双胍能够激活对精子能量稳态起关键调节作用的AMP 依赖蛋白激酶（AMPK），增强精子内线粒体活性，进而改善精子运动能力。
（3）本发明采用液氮面直接降温的方法冻存四倍体精子，操作简便、效率高，适宜大规模冻存精子，完全可以满足实际生产的需要。
（4）本发明采用二步升温的方法复苏冻存的四倍体精子，冻存的精子温度在30s内即可迅速达到25℃（室温），有效防止了因冰晶生成而引起的细胞损伤。
（5）本发明提供的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存和激活方法，在对太平洋牡蛎四倍体精子的冷冻、复苏和激活过程中，均没有太过复杂的操作步骤，也没有用到复杂昂贵的设备，复苏后四倍体精子的成活率高，活力强，随时随地随取随用，给三倍体牡蛎生产带来了极大方便。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
1、准备四倍体牡蛎
四倍体太平洋牡蛎养殖于山东烟台崆峒岛近海养殖基地，于6月中下旬从海上转移至车间养殖池中，暂养2天后，解剖观察性腺发育程度，并取小样用海水激活，在显微镜下观察精子活跃度，最后挑选3只肥满且精子活跃度佳的牡蛎置于4℃冷藏2h。
2、配制精子冷冻保存液和精子激活液
（1）配制基础液
向蒸馏水中添加NaCl、KCl、Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、NaH2PO4·H2O和NaHCO3，各物质的浓度分别如下：NaCl 8g/L，KCl 0.4g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaH2PO4·H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.35g/L。
（2）配制精子冷冻保存液
向基础液中添加肌肽、脯氨酸和6-DMAP，各物质的浓度分别如下：肌肽 5.0mmol/L，脯氨酸 50mmol/L，6-DMAP 1.5mmol/L。
（3）配制精子激活液
向基础液中添加CaCl2、MgSO4·7H2O和二甲双胍，各物质的浓度分别如下：CaCl20.14g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，二甲双胍 300μmol/L。
精子冷冻保存液置于4℃冷藏过夜，精子激活液置于25℃保存。
3、取精
将四倍体太平洋牡蛎的雄性生殖腺挤成浆状，置于200目筛绢上，过滤去除杂质，置于冻存管中，按2：1的体积比加入预冷的精子冷冻保存液（V精子冷冻保存液：V四倍体精子=2:1），在涡轮振荡器上充分混匀，置于4℃平衡20min。
4、低温冻存四倍体精子
在保温罐中水平放入网状支架，向保温罐中加入液氮并使液氮面距支架上平面15cm，将装有四倍体精子的冻存管横置于支架上，盖上保温盖，熏蒸20min。
打开保温盖，继续加入液氮，使液氮面距支架上平面5cm，盖上保温盖，继续熏蒸10min。
打开保温盖，迅速将冻存管从保温罐中取出并装入液氮罐中存储备用。
5、复苏四倍体精子
精子冻存1个月之后进行复苏。
复苏之前，准备两个水浴锅，温度分别设置为25℃和37℃，并提前将精子激活液预热至25℃。
从液氮罐中迅速取出一只冻存管，置于37℃水浴中迅速搅动15s，再在25℃水浴中迅速搅动15s，使冻存管内的四倍体精子温度升至25℃，期间搅动速度为4次/s。
6、激活四倍体精子
按10：1体积比向复苏后的四倍体精子中加入预热的精子激活液（V精子激活液：V四倍体精子=10:1），上下轻轻倒转使四倍体精子和精子激活液充分混合，5min后用同样的方法进行第二次激活，之后按1000：1体积比将已激活两次的四倍体精子加入到25℃的海水中（V海水：V四倍体精子+精子激活液=1000:1），充分混匀，5min后先在显微镜下观察精子活力状况，然后利用精子质量分析系统（CASA）对精子的动静态特征进行分析，分析结果表明：复苏后激活的四倍体精子活力为46.8～52.4%。
7、受精第一次
从养殖场获得二倍体太平洋牡蛎，解剖后挑选雌性5只，挤卵后，先用200目筛绢过滤大杂质一次，再用500目筛绢洗卵3次，倒入30L孵化桶中，加入激活后的太平洋牡蛎四倍体精子，使每个卵细胞周围附着精子达到3～6个；受精2h后，显微镜下检查卵子受精情况，检查结果：受精率达到80%左右；将受精卵转入孵化池中继续发育，24h后检测孵化率，检测结果：孵化率为75%，完全可以满足生产要求。
8、受精第二次
四倍体精子冻存8个月后，于来年3月复苏并激活，复苏、激活步骤同前，经检测：复苏后激活的四倍体精子活力为42.2～47.3%。
从养殖场获得升温培养的雌性二倍体太平洋牡蛎，挤卵、除杂、洗卵后倒入孵化桶中，加入激活后的太平洋牡蛎四倍体精子，使每个卵细胞周围附着精子达到3～6个；受精2h后，经检测，受精率为75%左右；将受精卵转入孵化池中继续发育24h，经检测，孵化率为72%左右，完全可以满足生产要求。
实施例2
1、准备四倍体牡蛎
12月，在山东烟台崆峒岛近海养殖基地升温育肥四倍体太平洋牡蛎，来年3月，解剖观察性腺发育程度，挑选3只肥满且精子活跃度佳的牡蛎置于4℃冷藏2h。
2、配制精子冷冻保存液和精子激活液
精子冷冻保存液和精子激活液的配制方法与实施例1相同。
3、取精
取精方法与实施例1相同。
4、低温冻存四倍体精子
低温冻存四倍体精子的过程采用程序降温仪。
程序降温仪开启后，预冷至2℃，将4℃平衡后的装有四倍体精子的冻存管插入程序降温仪管槽内，在2℃下孵育5min，然后以-5℃/min的降温速率降至-20℃，再以-10℃/min的降温速率降至-80℃，然后再以-20℃/min的降温速率降至-150℃，最后将冻存管从程序降温仪管槽内取出并置于液氮罐中长期保存。
5、复苏和激活四倍体精子
7月份，进行四倍体精子复苏和激活，复苏和激活过程与实施例1相同，检测结果表明：复苏后激活的四倍体精子活力为60.8～68.2%。
6、受精
从养殖场附近海域获得二倍体太平洋牡蛎，解剖后查看性腺发育程度，挑选发育成熟的雌性牡蛎5只，挤卵、除杂、洗卵后倒入孵化桶中，加入激活后的太平洋牡蛎四倍体精子，使每个卵细胞周围附着精子达到3～6个；受精2h后，经检测，受精率为85%左右；将受精卵转入孵化池中继续发育24h，经检测，孵化率为77%，完全可以满足生产要求。
对比实施例1和实施例2可知：采用程序降温仪确实能小幅提高复苏后的四倍体精子活力及受精率，但该仪器操作复杂、耗费液氮量大、成本较高，而实施例1提供的方法操作简单，成本低廉，且效果与采用程序降温仪的效果相差无几，尤为适合企业大批量冻存四倍体精子的需要。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：挑选肥满且精子活跃度佳的四倍体太平洋牡蛎置于4℃冷藏；
步骤2：用蒸馏水配制基础液，各物质的浓度分别如下：NaCl 8g/L，KCl 0.4g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.1g/L，NaH2PO4·H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.35g/L；
步骤3：用基础液配制精子冷冻保存液，各物质的浓度分别如下：肌肽 5.0mmol/L，脯氨酸 50mmol/L，6-DMAP 1.5mmol/L；
步骤4：用基础液配制精子激活液，各物质的浓度分别如下：CaCl2 0.14g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，二甲双胍 300μmol/L；
步骤5：将四倍体太平洋牡蛎的雄性生殖腺挤成浆状，除杂后置于冻存管中，并向冻存管中加入预冷的精子冷冻保存液，混匀后4℃平衡20min；
步骤6：向保温罐中加入液氮，将装有四倍体精子的冻存管置于保温罐中，熏蒸20min；
步骤7：向保温罐中继续加入液氮，再熏蒸10min；
步骤8：打开保温盖，迅速将冻存管从保温罐中取出并装入液氮罐中存储。
2.根据权利要求1所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，其特征在于，在步骤2中，精子冷冻保存液置于4℃冷藏过夜，精子激活液置于25℃保存。
3.根据权利要求1所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，其特征在于，在步骤5中，精子冷冻保存液与四倍体精子按2：1的体积比混合。
4.根据权利要求1所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，其特征在于，在步骤6中，冻存管与液氮面的垂直距离为15cm。
5.根据权利要求1所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法，其特征在于，在步骤7中，冻存管与液氮面的垂直距离为5cm。
6.一种如权利要求1至5任意一项所述的太平洋牡蛎四倍体精子的超低温冻存方法的激活方法，其特征在于，包括复苏和激活步骤，其中：
（1）复苏步骤具体如下：从液氮罐中迅速取出冻存管，置于37℃水浴中迅速搅动15s，再在25℃水浴中迅速搅动15s，使冻存管内的四倍体精子温度升至25℃；
（2）激活步骤具体如下：向复苏后的四倍体精子中加入预热至25℃的精子激活液，充分混合，5min后用同样的方法进行第二次激活。
7.根据权利要求6所述的激活方法，其特征在于，在复苏步骤中，冻存管在水浴中的搅动速度为4次/s。
8.根据权利要求6所述的激活方法，其特征在于，在激活步骤中，精子激活液与四倍体精子按10：1体积比混合。
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