CN112674075A - 一种绵羊精液冷冻保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵羊精液冷冻保护剂及其应用，该绵羊精液冷冻保护剂包括冷冻基础稀释液和AMPK激活剂，所述的AMPK激活剂为Met或AICAR。通过向绵羊精液冷冻保存稀释液中添加适当浓度的AMPK激活剂Met或AICAR能够通过激活AMPK来提高精子解冻后的活力、运动性能以及结构完整性，并通过保持顶体酶活性，提高抗氧化酶活性，促进精子代谢，维持线粒体功能来提高精液品质。

Description

一种绵羊精液冷冻保护剂

技术领域

本发明属于动物生殖技术领域，具体涉及一种绵羊精液冷冻保护剂及其应用。

背景技术

精液冷冻保存技术可以打破时间和空间的障碍长期保存精液，提高优良种公羊的利用率，加快品种改良的进程，是人工授精技术的关键环节之一。近年来，国内外学者从不同角度对绵羊精液冷冻保存技术进行了研究，丰富了这一领域的数据，但冻精技术在羊领域研究起步晚，目前绵羊冷冻精液解冻后精子活率较其他家畜(如牛、猪)而言仍处于较低水平，且使用冻精进行人工授精的受胎率也低于自然交配的受胎率。羊的精子质膜薄，在超低温环境中易脆破裂，容易造成精子质膜的结构损伤，易受到冷休克、细胞内冰晶、氧化应激、高渗损伤等冷冻损伤。另外，羊精液中含有一种酶，会与稀释液中蛋黄发生反应，降低精子存活率，从而影响受胎率。因此，改善稀释液成分、优化冷冻保存程序可以减少冷冻损伤，对提高绵羊冻精解冻后精液的品质至关重要。

本发明以绵羊精子为试验对象,探究Met或AICAR对精子冷冻保存效果的影响，并且探究Met或AICAR是否通过AMPK的介导而影响精子的能量代谢。通过检测冷冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整性、线粒体膜电位、ATP含量、AMPK磷酸化水平、顶体酶活性，探究AMPK激活剂对绵羊精子体外冷冻保存效果的影响及其机理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊精液冷冻保护剂及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

AMPK激活剂在制备绵羊精液冷冻保护剂中的应用。

作为一种优选技术方案，所述的绵羊精液冷冻保护剂为向冷冻基础稀释液添加AMPK激活剂制成的，所述的AMPK激活剂为Met或AICAR。

一种绵羊精液冷冻保护剂，该绵羊精液冷冻保护剂包括冷冻基础稀释液和AMPK激活剂，所述的AMPK激活剂为Met或AICAR。

作为一种优选技术方案，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～300μM。进一步优选的，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为300～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～200μM；最优选的，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为200μM。

所述的冷冻基础稀释液为将双蒸水提前加热至30～35℃后，与无卵黄稀释浓缩液按体积比4：1充分混合制成。混合后的稀释液4℃保存，使用前需30～32℃预热。

上述的绵羊精液冷冻保护剂在绵羊精液冷冻保存中的应用。

本发明的有益效果：

本发明研究了AMPK激活剂二甲双胍(Metformin，Met)和阿卡地新(Acadesine，AICAR)对绵羊精液冷冻保存效果的影响。首先在冷冻基础稀释液中分别添加不同浓度(0、100、200、300、400、500μM)的Met或AICAR，冷冻解冻后根据精子活力、运动性能和结构完整性指标筛选出最佳的添加浓度(400μM Met、200μM AICAR)；然后分别使用不同的冷冻稀释液(对照组：稀释液；Met组：含400μM Met的稀释液；AICAR组：含200μM AICAR的稀释液)冷冻精液，解冻后检测精子中AMPK蛋白表达、顶体酶活性、代谢指标、线粒体功能以及抗氧化酶活性。稀释液中添加400μM Met和200μM AICAR均可显著提高解冻后精子活力、运动性能及精子结构完整性(P<0.05)，其中400μM Met组精子总活力达43.20％，顶体完整率为91％，质膜完整率为46％。与对照组相比，Met组和AICAR组解冻后精子中AMPK磷酸化水平显著升高(P<0.05)；顶体酶活性显著提高(P<0.05)；丙酮酸水平显著下降(P<0.05)，乳酸脱氢酶活性、乳酸含量以及ATP含量均显著升高(P<0.05)；与对照组相比，Met组和AICAR组稀释液更有利于维持线粒体膜电位(P<0.05)，提高ATP酶活性(P<0.05)以及抗氧化酶的活性(P<0.05)。添加适当浓度的AMPK激活剂可以提高绵羊精液冷冻保存的效果。

附图说明

图1为精液冷冻保存试验技术路线图。

图2为显微镜观察顶体完整和质膜完整(如图2A所示，白色箭头所指为顶体完整精子，背景为浅蓝色，核为深蓝色；黑色箭头所指为顶体不完整精子，整个精子头部呈深蓝色。如图2B所示，白色箭头所指为质膜完整精子，尾部呈弯曲状；黑色箭头所指为质膜不完整精子)。

图3为AMPK及p-AMPK在绵羊精子上的表达定位。

图4为AMPK激活剂对冷冻保存后精子中AMPK和p-AMPK蛋白表达的影响。

其中，A：AMPK和p-AMPK的蛋白表达条带；B：AMPK蛋白表达；C：p-AMPK蛋白表达；D：p-AMPK/AMPK比率。1,2,3分别表示Control，Met，AICAR。注：对照组使用AndroMed稀释液冷冻精液，试验组分别使用含终浓度为400μM Met和200μM AICAR的Andromed稀释液冷冻精液；字母a～c表示差异显著性，不同字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同。

图5AMPK激活剂对冷冻保存后精子顶体酶活性的影响。

图6AMPK激活剂对冷冻保存后精子代谢的影响。

其中，A：丙酮酸含量(Control：21.49±0.19mg/L；Met：12.58±0.31mg/L；AICAR：14.90±0.27mg/L)；B：乳酸脱氢酶活性(Control：6.84±0.15IU/L；Met：9.48±0.13IU/L；AICAR：8.84±0.12IU/L)；C：乳酸含量(Control：1419.43±40.18μM；Met：2442.90±79.89μM；AICAR：2204.20±69.21μM)；D：ATP含量(Control：76.43±0.88pg/mL；Met：144.75±2.19pg/mL；AICAR：126.42±0.70pg/mL)。

图7AMPK激活剂对冷冻保存后精子线粒体膜电位及ATP酶活性的影响

其中，A：线粒体膜电位(Control：140.78±0.72；Met：215.73±1.15；AICAR：197.91±1.45)；B：ATP酶活性(Control：7.82±0.07U/mL；Met：13.98±0.27U/mL；AICAR：12.67±0.22U/mL)。

图8AMPK激活剂对冷冻保存后精子抗氧化酶活性的影响

其中，A：谷胱甘肽还原酶活性(Control：73.53±3.14U/L；Met：132.64±1.89U/L；AICAR：125.28±4.56U/L)；B：谷胱甘肽过氧化物酶活性(Control：133.10±2.98U/mL；Met：256.49±11.20U/mL；AICAR：227.26±7.10U/mL)；C：过氧化氢酶活性(Control：36.10±0.73U/mL；Met：64.08±1.19U/mL；AICAR：46.52±1.21U/mL)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物

试验所用羊只由江苏省太仓市金仓湖生态养殖基地提供。在采精期间，选取5只性欲良好、体型适中、训练有素的成年健康种公羊，采用单栏舍饲，每日饲喂2次。日粮配方：预混料0.33％，玉米粉2.64％，玉米粕3.96％，花生秧3.17％，稻草21.11％，豆渣66％，大豆皮2.51％，小苏打0.15％，盐0.13％。采精前补饲玉米。

1.1.2主要试剂

精液稀释液(AndroMed，13503/0200)、Met(MCE，HY-17471A)、AICAR(MCE，HY-13417A)、快速姬姆萨染液(南京建成，Do11-1)、BCA试剂盒(Beyotime，P0012)、AMPK(Proteintech，10929-2-AP)、P-AMPK(Affinity，AF3423)、GAPDH(Proteintech，60004-1-lg)、Cy3标记山羊抗兔IgG(Servicebio，GB21303)。

1.1.3主要溶液配制

1.1.3.1AndroMed稀释液：将双蒸水提前加热至30～35℃后，与200mL AndroMed无卵黄稀释浓缩液(即市售的精液稀释液)按体积比4：1充分混合。混合后的稀释液4℃保存，使用前需30～32℃预热。

1.1.3.2Met浓储液(1mM)：0.42mg Met溶于25.359mL DPBS，-20℃保存。

1.1.3.3AICAR浓储液(1mM)：0.12mg AICAR溶于3.93mL DPBS，-20℃保存。

1.1.3.4低渗溶液：4.9g柠檬酸三钠和9.0g果糖溶于1000mL蒸馏水。

1.1.3.5绵羊精液冷冻保护剂：取Met浓储液或AICAR浓储液按比例添加到AndroMed稀释液中，Met或AICAR在AndroMed稀释液中的终浓度为0、100、200、300、400、500μM。

1.2试验方法

1.2.1精液处理

将采集后的精液置于恒温箱(37℃)带回实验室，立即进行处理。精液冷冻保存试验技术路线图如图1所示。

1.2.2精液品质相关指标的检测

1.2.2.1精子活力及运动性能：使用CASA系统分析精子运动特征。吸取10μL解冻后精液置于预热载玻片上，盖上盖玻片置于显微镜恒温台上，检测精子总活力(TM)，快速运动精子比例(Rapid)，平均路径速率(VAP)，直线速率(VSL)和曲线速率(VCL)。每个样本至少观察5个视野，每个视野不少于400个精子，每个视野平均在5s内读数。

1.2.2.2.顶体完整率：使用姬姆萨染色法，吸取10μL解冻后精液置于载玻片上抹片，固定，姬姆萨染色4h，背面冲洗后晾干待用。显微镜下观察精子，每个视野不少于200个精子，至少观察3个视野，顶体完整率(％)＝(总精子数-顶体不完整精子数)/总精子数×100％。

1.2.2.3.质膜完整率：使用低渗膨胀法，将10μL解冻后精液与100μL低渗溶液混合均匀，37℃孵育30min，吸取10μL混合液置于载玻片抹片，自然风干后待用。显微镜下观察精子，每个视野不少于200个精子，至少观察3个视野。质膜完整率(％)＝弯尾精子数/总精子数×100％。

1.2.2.4.顶体酶活性、精子能量代谢指标(丙酮酸、乳酸脱氢酶、乳酸含量、ATP含量)、线粒体膜电位、ATP酶活性、精子抗氧化酶指标(谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶)均使用上海卡迈舒生物科技有限公司提供的试剂盒进行测定，具体操作参照试剂盒使用说明。

1.2.3精子免疫荧光检测

4％多聚甲醛固定精子涂片30min；PBS清洗涂片3次，5min/次；0.25％Triton-100溶液覆盖于涂片处，通透20min；PBS清洗涂片3次，5min/次；5％BSA溶液在室温封闭1h；4℃孵育一抗，过夜；孵育结束后，将涂片放置至室温；PBS清洗精子涂片3次，5min/次；室温避光孵育二抗，1h；使用PBS溶液避光清洗精子涂片3次，5min/次；使用DAPI避光染核5min；PBS清洗涂片3次，5min/次；滴加抗荧光猝灭剂后封片；使用激光共聚焦显微镜进行观察与拍照。

1.2.4精子蛋白免疫印迹检测

提取解冻后绵羊精子总蛋白，根据BCA试剂盒(碧云天)说明书进行蛋白浓度测定后进行蛋白变性，蛋白变性条件为：70℃，10min。SDS-PAGE电泳：蛋白上样量10μL(20μg)，200V，35min；转膜：100V，1h；封闭：5％脱脂奶粉封闭2h；TBST洗三次孵一抗，4℃过夜；TBST洗三次孵二抗，室温1h；TBST洗三次，使用ECL显影液孵育，显影拍照，使用ImageJ软件对条带进行灰度分析。

1.2.5数据分析

每个试验至少重复三次，所有结果均表示为平均值±标准差(mean±SD)，利用SPSS 25.0软件对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用邓肯多重比较(DunCan)进行事后比较。P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1AMPK激活剂对冷冻解冻后精子活力及运动性能的影响

通过向精液冷冻稀释液中添加终浓度为0、100、200、300、400、500μM Met或AICAR来探究AMPK激活剂对冷冻精液解冻后精子活力及运动性能的影响，结果如附表中的表1和表2所示：

与对照组相比，400μM Met使精子总活力提高了8％(P<0.05)，并且能显著提高精子的运动性能(快速运动精子比例、平均路径速率、直线运动速率和曲线运动速率，P<0.05)。

与对照组相比，200μM AICAR使精子总活力提高14％(P<0.05)，并且能显著提高精子的运动性能(快速运动精子比例、平均路径速率、直线运动速率和曲线运动速率，P<0.05)。

2.2AMPK激活剂对冷冻解冻后精子结构完整性的影响

通过向精液冷冻稀释液中添加终浓度为0、100、200、300、400、500μM Met或AICAR来探究AMPK激活剂对冷冻精液解冻后精子结构完整性的影响，显微镜下观察精子，如图2A所示，白色箭头所指为顶体完整精子，背景为浅蓝色，核为深蓝色；黑色箭头所指为顶体不完整精子，整个精子头部呈深蓝色。如图2B所示，白色箭头所指为质膜完整精子，尾部呈弯曲状；黑色箭头所指为质膜不完整精子。

统计结果如附表中的表3和表4所示：与对照组相比，300μM和400μM Met均能显著提高解冻后精子顶体完整率和质膜完整率(P<0.05)，综合结果2.1，选择添加400μM Met进行后续试验。

与对照组相比，100μM和200μM AICAR能显著提高解冻后精子质膜完整率(P<0.05)，综合结果2.1，选择添加200μM AICAR到精液稀释液进行后续试验。

2.3AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK蛋白表达的影响

如图3所示：绵羊鲜精中AMPK定位于精子的顶体和颈部，p-AMPK定位于精子赤道环及尾部。

AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK及p-AMPK的蛋白表达的影响参见图4。与对照组相比，解冻后Met组精子中的AMPK和p-AMPK蛋白表达量显著升高(P<0.05，图4B，C)，AICAR组精子中的AMPK和p-AMPK蛋白表达量无显著差异(P>0.05，图4B，C)，Met组和AICAR组精子中的p-AMPK/AMPK比值均显著高于对照组(P<0.05，图4D)，Met组和AICAR组之间无显著差异(P>0.05)。对照组使用AndroMed稀释液冷冻精液，试验组分别使用含终浓度为400μMMet和200μM AICAR的Andromed稀释液冷冻精液；字母a～c表示差异显著性，不同字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同。图3中，A：AMPK和p-AMPK的蛋白表达条带；B：AMPK蛋白表达；C：p-AMPK蛋白表达；D：p-AMPK/AMPK比率。1,2,3分别表示Control，Met，AICAR。

2.4AMPK激活剂对冷冻解冻后精子顶体酶活性的影响

如图5所示：与对照组相比，Met组和AICAR组均能显著提高冷冻解冻后精子的顶体酶活性(P<0.05)，其中400μM Met能极显著提高冷冻解冻后精子顶体酶活性(P<0.01)。图5中，顶体酶活性(Control：21.18±0.96U/L；Met：40.33±0.65U/L；AICAR：32.79±0.27U/L)。

2.4AMPK激活剂对冷冻解冻后精子代谢指标的影响

如图6所示，与对照组相比，Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中的丙酮酸含量显著降低(P<0.05，图6A)，其中Met组中精子丙酮酸含量最低；Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中的乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性显著升高(P<0.05，图6B)，其中Met组中精子LDH活性最高；Met组和AICAR组冷冻解冻后精子中乳酸含量显著高于对照组(P<0.05，图6C)，Met组中精子乳酸含量最高；与对照组相比，试验组显著提高了ATP的含量(P<0.05，图6D)，其中Met组中精子ATP含量最高。

图6中，A：丙酮酸含量(Control：21.49±0.19mg/L；Met：12.58±0.31mg/L；AICAR：14.90±0.27mg/L)；B：乳酸脱氢酶活性(Control：6.84±0.15IU/L；Met：9.48±0.13IU/L；AICAR：8.84±0.12IU/L)；C：乳酸含量(Control：1419.43±40.18μM；Met：2442.90±79.89μM；AICAR：2204.20±69.21μM)；D：ATP含量(Control：76.43±0.88pg/mL；Met：144.75±2.19pg/mL；AICAR：126.42±0.70pg/mL)。

2.5AMPK激活剂对冷冻解冻后精子线粒体功能的影响

如图7所示，与对照组相比，Met组和AICAR组冷冻解冻后的精子能够维持更高的线粒体膜电位(P<0.05，图7A)，并能显著提高精子中ATP酶活性(P<0.05，图7B)，其中400μMMet作用更显著。

图7中，A：线粒体膜电位(Control：140.78±0.72；Met：215.73±1.15；AICAR：197.91±1.45)；B：ATP酶活性(Control：7.82±0.07U/mL；Met：13.98±0.27U/mL；

AICAR：12.67±0.22U/mL)。

2.6AMPK激活剂对冷冻解冻后精子抗氧化酶活性的影响

如图8所示，与对照组相比，Met组和AICAR组能显著提高冷冻解冻后精子中谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-Px)活性和过氧化氢酶(Catalase，CAT)活性(P<0.05，图8A、B、C)，其中Met组活性最高。

图8中，A：谷胱甘肽还原酶活性(Control：73.53±3.14U/L；Met：132.64±1.89U/L；AICAR：125.28±4.56U/L)；B：谷胱甘肽过氧化物酶活性(Control：133.10±2.98U/mL；Met：256.49±11.20U/mL；AICAR：227.26±7.10U/mL)；C：过氧化氢酶活性(Control：36.10±0.73U/mL；Met：64.08±1.19U/mL；AICAR：46.52±1.21U/mL)。

3讨论

3.1AMPK激活剂对冷冻解冻后精子活力及运动性能的影响

精子活力是最常用的评价精子质量和受精能力的指标。研究表明，冷冻保存处理后，精子活力显著下降。在本试验中，添加100～400μM Met或100～300μM AICAR的冷冻保存稀释液均能不同程度地提高冷冻保存后精子的总活力，其中以400μM Met和200μMAICAR作用效果最佳，解冻后的精子活力分别为43.2％和49.47％，与姜珊(40.29％)、乌兰托娅(43％)、哈福(40％)等添加其他冷冻保护剂的研究结果相似，此浓度还可显著提高精子解冻后快速运动精子比例，精子平均路径速率等运动性能。以上结果说明，在精液冷冻保存稀释液中添加一定浓度的AMPK激活剂Met或AICAR能够改善解冻后绵羊精子的活力和运动性能。

3.2AMPK激活剂对冷冻解冻后精子结构完整性及顶体酶活性的影响

顶体反应对于精卵融合以及受精过程至关重要，完整的精子结构是精卵结合的重要前提，也是成功受精的必要条件，所以精子的顶体完整率和质膜完整性成为检测精液品质的重要指标。研究表明，冷冻解冻后，80％绵羊精子发生质膜肿胀并且还会发生顶体外膜肿胀，导致内容物外泄。

精子头部的顶体由细胞核周围的高尔基体同源性膜形成，含有多种与精卵结合相关的水解酶，其中，顶体酶是一种特殊的丝氨酸蛋白水解酶，主要参与调控顶体中其它酶的释放。大部分的顶体酶分布于顶体内膜和赤道膜上外，而精子的冷冻保存处理会使顶体膜受到结构和功能的损伤，因此不可避免地会造成顶体酶的失活或损失。研究表明，精子顶体酶的活性与顶体完整率具有相关性，它与正常形态的精子比例呈显著正相关；同时，AMPK在正常精子顶体中的磷酸化水平较高。在本试验中，适当浓度的Met和AICAR可保护冷冻解冻后精子的顶体和质膜完整性。在冷冻稀释液中分别添加400μM Met和200μM AICAR，解冻后精子的顶体完整率和质膜完整率可达91％，46％和83％，44％，与宏伟(64.89％，34.84％)和郑云胜(65.67％，42.84％)等添加其他冷冻保护剂的研究结果相似。此外，400μM Met和200μM AICAR均能显著提高绵羊精液冷冻保存后精子的顶体酶活性，有利于精子存活。以上结果说明使用AMPK激活剂Met和AICAR能够通过激活AMPK提高绵羊精液冷冻保存后精子的结构完整性和顶体酶活性。

3.3AMPK激活剂对冷冻解冻后精子中AMPK蛋白表达的影响

AMPK可能参与冷冻保存过程中精子的功能调节。研究表明，AMPK蛋白定位于许多哺乳动物的精子中，如猪、小鼠、马、大鼠、山羊和人类，但分布的部位由于物种差异不尽相同。本试验发现，AMPK定位绵羊鲜精的顶体前部和精子颈部，而其活化形式定位于精子赤道环及整个尾部，与猪精子中AMPK及p-AMPK定位类似。根据AMPK和p-AMPK蛋白在精子中的定位，我们推测分布在绵羊精子顶体前部的AMPK可能参与顶体反应的调控，颈部分布的AMPK与赤道环和尾部分布的p-AMPK可能与精子活率、运动性能和结构完整性的调控有关。通过检测冷冻解冻后精子中AMPK和p-AMPK蛋白的表达水平发现，400μM Met和200μM AICAR的添加可显著提高精子中AMPK的磷酸化水平。

3.4AMPK激活剂对冷冻解冻后精子能量代谢的影响

在精液冷冻保存过程中，低温减缓精子代谢，而冷冻解冻后精子的复苏需要大量ATP。磷酸化的AMPK通过增加分解代谢相关的蛋白质的活性(如葡萄糖摄取、糖酵解、脂肪酸氧化和线粒体生物合成)来促进ATP的产生，同时会抑制生物合成途径(如脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、葡萄糖或糖原的合成)保证ATP水平^[27]，从而维持能量平衡。糖酵解作为精子代谢的主要方式之一，能够在相关酶的作用下将葡萄糖分解为丙酮酸和ATP，LDH可将丙酮酸转化为乳酸^[28]。在本试验中，向绵羊精液冷冻保存稀释液中添加400μM Met或200μM AICAR可以显著提高解冻后精子中LDH的活性，降低丙酮酸含量，并提高乳酸以及ATP的含量。有研究表明，同为AMPK间接激活剂的罗格列酮通过增强线粒体代谢和种马精子糖酵解来增加细胞内ATP水平^[29]，鸡精液中加入药物(Met或AICAR)激活AMPK后，精子细胞中ATP和乳酸量增加^[30]，这与本试验结果类似。以上结果均表明AMPK激活剂可以加快精子中丙酮酸向乳酸的转化过程，促进糖酵解，提高精子内ATP的含量。

3.5AMPK激活剂对冷冻解冻后精子线粒体膜电位和ATP酶活性的影响

有研究表明，AMPK可定位于线粒体膜上，并且在猪、小鼠和鸡的精子中参与调节线粒体膜电位。线粒体鞘中产生的能量主要用于维持精子活率，因此，线粒体膜电位的降低会导致精子活率降低，而ATP酶存在于线粒体的内膜上，可催化ATP水解并释放出大量能量用于细胞活动。而冷冻损伤会导致线粒体膜电位降低，ATP酶活性降低，影响精子活率。本试验中，400μM Met和200μM AICAR可显著提高冷冻保存后精子中线粒体膜电位，并维持较高的ATP酶活性和ATP含量。

3.6AMPK激活剂对冷冻解冻后精子抗氧化酶活性的影响

低温对精子造成损伤的机制可能与ROS过量和抗氧化系统的改变有关，GR是这个系统中的关键酶，它可以将氧化性谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，从而消除精子中的ROS，阻止脂质过氧化的发生，保护细胞膜结构和功能的完整性^[39]，同时，GSH-Px与CAT能够特异性清除超氧阴离子基团^[40]，共同抵抗氧化应激。徐振军等人的研究表明，冷冻处理会显著降低精子中的GR、GSH-Px和CAT的活性，因此本试验采用GR、GSH-P和CAT来评价冻后精子的抗氧化能力。在本试验中，400μM Met和200μM AICAR的添加显著增加了GSH-Px、GR和CAT的活性。

4结论

绵羊精液冷冻保存稀释液中添加适当浓度的AMPK激活剂Met或AICAR能够通过激活AMPK来提高精子解冻后的活力、运动性能以及结构完整性，并通过保持顶体酶活性，提高抗氧化酶活性，促进精子代谢，维持线粒体功能来提高精液品质。

Claims (8)

1.AMPK激活剂在制备绵羊精液冷冻保护剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的绵羊精液冷冻保护剂为向冷冻基础稀释液添加AMPK激活剂制成的，所述的AMPK激活剂为Met或AICAR。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～300μM。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为300～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～200μM；优选的，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为200μM。

5.一种绵羊精液冷冻保护剂，其特征在于，该绵羊精液冷冻保护剂包括冷冻基础稀释液和AMPK激活剂，所述的AMPK激活剂为Met或AICAR。

6.根据权利要求5所述的绵羊精液冷冻保护剂，其特征在于，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～300μM。

7.根据权利要求6所述的绵羊精液冷冻保护剂，其特征在于，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为300～400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为100～200μM；优选的，所述的Met在冷冻基础稀释液中的终浓度为400μM；所述的AICAR在冷冻基础稀释液中的终浓度为200μM。

8.权利要求5～7中任意一项所述的绵羊精液冷冻保护剂在绵羊精液冷冻保存中的应用。

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