CN107041362A - 一种肿瘤组织块深低温冷冻方法 - Google Patents

Abstract

一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，涉及一种肿瘤组织冷冻方法。是要解决现有的组织冻存方法导致复苏后肿瘤细胞活性显著降低，成瘤率低的问题。方法：一、冻存液的配制；二、组织块的处理及冷冻；三、冻存肿瘤组织块复苏。本发明利用渗透性和非渗透性冻存保护剂结合的方法进行肿瘤组织冻存，同时对试剂的配制比例进行优化，使冻存液中DMSO的比例降低到2％，降低了组织细胞毒性，对冻存后的组织起到很好的保护作用，使其复苏后具有较高的小鼠成瘤性，成瘤率达到90％以上。本发明用于肿瘤组织冷冻。

Description

一种肿瘤组织块深低温冷冻方法

技术领域

本发明涉及一种肿瘤组织冷冻方法。

背景技术

肿瘤表面标志物是肿瘤细胞生长过程中产生的一种特异性物质，或因细胞病变而过 量表达的细胞成分，病理诊断及分型可为肿瘤治疗提出合理化方案，因此在改变治疗方案时，应参考已有病理结果或重新进行其他方面的病理检测分析。目前研究的肿瘤治疗 性疫苗很多，在临床研究活跃，至2017年1月，美国ClinicalTrials.gov网站已登记有1862 项临床研究，其中中国共有71项。能够在体内介导强烈的抗肿瘤效应的治疗型疫苗主要 包括：1)重组的肿瘤相关抗原(TAA)，有短的合成多肽的组合或全长的蛋白，前者需 结合到抗原提呈细胞APC表面的MHC分子上，直接提呈给T细胞，后者需被APC摄取 加工后再提呈；2)肿瘤细胞或其裂解物，其中含有TAA或与伴侣分子(如热休克蛋白) 复合的TAA；3)编码TAA的载体疫苗，包括裸DNA、RNA和病毒为载体；4)树突状 细胞(dendritic cell，DC)为基础的疫苗，包括体外荷载TAA融合蛋白的DC。

低温保护剂的种类按照是否能渗透到细胞内通常将其分为渗透性和非渗透性两种。 渗透性保护剂主要有二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇等等。其特性在于保护剂的小分子结构在溶液中易结合水分子发生水合作用，增加溶液的黏性，从而在降温的过程中 减缓水分子结晶形成，减小“胞内冰晶损伤”，来达到保护细胞、组织的目的。非渗透性冷 冻保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉等等。乙烯吡咯烷酮、 羟乙基等为大分子非渗透性物质，虽能溶于水但不能自由进出细胞，其加入到溶液后可 以使溶液呈过冷状态，抑制冰晶形成。可以使特定温度电解质的浓度降低，减小溶质损 伤，并通过改变渗透压引起细胞脱水减小胞内冰晶形成，从而起到保护作用。在降温过 程中，此类保护剂主要与渗透性保护剂联合使用，促使细胞完成脱水，同时可以减少渗 透性保护剂的使用浓度来减少毒性损害。复温时，其可以提供一个高渗透压的环境，防 止过多水分进入细胞太快而引起细胞膨胀损伤。白蛋白也是一种常用的非渗透性抗冻剂。

目前，研究者们仍在不断的研究动物细胞和组织的冻存方法及冻存技术，从种类繁 多的保护剂中挑选最优保护剂的种类并研究其配比浓度以及导入、洗脱方法。降温前要将保护剂导入到组织内，复温后需要将其洗脱出来，在导入、洗脱过程中，由于细胞膜 外溶液浓度的变化造成细胞脱水或肿胀超过一定限度时，会造成组织不可逆损伤，因此 在深低温保存过程中，保护剂的导入和洗脱对组织细胞活性起着重大作用。目前研究中， 冻存较多的为质地柔软的卵巢癌、结肠癌等肿瘤组织、脂肪组织及脐带华通氏胶组织， 冻存液主要为DMSO、胎牛血清及培养基按不同配的比混合液，该方法冻存的肿瘤组织 一般在冻存半年后细胞活性即开始出现显著降低现象，主要表现为成瘤率低，仅为 50％-70％。这就限制了有计划地进行经常研究及临床应用，因而有必要寻找一种能长期 保存新鲜标本并保持其生物学特性的方法，从而实现不同质地肿瘤组织的高活性。

发明内容

本发明是要解决现有的组织冻存方法导致复苏后肿瘤细胞活性显著降低，成瘤率低的 问题，提供一种肿瘤组织块深低温冷冻方法。

本发明肿瘤组织块深低温冷冻方法，包括以下步骤：

一、冻存液的配制：

用DMEM将人血白蛋白(HSA)冻干粉配制成质量浓度为10％～40％的人血白蛋白溶液，用DMEM将羟乙基淀粉(HES)配制成质量浓度为15％～25％的羟乙基淀粉溶液， 用DMEM将乙二醇(EG)配制成质量浓度为20％～30％的乙二醇溶液，三种溶液分别用 0.22μm滤器无菌条件下过滤备用；

然后将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜(DMSO)按体积比为(25-30)：(10-15)：(8-12)：(1-1.5)比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用。

二、组织块的处理：

将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织2～3次， 用手术剪剪碎至1～2mm³的块状，然后加入步骤一配好的冻存液重悬组织块，按每管1mL 分装到冻存管中；

先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体为：20℃ /min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升温至-20℃，然后以2℃/min的速度降至 -40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃长期保存。

三、冻存肿瘤组织块复苏：

冻存12～24个月后，将冻存管从液氮中取出于37～38℃水浴快速解冻，冻存管内剩余 1～2mm³冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4℃预冷DMEM后将解冻后的组织块加入离心管中，4℃，1500～2000rpm离心5～10min后弃上清，用含3％～10％人血白蛋白的PBS洗涤组织两次后重悬组织于PBS中用于相关验证实验。

进一步的，步骤二中含双抗的hank’s液为含有100U/mL氨苄青霉素和100g/mL链霉素的hank’s液。

本发明的有益效果：

(1)细胞发生癌变后往往出现异型细胞，即细胞大小不一，形状不规则，细胞核增大，核浆比例增大，核分裂象增多，甚至有病理性核分裂，细胞极性紊乱等，因此，冻存 时冻存液需选择毒性极低，渗透损伤较小的配方，且冻存复苏需选择较柔和、舒缓的方法， 这样才能保证组织中各种异型细胞均保持最佳状态。另外软组织冻存时，冻存液容易接触 内部细胞，较易冻存，硬组织需要保证冻存液的渗透，因此需要将组织处理更小一些，且 需要加入小分子渗透性冻存剂。

(2)本发明利用渗透性和非渗透性冻存保护剂结合的方法进行肿瘤组织冻存，同时 对试剂的配制比例进行优化，使冻存液中DMSO的比例降低到2％，降低了组织细胞毒性，对冻存后的组织起到很好的保护作用，冻存12～24个月，肿瘤组织复苏后具有较高的小 鼠成瘤性，成瘤率达到90％以上(而现有常规方法的冻存肿瘤组织，复苏后成瘤率仅为 50％～70％)。

(3)将肿瘤组织切割并剪碎至1-2mm³大小，使冻存液更易接触渗入组织中的细胞，使细胞内水分脱出，在冷冻过程中可更好的保护组织细胞的活性。复苏时，组织中细胞受热均匀，且容易去除渗入的冻存液，有助于维持组织中细胞活力。

(4)本发明的复温、洗脱方法为：37℃水浴快速解冻，待组织冻存液融化至剩余约1mm³冰块时停止水浴，以减少组织内外成分的快速置换，同时组织洗涤时向PBS中加入 终浓度为5％的人血白蛋白，以减少洗涤过程中细胞膜内外渗透压差所引起细胞渗透性损伤。

(5)本发明中包含了冻存及复温的整套的肿瘤组织块深低温冷冻技术，整套技术的 应用有利于保护剂的导入和洗脱，对组织细胞活性起着重大作用。本发明利用质地较硬的 肿瘤组织进行实验，因此该方法同样适用于质地较软的肿瘤组织，该方法保存的肿瘤组织 块具有与新鲜组织类似的分子水平特征及细胞扩增能力，复苏扩增后可进行肿瘤诊断及治 疗方面的应用。

附图说明

图1为RT-PCR对内参基因β-actin的检测结果；

图2为Western对内参基因β-actin的检测结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任 意组合。

具体实施方式一：本实施方式肿瘤组织块深低温冷冻方法，包括以下步骤：

一、冻存液的配制：

用DMEM将人血白蛋白冻干粉配制成质量浓度为10％～40％的人血白蛋白溶液，用DMEM将羟乙基淀粉配制成质量浓度为15％～25％的羟乙基淀粉溶液，用DMEM将乙二 醇配制成质量浓度为20％～30％的乙二醇溶液，三种溶液分别用0.22μm滤器无菌条件下 过滤备用；

然后将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为(25-30)：(10-15)：(8-12)：(1-1.5)比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用；

二、组织块的处理：

将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织2～3次， 用手术剪剪碎至1～2mm³的块状，然后加入步骤一配好的冻存液重悬组织块，按每管1mL 分装到冻存管中；

先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体为：20℃ /min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升温至-20℃，然后以2℃/min的速度降至 -40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃长期保存；

三、冻存肿瘤组织块复苏：

冻存12～24个月后，将冻存管从液氮中取出于37～38℃水浴快速解冻，冻存管内剩余 1～2mm³冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4℃预冷DMEM后将解冻后的组织块加入离心管中，4℃，1500～2000rpm离心5～10min后弃上清，用含3％～10％人血白蛋白的PBS洗涤组织两次后重悬组织于PBS中用于相关验证实验。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中制成质量浓度 为20％～30％的人血白蛋白溶液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中制成质量 浓度为18％的羟乙基淀粉溶液。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中制成 质量浓度为25％的乙二醇溶液。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中将人 血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为25：14：10：1 比例混合。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中用含 5％人血白蛋白的PBS洗涤组织。其它与具体实施方式一至五之一相同。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。

试验1：本试验进行冻存液的配制及三种肿瘤组织块的冻存：

一、冻存液的配制：

用DMEM将人血白蛋白冻干粉配制成浓度为20％人血白蛋白溶液，将羟乙基淀粉配制成浓度为18％的羟乙基淀粉溶液，将乙二醇配制成25％的乙二醇溶液，三种溶液分别 用0.22μm滤器无菌条件下过滤备用；

将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为25：14： 10：1比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用。

二、组织块的处理：

将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织两次， 用手术剪剪碎至1-2mm³的块状；加入配好的冻存液重悬组织块，然后按每管1mL分装到冻存管中；先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体 为：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升温至-20℃，然后以2℃/min的速 度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃长期保存。所述肿瘤组织 块为乳腺癌组织、胰腺癌组织和肝癌组织。

试验2：本试验进行组织块的复苏及生物大分子完整性、肿瘤形成率检测

一、冻存肿瘤组织块复苏：

冻存12个月后，将三种组织的冻存管从液氮中取出于37℃水浴快速解冻，冻存管内 剩余约1mm³冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4ml 4℃预冷DMEM后将解冻后的 的组织块加入其中，4℃，1500rpm离心5min后弃上清，含5％人血白蛋白PBS洗涤组织 两次后重悬组织于PBS中用于相关验证实验。

二、RT-PCR进行mRNA完整性检测

冻存12个月后，取三种复苏后的肿瘤组织各0.1g，液氮中进行研磨成粉末后转入1.5ml EP管，并加入1mL Trizol于冰上裂解15min，4℃12000rpm 15min离心取上清， 用氯仿抽提后将上层的透明水相转移至另外的EP管中，用500μL异丙醇沉淀RNA，12 000rpm15min离心后用75％乙醇洗涤2次，用RNase-free water溶解管底的沉淀，用 核酸分析仪测定所提取的总RNA的纯度和浓度；利用总RNA为模板，根据M-MLV逆 转录酶的说明书进行cDNA第一链的合成，以下列引物进行β-actin内参基因的PCR反应， 验证mRNA完整性。

上游：5’-CTGTCCCTCTACGCCTCTG-3’

下游：5’-GGCGGTGATCTCCTTCTG-3’

三、Western blotting进行蛋白完整性检测

冻存12个月后，取三种复苏后的肿瘤组织各0.1g，液氮中进行研磨成粉末后转入1.5mlEP管中，加入1mL组织裂解液于冰上裂解10min，4℃12000rpm 5min离心取上 清进行SDS-PAGE电泳分离。采用湿转法(恒流，230mA)将凝胶上的蛋白转移至膜上。 将膜置于5％的脱脂牛奶室温封闭2h后，分别用1：500稀释的兔抗人β-actin抗体4℃轻 摇孵育过夜，PBS洗膜3次，10min/次。再用羊抗兔HRP-二抗37℃孵育1h，PBS洗膜 3次，10min/次。用化学发光底物检测试剂检测反应信号。

四、建立PDTT移植瘤模型，操作步骤如下：

将4周龄的Balb/c裸鼠于SPF级屏障环境中饲养，并适应环境三天以上，每种肿瘤组织模型动物各30只；将动物用戊巴比妥钠麻醉，背部皮肤消毒，无菌棉球擦干后在裸 鼠一侧的肋部切开一小口，18号穿刺针头钝性分离皮肤与皮下，使成一皮带，将准备好 的肿瘤碎片用12G套管针送入其中，切口滴加一滴双抗(100×青霉素/链霉素)；每天观 察肿瘤生长状况，并且每周用游标卡尺测定瘤体体积，三个月后剥离瘤体计算成瘤率；

对照组与实验组的操作相同，只是对照组将冻存液更换为常规冻存液，具体配方为： 10％DMSO、10％FBS、80％DMEM；对照组冻存管从液氮中取出于37℃水浴快速解冻， 冻存液完全融化后停止水浴，同时组织洗涤时的PBS中不加入人血白蛋白。

结果如下：

(一)mRNA完整性检测

图1为RT-PCR对内参基因β-actin的检测结果，M代表DL2000marker，a1代表对 照组中乳腺癌检测结果，b1代表对照组中胰腺癌检测结果，c1代表对照组中肝癌检测结 果，a2代表实验组中乳腺癌检测结果，b2代表实验组中胰腺癌检测结果，c2代表实验组 中肝癌检测结果。观察图中条带面积及亮度可知，两组中的各肿瘤组织均具有较好的 mRNA完整性，且实验组的PCR结果优于对照组。

(二)蛋白完整性检测

图2为Western对内参基因β-actin的检测结果，a1代表对照组中乳腺癌检测结果，b1代表对照组中胰腺癌检测结果，c1代表对照组中肝癌检测结果，a2代表实验组中乳腺 癌检测结果，b2代表实验组中胰腺癌检测结果，c2代表实验组中肝癌检测结果。观察图 中条带面积可知，两组中的各肿瘤组织均具有较好的蛋白完整性，且实验组中乳腺癌与胰 腺癌的检测结果较对照组更好，说明本研究的肿瘤组织冻存及复苏技术有利于保持组织中 蛋白完整性，利于肿瘤特异性物质的保存。

(三)PDTT移植瘤模型对组织成瘤率的检测

表1为各肿瘤组织的裸鼠PDTT移植瘤模型研究结果，a1代表对照组中乳腺癌检测结果，b1代表对照组中胰腺癌检测结果，c1代表对照组中肝癌检测结果，a2代表实验组 中乳腺癌检测结果，b2代表实验组中胰腺癌检测结果，c2代表实验组中肝癌检测结果。 由表中数据可知，冻存一年时，对照组中各肿瘤组织的成瘤率较低，说明其冻存复苏后组 织细胞的成活率较低，该冻存方法冻存对组织伤害较大，不宜于长期组织冻存；实验组中 各肿瘤组织的成瘤率明显高于对照组且均高于90％，说明该方法可以更好的保护组织免 受环境变化影响，能够对组织进行长期冻存。

表1

序 列 表

<110> 黑龙江天晴干细胞股份有限公司

<120>一种肿瘤组织块深低温冷冻方法

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> mRNA完整性验证的上游引物。

<400> 1

ctgtccctctacgcctctg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> mRNA完整性验证的下游引物。

<400> 2

ggcggtgatctccttctg 18

Claims (6)

1.一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

一、冻存液的配制：

用DMEM将人血白蛋白冻干粉配制成质量浓度为10％～40％的人血白蛋白溶液，用DMEM将羟乙基淀粉配制成质量浓度为15％～25％的羟乙基淀粉溶液，用DMEM将乙二醇配制成质量浓度为20％～30％的乙二醇溶液，三种溶液分别用0.22μm滤器无菌条件下过滤备用；

然后将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为(25-30)：(10-15)：(8-12)：(1-1.5)比例混合，得到冻存液，4℃预冷备用；

二、组织块的处理：

将肿瘤组织块用含双抗的hank’s液漂洗后，用不含双抗的生理盐水洗涤组织2～3次，用手术剪剪碎至1～2mm³的块状，然后加入步骤一配好的冻存液重悬组织块，按每管1mL分装到冻存管中；

先于4℃平衡50min，使DMSO渗入组织，然后采用程控降温仪降温，具体为：20℃/min的速度降至-55℃，再以10℃/min的速度升温至-20℃，然后以2℃/min的速度降至-40℃，接着以10℃/min的速度降至-80℃，最后于-196℃长期保存；

三、冻存肿瘤组织块复苏：

冻存12～24个月后，将冻存管从液氮中取出于37～38℃水浴快速解冻，冻存管内剩余1～2mm³冰块时停止水浴；取无菌的离心管，加入4℃预冷DMEM后将解冻后的组织块加入离心管中，4℃，1500～2000rpm离心5～10min后弃上清，用含3％～10％人血白蛋白的PBS洗涤组织两次后重悬组织于PBS中。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为20％～30％的人血白蛋白溶液。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为18％的羟乙基淀粉溶液。

4.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中制成质量浓度为25％的乙二醇溶液。

5.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤一中将人血白蛋白溶液、羟乙基淀粉溶液、乙二醇溶液及二甲基亚砜按体积比为25：14：10：1比例混合。

6.根据权利要求1所述的一种肿瘤组织块深低温冷冻方法，其特征在于步骤三中用含5％人血白蛋白的PBS洗涤组织。