CN101974071B - 胰岛素b链hla-a*0201限制性ctl表位改造肽配体及其获得方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体(APL)及其获得方法和应用，该APL的氨基酸序列为HLCGPFLVEA，是将天然表位mInsB_5-14的第6位组氨酸替换为苯丙氨酸而得；其获得方法是先建立TCR-HLA-A*0201-mInsB_5-14复合物模型，确定mInsB_5-14中潜在的TCR作用位点并对其进行单氨基酸突变，从中筛选出与HLA-A*0201分子亲和力高于天然表位且空间构象和天然表位接近的候选APL，再进一步通过细胞功能实验从中鉴定出能显著下调mInsB_5-14特异性CTL应答水平的APL，即得；本发明APL可用于制备I型糖尿病治疗性负调肽疫苗。

Description

胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体及其获得方法和应用

技术领域

本发明涉及一种改造肽配体(altered peptide ligand，APL)，特别涉及胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表位mInsB_5-14的APL，还涉及该APL的获得方法和应用。 

背景技术

I型糖尿病(Type I diabetes)是由淋巴细胞介导的以胰岛β细胞特异性损伤导致胰岛素生成绝对不足为特征的一种自身免疫性疾病。I型糖尿病多发生在儿童和青少年，起病急，如不及时治疗可引发累及心、肝、肾、神经、眼等重要组织器官的严重并发症，是儿童和青少年致残及早亡的主要原因之一。近年来，我国儿童和青少年患I型糖尿病的人数逐年递增，I型糖尿病正在成为危害我国儿童和青少年健康的主要疾病。目前，I型糖尿病以胰岛素终身替代疗法和非特异性免疫抑制为主要治疗手段，治疗费用高昂且副作用大，因此，急需建立一种特异性免疫干预治疗策略。 

大量动物实验证实，给非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠口服或接种自身抗原，可以减缓甚至完全阻断I型糖尿病的发生、发展。既往研究发现，不管是糖尿病患者还是NOD小鼠，自身反应性Th1细胞在I型糖尿病的致病机制中占中心地位，因此，近年来发展了用自身反应性CD4⁺T细胞表位替代完整自身抗原来诱导免疫耐受的策略。相对于结构复杂的大分子天然抗原，小分子表位肽具有更易诱导免疫耐受、相对安全、易于实现规模化制备和纯化等优点，最为重要的是可以通过一些氨基酸位点的化学修饰最大限度地增强其免疫调节的能力。例如，源于胰岛素B链的mInsB_9-23是优势性自身反应性CD4⁺T细胞表位，Alleva等采用丙氨酸突变扫描技术筛选出一条将mInsB_9-23的第16位和第19位氨基酸 同时替换为丙氨酸的APL，该APL免疫NOD小鼠后可以有效诱导Th1→Th2型应答转换，从而阻断I型糖尿病的发生。源于热休克蛋白60的Hsp60_437-460也是一个优势性自身反应性CD4⁺细胞表位，Raz等将其第6位和第11位的氨基酸同时替换为缬氨酸后获得了一条稳定性更强的APL，该APL可以有效诱导Th1→Th2型应答转换，在一定程度上减轻或者阻断β细胞的免疫损伤，但临床研究显示其对I型糖尿病的防治效果却因人而异，可能是由于免疫应答类型转换在尺度上很难把握，一旦Th2辅助的体液免疫过分加强后，疾病最终转归则变得难以预料，这使得以调节CD4⁺T细胞应答为目的的免疫干预策略陷于尴尬境地。 

近年来在NOD小鼠模型研究中有愈来愈多的证据表明自身反应性CD8⁺T细胞(即CTL)在I型糖尿病中同样具有十分重要的致病作用，其识别β细胞上的自身抗原CTL表位与MHC-I类分子形成的复合物，通过Fas/FasL、释放穿孔素等途径直接杀伤β细胞。已有研究利用自身抗原CTL表位或其APL在NOD小鼠体内成功诱导了特异性CTL免疫耐受，对I型糖尿病有一定的防治作用。 

同时研究报道，I型糖尿病的发生与人类HLA-A*0201分子密切相关。据统计，约60％的I型糖尿病患者携带HLA-A*0201等位基因。在HLA-A*0201转基因NOD小鼠[NOD.129P2(B6)-β_2m ^tmlUncTg(HLA-A/H2-D/β2M)]中，I型糖尿病的发病时间较普通NOD小鼠提前且程度加重，是良好的人源化动物模型。近年来已陆续鉴定出一系列人和小鼠I型糖尿病自身抗原HLA-A*0201限制性CTL表位，其中部分存在较高的人、鼠交叉反应性。因此，利用人源化NOD小鼠筛选对自身反应性CTL具有负调节效应的APL，对于人类I型糖尿病的防治研究具有重要意义。 

在人源化NOD小鼠中，源于胰岛素B链的mInsB_5-14(即鼠源胰岛素B链第5到14位氨基酸)已被证实为HLA-A*0201限制的免疫优势性CTL表位，且与人源表位具有高度的交叉反应性。因而，通过改造天然表位mInsB_5-14来获得在HLA-A*0201背景下能显著下调mInsB_5-14特异性CTL应答水平的APL，对于人 类I型糖尿病的防治研究具有重要的实际意义和良好的应用前景。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14的APL，其在HLA-A*0201背景下能显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平；目的之二在于提供所述APL的获得方法，该方法同样适用于其它自身免疫疾病中自身抗原的改造及其APL的筛选，可为治疗性负调疫苗的设计和研制提供有用的工具；目的之三在于提供所述APL在医药方面的应用。 

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 

1、胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL，由His-Leu-Cys-Gly-Pro-Phe-Leu-Val-Glu-Gla所示的氨基酸序列组成，是将鼠源胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14的第6位组氨酸替换为苯丙氨酸而得。 

2、所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL的获得方法，其特征在于：包括以下步骤： 

a、利用计算机模拟技术建立胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14与HLA-A*0201分子的二元复合物结构模型，再进一步建立上述二元复合物与T细胞抗原受体(TCR)的三元复合物结构模型，分析天然表位mInsB_5-14中潜在的TCR主要作用位点； 

b、对步骤a所得天然表位mInsB_5-14中潜在的TCR主要作用位点进行单氨基酸残基突变，获得一系列天然表位mInsB_5-14的候选APL，对这些候选APL进行计算机分析，从中筛选出与HLA-A2分子亲和力高于天然表位、且空间构象和天然表位接近的候选APL； 

c、合成步骤b筛选出的候选APL，通过细胞功能实验从中鉴定出在HLA-A*0201背景下能够显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平的APL，即得本发明所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL。 

3、所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位APL在制备I型糖尿病 治疗性负调肽疫苗中的应用。 

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14的APL，其在HLA-A*0201背景下能显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平，并具有易于规模化制备和纯化、使用安全等特点，可单独或联合其他免疫显性自身抗原CTL表位APL应用于I型糖尿病治疗性负调肽疫苗的研制，在I型糖尿病治疗领域具有较好的应用前景；本发明还提供了获得所述APL的方法，该方法同样适用于其它自身免疫疾病中自身抗原的改造及其APL的筛选，能够有效指导后续研究，减少肽合成与细胞功能实验的工作量，降低研究成本，加快研究进度，从而为治疗性负调疫苗的设计和研制提供有用的工具。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中： 

图1为TCR-HLA-A*0201-mInsB_5-14三元复合物的模拟结构，其中箭头a所指为TCR；箭头b所指为mInsB_5-14；箭头c所指为HLA-A*0201分子；箭头d所指为mInsB_5-14第6位点。 

图2为天然表位mInsB_5-14和候选APL mInsB_5-14H6F在HLA-A*0201分子结合槽中的构象，其中HLA-A*0201分子以表面静电势能图显示。 

图3为合成的候选APL mInsB_5-14H6F的高效液相色谱图和质谱图。 

图4为候选APL mInsB_5-14H6F与HLA-A*0201分子的亲和力检测结果。 

图5为HLA-A*0201转基因NOD小鼠的PCR鉴定结果，其中1泳道为DNA分子量标准，2泳道为待测小鼠基因组DNA的PCR产物，3泳道为内参照的PCR产物。 

图6为ELISpot法检测候选APL mInsB_5-14H6F刺激天然表位mInsB_5-14特异性CTL分泌IFN-γ的能力。 

图7为胞内因子染色法检测候选APL mInsB_5-14H6F刺激天然表位mInsB_5-14特异性CTL分泌IFN-γ的能力。 

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。 

一、建立TCR-HLA-A＊0201-mInsB_5-14三元复合物结构模型，确定天然表位mInsB_5-14中潜在的TCR主要作用位点 

采用Insight II软件先建立天然表位mInsB_5-14(氨基酸序列为HLCGPHLVEA)与HLA-A*0201分子的二元复合物(pMHC)结构模型，再进一步建立pMHC与TCR的三元复合物结构模型(图1)，分析天然表位mInsB_5-14中可能与TCR发生作用的氨基酸残基位点。结果显示，天然表位mInsB_5-14中的第5位点和第6位点均为潜在的TCR主要作用位点，但第5位点的脯氨酸残基对多肽构象的影响较大，因此本发明仅将第6位点作为改造位点。 

二、对天然表位mInsB_5-14中潜在的TCR主要作用位点进行单氨基酸残基突变，从中筛选出与HLA-A2分子亲和力高于天然表位、且空间构象和天然表位接近的候选APL 

采用InsightII软件，首先，以天然表位mInsB_5-14与HLA-A*0201分子的二元复合物结构模型为模板，定义距天然表位mInsB_5-145 

范围内的HLA-A*0201分子中的氨基酸残基为作用位点，对天然表位mInsB_5-14与前述定义为作用位点的HLA-A*0201分子中的氨基酸残基进行分子动力学计算；然后，将天然表位mInsB_5-14中第6位点的组氨酸残基(H)分别进行保守或不保守的单氨基酸残基(F、R、E、Y、Q、L、T或G)突变，获得一系列候选APL，分别对这些候选APL与前述定义为作用位点的HLA-A*0201分子中的氨基酸残基进行分子动力学计算；最后，采用discovery studio 2.5.5内嵌模块MM-PBSA计算突变前后多肽与HLA-A*0201分子结合自由能的变化值，并将所得候选APL的空间构象与天然表位mInsB_5-14的空间构象进行分子重叠，计算候选APL中α碳(Cα)原子相 对天然表位mInsB_5-14的RMSD值。 

结果如表1和图2所示，当天然表位mInsB_5-14中第6位点的组氨酸残基(H)突变为苯丙氨酸残基(F)时，与HLA-A*0201分子的结合自由能变化最大(ΔΔG＝-7.747kcal/mol，ΔΔG值越负表示该候选APL与HLA-A*0201分子的亲和力越大)，而且Cα原子相对天然表位mInsB_5-14的RMSD值最小(RMSD_Cα＝0.38，RMSD_Cα值越小表示该候选APL的空间构象与天然表位的空间构象越接近)，因此，推测候选APL mInsB_5-14H6F为目标APL。 

表1候选APL相对天然表位mInsB_5-14的ΔΔG值和RMSD_Cα值 

三、合成筛选出的候选APL，通过细胞功能实验从中鉴定出在HLA-A＊0201背景下能够显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平的APL 

1、候选APL的合成、纯化及鉴定 

候选APL mInsB_5-14H6F委托杭州中肽生化有限公司进行合成，合成方案采用标准Fmoc方案，即由去保护和激活交联两个反应反复循环直至合成目的多肽，获得的目的多肽粗品用高效液相色谱法进行纯化，纯化后的目的多肽经反相高效液相色谱法鉴定纯度为97.4％，经质谱法鉴定分子量与理论值一致(图3)，最后冷冻干燥，温度-70℃保存备用。 

2、候选APL与HLA-A*0201分子的亲和力检测 

采用HLA-A*0201表达阳性但内源性抗原肽递呈途径必需的抗原加工相关 转运体(TAP)缺陷的T2细胞株进行实验，未与内源性抗原肽结合的HLA-A*0201分子在T2细胞表面的表达极不稳定，很快发生降解；而与外源性抗原肽结合的HLA-A*0201分子可以在T2细胞表面稳定地表达，且表达量与外源性抗原肽和HLA-A*0201分子的亲和力呈正相关。 

实验分为4组：APL组：mInsB_5-14H6F；天然表位组：mInsB_5-14；阳性对照组：HIV_476-484(氨基酸序列为ILKEPVHGV)；阴性对照组：OVA(氨基酸序列为AHTK-DGFNF)。将1×10⁶个T2细胞悬于1ml含有浓度为100μg/ml的肽(按实验分组加入相应肽)、浓度为3μg/ml的β2微球蛋白的无血清RPMI 1640培养基中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下孵育18小时，用PBS洗涤细胞2次，加入BB7.2杂交瘤细胞分泌的鼠抗人HLA-A*0201单克隆抗体100μl，4℃孵育30分钟，再用PBS洗涤细胞2次，加入按体积比为1∶50或1∶100稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体100μl，4℃孵育30分钟，用PBS洗涤并重悬细胞后，用流式细胞仪(Becton-Dickinson公司)于波长488nm处测定荧光强度，计算平均荧光强度百分数(％MFI)。 

结果如图4所示，候选APL mInsB_5-14H6F与HLA-A*0201分子的亲和力(％MFI＝2.44)与天然表位mInsB_5-14(％MFI＝2.81)相当。 

3、候选APL刺激天然表位mInsB_5-14特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ能力检测 

(1)HLA-A*0201转基因NOD小鼠的鉴定 

取实验小鼠组织0.1g，用基因组DNA提取试剂盒(TIANgen公司)抽提得到浓度为60～100ng/μl的基因组DNA 50μl，经紫外分光光度法检测其A260/280为1.80～2.00，满足后续实验要求。根据Jackson官方网站(http://jaxmice.jax.org/strain/006611.html#genes)提供的PCR鉴定HLA-A2基因型方法鉴定实验小鼠是否为HLA-A*0201转基因NOD小鼠。结果如图5所示，从实验小鼠的基因组DNA中扩增出了长度约300bp的HLA-A*0201基因片段，证实实验小鼠为HLA-A*0201转基因NOD小鼠。 

(2)ELISpot法检测候选APL刺激天然表位mInsB_5-14特异性CTL分泌IFN-γ的 能力 

选择16～20周龄雌性HLA-A*0201转基因NOD小鼠，用ONETOUCH Ultra血糖仪(强生公司)每周监测小鼠血糖值变化，取血糖值≤11.1mol/L的糖尿病前驱期小鼠进行实验。实验分为4组：APL组：mInsB_5-14H6F；天然表位组：mInsB_5-14；阴性对照组：OVA；空白对照组：只加入浓度为10IU/ml的小鼠白介素2(mIL-2)维持而不加任何刺激物。采用密度梯度离心法从小鼠脾脏中分离脾脏单个核细胞(SPMC)，同时冲洗小鼠股骨骨髓腔获得骨髓细胞。将小鼠骨髓细胞用含胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬并调整细胞浓度至2×10⁵/ml，以5ml/孔接种至6孔培养板中，每孔加入终浓度为50ng/ml的小鼠集落刺激因子(mGM-CSF)和终浓度为10ng/ml的小鼠白细胞介素4(mIL-4)，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下诱导培养。每2天1/3量更换培养基并补加mGM-CSF和mIL-4，第6天加入终浓度为5ng/ml的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，第7天收获细胞，得成熟的骨髓来源树突状细胞(BMDC)，用流式细胞仪检测BMDC表面分子CD11c、CD80验证BMDC的纯度和成熟度，保存备用。将小鼠SPMC用含胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬并调整细胞浓度至1.0×10⁶/ml，以1ml/孔接种于48孔培养板中，每孔加入终浓度为10μg/ml的mInsB_5-14(空白对照组不加)和终浓度为10IU/ml的mIL-2，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5％的条件下刺激培养28天(共4个周期)，每2天1/3量更换培养基并补加mIL-2，按实验分组每7天补加负载相应肽的同源BMDC(将BMDC以1×10⁵/孔接种于48孔培养板中，加入终浓度为10μg/孔的肽进行刺激，第7天按BMDC与SPMC的数量比为1∶10加入经mInsB_5-14刺激过的SPMC中)，获得经不同肽刺激的mInsB_5-14特异性CTL。采用ELISpot试剂盒(达科为公司)检测上述经不同肽刺激的mInsB_5-14特异性CTL分泌IFN-γ的能力：调整CTL浓度至1.0×10⁶/ml，取100μl铺板，按实验分组加入终浓度为10μg/ml的相应肽，刺激36小时后去除细胞，再按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。 

结果如图6所示，APL组分泌IFN-γ的能力明显低于天然表位组(P＜0.01)，阴 性对照组分泌IFN-γ的能力与天然表位组相当，证实候选APL mInsB_5-14H6F是具有特异性负调作用的APL，在HLA-A*0201背景下能够显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平。 

(2)胞内因子染色法检测候选APL刺激天然表位mInsB_5-14特异性CTL分泌IFN-γ的能力 

选择16～20周龄雌性HLA-A*0201转基因NOD小鼠，用ONETOUCH Ultra血糖仪每周监测小鼠血糖值变化，取血糖值≤11.1mol/L的糖尿病前驱期小鼠进行实验。实验分为5组：APL组：mInsB_54-14H6F；天然表位组：mInsB_5-14；阳性对照组：刀豆素A(ConA)；阴性对照组：OVA；空白对照组：只加入浓度为10IU/ml的mIL-2维持而不加任何刺激物。将溶于完全弗氏佐剂(CFA)的mInsB_5-14经腹腔免疫小鼠，每7天免疫1次，共免疫2次，于末次免疫后的第3天，采用密度梯度离心法从免疫小鼠脾脏中分离SPMC，按前述方法进行培养，用mInsB_5-14刺激1个周期后，按实验分组加入负载相应肽的同源BMDC，于第2个周期的第3天，按实验分组加入终浓度为10μg/ml的相应肽或终浓度为5μg/ml的ConA，再加入高尔基阻断剂0.7μl，6小时后用胞内因子染色试剂盒(eBioscience公司)对CTL表面分子CD3、CD8以及胞内因子IFN-γ进行染色，按照试剂盒说明书操作，用流式细胞仪测定，检测经不同肽刺激的mInsB_5-14特异性CTL中分泌IFN-γ的T细胞(即CD3⁺CD8⁺IFN-γ⁺T细胞)所占的百分率。 

结果如图7所示，APL组分泌IFN-γ的能力明显低于天然表位组(P＜0.01)，阴性对照组分泌IFN-γ的能力与天然表位组相当，证实候选APL mInsB_5-14H6F是具有特异性负调作用的APL，在HLA-A*0201背景下能够显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平。 

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 

Claims (3)

1.胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体，其特征在于：由His-Leu-Cys-Gly-Pro-Phe-Leu-Val-Glu-Ala所示的氨基酸序列组成，是将鼠源胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14的第6位组氨酸替换为苯丙氨酸而得。

2.权利要求1所述胰岛素B链HLA-A*0201 限制性CTL表位改造肽配体的获得方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、利用计算机模拟技术建立胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位mInsB_5-14与HLA-A*0201分子的二元复合物结构模型，再进一步建立上述二元复合物与T细胞抗原受体的三元复合物结构模型，分析天然表位mInsB_5-14中潜在的T细胞抗原受体主要作用位点；

b、对步骤a所得天然表位mInsB_5-14中潜在的T细胞抗原受体主要作用位点进行单氨基酸残基突变，获得一系列天然表位mInsB_5-14的候选改造肽配体，对这些候选改造肽配体进行计算机分析，从中筛选出与HLA-A*0201分子亲和力高于天然表位、且空间构象和天然表位接近的候选改造肽配体；

c、合成步骤b筛选出的候选改造肽配体，通过细胞功能实验从中鉴定出在HLA-A*0201背景下能够显著下调天然表位mInsB_5-14特异性CTL应答水平的改造肽配体，即得权利要求1所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体。

3.权利要求1所述胰岛素B链HLA-A*0201限制性CTL表位改造肽配体在制备I型糖尿病治疗性负调肽疫苗中的应用。 

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