CN1721533A - Il2与抗gd2单链抗体融合蛋白及编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药,具体的说是一种新型的IL2-抗GD2单链抗体融合基因在大肠杆菌中的表达和应用;选择经过突变改变其稀有密码子的IL-2,与黑色素瘤单链抗体连接,形成有抗肿瘤作用的融合蛋白具有序列表SEQ ID No:4中氨基酸序列;该融合蛋白可激活体内免疫系统,特异性杀伤黑色素瘤、成细胞纤维瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞,有效防止了人体反复应用IL-2产生的多种副作用,融合蛋白较IL-2单独应用的生物学活性更佳,其杀伤肿瘤细胞的效果更好,副作用也小。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药,具体的说是一种新型的IL2-抗GD2单链抗体融合基因在大肠杆菌中的表达和应用。
背景技术
生物反应调节剂(biological response modifier,BRM)主要是指来自生物体自身的一些分子和免疫细胞,它们既是机体为内外环境刺激应答的效应成分,也是维持机体内外环境的重要因素。此类因子范围甚广,包括细胞因子、白细胞介素2(Il-2)、干扰素(INF)、肿瘤坏死因子(TNF)、单抗受体、LAK细胞、抗独特型抗体疫苗和分子疫苗等。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤肿瘤细胞,已取得了较好的疗效。但由于其输入体内后,仅有部分到达肿瘤靶部位,其杀伤作用得不到充分的发挥,且有毒副作用。将BRM与单抗偶联,通过单抗携带其达到靶部位而发挥杀伤肿瘤的作用,使这些分子的作用更强,且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等。
尽管IL-2有独立的抗肿瘤作用,但是给人体反复应用IL-2可产生多种副作用,轻者表现为发热、寒战、腹泻、体重减轻,重者表现为贫血、血小板减少、呼吸紧迫、休克和昏迷等。且经实验证明,单抗-IL-2交联物较IL-2单独应用的生物学活性更佳,其杀伤肿瘤细胞的效果更好,副作用也小。如将IL-2与单抗交联,其交联物还可以激活LAK细胞共同杀伤肿瘤细胞,效果更强。
本实验选择经过突变改变其稀有密码子的IL-2,与抗GD2单链抗体连接。形成有抗肿瘤作用的融合蛋白,为肿瘤的免疫治疗提供了新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种IL-2与抗GD2单链抗体融合基因及该融合蛋白的应用。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种IL2与抗GD2单链抗体融合蛋白,具有序列表SEQ ID No:4中氨基酸序列;其编码基因具有序列表SEQ ID NO:3中的核苷酸序列。
所述的编码基因通过PCR方法进行扩增,进行双特异性抗体的编码基因制备;
具体过程:①以人的经过突变改变其稀有密码子的IL-2基因(具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列)为模板,通过PCR进行扩增,引物引入连接肽序列;②以鼠源性抗GD2单链抗体基因(M-ScFv(源于HB8759)具有序列表SEQ ID No:2中碱基序列)为模板,利用PCR进行扩增,引物引入连接肽序列his tag序列;③第三轮PCR反应是利用重叠PCR技术,将两种单链抗体基因连接形成融合基因(具有序列表SEQ ID No:3中碱基序列);Linker连接肽基因序列编码氨基酸序列为Gly4Ser。
该融合蛋白可激活体内免疫系统,特异性杀伤黑色素瘤、成细胞纤维瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞。
本发明具有以下优点:
1.构建了IL2与抗GD2单链抗体的融合基因,为人工制备的新基因,属首次制得的融合基因。
2.应用本发明,可进一步提供直接用于生产IL2-M-ScFv融合蛋白的工程菌株。
3.有效防止了人体反复应用IL-2产生的发热,寒战,休克等多种副作用,融合蛋白能特异性聚集在肿瘤周围,引发机体的免疫反应,较IL-2单独应用的生物学活性更佳,其杀伤肿瘤细胞的效果更好,副作用也小。
4.因IL2突变了其稀有密码子,因此融合蛋白在大肠杆菌中有较好的表达。
5.融合蛋白的分子量为普通抗体的30%,是单抗与IL-2融合蛋白分子量的25%,能更好的渗透组织,到达肿瘤细胞处。
附图说明
图1为融合蛋白IL2-M-ScFv的测序图谱之一;
图2为融合蛋白IL2-M-ScFv的测序图谱之二;
图3为融合蛋白IL2-M-ScFv的测序图谱之三;
图4为IL2-M-ScFv融合基因在大肠杆菌中的表达电泳图:其中:2、3为本发明实例工程菌,A为诱导带;1为对照;4为中分子量蛋白标准。
具体实施方式
实施例1
一种经过突变改变其稀有密码子的IL2具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列(详见中国专利申请号:03111487.3)。
GCTCCGACTTCTAGCTCTACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTGGAACA
CCTGCTGCTGGATTTACAGATGATTCTGAACGGTATCAACAACTACAA
GAACCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAGTTTTACATGCCGAA
GAAAGCTACCGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCA
AACCTCTGGAGGAAGTTCTGAACCTGGCTCAGAGCAAAAACTTTCAC
CTGCGTCCGCGTGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAA
CTGAAAGGTTCTGAAACCACCTTCATGTGCGAATATGCTGATGAGACA
GCAACCATTGTAGAATTTCTGAACCGTTGGATTACCTTCTCTCAGTCTA
TCATCTCTACTCTGACT
(1)SEQ ID No:1的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度:399碱基对
*类型:核酸
*链型:双链
*拓扑结构:线性
(b)分子类型:cDNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:经过突变改变其稀有密码子的IL2基因
(2)经过突变改变其稀有密码子的IL2的制备
Primer For(IL2-M1):5’-TCA
CCA TGG CT CCG ACT TCT AGC TCT
ACC AA-3’NcoI酶切位点
Primer back(IL2-M2,含linker):5’-TGA ACC GCC TCC ACC AGT CAG
AGTAGA GAT-3’
扩增条件:以含经过突变改变其稀有密码子的IL2基因的质粒为模板,以Pfu酶进行扩增。
反应条件:95℃变性2分钟;95℃30秒,68℃30秒,72℃1分45秒,30个循环;72℃延伸10分钟。PCR产物回收:按上海华舜试剂盒使用说明书操作。
实施例2
一种鼠源性抗GD2单链抗体基因M-ScFv,来源于杂交瘤HB8759,具有序列表SEQ ID No:2中碱基序列。
CAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAG
GATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTA
CTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGA
TTGCAGAAATTAGATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGA
GTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAGGTA
GTGTCTACCTGCAAATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTT
ATTACTGTACCAGTTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTG
GGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAG
GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGAGCTCACCCAG
TCTCCAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACC
TGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAA
AAACCAGGGCAATCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGT
TACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGAT
TTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTAT
TTCTGTCAGCAATATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACC
AAGCTGGAAATCAAACGG
(1)SEQ ID No:2的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度:735碱基对
*类型:核酸
*链型:双链
*拓扑结构:线性
(b)分子类型:cDNA
(c)假设:否
(d)反义:否
(e)最初来源:鼠源性抗GD2单链抗体基因M-ScFv,源于杂交瘤细胞株HB8759(英文名称:hybridoma cell)
(2)抗GD2单链抗体基因M-ScFv的制备
以含有M-ScFv基因的质粒pCAS1为模板,以Pfu酶进行扩增。扩增引物和条件如下:
M-ScFv扩增引物:Primer For(IL2-M3,含linker):5’-GGT GGA GGC GGT TCA GCA GGT
GAAGCT GCAGGAGT-3’
Primer back(N1-M4):5’-GTC
AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT
HindIII酶切位点
TTC CAG CTT GGT GCC T-3’引入His tag序列,HindIII酶切位点及终止子TGA反应条件:95℃变性2分钟;95℃30秒,68℃30秒,72℃1分45秒,30个循环;72℃延伸10分钟。PCR产物回收:按上海华舜试剂盒使用说明书操作。
实施例3
IL2-M-ScFv融合基因具有序列表SEQ ID No:3的碱基序列:
ATGGCTCCGACTTCTAGCTCTACCAAGAAAACCCAGCTGCAGCTGGA
ACACCTGCTGCTGGATTTACAGATGATTCTGAACGGTATCAACAACTA
CAAGAACCCGAAACTGACCCGTATGCTGACCTTCAAGTTTTACATGCC
GAAGAAAGCTACCGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAAC
TCAAACCTCTGGAGGAAGTTCTGAACCTGGCTCAGAGCAAAAACTTT
CACCTGCGTCCGCGTGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTG
GAACTGAAAGGTTCTGAAACCACCTTCATGTGCGAATATGCTGATGAG
ACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACCGTTGGATTACCTTCTCTCAG
TCTATCATCTCTACTCTGACTGGTGGAGGCGGTTCACAGGTGAAGCTG
CAGGAGTCAGGAGGGGGCTTGGTGCAACCTGsAGGATCCATGAAACT
CTCCTGTGTTGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGG
GTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGATTGCAGAAATTAG
ATTGAAATCCAATAATTTTGCAAGATATTATGCGGAGTCTGTGAAAGG
GAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCC AAAGTAGTGTCTACCTGCA
AATGATCAACCTAAGAGCTGAAGATACTGGCATTTATTACTGTAGCAG
TTATGGTAACTACGTTGGGCACTATTTTGACCACTGGGGCCAAGGGAC
CACGGTCACCGTCTCCTCATGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCT
CTGGCGGTGGCGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAAAATTCA
TGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGT
CAGAATGTGGATACTAATGTAGCCTGGTATCAACAAAAACCAGGGCAA
TCTCCTGAACCACTGCTTTTCTCGGCATCCTACCGTTACACTGGAGTC
CCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACC
ATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAA
TATAACAGCTATCCTCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC
AAACGGCATCACCATCATCACCACTGAAAGCTT
(1)SEQ ID No:3的信息(参见序列表)
(A)序列特征
*长度:1179碱基对
*类型:核酸
*链型:双链
*拓扑结构:线性
(b)分子类型:CDNA
(C)假设:否
(d)反义:否
(2)将两个基因通过重叠PCR法用Linker连接。
Linker:翻译后为Gly4Ser
Primer For(IL2-M1):5’-TCA
CCA TGG CT CCG ACT TCT AGC TCTACC AA-3’
NcoI酶切位点
Primer back(N1-M4):5’-GTC
AAG CTT TCA GTG GTG ATG ATG ATG CCG TTT GAT
HindIII酶切位点
TTC CAG CTT GGT GCC T-3’
扩增条件:以N和M的PCR回收产物等摩尔混合作为模板,LATag酶
进行扩增。
反应条件:94℃变性5分钟;94℃30秒,54℃45秒,72℃1分45秒,5个循环;加入引物后,94℃30秒,63℃45秒,72℃1分45秒,30个循环;72℃延伸30分钟。PCR产物进行胶回收:按上海华舜试剂盒使用说明书。
提取质粒pMD18-Il2-M,NCoI、HindIII,双酶切,胶回收约1200bp目标片断,连接双酶切胶回收后的PSE380载体,16度过夜,pSE380-Il2-M转化JM109,菌体电泳选择有滞后质粒的菌株,提取质粒后双酶切及PCR验证。将验证正确的质粒转化JM109或BL21菌株,挑取转化子单菌落,接种于含Amp(100ug/ml)的LB液体培养基,37度过夜培养,次日1%转种量转于新鲜的含Amp的LB培养基中,当OD560达到0.6-0.8时用1.0mmol/L IPTG诱导表达。于37度诱导表达10小时。取1ml发酵液离心,菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤,离心后悬于1倍的上样缓冲液中,沸水浴煮10分钟,12000g离心两分钟。取10ul进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色,用紫外凝胶成像系统进行扫描检测蛋白的表达。
结果:在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带,诱导蛋白如图2所示。分子量约为43000dalton;紫外凝胶成像系统扫描显示此蛋白占菌体中蛋白的33%。
IL2与抗GD2
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>IL2与抗GD2单链抗体融合蛋白及编码基因和应用
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>399
<212>DNA
<213>Human interleukin-2
<220>
<221>old_sequence
<222>(1)..(399)
<223>
<400>1
gctccgactt ctagctctac caagaaaacc cagctgcagc tggaacacct gctgctggat 60
ttacagatga ttctgaacgg tatcaacaac tacaagaacc cgaaactgac ccgtatgctg 120
accttcaagt tttacatgcc gaagaaagct accgaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagttctg aacctggctc agagcaaaaa ctttcacctg 240
cgtccgcgtg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactgaa aggttctgaa 300
accaccttca tgtgcgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaaccgt 360
IL2与抗GD2
tggattacct tctctcagtc tatcatctct actctgact 399
<210>2
<211>735
<212>DNA
<213>杂交瘤细胞株(hybridoma cell)
<220>
<221>V_region
<222>(1)..(735)
<223>
<400>2
caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60
tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct 120
ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga 180
tattatgcgg agtczgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaggtagt 240
gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt 300
tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcctcaggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag 420
ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc 480
aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct 540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca 600
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg 660
gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag 720
czggaaatca aacgg 735
<210>3
<211>1179
IL2与抗GD2
<212>DNA
<213>融合基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1179)
<223>
<400>3
atg gct ccg act tct agc tct acc aag aaa acc cag ctg cag ctg gaa 48
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
cac ctg ctg ctg gat tta cag atg att ctg aac ggt atc aac aac tac 96
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
aag aac ccg aaa ctg acc cgt atg ctg acc ttc aag ttt tac atg ccg 144
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
aag aaa gct acc gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc 192
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
aaa cct ctg gag gaa gtt ctg aac ctg gct cag agc aaa aac ttt cac 240
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
ctg cgt ccg cgt gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa 288
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
ctg aaa ggt tct gaa acc acc ttc atg tgc gaa tat gct gat gag aca 336
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
gca acc att gta gaa ttt ctg aac cgt tgg att acc ttc tct cag tct 384
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser
115 120 125
atc atc tct act ctg act ggt gga ggc ggt tca cag gtg aag ctg cag 432
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln
130 135 140
gag tca gga ggg ggc ttg gtg caa cct gsa gga tcc atg aaa ctc tcc 480
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Xaa Gly Ser Met Lys Leu Ser
145 150 155 160
IL2与抗GD2
tgt gtt gtc tct gga ttc act ttc agt aat tac tgg atg aac tgg gtc 528
Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val
165 170 175
cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg att gca gaa att aga ttg 576
Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu
180 185 190
aaa tcc aat aat ttt gca aga tat tat gcg gag tct gtg aaa ggg agg 624
Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
195 200 205
ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt agt gtc tac ctg caa atg 672
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met
210 215 220
atc aac cta aga gct gaa gat act ggc att tat tac tgt agc agt tat 720
Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
225 230 235 240
ggt aac tac gtt ggg cac tat ttt gac cac tgg ggc caa ggg acc acg 768
Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
245 250 255
gtc acc gtc tcc tca tgt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc 816
Val Thr Val Ser Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
ggt ggc gga tct gac att gag ctc acc cag tct cca aaa ttc atg tcc 864
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser
275 280 285
aca tca gta gga gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat 912
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn
290 295 300
gtg gat act aat gta gcc tgg tat caa caa aaa cca ggg caa tct cct 960
Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
305 310 315 320
gaa cca ctg ctt ttc tcg gca tcc tac cgt tac act gga gtc cct gat 1008
Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
325 330 335
cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc 1056
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
aat gtg cag tct gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac 1104
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
355 360 365
agc tat cct ctg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg 1152
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
370 375 380
IL2与抗GD2
cat cac cat cat cac cac tga aag ctt 1179
His His His His His His Lys Leu
385 390
<210>4
<211>390
<212>PRT
<213>融合基因
<220>
<221>misc_feature
<222>(154)..(154)
<223>The ’Xaa’at location 154 stands for Gly,Or Ala.
<400>4
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Ash Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Set Gln Ser
115 120 125
IL2与抗GD2
Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln
130 135 140
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Xaa Gly Ser Met Lys Leu Ser
145 150 155 160
Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val
165 170 175
Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ile Arg Leu
180 185 190
Lys Ser Asn Asn Phe Ala Arg Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met
210 215 220
Ile Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr
225 230 235 240
Gly Asn Tyr Val Gly His Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Thr
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser
275 280 285
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn
290 295 300
Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
305 310 315 320
Glu Pro Leu Leu Phe Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
325 330 335
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
IL2与抗GD2
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn
355 360 365
Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
370 375 380
His His His His His His
385 390
Claims (4)
1.一种IL2与抗GD2单链抗体融合蛋白,其特征在于:具有序列表SEQ ID No:4中氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述IL2与抗GD2单链抗体融合蛋白的编码基因,其特征在于:具有序列表SEQ ID NO:3中的核苷酸序列。
3.按照权利要求2所述的编码基因,其特征在于:通过PCR方法进行扩增,进行双特异性抗体的编码基因制备;
具体过程:①以人的经过突变改变其稀有密码子的IL-2基因为模板,通过PCR进行扩增,引物引入连接肽序列;②以鼠源性抗GD2单链抗体基因为模板,利用PCR进行扩增,引物引入连接肽序列his tag序列;③第三轮PCR反应是利用重叠PCR技术,将两种单链抗体基因连接形成融合基因;连接肽基因序列编码氨基酸序列为Gly4Ser。
4.一种权利要求1所述IL2与抗GD2单链抗体融合蛋白的应用,其特征在于:该融合蛋白可用于制备特异性杀伤肿瘤细胞的药物。
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Cited By (3)
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CN106349393A (zh) * | 2015-12-21 | 2017-01-25 | 合肥立方制药股份有限公司 | 一种增强抗体药物稳定性的结构 |
CN106349393B (zh) * | 2015-12-21 | 2020-10-30 | 合肥立方制药股份有限公司 | 一种增强抗体药物稳定性的结构 |
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