ES2837755T3

ES2837755T3 - Anticuerpos anti-PD-1

Info

Publication number: ES2837755T3
Application number: ES17772258T
Authority: ES
Inventors: Daniel E H Afar; Fiona A Harding; Josue Samayoa
Original assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Current assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: IL265179B1; KR20190045938A; LT3512547T; US20180072810A1; CN109789205B; RS61204B1; JP2019533989A; CO2019003154A2; PL3512547T3; EP3512547A1; US20180148513A1; US20200040098A1; DOP2019000056A; NZ751202A; SG10201914120XA; MX2019002946A; CA3035932A1; HRP20201993T1; SI3512547T1; RU2019110835A3

Abstract

Un anticuerpo anti-PD-1 humano, en donde el anticuerpo comprende (i) una cadena VH que comprende tres CDR; y (ii) una cadena VL que comprende tres CDR, en donde: la CDR 1 de la VH es GYTFTHYGMN (SEQ ID NO: 11); la CDR 2 de la VH es WVNTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 12); la CDR 3 de la VH es EGEGLGFGD (SEQ ID NO: 13); la CDR 1 de la VL es RSSQSIVHSHGDTYLE (SEQ ID NO: 14); la CDR 2 de la VL es KVSNRFS (SEQ ID NO: 15); y la CDR 3 de la VL es FQGSHIPVT (SEQ ID NO: 16).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-1

1. Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C § 119 (e) de la solicitud provisional de los Estados Unidos con núm. 62/ 394,314, presentada el 14 de septiembre de 2016, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción en su totalidad como referencia.

2. Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora por este medio como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 10 de agosto de 2017, se denomina 381493-327WO_SL.txt y tiene un tamaño de 33195 bytes.

3. Campo técnico

La presente solicitud se refiere a, entre otras cosas, novedosos anticuerpos anti-PD-1, composiciones que incluyen los nuevos anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y a los métodos de fabricación y uso de los mismos. La descripción técnica detallada que se expone más abajo puede, en algunos aspectos, ir más allá de la descripción de la invención per se, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no pretenden definir la invención como tal (que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien colocarla en un contexto técnico más amplio. En consecuencia, se apreciará que los términos "modalidades”, "aspectos", "tema" reflejan detalles específicos de la descripción, pero en la medida en que se refieren a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no se pretenden definir como parte del tema de la invención lo que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

4. Antecedentes

Las terapias contra el cáncer comprenden una amplia gama de enfoques terapéuticos, lo que incluye cirugía, radiación y quimioterapia. Si bien los varios enfoques permiten que el profesional médico disponga de una amplia selección de tratamientos para tratar el cáncer, las terapias existentes presentan una serie de desventajas, tales como una falta de selectividad para dirigirse a las células cancerosas por sobre las células normales y sanas, y el desarrollo de resistencia por el cáncer al tratamiento.

Los enfoques recientes basados en terapias dirigidas, que interfieren con los procesos celulares de las células cancerosas preferentemente por sobre las células normales, han llevado a regímenes quimioterapéuticos con menos efectos secundarios en comparación con las terapias no dirigidas, tales como el tratamiento con radiación.

La inmunoterapia contra el cáncer se ha revelado como un enfoque terapéutico prometedor para complementar los estándares de atención existentes. Ver, por ejemplo, Miller y otros, Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Tales enfoques de inmunoterapia incluyen el desarrollo de anticuerpos usados para modular el sistema inmunitario para destruir las células cancerosas.

Por ejemplo, la interacción de PD-1, un receptor de superficie celular de tipo I, con cualquiera de sus dos ligandos, PD-L1 o PD-L2, da como resultado una señal de punto de regulación negativa dominante que limita la activación celular subsecuente controlada por el receptor del antígeno. Los ligandos de PD-1 se expresan diferencialmente en varios tejidos y tipos de células, que incluyen las células presentadoras de antígenos del sistema inmunológico, y se regulan al alza en muchos tipos de células tumorales. La regulación al alza del PD-L1 dentro del microambiente tumoral es un mecanismo propuesto de los tumores para subvertir las respuestas inmunitarias protectoras antitumorales por parte del huésped. Los anticuerpos dirigidos a PD-1 que bloquean la interacción del receptor con cualquiera de sus ligandos dan como resultado la inhibición de la señalización negativa. Se ha demostrado que la inhibición in vitro de la señal del punto de regulación mediada por PD-1 da como resultado una activación prolongada de células T específicas de antígeno. Se ha demostrado que el bloqueo de PD-1 in vivo potencia las respuestas inmunitarias antitumorales tanto en modelos tumorales singénicos de ratón como en ensayos clínicos en humanos.

Las respuestas inmunitarias antitumorales en pacientes con tumores sólidos se han potenciado mediante el tratamiento anti-PD-1. Existen dos anticuerpos monoclonales antagonistas anti-PD-1 aprobados y comercializados: nivolumab (OPDIVO®) y pembrolizumab (KEYTRUDA®), con aprobaciones en los Estados Unidos y la Unión Europea para tratar enfermedades tales como el melanoma no extirpable o metastásico y el cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico. El tratamiento de pacientes con estos agentes ha dado como resultado respuestas antitumorales medidas por la mejora en ya sea la supervivencia libre de progresión y/o la supervivencia general.

El reciente fracaso de OPDIVO® en retrasar la progresión del cáncer de pulmón avanzado en una población de pacientes sin tratamiento previo en un ensayo clínico que comparaba OPDIVO® con la quimioterapia convencional destaca la necesidad de enfoques alternativos y tratamientos contra el cáncer adicionales para complementar los estándares de atención terapéuticos existentes.

5. Resumen

La presente descripción proporciona anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente a PD-1. Se proporcionan en la Descripción Detallada más abajo las secuencias de aminoácidos de las CDR ilustrativas, así como también la secuencia de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de las cadenas pesadas y ligeras de anti-PD-1 ilustrativos. Los anticuerpos proporcionados en la presente descripción interfieren con la interacción del receptor PD-1 con cualquiera de sus ligandos (PD-L1, SEQ iD NO: 3; PD-L2, SEQ ID NO: 4), lo que da como resultado la inhibición de la señalización negativa y la regulación al alza de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Los anticuerpos anti-PD-1 pueden incluir modificaciones y/o mutaciones que alteran las propiedades de los anticuerpos, tales como el aumento de la vida media, el aumento o disminución de la citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC), etcétera, como se conoce en la técnica.

Se proporcionan en la presente descripción ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos anti-PD-1 de la presente descripción, al igual que los vectores que comprenden los ácidos nucleicos. Adicionalmente, se proporcionan en la presente descripción células huésped procariotas y eucariotas transformadas con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-PD-1 descrito, así como también células huésped eucariotas (tales como de mamíferos) modificadas por ingeniería genética para expresar las secuencias de nucleótidos. Además, se proporcionan métodos para producir los anticuerpos, mediante el cultivo de células huésped y la recuperación de los anticuerpos, y se analizan posteriormente en la Descripción Detallada más abajo.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona composiciones que incluyen los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción. Las composiciones generalmente comprenden uno o más anticuerpos anti-PD-1 como se describe en la presente descripción, y/o sales de los mismos, y uno o más excipientes, portadores o diluyentes.

La presente descripción proporciona los métodos para tratar sujetos, tales como sujetos humanos, diagnosticados con un tumor sólido o una neoplasia maligna de la sangre con un anticuerpo anti-PD-1. El método implica generalmente administrar al sujeto una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en la presente descripción efectiva para proporcionar un beneficio terapéutico. El sujeto puede diagnosticarse con cualquiera de una serie de tumores sólidos o neoplasias malignas de la sangre que pueden ser diagnosticados recientemente, recurrentes o recurrentes y refractarios. Un anticuerpo anti-PD-1 se administra típicamente como una infusión intravenosa dos veces por semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, o una vez cada ocho semanas.

Los anticuerpos anti-PD-1 pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales (monoterapia) complementario a, o con, otros agentes terapéuticos típicamente, pero no necesariamente, los usados para el tratamiento de un tumor sólido o una neoplasia maligna de la sangre. Los agentes terapéuticos se usarán, típicamente, a su dosis, vía de administración y frecuencia de administración aprobadas, pero pueden usarse a dosis más bajas.

Los anti-PD-1 pueden administrarse a través de una variedad de vías o modos de administración, que incluyen, pero sin limitarse a, la infusión y/o inyección intravenosa, inyección intratumoral e inyección subcutánea. La cantidad administrada dependerá de la vía de administración, el programa de dosis, el tipo de cáncer que se trata, la etapa del cáncer que se trata y otros parámetros tales como la edad y el peso del paciente, como se conoce bien en la técnica. Los programas de dosis ilustrativos específicos que se espera proporcionen un beneficio terapéutico se proporcionan en la Descripción Detallada.

6. Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestran las secuencias de aminoácidos del PD-1 humano (SEQ ID NO: 1), PD-1 murino (SEQ ID NO: 2), PD-L1 humano (SEQ ID NO: 3) y PD-L2 humano (SEQ ID NO: 4). La figura 1A representa las secuencias del PD-1 humano y murino; la figura 1B representa las secuencias del PD-L1 y del PD-L2 humanos. La figura 2 proporciona secuencias de aminoácidos de las regiones V^hy V^len anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos de la descripción.

Las figuras 3A y 3C muestran los efectos de las condiciones oxidativas y de temperatura variable sobre el anticuerpo humanizado ilustrativo Hu12A11.2b1 y sus mutaciones puntuales en Kabat 99 en la CDR-H3. La figura 3A representa la unión al PD-1 en células Jurkat de Hu12A11.2b1 almacenadas a -80, 5, 25 o 40 °C durante 30 días o después de haber sido sometidas a condiciones oxidativas (peróxido de hidrógeno al 1%, "HP al 1%"; o Hidroperóxido de terc-butilo al 1%, "TBHP al 1%"); la figura 3B representa la unión de anticuerpos anti-PD-1 Hu12A11.2b1, Hu12A11.2b2, Hu12A11.2b3 y Hu12A11.2b4; la figura 3C representa la unión de Hu12A11.2b4 a PD-1 en células Jurkat después de la incubación a -80, 5, 25 o 40 °C durante 30 días.

Las figuras 4A y 4B muestran la actividad biológica de nivolumab y Hu12A11.2b4 en la respuesta leucocitaria mixta (MLR) y los ensayos de recuperación del antígeno del toxoide tetánico. La figura 4A muestra una potenciación en los niveles de IL-2 o de interferón-gamma (IFN-y) después del tratamiento con 10 pg/ml de nivolumab, Hu12A11.2b4, o control de isotipo en cultivos de leucocitos mixtos. La figura 4B muestra una respuesta dependiente de la dosis de nivolumab, Hu12A11.2b4, o control de isotipo en la potenciación de IFN-^yen el ensayo de respuesta al toxoide tetánico.

7. Descripción detallada

La presente descripción se refiere a los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que se unen específicamente a PD-1, las composiciones que comprenden los anticuerpos, los polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-PD-1, las células huésped capaces de producir los anticuerpos, los métodos y composiciones útiles para fabricar los anticuerpos y los fragmentos de unión, y varios métodos para usar los mismos.

Como apreciarán los técnicos con experiencia, los anticuerpos son de naturaleza "modular". A lo largo de la descripción, se describen varias modalidades específicas de los varios "módulos" que componen los anticuerpos. Como ejemplos específicos no limitantes, se describen varias modalidades específicas de las CDR de V^h, las cadenas Vh, las CDR de Vl y las cadenas Vl. Se pretende que todas las modalidades específicas puedan combinarse entre sí como si cada combinación específica se describiera explícitamente individualmente.

7.1. Abreviaturas

Los anticuerpos, los fragmentos de unión, y polinucleótidos descritos en la presente descripción se describen, en muchas modalidades, por medio de sus respectivas secuencias de polipéptidos o polinucleótidos. A menos que se indique de cualquier otra manera, las secuencias de polipéptidos se proporcionan en orientación N^-C; las secuencias de polinucleótidos en orientación 5 '^3 '. Para las secuencias de polipéptidos, pueden usarse las abreviaturas convencionales de tres o una letra para los aminoácidos codificados genéticamente, como se indica en la TABLA 1, más abajo.

Ciertas secuencias se definen mediante fórmulas estructurales que especifican residuos de aminoácidos que pertenecen a ciertas clases (por ejemplo, alifáticos, hidrofóbicos, etc.). Las varias clases a las que pertenecen los aminoácidos codificados genéticamente como se usan en la presente descripción se indican en la TABLA 2, más abajo. Algunos aminoácidos pueden pertenecer a más de una clase. La cisteína, que contiene un grupo sulfhidrilo, y la prolina, que está restringida conformacionalmente, no son clases asignadas.

Las abreviaturas usadas para los varios anticuerpos ilustrativos descritos en la presente descripción se proporcionan en la TABLA 3, más abajo:

7.2. Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera en la presente descripción, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica.

7.3. Anticuerpos Anti-PD-1 y Fragmentos de Unión

En un aspecto, la descripción se refiere a los anticuerpos y/o los fragmentos de unión de los mismos que se unen específicamente al receptor de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) (también conocido como PDCD1, CD279, PD1, SLEB2 o SLE1).

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" (Ac) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno en particular, aquí, PD-1. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción se unen al PD-1 humano y de esta manera modulan el sistema inmunitario. La respuesta del sistema inmunitario resultante es citotóxica para las células tumorales. Los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Como se conoce en la técnica, la posición de los aminoácidos/límite que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, en dependencia del contexto y las varias definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posiciones hipervariables híbridas en el sentido de que estas posiciones pueden considerarse que están dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios, a la vez que se consideran fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también pueden encontrarse en regiones hipervariables extendidas. La descripción proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, en gran parte mediante la adopción de una configuración de lámina p, conectada por tres CDR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión diana de los anticuerpos. Ver Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Como se usa en la presente descripción, la numeración de los residuos de aminoácidos de las inmunoglobulinas se realiza de acuerdo con el sistema de numeración de los residuos de aminoácidos de las inmunoglobulinas de Kabat y otros a menos que se indique de cualquier otra manera.

Los anticuerpos de la descripción pueden ser por naturaleza policlonales, monoclonales, genéticamente modificados y/o modificados de cualquier otra manera, que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de una sola cadena, etc. En varias modalidades, los anticuerpos comprenden todo o una porción de una región constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la región constante es un isotipo seleccionado entre: IgA (por ejemplo, IgAi o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3 o IgG4) e IgM. En modalidades específicas, los anticuerpos descritos en la presente descripción comprenden una IgGi. En otras modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 comprenden una IgG2. En otras modalidades más, los anticuerpos anti-PD-1 comprenden una IgG4. Como se usa en la presente descripción, la "región constante" de un anticuerpo incluye la región constante natural, los alotipos o las variantes naturales, tales como D356E y L358M, o A431G en la IgGi humana. Ver, por ejemplo, Jefferis y Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (julio-agosto de 2009).

La región constante ligera de un anticuerpo anti-PD-1 puede ser una región ligera kappa (^k) o una región lambda (A). Una región ligera A puede ser de cualquiera de los subtipos conocidos, por ejemplo, Ai, A2, A3 o A4. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 comprende una región ligera kappa (^k).

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción no se limita a los anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridomas. Un anticuerpo monoclonal se deriva de un solo clon, que incluye cualquier clon de eucariota, de procariota o de fago, por cualquier medio disponible o conocido en la técnica. Los anticuerpos monoclonales útiles con la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen el uso de tecnologías de hibridomas, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. En muchos usos de la presente descripción, lo que incluye el uso in vivo de los anticuerpos anti-PD-1 en humanos, pueden usarse anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos adecuadamente.

El término anticuerpo "quimérico", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o de ratón, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, típicamente elegidas de una plantilla de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi y otros, 1986, BioTechniques 4: 214-221; Gillies y otros, 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; las patentes de los Estados Unidos con núms. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397.

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas que contienen secuencias mínimas derivadas de la inmunoglobulina no humana. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos, o al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Riechmann y otros, 1988, Nature 332: 323-7; las patentes de los Estados Unidos con núms: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; y 6,180,370 de Queen y otros; el documento EP239400; la publicación PCT WO 91/09967; la patente de los Estados Unidos con núm. 5,225,539; el documento EP592106; el documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka y otros, 1994, Prot. Eng. 7: 805-814; Roguska y otros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; y la patente de los Estados Unidos con núm. 5,565,332.

Los "anticuerpos humanos" incluyen los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen los anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulina humana o a partir de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, lo que incluye los métodos de presentación en fagos que usan bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver las patentes de los Estados Unidos con núms. 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante el uso de ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Ver, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; Wo 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; las patentes de los Estados Unidos con núms. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; y 5,939,598. Además, empresas tales como LakePharma, Inc. (Belmont, CA) o Creative BioLabs (Shirley, NY) pueden comprometerse en proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado mediante el uso de una tecnología similar a la descrita anteriormente. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse mediante el uso de una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (ver, Jaspers y otros, 1988, Biotecnología 12: 899-903).

Los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción incluyen las moléculas de anticuerpo de longitud completa (intactas). En algunas modalidades, la presente descripción también incluye los fragmentos de unión anti-PD-1 que son capaces de unirse específicamente a PD-1. Los ejemplos de fragmentos de unión de los anticuerpos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, a Fab, Fab', F(ab% los fragmentos Fv, los fragmentos Fv de una sola cadena y los fragmentos de un solo dominio.

Un fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHi) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, lo que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen por escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de la bisagra del producto de digestión con pepsina de F(ab')2. Los expertos en la técnica conocen los acoplamientos químicos adicionales de los fragmentos de los anticuerpos. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación de los animales y pueden tener una menor unión no específica a tejidos que un anticuerpo intacto (ver, por ejemplo, Wahl y otros, 1983 J. Nucl. Med. 24: 316).

Un fragmento "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a la diana completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera, en una asociación estrecha y no covalente (dímero V^h-V^l). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a la diana en la superficie del dímero Vh-Vl. A menudo, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión a la diana. Sin embargo, en algunos casos, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para una diana) puede tener la capacidad de reconocer y unirse a la diana, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Los fragmentos de unión del anticuerpo "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a la diana.

Los "anticuerpos de dominio único" se componen de dominios únicos V^ho V^lque exhiben suficiente afinidad por el PD-1. En una modalidad específica, el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo camelizado (ver, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).

Los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción incluyen anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos derivatizados se modifican típicamente por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular o a otra proteína. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, lo que incluye, pero no se limita a, la escisión química específica, la acetilación, la formilación, la síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología ambrx (ver, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13 (10): 1011-2).

Los anticuerpos anti-PD-1 o los fragmentos de unión pueden ser anticuerpos o fragmentos cuyas secuencias se han modificado para alterar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 puede modificarse para reducir al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con relación al anticuerpo no modificado, por ejemplo, la unión reducida a uno o más de los receptores de Fc (FcyR) tales como FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y/o FcyRIIIB. L^{a unión al}FcyR puede reducirse mediante la mutación del segmento de la región constante de la inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones con el F^cyR (ver, por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; y Lund y otros, 1991, J. Immunol. 147: 2657-2662). La reducción en la capacidad de unión del anticuerpo al FcyR puede reducir, además, otras funciones efectoras que dependen de las interacciones con el FcyR, tales como la opsonización, la fagocitosis y la citotoxicidad celular dependiente de antígeno ("ADCC").

El anticuerpo anti-PD-1 o el fragmento de unión descrito en la presente descripción incluye los anticuerpos que se han modificado para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con relación a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, para potenciar las interacciones con el F^cyR (ver, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. 2006/0134709). Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 de la descripción puede tener una región constante que se une al F^cyRI, F^cyRIIA, F^cyRIIB, F^cyRIIIA y/o al F^cyRIIIB con mayor afinidad que la correspondiente región constante de tipo salvaje.

Por lo tanto, los anticuerpos de la descripción pueden tener alteraciones en la actividad biológica que dan como resultado un aumento o disminución de la opsonización, la fagocitosis, o la ADCC. Dichas alteraciones se conocen en la técnica. Por ejemplo, las modificaciones en los anticuerpos que reducen la actividad de la ADCC se describen en la patente de los Estados Unidos con núm. 5,834,597. Una variante ilustrativa de la reducción de la ADCC corresponde al "mutante 3" (también conocido como "M3", que se muestra en la Figura 4 de la patente de los Estados Unidos con núm. 5,834,597) en la que los residuos 234 y 237 (mediante el uso de la numeración EU) se sustituyen con alaninas. Puede usarse una variación del mutante 3 (también conocido como "M3") en varios isotipos de anticuerpos, por ejemplo, en IgG2.

Las sustituciones adicionales que pueden modificar la unión al FcyR y/o la función efectora de la ADCC de un anticuerpo anti-PD-1, incluyen la sustitución K322A o la doble sustitución L234A y L235A en la región Fc. Ver, por ejemplo, Hezareh y otros, J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción tienen niveles bajos de fucosa o carecen de ella. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con una mayor actividad de ADCC, especialmente a bajas dosis de anticuerpos. Ver Shields y otros, 2002, J. Biol. Chem 277: 26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J. Biol. Chem 278: 3466-73. Los métodos para preparar anticuerpos con menos fucosa incluyen el crecimiento en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las células YB2/0 expresan bajos niveles de ARNm de FUT8, que codifica la a-1,6-fucosiltransferasa, una enzima necesaria para la fucosilación de polipéptidos.

Los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción pueden comprender dominios CH2 modificados (o variantes) o dominios Fc completos que incluyen sustituciones de aminoácidos que aumentan la unión al F^cyRIIB y/o reducen la unión al F^cyRIIIA, en comparación con la unión de una región CH2 o Fc de tipo salvaje correspondiente. Los dominios de variantes de CH2 o de variantes de Fc se han descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm.

2014/0377253. Un dominio de variante de CH2 o de variante de Fc incluye típicamente una o más sustituciones en la posición 263, la posición 266, la posición 273 y la posición 305, en donde la numeración de los residuos en el dominio Fc es la del índice de EU como en Kabat. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 comprenden una o más sustituciones seleccionadas de V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K y V305W, con relación al dominio CH2 de tipo salvaje. En modalidades específicas, la una o más sustituciones del dominio CH2 se seleccionan de V263L, V273E, V273F, V273M, V273S y V273Y, con relación al dominio CH2 de una IgGi humana. Por ejemplo, la una o más sustituciones de un dominio CH2 de una IgGi puede ser V273E. En otra modalidad específica, el anticuerpo anti-PD-1 de la descripción comprende una variante de la región bisagra de la IgGi que comprende la sustitución de aminoácidos V263L.

Otros ejemplos de dominios de variantes de CH2 o de variantes de Fc que pueden proporcionar un aumento de la unión al F^cyRIIB y/o una reducción de la unión al F^cyRIIIA, en comparación con la unión de una región CH2 o Fc de tipo salvaje correspondiente, incluyen los encontrados en Vonderheide, y otros, Clin. Cancer Res., 19 (5), 1035-1043 (2013), tales como S267E o S267E/L328F en la IgGi humana.

Los anticuerpos anti-PD-1 o los fragmentos de unión que comprenden una región constante de la IgG4 humana pueden comprender la mutación S228P, que se ha informado que previene el intercambio de brazos Fab. Ver, por ejemplo, Silva, JP et al. Journal of Biological Chemistry, 290 (9), 5462-5469 (2015).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 o los fragmentos de unión incluyen modificaciones que aumentan o disminuyen sus afinidades de unión al receptor de Fc fetal, FcRn, por ejemplo, mediante la mutación del segmento de la región constante de la inmunoglobulina en regiones particulares involucradas en las interacciones con el FcRn (ver, por ejemplo, el documento WO 2005/123780). En modalidades particulares, un anticuerpo anti-PD-1 de la clase IgG se muta de manera que al menos uno de los residuos de aminoácidos 250, 314 y 428 de la región constante de la cadena pesada se sustituye solo, o en cualquiera de sus combinaciones, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428, donde las posiciones 250 y 428 son una combinación específica. Para la posición 250, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea treonina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 314, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea leucina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 428, los residuos de aminoácidos sustituyentes pueden ser cualquier resto de aminoácidos que no sea metionina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Una sustitución ilustrativa conocida para modificar la función efectora del Fc es la sustitución M428L del Fc, que puede producirse en combinación con la sustitución T250Q del Fc. Se identifican combinaciones específicas adicionales de sustituciones de aminoácidos adecuadas en la Tabla 1 de la patente de los Estados Unidos con núm.

7,217,797. Tales mutaciones aumentan la unión al FcRn, lo cual protege al anticuerpo de la degradación y aumenta su vida media.

Un anticuerpo anti-DP-1 puede tener uno o más aminoácidos insertados en una o más de sus CDR, por ejemplo, como se describe en Jung y Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki y otros, 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5): 481-9. Epub 17 de agosto de 2004; y la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm.

2007/0280931.

Los anticuerpos anti-PD-1 con alta afinidad por el PD-1 humano pueden ser convenientes para sus usos terapéuticos y de diagnóstico. En consecuencia, la presente descripción contempla los anticuerpos que tienen una alta afinidad de unión por el PD-1 humano. En modalidades específicas, los anticuerpos anti-PD-1 se unen al PD-1 humano con una afinidad de al menos aproximadamente 100 nM, pero pueden exhibir mayor afinidad, por ejemplo, de al menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, o incluso mayor. En algunas modalidades, los anticuerpos se unen al PD-1 humano con una afinidad en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, o una afinidad que varía entre cualquiera de los valores anteriores.

La afinidad de los anticuerpos anti-PD-1 por el PD-1 humano puede determinarse mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica o descritas en la presente descripción, tales como, por ejemplo, pero no a modo de limitación, el ELISA, la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la resonancia de plasmones de superficie o el ensayo de polarización de la fluorescencia.

Los anticuerpos anti-PD-1 comprenden generalmente una cadena pesada que comprende una región variable (Vh) que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") denominadas en la presente descripción (en orden N^-C) CDR#1 de Vh, CDR#2 de Vh y CDR#3 de Vh, y una cadena ligera que comprende una región variable (Vl) que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad denominadas en la presente descripción (en orden N^-C) CDR#1 de Vl, CDR#2 de Vl y c Dr#3 de Vl. Se proporcionan en la presente descripción las secuencias de aminoácidos de las CDR ilustrativas, así como también la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL de las cadenas pesadas y ligeras de los anti-PD-1 ilustrativos. Las modalidades específicas de los anticuerpos anti-PD-1 incluyen estas secuencias ilustrativas de las CDR y/o VH y/o VL, así como también los anticuerpos que compiten por la unión al PD-1 humano con dichos anticuerpos.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 es adecuado para la administración a los humanos. En una modalidad específica, el anticuerpo anti-PD-1 se humaniza. En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos de las CDR de un anticuerpo anti-PD-1 se seleccionan de las siguientes secuencias:

Se describen en la presente descripción modalidades ilustrativas específicas de anticuerpos anti-PD-1 con las CDR anteriores. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 tiene las CDR de SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 y 16. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 tiene las CDR de SEQ ID NOS: 11, 12, 21, 14, 15 y 16. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 tiene las CDR de SEQ ID NOS: 11, 12, 22, 14, 15 y 16. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 tiene las CDR de SEQ ID NOS: 11, 12, 23, 14, 15 y 16.

En algunas modalidades, cada CDR de un anticuerpo anti-PD-1, independientemente de los demás, se selecciona para que corresponda en secuencia a la respectiva CDR de un anticuerpo proporcionado en la TABLA 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 es una IgG, y tiene una V^hy una V^lcorrespondientes en secuencia con la V^hy la Vl de un anticuerpo proporcionado en la TABLA 3.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena VH correspondiente en secuencia al SEQ ID NO: 31; y una cadena V ^lcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 41. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena Vh correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 32; y una cadena Vl correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena Vh correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 33; y una cadena Vl correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena V^hcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 34; y una cadena V^lcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena VH correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 35; y una cadena Vl correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una cadena V^hcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 36; y una cadena V^lcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42.

Un experto en la técnica entenderá que ciertas mutaciones de una secuencia V^ho V^len un anticuerpo anti-PD-1 descrito en la presente descripción proporcionan anticuerpos anti-PD-1 dentro del alcance de la descripción. Las mutaciones pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos de una secuencia Vh o Vl como se describe en la presente descripción, a la vez que se mantiene una actividad anti-PD-1 significativa. En consecuencia, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia VH que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia V^hde cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3. Un anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia Vh que tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con la secuencia V^hde cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia Vh que tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con la secuencia Vh de cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia VL que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia Vl de cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3. Un anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia V^lque tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con la secuencia V^lde cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 puede comprender una secuencia V^lque tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con la secuencia Vl de cualquiera de los anticuerpos que se muestran en la TABLA 3.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con:

EIOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTHYGMm\^OAPGOGLEW VGWVNTYTGEPT

YADDFKGRLTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGEGLGFGDWGOGTTVTVSSAS7

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKD YFPEP VT VSWNSGALTSG YHTFPA VLQSSGL YSLSSYVW

PSSSLG TQTYK. 'Nl’NHKPSNTKVDKKVEPKSÍ E)KTHTL PPL TAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMIS R I FE Vl V VVVD VSHEDPE VKFNWY VDG VE VHNA K'l KPREEQ YNSTYR VVSVLIVLHQD WLNGKE Y

KCKINNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEVITKNQ VSLTCL VKGFYPSDIA VE WESNG

QPENNYKTTPPVimDGSFFiySKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSI.Sl.SPGK (SEQ IDNO:51).

una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con:

DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSIVFISHGDTYLEWYLOKPGOSPOLLryKVSNRFSGVI

DRFSGSGSGTDFTLKIS R V E A E D V GV Y Y C F O G S HIP VT FG O GTK L EIK R 77 ’AA PSVF1FPPSDEG

LKSGTASWVLLNNFYPREAKVQWKmNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK ÍTACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:61),

en donde los aminoácidos subrayados representan las CDR y los aminoácidos en cursiva representan las regiones constantes.

Pueden producirse modificaciones postraduccionales a las secuencias de un anticuerpo anti-PD-1, tal como la escisión de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o más) residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo.

EIOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTHYGMNWVROAPGOGLEWVGWVNTYTGEPT

YADDFKGRLTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGEGLGFGDWGOGTTVTVSS,4,S7

KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPITVSWNSGALTSGWTFPAVLQSSGLYSLSSW'TI'

PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLM1S

R TP E ITC nTD VSHEDPEVKFNWYVDG VEIUNAKTKPREEQYNSTYRITSVLTVLHQD WLNGKEY

KCKY'SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNl'FSCSl'MHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO 52);

una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con:

DVVMTOSPLSLPVTPGEPASISCRSSOSIVHSHGDTYLEWYLOKPGOSPOLLIYKVSNRFSGVP

DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF0GSHIPVTFG0GTKLEIKR7T^7SI/F/FmSZ)E,0

LKSGTASIYCLLNNFYPREAKVQWKI’DNALQSGNSQESITEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK

VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. (SEQ ID NO:61),

Las modificaciones postraduccionales adicionales de un anticuerpo anti-PD-1 pueden incluir la glucosilación. Los complejos biantenarios comunes pueden componerse de una estructura central que tiene dos N-acetilglucosamina (GlcNAc), tres manosas y dos residuos GlcNAc que se unen por (3-12 a la a-6 manosa y a la a-3 manosa para formar dos antenas. Pueden unirse al núcleo una o más fucosas (Fuc), galactosas (Gal), glucanos con alto contenido de manosa Man-5 o Man-9, GlcNAc bisecante y ácido siálico, lo que incluye residuos de ácido N-acetilneuramínico (NANA) o ácido N-glicolilneuramínico (NGN^a). Las glicoformas ligadas a N pueden incluir la G0 (proteína que tiene una estructura de glucosilación biantenaria central), la G0F (G0 fucosilada), la GlcNAc G0F, la Gl (proteína que tiene una estructura de glucosilación central con un residuo de galactosa), la GIF (G1 fucosilada), la G2 (proteína que tiene una estructura de glucosilación central con dos residuos de galactosa) y/o la G2F (G2 fucosilada). En algunas modalidades, un anticuerpo anti-PD-1 tiene una glucano G0F.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 compiten por la unión al PD-1 humano en ensayos in vitro con un anticuerpo de referencia. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 compiten por unirse al PD-1 humano en células que expresan PD-1 humano. El anticuerpo de referencia puede ser cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo proporcionado en la TABLA 3. En modalidades específicas, el anticuerpo de referencia se selecciona del anticuerpo de ratón 12A11 ("Mu12A11"). En algunas modalidades, el anticuerpo de referencia es una versión humanizada del Mu12A11. En una modalidad específica, el anticuerpo de referencia es el anticuerpo humanizado 12A11.1b ("Hu12A11.1b") o el anticuerpo humanizado 12A11.2b M99L ("Hu12A11.2b4").

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 antagonizan, por ejemplo, inhiben, el PD-1 humano (SEQ ID NO: 1). El antagonismo del receptor PD-1 puede ocurrir por una serie de mecanismos, por ejemplo, al inhibir la unión del PD-1 por el PD-L1 humano (SEQ ID NO: 3) o el PD-L2 (SEQ ID NO: 4).

Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción generalmente se unen específicamente al PD-1 humano. La reactividad cruzada de los anticuerpos por la unión al PD-1 de otras especies, por ejemplo, de mono, por ejemplo, mono cynomolgus, puede ofrecer ventajas, tales como la capacidad de probar en modelos animales de mono para determinar la actividad biológica. Dichas pruebas en modelos animales pueden usarse para tamizar anticuerpos anti-PD-1 para seleccionar propiedades relacionadas con la eficacia, por ejemplo, farmacocinética favorable, o aquellas relacionadas con la seguridad, por ejemplo, disminución de la toxicidad hepática. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PD-1 se unen al PD-1 cynomolgus; así como al PD-1 humano.

Los ensayos para la competencia incluyen, pero sin limitarse a, un inmunoensayo marcado con material radiactivo (RIA), un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ELISA tipo sándwich, ensayos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y ensayos de resonancia de plasmones de superficie.

Al llevar a cabo un ensayo de competencia de anticuerpos entre un anticuerpo de referencia y un anticuerpo de prueba (independientemente de la especie o el isotipo), primero puede marcarse el de referencia con un marcador detectable, tal como un fluoróforo, biotina o un marcador enzimático (o incluso radiactivo) para permitir la identificación subsecuente. En este caso, las células que expresan el PD-1 humano se incuban con un anticuerpo de prueba sin marcar, se añade un anticuerpo de referencia marcado y se mide la intensidad del marcador unido. Si el anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia marcado mediante la unión a un epítopo superpuesto, la intensidad disminuirá con relación a una reacción de control llevada a cabo sin el anticuerpo de prueba.

En una modalidad específica de este ensayo, primero se determina la concentración de anticuerpo de referencia marcado que produce el 80 % de la unión máxima ("conc80 %") en las condiciones de ensayo (por ejemplo, una densidad específica de células), y se lleva a cabo un ensayo de competición con 10X conc80 % de anticuerpo de prueba no marcado y conc80 % de anticuerpo de referencia marcado.

La inhibición puede expresarse como una constante de inhibición, o Ki, que se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

Ki = IC5o/(1 [concentración de Ab de referencia]/Kd),

en donde IC50 es la concentración de anticuerpo de prueba que produce una reducción del 50 % en la unión del anticuerpo de referencia y Kd es la constante de disociación del anticuerpo de referencia, una medida de su afinidad por el PD-1 humano. Los anticuerpos que compiten con los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción pueden tener una Ki de 10 pM a 10 nM en las condiciones de ensayo descritas en la presente descripción.

En varias modalidades, se considera que un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si este disminuye la unión del anticuerpo de referencia en al menos aproximadamente 20 % o más, por ejemplo, en al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso más, o en un porcentaje que varía entre cualquiera de los valores anteriores, a una concentración de anticuerpo de referencia que es el 80 % de la unión máxima en las condiciones de ensayo específicas usadas, y una concentración de anticuerpo de prueba que es 10 veces mayor que la concentración del anticuerpo de referencia.

En la Sección 8.1.5 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo útiles para evaluar si un anticuerpo compite por unirse al PD-1 humano con un anticuerpo de referencia como se describe en la presente descripción.

7.4. Polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-PD-1, sistemas de expresión y métodos para producir anticuerpos

La presente descripción abarca moléculas de ácido nucleico que codifican los genes de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina para producir los anticuerpos anti-PD-1, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos y células huésped capaces de producir los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción.

Puede prepararse un anticuerpo anti-PD-1 de la descripción mediante la expresión recombinante de los genes de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula huésped se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina del anticuerpo, de manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula huésped y, opcionalmente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células huésped, a partir del cual pueden recuperarse los anticuerpos. Las metodologías estándar de ADN recombinante se usan para obtener genes de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en las células huésped, tales como las descritas en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, NY, 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, FM y otros, Eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la patente de los Estados Unidos con núm.4,816,397.

Para generar ácidos nucleicos que codifican tales anticuerpos anti-PD-1, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse mediante amplificación y modificación del ADN de línea germinal o ADNc que codifica secuencias variables de las cadenas ligera y pesada, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena ligera y pesada humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, la base de datos de las secuencias de la línea germinal humana "VBASE"; ver, además, Kabat, E.A. y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de los Estados Unidos, Publicación NIH con núm. 91-3242; Tomlinson y otros, 1992, J. Mol. Biol.

22T: 116-198; y Cox y otros, 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora por este medio como referencia).

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos Vh y Vl relacionados con el anticuerpo anti-PD-1, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante las técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadenas de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ^aDⁿque codifica para Vl o Vh se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica para otra proteína, como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. El término "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región V^hpuede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa al unir operativamente el ADN que codifica la Vh a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E.A. y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de los Estados Unidos, Publicación NIH con núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en ciertas modalidades, es una IgGi o IgG4. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica la Vh puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región V^lpuede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también en un gen de cadena ligera de Fab) al unir operativamente el ADN que codifica la Vl a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de los Estados Unidos, Publicación NIH con núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en ciertas modalidades es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican la VH y la VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4~Ser)3 (SEQ ID NO: 5), de manera que las secuencias Vh y Vl pueden expresarse como una proteína de cadena única contigua, con las regiones Vl y Vh unidas por el conector flexible (Ver, por ejemplo, Bird y otros, 1988, Science 242:423-426; Huston y otros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y otros, 1990, Nature 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidas como se describió anteriormente, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a las secuencias de control transcripcionales y traduccionales. En este contexto, el término "unido operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo está ligado a un vector de manera que las secuencias de control transcripcionales y traduccionales dentro del vector cumplen su función prevista de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligadura de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción de las secuencias de las cadenas ligeras o pesadas relacionadas con el anticuerpo anti-PD-1, el vector de expresión ya puede portar las secuencias de la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir las secuencias VH y VL relacionadas con los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 en los genes de los anticuerpos de longitud completa, es insertarlas en los vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de la cadena pesada y constante de la cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH está unido operativamente al segmento o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VL está unido operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar para un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal esté unido en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no sea inmunoglobulina).

Además de los genes de las cadenas de los anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes de la descripción portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas de los anticuerpos en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir los promotores, los potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, las señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de las cadenas de los anticuerpos. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, lo que incluye la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de las células huésped de mamíferos incluyen los elementos virales que dirigen los altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como los promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador CMV), Virus 40 de simios (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y el polioma. Para una descripción más detallada de los elementos reguladores virales y sus secuencias, ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con núm.

5,168,062 de Stinski, la patente de los Estados Unidos con núm. 4,510,245 de Bell y otros, y la patente de los Estados Unidos con núm. 4,968,615 de Schaffner y otros.

Además de los genes de las cadenas de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la descripción pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en las que se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos con núms. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas por Axel y otros). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a los fármacos, tales como el G418, la higromicina o el metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en las células huésped DHFR-con selección/amplificación por el metotrexato) y el gen neo (para selección por el G418). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las varias formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares.

Es posible expresar los anticuerpos de la descripción en células huésped procariotas o eucariotas. En ciertas modalidades, la expresión de los anticuerpos se realiza en células eucariotas, por ejemplo, células huésped de mamíferos, de secreción óptima de un anticuerpo inmunológicamente activo y plegado adecuadamente. Las células huésped de mamíferos ilustrativas para expresar los anticuerpos recombinantes de la descripción incluyen las de ovario de hámster chino (células CHO) (lo que incluye las células CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77: 4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican los genes de los anticuerpos se introducen en las células huésped de los mamíferos, los anticuerpos se producen al cultivar las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo hacia el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo mediante el uso de los métodos estándar de purificación de proteínas. Las células huésped pueden usarse además para producir porciones de anticuerpos intactos, tal como los fragmentos Fab o las moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser conveniente transfectar una célula huésped con ADN que codifique ya sea la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo anti-PD-1 de esta descripción.

La tecnología del ADN recombinante puede usarse también para eliminar parte o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligera y pesada que no es necesaria para la unión al PD-1 humano. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también se abarcan por los anticuerpos de la descripción. Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-PD-1 de la descripción, la célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la descripción, donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos, o cada uno puede contener un marcador seleccionable separado. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifica para los polipéptidos de las cadenas pesada y ligera.

Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica una o más porciones de un anticuerpo anti-PD-1, pueden introducirse otras alteraciones o mutaciones en la secuencia codificante, por ejemplo, para generar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias de CDR, anticuerpos con afinidad reducida al receptor de Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos anti-PD-1 de la descripción también pueden producirse mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2da ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Las variantes de los anticuerpos también pueden generarse mediante el uso de una plataforma libre de células (ver, por ejemplo, Chu y otros, Biochemia núm. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) y Murray y otros, 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17: 420-426).

Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-PD-1 de la descripción por expresión recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos anti-PD-1 de la presente descripción pueden fusionarse con las secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en la presente descripción o de cualquier otra manera conocida en la técnica para facilitar la purificación.

Una vez aislado, el anticuerpo anti-PD-1 puede, si se desea, purificarse aún más, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (ver, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980), o por cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

7.5. Composiciones Farmacéuticas

Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción pueden estar en forma de composiciones que comprenden el anticuerpo y uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes. Las composiciones pueden formularse para usos específicos, tales como para usos veterinarios o usos farmacéuticos en humanos. La forma de la composición (por ejemplo, polvo seco, formulación líquida, etc.) y los excipientes, diluyentes y/o los portadores usados dependerán de los usos previstos del anticuerpo y, para usos terapéuticos, del modo de administración. Para usos terapéuticos, las composiciones pueden suministrarse como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (en dependencia del método deseado de administración a un paciente). La composición farmacéutica puede administrarse a un paciente por una variedad de vías tales como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intratecal, tópica o local. La vía más adecuada para la administración en cualquier caso dependerá del anticuerpo en particular, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica se administrará por vía intravenosa o subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-PD-1 descrito en la presente descripción por dosis. La cantidad de anticuerpo anti-PD-1 incluida en una dosis unitaria dependerá de la enfermedad a tratar, así como también de otros factores como se conocen bien en la técnica. Dichas dosis unitarias pueden estar en forma de un polvo seco liofilizado que contiene una cantidad de anticuerpo adecuada para una administración única, o en forma de un líquido. Las formas de dosis unitarias de polvo seco pueden empaquetarse en un kit con una jeringa, una cantidad adecuada de diluyente y/u otros componentes útiles para la administración. Las dosis unitarias en forma líquida pueden suministrarse convenientemente en forma de una jeringa precargada con una cantidad del anticuerpo anti-PD-1 adecuada para una administración única.

Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse, además, en forma a granel que contiene cantidades de anticuerpo anti-PD-1 adecuadas para las administraciones múltiples.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante la mezcla de un anticuerpo, que tenga el grado deseado de pureza, con los portadores, los excipientes o los estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales típicamente empleados en la técnica (todos los cuales se denominan en la presente descripción "portadores"), es decir, agentes tamponantes, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16va edición (Osol, edición 1980). Tales aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las dosis y las concentraciones empleadas.

Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden estar presentes en una amplia variedad de concentraciones, pero típicamente estarán presentes en concentraciones que varían de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados para usar con la presente descripción incluyen los ácidos orgánicos e inorgánicos y las sales de los mismos, tales como los tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico y tartrato de potasio, mezcla de hidróxido de sodio y ácido tartárico, etc.), tampones de fosfato (por ejemplo, mezcla de ácido fosfórico y fosfato monosódico, mezcla de ácido fosfórico y fosfato disódico, mezcla de fosfato monosódico y fosfato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico y gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico y oxalato de sodio, mezcla ácido oxálico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico y oxalato de potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico y lactato de sodio, mezcla de ácido láctico e hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico y lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético y acetato de sodio, mezcla de ácido acético e hidróxido de sodio, etc.). Adicionalmente, se pueden usar tampones de fumarato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como el 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (es decir, Tris, THAM o tris (hidroximetil) aminometano).

Los isotonicificadores a veces conocidos como "estabilizadores" pueden añadirse para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente descripción e incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, por ejemplo, alcoholes trihídricos de azúcar o superiores, tales como la glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes polihídricos de azúcar (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como la arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como la lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, lo que incluye los cicitoles como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como la urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); polímeros hidrofílicos, tales como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, tales como la xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos tales como la lactosa, maltosa, sacarosa y trehalosa; y trisacáridos tales como la rafinosa; y polisacáridos tales como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en cantidades que varían de 0,5 a 10 % en peso por peso de anticuerpo anti-PD-1.

Pueden añadirse surfactantes o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar la glucoproteína, así como para proteger la glucoproteína contra la agregación inducida por la agitación, que también permite que la formulación se exponga a la superficie de cizallamiento estresada sin causar la desnaturalización de la proteína. Los surfactantes no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), poloxámeros (184, 188, etc.) y polioles plurónicos. Los surfactantes no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL.

Una modalidad ilustrativa específica de una composición acuosa adecuada para la administración mediante infusión intravenosa comprende 20 mg/ml de un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, y una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 61, histidina 15 mM pH 5,7, sacarosa al 8,0% (p/v) y polisorbato 80 al 0,05% (p/v). La composición puede estar en forma de un polvo liofilizado que, tras la reconstitución con agua estéril u otra solución adecuada para la inyección o la infusión (por ejemplo, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer, solución de Ringer lactato, etc.) proporciona la composición acuosa anterior. La composición, u otras modalidades de las composiciones, puede también estar en forma de una jeringa u otro dispositivo adecuado para la inyección y/o la infusión precargada con una cantidad de composición adecuada para una administración única de anticuerpo anti-PD-1.

7.6. Métodos de uso

7.6.1. Beneficio terapéutico

Los datos proporcionados en la presente descripción demuestran que los anticuerpos anti-PD-1 descritos antagonizan al PD-1 en presencia de células cancerosas y ejercen una potente actividad anticancerosa contra cánceres tales como tumores sólidos y neoplasias malignas de la sangre in vivo. En consecuencia, los anticuerpos anti-PD-1, los fragmentos de unión y/o las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PD-1 pueden usarse terapéuticamente para tratar tumores sólidos o neoplasias malignas de la sangre.

En algunas modalidades, el método implica administrar a un paciente humano que tiene un tumor sólido una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1 que antagoniza a PD-1 y destruye las células tumorales a una velocidad efectiva para proporcionar un beneficio terapéutico. Los tumores sólidos que pueden tratarse con el anticuerpo anti-PD-1 incluyen, entre otros, cánceres suprarrenales, cánceres de vejiga, cánceres de huesos, cánceres de cerebro, cánceres de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo), cánceres de cuello uterino, cánceres colorrectales, cánceres de endometrio, cánceres de esófago, cánceres de ojos, cánceres gástricos, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de riñón (carcinoma avanzado de células renales), cánceres de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma), cánceres de pulmón (por ejemplo, pulmón de células no pequeñas cáncer, mesotelioma, cáncer de pulmón de células pequeñas), cánceres de cabeza y cuello, melanomas (por ejemplo, melanoma no extirpable o metastásico, melanoma maligno avanzado), cánceres orales, cánceres de ovario, cánceres de pene, cánceres de próstata, cánceres de páncreas, cánceres de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cánceres testiculares, cánceres de tiroides, cánceres de útero, cánceres vaginales y tumores con evidencia de deficiencia de reparación de desajustes del ADN. Los cánceres pueden estar compuestos por células tumorales que expresan PD-L1 o PD-L2, cánceres compuestos por células tumorales que no expresan PD-L1 o PD-L2, o cánceres compuestos por células tumorales, algunas de las cuales expresan PD-L1 o PD-L2 y algunos de los cuales no. El cáncer puede ser diagnosticado recientemente y sin tratamiento previo, o puede ser recurrente, refractario, o recurrente y refractario, o una forma metastásica de un tumor sólido. En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona del cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, linfoma, melanoma y cáncer gástrico. En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona de: melanoma (por ejemplo, melanoma no extirpable o metastásico), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas) y carcinoma de células renales (por ejemplo, carcinoma avanzado de células renales). En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona del cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de células pequeñas, mesotelioma, colangiocarcinoma, carcinoma de células de Merkel y tumores con evidencia de deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento del ADN. En determinadas modalidades, el melanoma es un melanoma metastásico o no extirpable de tipo salvaje BRAF V600. En otras ciertas modalidades, el melanoma es un melanoma metastásico o no extirpable con mutación BRAF V600 positiva. En ciertas modalidades, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico con progresión con o después de la quimioterapia basada en platino. En ciertas modalidades, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico o localmente avanzado que ha fracasado en la terapia basada en platino y sin terapia previa con un agente dirigido a PD-1. En ciertas modalidades, el cáncer de cabeza y cuello es un carcinoma metastásico (diseminado) de cabeza y cuello de células escamosas de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe y laringe, que se considera incurable mediante las terapias locales. En ciertas modalidades, el carcinoma de células renales es un carcinoma de células renales avanzado que ha recibido una terapia antiangiogénica previa.

En algunas modalidades, el método de la descripción implica administrar a un paciente humano que tiene una neoplasia maligna de la sangre una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1 que antagoniza al PD-1 y destruye las células malignas a una velocidad efectiva para proporcionar un beneficio terapéutico. Los cánceres pueden estar compuestos por células malignas que expresan PD-L1 o PD-L2, cánceres compuestos por células malignas que no expresan PD-L1 o PD-L2, o cánceres compuestos por células malignas, algunas de las cuales expresan PD-L1 o PD-L2 y algunos de los cuales no. El cáncer puede ser diagnosticado recientemente y sin tratamiento previo, o puede ser recurrente, refractario, o recurrente y refractario, o una forma metastásica de una neoplasia maligna de la sangre. Las neoplasias malignas transmitidas por la sangre que se pueden tratar con el anticuerpo anti-PD-1 incluyen, pero sin limitarse a, mielomas (por ejemplo, mieloma múltiple), linfomas (por ejemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células del manto), leucemias (por ejemplo, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica aguda) y síndromes mielodisplásicos.

Como se describió anteriormente, los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente modulan una respuesta inmunitaria. En consecuencia, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos pueden excluirse del tratamiento. En algunas modalidades, se excluye a un paciente después de cumplir uno o más de los siguientes criterios: (1) enfermedad autoinmune activa o previamente documentada (lo que incluye, pero no se limita a, la enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, síndrome de Wegener) en los últimos 2 años. (No se excluyen los sujetos con atopia infantil o asma, vitiligo, alopecia, síndrome de Hashimoto, enfermedad de Grave o psoriasis que no requiere tratamiento sistémico (en los últimos 2 años); (2) antecedentes de inmunodeficiencia primaria, trasplante de médula ósea, leucemia linfocítica crónica, trasplante de órganos sólidos o diagnóstico clínico previo de tuberculosis; (3) antecedentes de una coagulopatía o un trastorno plaquetario; (4) resultados positivos confirmados de la prueba para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o sujetos con hepatitis B o C crónica o activa. (Pueden inscribirse sujetos que tienen antecedentes de hepatitis B o C que hayan documentado curas después de la terapia antiviral); (5) grado previo > 3 de neurotoxicidad o neumonitis mediada por el sistema inmunitario mientras recibe inmunoterapia (lo que incluye, pero no se limita a, los agentes dirigidos contra CTLA-4, PD-L1 o PD-1). Además, cualquier otro evento adverso anterior mediado por inmunidad de grado > 3 mientras recibe inmunoterapia que no se ha resuelto o se ha vuelto asintomático en 3 meses; (6) recepción de vacuna viva atenuada dentro de los 28 días previos a la primera dosis del anticuerpo anti-PD-1.

Un anticuerpo anti-PD-1 de la descripción puede administrarse solo (monoterapia) o complementario a, o con, otras terapias contra el cáncer y/o agentes dirigidos o no dirigidos contra el cáncer. Cuando se administra como una monoterapia anti-PD-1, pueden usarse uno o más anticuerpos. Ya sea que se administre como monoterapia o complementario a, o con, otras terapias o agentes, se administra una cantidad de anticuerpo anti-PD-1 de manera que el régimen de tratamiento general proporcione un beneficio terapéutico.

Por beneficio terapéutico se entiende que el uso de anticuerpos anti-PD-1 para tratar el cáncer en un paciente da como resultado cualquier beneficio clínico demostrado en comparación con ninguna terapia (cuando sea apropiado) o con un estándar de atención conocido. El beneficio clínico puede evaluarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. En una modalidad, el beneficio clínico se evalúa en función de la tasa de respuesta objetiva (ORR) (determinada mediante el uso de RECIST versión 1.1), la duración de la respuesta (^dO^r), la supervivencia libre de progresión (PFS) y/o la supervivencia global (OS). En algunas modalidades, una respuesta completa indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, una respuesta parcial indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, la enfermedad estable indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, un aumento en la supervivencia global indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, el beneficio terapéutico puede constituir una mejora en el tiempo hasta la progresión de la enfermedad y/o una mejora en los síntomas o la calidad de vida. En otras modalidades, el beneficio terapéutico puede no traducirse en un mayor período de control de la enfermedad, sino más bien en una carga de síntomas marcadamente reducida que resulta en una mejor calidad de vida. Como será evidente para los expertos en la técnica, puede observarse un beneficio terapéutico mediante el uso de los anticuerpos anti-PD-1 solos (monoterapia) o complementario a, o con, otras terapias contra el cáncer y/o agentes dirigidos o no dirigidos contra el cáncer.

Típicamente, el beneficio terapéutico se evalúa mediante pruebas clínicas estándar diseñadas para medir la respuesta a un nuevo tratamiento para el cáncer. Para evaluar los beneficios terapéuticos de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción, puede usarse una o una combinación de las siguientes pruebas: (1) los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST) versión 1.1, (2) RECIST relacionado con el sistema inmunitario (irRECIST), (3) Estado de Rendimiento del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), (4) criterios de respuesta relacionados con el sistema inmunitario (irRC), (5) enfermedad evaluable mediante la evaluación de los antígenos tumorales, (6) escalas de resultados validadas informadas por los pacientes y/o (7) estimaciones de Kaplan-Meier para la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión.

La evaluación del cambio en la carga tumoral es una característica importante de la evaluación clínica de la terapéutica del cáncer. Tanto la contracción del tumor (respuesta objetiva) como el tiempo para el desarrollo de la progresión de la enfermedad son puntos finales importantes en los ensayos clínicos sobre el cáncer. Los criterios de respuesta estandarizados, conocidos como RECIST (Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos), se publicaron en 2000. Una actualización (RECIST 1.1) se lanzó en 2009. Los criterios RECIST se usan generalmente en ensayos clínicos en los que la respuesta objetiva es el objetivo principal del estudio, así como en los ensayos en los que se llevan a cabo evaluaciones de enfermedad estable, progresión tumoral o tiempo de progresión porque estas medidas de resultado se basan en una evaluación de la carga tumoral anatómica y su cambio en el transcurso de la prueba. La TABLA 4 proporciona las definiciones de los criterios de respuesta usados para determinar la respuesta objetiva del tumor a un fármaco en estudio, tal como los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción.

Los indicadores de resultados secundarios que pueden usarse para determinar el beneficio terapéutico de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción incluyen: la Tasa de Respuesta Objetiva (ORR), Supervivencia Libre de Progresión (PFS), Supervivencia General (OS), Duración de la Respuesta General (DOR) y la Profundidad de Respuesta (DpR). ORR se define como la proporción de los participantes que logran una respuesta completa (CR) o una respuesta parcial (PR). La PFS se define como el tiempo desde la fecha de la primera dosis de un anticuerpo anti-PD-1 hasta, ya sea, la progresión de la enfermedad o la muerte, lo que se produzca primero. La OS se define como el periodo de tiempo transcurrido desde la fecha del diagnóstico o el inicio del tratamiento de una enfermedad, en que los pacientes diagnosticados con la enfermedad todavía están vivos. DOR se define como el tiempo desde el CR o PR inicial del paciente hasta el momento de progresión de la enfermedad. DpR se define como el porcentaje de contracción tumoral observado en el punto de respuesta máximo en comparación con la carga tumoral basal. Los criterios de valoración clínicos para tanto ORR como PFS pueden determinarse basado en los criterios RECIST 1.1 descritos anteriormente.

Los criterios adicionales que pueden usarse para la evaluación clínica específica para pacientes con cáncer sometidos a tratamiento de inmunoterapia incluyen los criterios estandarizados RECIST relacionados con el sistema inmunitario (irRECIST). Ver, por ejemplo, Nishino, M. y otros, Eur. J. Radiol., 84 (7), páginas 1259-1268 (julio de 2015). Estas directrices modificaron los criterios RECIST 1.1 anteriores con la consideración de los posibles efectos inmunomoduladores. La TABLA 5 proporciona las definiciones de los criterios de respuesta usados para determinar la respuesta objetiva del tumor a un fármaco inmunomodulador, tal como los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción.

La Escala del Estado de Rendimiento del ECOG que se muestra en la TABLA 6 se usa para describir el nivel de funcionamiento del paciente en términos de su capacidad para cuidarse a sí mismo, su actividad diaria y su capacidad física. La escala fue desarrollada por el Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), que ahora forma parte del ECOG-ACRIN Cancer Research Group, y se publicó en 1982.

Otro conjunto de criterios que pueden usarse para caracterizar completamente y determinar la respuesta a los agentes inmunoterapéuticos, tales como las terapias contra el cáncer basadas en anticuerpos, es el criterio de respuesta relacionado con el sistema inmunitario (irRC), que se desarrolló para la medición de tumores sólidos en 2009, y se actualizó en 2013 (Wolchok, y otros, Clin. Cancer Res. 2009; 15 (23): 7412-7420 y Nishino, y otros Clin. Cancer Res. 2013; 19 (14): 3936-3943). Los criterios actualizados de irRC se usan típicamente para evaluar el efecto de un agente inmunoterapéutico, tal como un anticuerpo anti-PD-1 descrito en la presente descripción, sobre la carga tumoral, y define la respuesta de acuerdo con la TABLA 7.

Los antígenos tumorales que pueden usarse para evaluar el beneficio terapéutico de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción incluyen ApoE, CD11c, CD40, CD45 (PTPRC), CD49D (ITGA4), C^d80, CSF1R, CTSD, GZMB, Ly86, MS4A7, PIK3AP1, PIK3CD, CD74, CCL5, CCR5, CXCL10, IFNG, IL10RA1, IL-6, ACTA2, COL7A1, LOX, LRRC15, MCPT8, MMP10, NOG, SERPINE1, STAT1, TGFBR1, CTSS, PGF, VEGFA, C1QA, C1QB, ANGPTL4, EGLN, ANGPTL4, EGLN3, BNIP3, AIF1, CCL5, CXCL10, CXCL11, IFI6, PLOD2, KISS1R, STC2, DDIT4, OX40, OX40L, PFKFB3, PGK1, PDK1, AKR1C1, AKR1C2, CADM1, CDH11, COL6A3, CTGF, HMOX1, KRT33A, LUM, WNT5A, IGFBP3, MMP14, CDCP1, PDGFRA, TCF4, TGF, TGFB1, TGFB2, CD11b, ADGRE1 (EMR1, F4/80), CD86, CD68, MHC-Clase II, CD3, HLA-DR, CD4, CD3, CD5, CD19, CD7, CD8, CD16, TCRap, TCRy5, PD-1, PD-L1, CTLA-4, fosfatasa acida, ACTH, fosfatasa alcalina, alfa-fetoproteína CA-125, CA15-3, CA19-9, ^cA-195, C-212, CA-549, calcitonina, catecolaminas, catepsina-D, CEA, ERBB2 (HER2/neu), cromagranina-A, c-Myc, EGFR, ERA (ensayo del receptor de estrógenos), ferritina, gastrina, 5-HIAA, hCG, alfa-HCG, beta-HCG, HVA, LDH1-5, NSE (enolasa específica de neurona), polipéptido pancreático, PLAP, PLP, PRA (receptor de progesterona A), péptido C de proinsulina, PSA, SMA, SCC, tiroglobulina, TDT, TPA y alfa-TSH. Estos antígenos tumorales pueden evaluarse a nivel de ADN, ARN o proteína mediante el uso de técnicas de secuenciación de ADN, o técnicas de secuenciación de ARN, micromatrices de chips genéticos, métodos basados en PCR, citometría de flujo o métodos de inmunohistoquímica como los expertos en la técnica conocen.

Un beneficio terapéutico ilustrativo resultante del uso de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción para tratar tumores sólidos, ya sea administrado como monoterapia o complementario a, o con, otras terapias o agentes, es una respuesta completa. Otro beneficio terapéutico ilustrativo que resulta del uso de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción para tratar tumores sólidos, ya sea administrado como monoterapia o complementario a, o con, otras terapias o agentes, es una respuesta parcial.

Las escalas de resultado informadas por el paciente validadas pueden usarse además para denotar la respuesta proporcionada por cada paciente a través de un sistema de informe específico. En lugar de centrarse en la enfermedad, tales escalas de resultados se refieren a la función retenida mientras se maneja una condición crónica. Un ejemplo no limitante de una escala validada de resultados informada por el paciente es PROMIS® (Sistema de información de medición de resultados informados por el paciente) de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Por ejemplo, el Instrumento de función física PROMIS® para pacientes adultos con cáncer puede evaluar las capacidades autoinformadas para el funcionamiento de las extremidades superiores (por ejemplo, destreza), extremidades inferiores (por ejemplo, andar o movilidad) y regiones centrales (por ejemplo, movilidad del cuello y espalda), e incluye actividades diarias de rutina, tales como hacer mandados.

Las curvas de Kaplan-Meier (Kaplan y Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53(282): 457-481) pueden también usarse para estimar la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión para pacientes con cáncer sometidos a terapia con anticuerpos anti-PD-1 en comparación con el estándar de atención.

7.6.2. Terapias complementarias

Los anticuerpos anti-PD-1 pueden usarse complementario a, o con, otros agentes o tratamientos que tienen propiedades contra el cáncer. Cuando se usa de forma complementaria, el anticuerpo anti-PD-1 y otro(s) agente(s) puede(n) formularse juntos en una sola formulación farmacéutica combinada, o pueden formularse y administrarse por separado, ya sea en un único régimen de dosis coordinado o en diferentes regímenes de dosis. Los agentes administrados complementarios a, o con, los anticuerpos anti-PD-1 tendrán típicamente actividades complementarias a los anticuerpos anti-PD-1 de manera que los anticuerpos y otros agentes no se afecten negativamente entre sí.

Los agentes que pueden usarse de forma complementaria con los anticuerpos anti-PD-1 incluyen, pero sin limitarse a, los agentes alquilantes, inhibidores de la angiogénesis, anticuerpos, antimetabolitos, antimitóticos, antiproliferativos, antivirales, inhibidores de quinasa Aurora, promotores de la apoptosis (por ejemplo, inhibidores de la familia Bcl-2), activadores de la vía del receptor de muerte, inhibidores de la quinasa Bcr-Abl, anticuerpos BiTE (atacantes de las células T biespecíficos), conjugados fármaco-anticuerpo, modificadores de la respuesta biológica, inhibidores de quinasas dependientes de ciclina, inhibidores del ciclo celular, inhibidores de la ciclooxigenasa-2, DVD, inhibidores del receptor de leucemia homólogo oncógeno viral (ErbB2), inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores de la proteína de choque térmico (HSP)-90, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), terapias hormonales, inmunológicas, inhibidores de los inhibidores de las proteínas de la apoptosis (IAP), antibióticos intercalados, inhibidores de la quinasa, inhibidores de la quinesina, inhibidores de Jak2, inhibidores del blanco de la rapamicina en mamíferos, microARN, inhibidores de la quinasa regulada por señal extracelular activada por mitógeno, proteínas de unión multivalentes, antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), inhibidores de la poli ADP (difosfato de adenosina)-ribosa polimerasa (PARP), quimioterapéuticos de platino, inhibidores de la quinasa tipo polo (Plk), inhibidores de la fosfoinositol-3 quinasa (PI3K), inhibidores del proteasoma, análogos de purina, análogos de pirimidina, inhibidores de los receptores de la tirosina quinasa, alcaloides de plantas retinoides/deltoides, inhibidores pequeños de ácidos ribonucleicos (ARNip), inhibidores de la topoisomerasa, inhibidores de la ubiquitina ligasa y similares, así como combinaciones de uno o más de estos agentes.

Los anticuerpos BiTE son anticuerpos biespecíficos que dirigen a las células T a atacar las células cancerosas al unir simultáneamente las dos células. La célula T después ataca a la célula cancerosa diana. Los ejemplos de anticuerpos BiTE incluyen al adecatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) y similares. Sin estar limitado por la teoría, uno de los mecanismos por los cuales las células T provocan la apoptosis de la célula cancerosa diana es la exocitosis de los componentes del gránulo citolítico, que incluyen la perforina y la granzima B.

Los ARNip son moléculas que tienen bases de ARN endógenas o nucleótidos modificados químicamente. Las modificaciones no eliminan la actividad celular, sino que imparten mayor estabilidad y/o mayor potencia celular. Los ejemplos de las modificaciones químicas incluyen grupos fosforotioato, 2'-desoxinucleótidos, 2'-OCH3 que contiene ribonucleótidos, 2'-F-ribonucleótidos, 2'-metoxietilo ribonucleótidos, combinaciones de los mismos y similares. El ARNip puede tener diferentes longitudes (por ejemplo, de 10 a 200 bps) y estructuras (por ejemplo, horquillas, hebras simples/dobles, protuberancias, mellas /discontinuidades, apareamientos erróneos) y se procesan en las células para proporcionar el silenciamiento genético activo. Un ARNip de doble cadena (ARNdc) puede tener el mismo número de nucleótidos en cada cadena (extremos romos) o extremos asimétricos (salientes). El saliente de 1 a 2 nucleótidos puede estar presente en la cadena codificante y/o no codificante, así como también presente en los extremos 5' y/o 3' de una cadena dada.

Las proteínas de unión multivalentes son proteínas de unión que comprenden dos o más sitios de unión a antígeno. Las proteínas de unión multivalentes están diseñadas para tener los tres o más sitios de unión a antígeno y, en general, no son anticuerpos naturales. El término "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión capaz de unir dos o más dianas relacionadas o no relacionadas. Las proteínas de unión de dominio variable dual (DVD) son proteínas de unión tetravalente o multivalente que se unen a dos o más sitios de unión a antígeno. Dichos DVD pueden ser monoespecíficos (es decir, capaces de unirse a un antígeno) o multiespecíficos (es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos). Las proteínas de unión de DVD que comprenden dos polipéptidos DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos DVD de la cadena ligera se denominan Ig de DVD. Cada mitad de una Ig de DVD comprende un polipéptido de DVD de la cadena pesada y un polipéptido de DVD de la cadena ligera y dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera con un total de 6 CDR involucradas en la unión al antígeno por sitio de unión a antígeno.

Los agentes alquilantes incluyen, pero sin limitarse a, la altretamina, AMD-473, AP-5280, apaziquona, bendamustina, brostallicina, busulfano, carboquona, carmustina (BCNU), clorambucilo, CLORETAZINE® (laromustina, VNP 40101M), ciclofosfamida, dacofosfamida, dacofosfamida estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, lomustina (CCNU), mafosfamida, melfalan, mitobronitol, mitolactol, nimustina, mostaza nitrogenada, N-óxido, ranimustina, temozolomida, tiotepa, TREANDA®, treosamida, trofostanuro, trofosamida y treosamida.

Los inhibidores de la angiogénesis incluyen, pero sin limitarse a, los inhibidores del receptor de la tirosina quinasa (Tie-2) específicos del endotelio, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), inhibidores del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), inhibidores del ligando 4 tipo delta (DLL4), inhibidores del receptor del factor de crecimiento de insulina tipo 2 (IGFR-2), inhibidores de la metaloproteinasa de matriz tipo 2 (MMP-2), inhibidores de la metaloproteinasa de matriz tipo 9 (MMP-9), inhibidores del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), análogos de la trombospondina, e inhibidores de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR).

Los conjugados del fármaco anticuerpo incluyen, pero sin limitarse a, aquellos que se dirigen a la c-Met quinasa (por ejemplo, ADC descritos en la Patente de los Estados Unidos con núm. 7,615,529), LRRC15, CD30 (por ejemplo, ADCETRIS® (brentuximab vedotin)), CS1 (por ejemplo, ADC descritos en la publicación de los Estados Unidos con núm. 20160122430), DLL3 (por ejemplo, Rovalpituzumab tesirina (ROVA-T)), HER2 (por ejemplo, KADCYLA® (trastuzumab emtansine)), EGFR (por ejemplo, ADC descritos en la publicación de los Estados Unidos con núm.

20150337042), y receptor de prolactina (por ejemplo, ADC descritos en la publicación de los Estados Unidos con núm. 20140227294).

Los antimetabolitos incluyen, pero sin limitarse a, ALIMTA® (pemetrexed disodio, LY231514, MTA), 5-azacitidina, XELODA® (capecitabina), carmofur, LEUSTAT® (cladribina), clofarabina, citarabina, citarabina ocfosfato, citosina arabinósido, decitabina, deferoxamina, doxifluridina, eflornitina, EICAR (5-etinil-1-p-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida), enocitabina, etilcitidina, fludarabina, 5-fluorouracilo solo o en combinación con leucovorina, GEMZAR®, (gemcitabina), hidroxiurea, ALKERAN® (melfalán), mercaptopurina, ribósido de 6-mercaptopurina, metotrexato, ácido micofenólico, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, pelitrexol, pentostatina, raltitrexed, ribavirina, triapina, trimetrexato, S-1, tiazofurina, tegafur, TS-1, vidavirina y UFT.

Los antivirales incluyen, pero sin limitarse al, ritonavir, aciclovir, cidofovir, ganciclovir, foscarnet, zidovudina, ribavirina e hidroxicloroquina.

Los inhibidores de quinasa Aurora incluyen, pero sin limitarse a, ABT-348, AZD-1152, MLN-8054, VX-680, inhibidores de quinasa específicos de Aurora A, inhibidores de quinasa específicos de Aurora B e inhibidores de pan-Aurora quinasa.

Los inhibidores de la proteína Bcl-2 incluyen, pero sin limitarse al, ABT-263 (navitoclax), AT-101 ((-)gosipol), GENASENSE® (G3139 u oblimersen (oligonucleótido no codificante dirigido a Bcl-2)), IPI-194, IPI-565, N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobencenosulfonamida), N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetiM-ciclohex-1-es-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-((1R)-3-(morfolin-4-il)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)bencenosulfonamida, venetoclax y GX-070 (obatoclax).

Los inhibidores de la quinasa Bcr-Abl incluyen, pero sin limitarse a, DASATINIB® (BMS-354825) y GLEEVEC® (imatinib).

Los inhibidores de BTK incluyen, pero sin limitarse a, ibrutinib y acalabrutinib.

Los inhibidores de CDK incluyen, pero sin limitarse a, AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, seliciclib (CYC- 202, R-roscovitina) y ZK-304709. Los inhibidores de la COX-2 incluyen, pero sin limitarse a, ABT-963, ARCOXIA® (etoricoxib), BEXTRA® (valdecoxib), BMS347070, CELEBREX® (celecoxib), COX-189 (lumiracoxib), CT-3, DERAMAXX® (deracoxib), JTE-522, 4-metil-2-(3,4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoilfenil-lH-pirrol), MK-663 (etoricoxib), NS-398, parecoxib, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S-2474, T-614 y VIOXX® (rofecoxib).

Los inhibidores de EGFR incluyen, pero sin limitarse a, ABX-EGF, inmunoliposomas anti-EGFR, vacuna EGF, EMD-7200, ERBITUX® (cetuximab), ^hR3, anticuerpos IgA, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib u OSI-774), TAGRISSO® (osimertinib), TP-38, proteína de fusión a EGFR y TYKERB® (lapatinib).

Los inhibidores del receptor ErbB2 incluyen, pero sin limitarse al, CP-724-714, CI-1033 (canertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, pertuzumab), TAK-165, GW- 572016 (ionafarnib), GW282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (vacuna HER2), APC-8024 (vacuna HER-2), anticuerpo anti-HER/2neu biespecífico, B7.her2IgG3, AS HER2 anticuerpos biespecíficos trifuncionales, mAB AR-209 y mAB 2B-1.

Los inhibidores de histona desacetilasa incluyen, pero sin limitarse a, depsipéptido, LAQ-824, MS-275, trapoxina, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), TSA y ácido valproico.

Los inhibidores de HSP-90 incluyen, pero sin limitarse al, 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, geldanamicina, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB® (anticuerpo recombinante humano contra HSP-90), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, radicicol, SNX-2112, STA-9090 y VER49009.

Los inhibidores de las proteínas de apoptosis incluyen, entre otros, HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161 y LBW-242.

Los activadores de la vía del receptor de muerte incluyen, pero sin limitarse a, TRAIL, anticuerpos u otros agentes que se dirigen a TRAIL o receptores de muerte (por ejemplo, DR4 y DR5) tal como Apomab, conatumumab, ETR2-ST01, GDC0145 (lexatumumab), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 y trastuzumab.

Los inhibidores de cinesina incluyen, pero sin limitarse a, inhibidores de Eg5 tales como AZD4877, ARRY-520; e inhibidores de CENPE tales como GSK923295A.

Los inhibidores de JAK-2 incluyen, entre otros, CEP-701 (lesaurtinib), XL019 e INCB018424.

Los inhibidores de MEK incluyen, entre otros, ARRY-142886, ARRY-438162, PD-325901 y PD-98059.

Los inhibidores de mTOR incluyen, entre otros, AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamicina, temsirolimus, inhibidores ATP-competitivos de TORC1/TORC2, incluyendo PI-103, PP242, PP30 y Torin 1.

Los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos incluyen, pero sin limitarse a, AMIGESIC® (salsalato), DOLOBID® (diflunisal), MOTRIN® (ibuprofeno), ORUDIS® (ketoprofeno), RELAFEN® (nabumetona), FELDENE® (piroxicam), crema de ibuprofeno, ALEVE® (naproxeno) y NAPROSYN® (naproxeno), VOLTAREN® (diclofenaco), INDOCIN® (indometacina), CLINORIL® (sulindac), TOLECTIN® (tolmetina), LODINE® (etodolaco), TORADOL® (ketorolaco) y DAYPRO® (oxaprozina).

Los inhibidores de PDGFR incluyen, pero sin limitarse a, C-451, CP-673 y CP-868596.

Los agentes quimioterapéuticos de platino incluyen, pero sin limitarse a, cisplatino, ELOXATIN® (oxaliplatino) eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, PARAPLATIN® (carboplatino), satraplatino y picoplatino.

Los inhibidores de la quinasa tipo polo incluyen, entre otros, BI-2536.

Los inhibidores de la fosfoinositol-3 quinasa (PI3K) incluyen, entre otros, wortmannina, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235 y XL765.

Los análogos de trombospondina incluyen, pero sin limitarse a, ABT-510, ABT-567, ABT-898 y TSP-1.

Los inhibidores de VEGFR incluyen, pero sin limitarse a, AVASTIN® (bevacizumab), ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME™ (una ribozima que inhibe la angiogénesis (Ribozyme Pharmaceuticals (Boulder, CO) y Chiron (Emeryville, CA)), axitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, IM-862, MACUGEN® (pegaptamib), NEXAVAR® (sorafenib, BAY43-9006), pazopanib (GW-786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU-11248), trampa de VEGF y ZACTIMA™ (vandetanib, ZD-6474).

Los antibióticos incluyen, pero sin limitarse a, antibióticos intercalados, aclarrubicina, actinomicina D, amrubicina, annamicina, adriamicina, BLENOXANE® (bleomicina), daunorrubicina, CAELYX® o MYOCET® (doxorrubicina liposomal), elsamitrucina, epirbucina, glarbuicina, ZAVEDOS® (idarrubicina), mitomicina C, nemorubicina, neocarzinostatina, peplomicina, pirarrubicina, rebeccamicina, stimalamer, estreptozocina, VALSTAR® (valrubicina) y zinostatina.

Los inhibidores de la topoisomerasa incluyen, pero sin limitarse a, aclarrubicina, 9-aminocamptotecina, amonafida, amsacrina, becatecarina, belotecán, BN-80915, CAMPTOSAR® (clorhidrato de irinotecán), camptotecina, CARDIOXANE® (dexrazoxina), diflomotecán, edotecarina, ELLENCE® o PHARMORUBICIN® (epirrubicina), etopósido, exatecán, 10-hidroxicamptotecina, gimatecán, lurtotecán, mitoxantrona, Onivyde™ (irinotecán liposomal), oratecina, pirarbucina, pixantrona, rubitecán, sobuzoxana, SN-38, taflupósido y topotecán.

Los anticuerpos incluyen, pero sin limitarse a, AVASTIN® (bevacizumab), anticuerpos específicos de CD40, chTNT-1/B, denosumab, ^eR^bITUX® (cetuximab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), anticuerpos específicos de IGF1R, lintuzumab, anticuerpos específicos contra OX-40, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXAN® (rituximab), ticilimumab, trastuzumab, pertuzumab, VECTIBIX® (panitumumab) y anticuerpos contra CD20 tipos I y II.

Las terapias hormonales incluyen, entre otras, ARIMIDEX® (anastrozol), AROMASIN® (exemestano), arzoxifeno, CASOd Ex® (bicalutamida), CETROTIDE® (cetrorelix), degarelix, deslorelina, DeSOPAN® (trilostano), dexametasona, DROGENIL, DROGENIL (flutamida), EVISTA® (raloxifeno), AFEMA™ (fadrozol), FARESTON® (toremifeno), FASLODEX® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestano, glucocorticoides, HECTOROL® (doxercalciferol), RENAGEL® (sevelamer carbonato), lasofoxifeno, acetato de leuprolida, MEGACE® (megesterol), MIFEPREX® (mifepristona), NILANDRON™ (nilutamida), NOLVADEX® (citrato de tamoxifeno), PLENAXIS ™ (abarelix), prednisona, PROPECIA® (finasterida), rilostano, SUPREMA® (buserelina), TRELSTAR® (hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH)), V^aNTAS® (implante de histrelina), VETORYL® (trilostano o modrastano) y ZOLADEX® (fosrelina, goserelina).

Los deltoides y los retinoides incluyen, pero sin limitarse a, seocalcitol (EB1089, CB1093), lexacalcitrol (KH1060), fenretinida, PANRETIN® (aliretinoína), ATRAGEN® (tretinoína liposomal), TARGRETIN® (bexaroteno) y lGd-1550. Los inhibidores de PARP incluyen, pero sin limitarse a, ABT-888 (veliparib), KU-59436, AZD-2281 (olaparib), AG-014699 (rucaparib), MK4827 (niraparib), BMN-673 (talazoparib), iniparib, BSI -201, BGP-15, INO-1001 y ONO-2231. Los alcaloides vegetales incluyen, pero sin limitarse a, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina.

Los inhibidores del proteasoma incluyen, pero sin limitarse a, VELCADE® (bortezomib), KYPROLIS® (carfilzomib), MG132, NPI-0052 y PR-171.

Los ejemplos de inmunológicos incluyen, pero sin limitarse a, interferones, inhibidores del punto de regulación inmunitario, agentes coestimuladores y otros agentes potenciadores del sistema inmunitario. Los interferones incluyen interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-la, ACTIMMUNE® (interferón gamma-lb) o interferón gamma-nl, combinaciones de los mismos y similares. Los inhibidores del punto de regulación inmunitario incluyen anticuerpos que se dirigen a PD-L1 (por ejemplo, durvalumab, atezolizumab, avelumab, MEDI4736, MSB0010718C y MPDL3280A) y a CTLA4 (antígeno de linfocito citotóxico 4; por ejemplo, ipilimumab, tremelimumab). Los agentes coestimuladores incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos contra CD3, CD40, CD40L, CD27, CD28, CSF1R, CD137 (por ejemplo, urelumab), B7H1, GITR, ICOS, CD80, CD86, OX40, OX40L, CD70, HLA-DR, LIGHT, LIGHT-R, TIM3, A2AR, NKG2A, KIR (por ejemplo, lirilumab), TGF-P (por ejemplo, fresolimumab) y combinaciones de los mismos.

Otros agentes incluyen, pero sin limitarse a, ALFAFERONE® (IFN-a), BAM-002 (glutatión oxidado), BEROMUN® (tasonermina), BEXXAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), dacarbazina, denileukin, epratuzumab, GRANOCYTE® (lenograstim), lentinán, leucocitos alfa interferón, imiquimod, vacuna contra el melanoma, mitumomab, molgramostim, My LOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREX® (oregovomab), pemtumomab (Y-muHMFG1), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilan, teceleukin, THERACYS® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimex, VIRULIZIN® (inmunoterapéutico, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (Sustancia específica de Maruyama (SSM)), WF- 10 (Tetraclorodecaóxido (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleukin), ZADAXIN® (timalfasina), ZINBRYTA® (proceso de alto rendimiento de daclizumab) y ZEVALIN® (90Y-Ibritumomab tiuxetán).

Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa de los organismos vivos o las respuestas biológicas, como la supervivencia, el crecimiento o la diferenciación de las células tisulares para que tengan actividad antitumoral e incluyen, pero sin limitarse a, krestin, lentinán, sizofirán, picibanil PF-3512676 (CpG-8954) y ubenimex.

Los análogos de pirimidina incluyen, pero sin limitarse a, citarabina (ara C o arabinósido C), citosina arabinósido, doxifluridina, FLUDARA® (fludarabina), 5-FU (5-fluorouracilo), floxuridina, GEMZAR® (gemcitabina), TOMUDEX® (ratitrexed) y TROXATYL™ (triacetiluridina troxacitabina).

Los análogos de purina incluyen, pero sin limitarse a, LANVIS® (tioguanina) y PURI-NETHOL® (mercaptopurina). Los agentes antimitóticos incluyen, pero sin limitarse a, batabulina, epotilona D (KOS-862), N- (2 - ((4-hidroxifenil) amino) piridin-3-il) -4-metoxibencenosulfonamida, ixabepilona (BMS 247550), tAx OL® (paclitaxel), TAXOTERE® (docetaxel), PNU100940 (109881), patupilona, XRP-9881 (larotaxel), vinflunina y ZK-EPO (epotilona sintética). Los inhibidores de la ubiquitina ligasa incluyen, pero sin limitarse a, inhibidores de MDM2, como nutlinas, e inhibidores de NEDD8 como MLN4924.

Los anticuerpos anti-PD-1 pueden usarse además para mejorar la eficacia de la radioterapia. Los ejemplos de radioterapia incluyen radioterapia de haz externo, radioterapia interna (es decir, braquiterapia) y radioterapia sistémica.

Los anticuerpos anti-PD-1 pueden administrarse complementario a, o con, otros agentes quimioterapéuticos como ABRAXANE™ (ABI-007), ABT-100 (inhibidor de la farnesil transferasa), ADVEXIN® (vacuna Ad5CMV-p53), ALTOCOR® o MEVACOR® (lovastatina), AMPLIGEN® (poli I: poli C12U, un ARN sintético), APTOSYN® (exisulind), AREDIA® (ácido pamidrónico), arglabina, L-asparaginasa, atamestano (1-metil-3,17-diona-androsta-1,4-dieno), AVAGE® (tazaroteno), AVE8062 (derivado de combreastatina) BEC2 (mitumomab), cachectina o cachexina (factor de necrosis tumoral), canvaxina (vacuna), CEAVAC® (vacuna contra el cáncer), CELEUK® (celmoleukin), CEPLENE® (diclorhidrato de histamina), c ErVARIX® (vacuna contra el virus del papiloma humano), CHOP® (C: CYTOXAN® (ciclofosfamida); H: ADRIAMYCIN® (hidroxidoxorrubicina); O: Vincristina (ONCOVIN®); P: prednisona), CYPAT™ (acetato de ciproterona™), combrestatina A4P, DAB (389) EGF (dominios catalíticos y de translocación de la toxina diftérica fusionada a través de un conector His-Ala al factor de crecimiento epidérmico humano) o TransMID-107R™ (toxinas de difteria), dacarbazina, dactinomicina, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA), eniluracilo, EVI-ZON™ (lactato de escualamina), DIMERICINE® (loción de liposoma T4N5), discodermolida, DX-8951f (mesilato de exatecán), enzastaurina, EP0906 (epitilona B), GARDASIL® (virus del papiloma humano cuadrivalente (tipos 6, 11, 16, 18) vacuna recombinante), GASTRIMMUNE®, ^gEⁿASENSE®, GMK (vacuna conjugada de gangliósido), GVAX® (vacuna contra el cáncer de próstata), halofuginona, histrelina, hidroxicarbamida, ácido ibandrónico, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (cintredekin besudotox), IL-13-pseudomonas exotoxina, interferón-a, interferón-Y, JUNOVAN™ o MEPACT™ (mifamurtida), lonafarnib, 5,10-metilenetetrahidrofolato, miltefosina (hexadecilfosfocolina), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREXIN® (glucuronato de trimetrexato), NIPENT® (pentostatina), ONCONASE® (una enzima ribonucleasa), ONCOPHAGE® (tratamiento con vacuna contra melanoma), ONCOVAX® (Vacuna IL-2), ORATHECIN™ (rubitecán), OSIDe M® (fármaco celular basado en anticuerpos), OVAREX® MAb (anticuerpo monoclonal murino), paclitaxel, PANDIMEX™ (saponinas de aglicona del ginseng que comprenden 20(S)protopanaxadiol (aPPD) y 20(S)protopanaxatriol (aPPT)), panitumumab, PANVAC® VF (vacuna de investigación contra el cáncer), pegaspargasa, PEG Interferón A, fenoxodiol, procarbazina, rebimastat, REMOVAB® (catumaxomab), REVLIMID® (lenalidomida), RSR13 (efaproxiral), SOMATULINE® LA (lanreotida), SORIATANE® (acitretina), estaurosporina (Streptomyces staurospores), talabostat (PT100), TARGRETIN® (bexaroteno), TAXOPREXIN® (DHA-paclitaxel), TELCYTA® (canfosfamida, TLK286), temilifeno, TEMODAR® (temozolomida), tesmilifeno, talidomida, THERAt Op E® (STn-KLH), timitaq (diclorhidrato de 2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-oxo-5-(4-piridiltio)quinazolina), TNFERADE™ (adenovector: portador de ADN que contiene el gen del factor de necrosis tumoral-a), TRACLEER® o ZAVESCA® (bosentan), tretinoína (Retin-A), tetrandrina, TRISENOX® (trióxido de arsénico), VIRULIZIN®, ukraina (derivado de alcaloides de la planta de celidonia mayor), vitaxina (anticuerpo anti-alfavbeta3), XCYTRIN® (motexafin gadolinio), XINLAY™ (atrasentán), XYOTAX™ (paclitaxel poliglumex), YONDELIS® (trabectedina), ZD-6126, ZINEC^aR^d® (dexrazoxano), Z^oM^eTA® (ácido zolendrónico) y zorrubicina, así como también combinaciones de cualquiera de estos agentes.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido a la c-Met quinasa para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de páncreas, el cáncer colorrectal o el cáncer gástrico.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con un conjugado anticuerpofármaco dirigido a LRRC15 para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, sarcoma, cáncer de mama triple negativo o melanoma.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con un conjugado anticuerpofármaco dirigido a EGFR para tratar el glioblastoma.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con un conjugado anticuerpofármaco dirigido a CS1 para tratar una neoplasia maligna de la sangre como el mieloma múltiple.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con un conjugado anticuerpofármaco dirigido a DLL3 para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas o el glioblastoma.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con una proteína anti-CD40 para tratar el cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón (como adenocarcinoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, mesotelioma, cáncer de pulmón de células pequeñas), melanoma, cáncer de ovario o cáncer de páncreas.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con venetoclax para tratar una neoplasia maligna de la sangre como la leucemia linfocítica crónica.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con ibrutinib para tratar una neoplasia maligna de la sangre, como leucemia linfocítica crónica, linfoma de células del manto o macroglobulinemia de Waldenstrom, o un tumor sólido.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con ipilimumab y un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido a c-Met quinasa para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En algunas modalidades, se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con ipilimumab y un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido a LRRC15 para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas.

7.7. Dosis y regímenes de administración

La cantidad de anticuerpos anti-PD-1 administrada dependerá de una variedad de factores, que incluyen, pero sin limitarse a, el tipo particular de tumor sólido tratado, la etapa del tumor sólido que se está tratando, el modo de administración, la frecuencia de administración, el beneficio terapéutico deseado y otros parámetros como la edad, el peso y otras características del paciente, etc. La determinación de las dosis efectivas para proporcionar un beneficio terapéutico para modos y frecuencia de administración específicos está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Las dosis efectivas para proporcionar un beneficio terapéutico pueden estimarse inicialmente a partir de modelos animales in vivo o clínicos. Los modelos animales adecuados para una amplia variedad de enfermedades son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción pueden administrarse por cualquier vía apropiada para la afección a tratar. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 es cualquiera de los anticuerpos humanizados enumerados en la TABLA 3. En una modalidad específica, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una cadena pesada según SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, y una cadena ligera según SEQ ID NO: 61. Un anticuerpo anti-PD-1 se administrará típicamente por vía parenteral, es decir, infusión, subcutánea, intramuscular, intravenosa (IV), intradérmica, intratecal, bolo, inyección intratumoral o epidural ((Shire y otros, 2004, J. Pharm. Ciencias 93 (6): 13901402)). En una modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-PD-1 como un polvo liofilizado en un vial. Los viales pueden contener 100 mg, 110 mg, 120 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg o 400 mg de anticuerpo anti-PD-1. Antes de la administración, el polvo liofilizado se reconstituye con agua estéril para inyección (SWFI) u otro medio adecuado para proporcionar una solución que contenga 20 mg/ml de anticuerpo anti-PD-1. La solución reconstituida resultante se diluye adicionalmente con solución salina u otro medio adecuado para infusión y se administra mediante una infusión IV dos veces cada 7 días, una vez cada 7 días, una vez cada 14 días, una vez cada 21 días, una vez cada 28 días, una vez cada 35 días, una vez cada 42 días, una vez cada 49 días o una vez cada 56 días. En algunas modalidades, para el primer ciclo, la infusión ocurre durante 90 minutos. En algunas modalidades, las infusiones subsecuentes duran más de 60 minutos.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 se administra como una infusión intravenosa una vez cada 7 días a 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 8,0 mg/kg o 10,0 mg/kg. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 se administra como una infusión IV una vez cada 14 días a 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 8,0 mg/kg o 10,0 mg/kg.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 se administra como una infusión IV una vez cada 21 días a 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 8,0 mg/kg o 10,0 mg/kg.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PD-1 se administra como una infusión intravenosa una vez cada 28 días a 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 6,0 mg/kg, 8,0 mg/kg o 10,0 mg/kg. En una modalidad ilustrativa, se usa un anticuerpo anti-PD-1 complementario al ipilimumab (YERVOY®) para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El anticuerpo anti-PD-1 se administra mediante infusión intravenosa una vez cada 21 días a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg. El ipilimumab se administra mediante perfusión intravenosa a una dosis de 1 mg/kg una vez cada tres semanas durante cuatro dosis. Subsecuente a la última dosis de ipilimumab, el anticuerpo anti-PD-1 se administra por infusión IV una vez cada 14 días a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg. La terapia complementaria con anticuerpo anti-PD-1/ipilimumab se continúa hasta que se produce la progresión de la enfermedad o ya no es tolerada por el paciente.

En una modalidad ilustrativa, se usa un anticuerpo anti-PD-1 complementario al ipilimumab (YERVOY®) para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El anticuerpo anti-PD-1 se administra mediante infusión intravenosa una vez cada 14 días a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg. El ipilimumab se administra mediante perfusión intravenosa a una dosis de 1 mg/kg una vez cada seis semanas durante cuatro dosis. La terapia complementaria con anticuerpo anti-PD-1/ipilimumab se continúa hasta que se produce la progresión de la enfermedad o ya no es tolerada por el paciente.

En una modalidad ilustrativa, se usa un anticuerpo anti-PD-1 complementario al ipilimumab (YERVOY®) para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas. El anticuerpo anti-PD-1 se administra mediante infusión intravenosa una vez cada 14 días a 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg. El ipilimumab se administra mediante perfusión intravenosa a una dosis de 1 mg/kg una vez cada doce semanas durante cuatro dosis. La terapia complementaria con anticuerpo anti-PD-1/ipilimumab se continúa hasta que se produce la progresión de la enfermedad o ya no es tolerada por el paciente.

Cuando se administran complementarios a, o con otros agentes, tales como otros agentes terapéuticos, los anticuerpos anti-PD-1 pueden administrarse en el mismo horario que el(los) otro(s) agente(s) o en un horario diferente. El anticuerpo anti-PD-1 puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro agente, cuando se administra en el mismo horario. En algunas modalidades donde se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con, los estándares de atención, el anticuerpo anti-PD-1 puede iniciarse antes del comienzo de la terapia estándar, por ejemplo, un día, varios días, una semana, varias semanas, un mes o incluso varios meses antes del comienzo de la terapia estándar de atención. En algunas modalidades donde se administra un anticuerpo anti-PD-1 complementario a, o con, los estándares de atención, el anticuerpo anti-PD-1 puede iniciarse antes del comienzo de la terapia estándar, por ejemplo, un día, varios días, una semana, varias semanas, un mes o incluso varios meses antes del comienzo de la terapia estándar de atención.

Como apreciarán los expertos en la materia, las dosis recomendadas para los varios agentes descritos anteriormente pueden necesitar ajustarse para optimizar la respuesta del paciente y maximizar el beneficio terapéutico.

8. Ejemplos

Los siguientes ejemplos, que resaltan ciertas características y propiedades de las modalidades ilustrativas de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la presente descripción, se proporcionan con fines ilustrativos y no limitantes. Ejemplo 1: Materiales y Métodos

8.1.1. Anticuerpo que se une a PD-1 humano unido a placa por ELISA

Se recubrieron placas de 96 pocillos Immunolon 4xHB con 1 ug/ml de fusión Fc PD-1 humana a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con PBS que contiene Tween 20 al 0,1 % (PBST) mediante el uso de un lavador de placas. Las placas recubiertas con PD-1 se incubaron a continuación con las concentraciones indicadas de anticuerpo a temperatura ambiente (RT) durante una hora. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de específico anti-fragmento Fab humano de cabra marcado con biotina preparado a una dilución de 1:5000 en PBS que contenía BSA al 1 %. A continuación, las placas se lavaron cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de una dilución 1:1000 de estreptavidina-HRP a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a RT. Las placas se lavaron posteriormente cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de componente TMB One a cada pocillo y se incubaron a RT hasta que se desarrolló color (aproximadamente 5-10 minutos). La densidad óptica (OD) se leyó a 650 nm mediante el uso de Spectromax190 (Molecular Devices).

8.1.2. Unión de anticuerpos al PD-1 humano expresado en la superficie celular

Se recogieron células Jurkat que expresaban PD-1 de matraces y se resuspendieron a 2 x 106 células / ml en PBS que contenía BSA al 1%. Se añadieron 100 pl de células a una placa de 96 pocillos de fondo redondo que contenía 100 |_il de anticuerpo de prueba titulado o control de isotipo. Las células se incubaron con anticuerpos a temperatura ambiente durante 25 minutos y luego se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1%. El sedimento celular se resuspendió en 100 pl de un anticuerpo secundario de cabra anti-Fab PE humano diluido 1: 250. Después de 25 minutos de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1% y se resuspendieron en 200 pl de BSA al 1%. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCanto. Los datos se analizaron con el software BD FACSDiva (versión 8.0.1).

8.1.3. Anticuerpo que se une al mono Cynomolgus PD-1 unido a placa por ELISA

Se recubrieron placas de 96 pocillos Immunolon 4xHB con 1 \\ mu g / ml de fusión de Cynomolgus PD-1 Fc en DPBS a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % durante 30 minutos a RT y después se lavaron tres veces con PBST (PBS con Tween 20 al 0,1 %) mediante el uso de un lavador de placas. Las placas recubiertas con PD-1 se incubaron a continuación con las concentraciones indicadas de anticuerpo a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST y después se incubaron durante 1 hora a RT con 100 pl de específico anti-fragmento Fab humano de cabra marcado con biotina preparado a una dilución de 1:5000 en PBS que contenía BSA al 1 %. A continuación, las placas se lavaron cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de una dilución 1:1000 de estreptavidina-HRP a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a RT. Las placas se lavaron subsecuentemente cinco veces en PBST y 100 pl de TMB. Se añadió un componente a cada pocillo y se incubó a TA hasta que se desarrolló el color (aproximadamente 5-10 minutos). La densidad óptica (OD) se leyó a 650 nm Spectromax190 (Molecular Devices).

8.1.4. Unión de anticuerpos a células T CD4+ humanas activadas

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) a partir de capas leucocitarias compradas en Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Brevemente, las capas leucocitarias se diluyeron en una relación 1:1 con PBS sin magnesio y calcio. La sangre diluida (30 ml) se colocó sobre 15 ml de Ficoll-Paque Plus al 90 % preparado en PBS sin magnesio y calcio contenido en tubos SepMate. Los tubos se centrifugaron a 1200 g durante 10 minutos. La interfase se recogió y se lavó dos veces en PBS 1x. Se cultivaron PBMC a 2 x 106 células / ml durante 48 h en medio RPMI que contenía FCS HI al 10% con 1 pg / ml de PHA y 50 U / ml de IL-2 humana recombinante. Las células se recogieron, lavaron e incubaron con anticuerpos a TA durante 25 minutos. Las células marcadas se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1%. Las células se resuspendieron en 100 ml de PBS BSA al 1% y se añadió una dilución 1: 250 de fragmento Fab antihumano de cabra conjugado con PE y anti-CD4-FITC. Después de 30 minutos, las células se lavaron dos veces con PBS que contenía BSA al 1% y se resuspendieron en 200 pL de BSA al 1%. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCanto. Los datos se analizaron con el software BD FACSDiva (versión 8.0.1).

8.1.5. Afinidad de unión para PD-1 por resonancia de plasmones superficiales

La cinética de unión de un anticuerpo anti-PD-1 al ECD (dominio extracelular) de PD-1 soluble recombinante se determinó mediante mediciones basadas en resonancia de plasmones de superficie realizadas en un instrumento Biacore T200 a 25 °C mediante el uso de un enfoque de ensayo de captura anti-Fc. Los dominios extracelulares recombinantes de PD-1 humana (residuos 1-167) y Cynomolgus PD-1 (residuos 21-167) se adquirieron de una fuente comercial y se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel en HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, 3 mM EDTA. La preparación del chip y las mediciones de la cinética de unión se realizaron en el tampón de ensayo HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,05 %). Para la preparación del chip de captura anti-Fc, aproximadamente 2000 RU de anticuerpo policlonal anti-Fc de IgG humana de cabra diluido a 25 pg/ml en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5), se inmovilizó directamente en un chip biosensor CM5 mediante el uso de un kit de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con las instrucciones y procedimientos del fabricante. Los restos sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. Para las mediciones de la cinética de unión, cada ciclo de ensayo consistió en las siguientes etapas: 1) captura del anticuerpo de prueba solo en la superficie de prueba; 2) inyección del analito (ECD de PD-1 o solo tampón) sobre tanto la superficie de referencia como de prueba, 240 pl a 80 pl/min, después de lo cual se monitoreó la disociación durante 900 segundos a 80 pl/min; 3) regeneración de la superficie de captura mediante inyecciones de clorhidrato de glicina 10 mM, pH 1,5 sobre tanto la superficie de referencia como de prueba. Durante el ensayo, todas las mediciones se referenciaron contra la superficie de captura sola (es decir, sin anticuerpo de prueba capturado) y se usaron inyecciones de solo tampón para doble referenciación. Las inyecciones de PD-1 variaron en concentración de 900 nM a 11,1 nM en una serie aleatoria de diluciones de múltiplo 3. Los datos se procesaron y ajustaron globalmente a un modelo de unión 1:1 mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T200 para determinar las constantes de velocidad cinética de unión, ka (M-1s-1) y kd (s-1), y la constante de disociación de equilibrio Kd (M). 8.1.6. Bloqueo de la interacción de PD-1 con PD-L1 y PD-L2

Se recogieron células HEK 293G que expresan PD-1 humana de matraces confluentes. Las células se resuspendieron en PBS a una concentración de 2 x 106 células / ml. Las células (1 x 105) se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en V y las células se bloquearon durante 15 min a 4 ° C utilizando el bloque FcR humano. En placas separadas, los anticuerpos de prueba y las soluciones de control de isotipo se prepararon utilizando una dilución en serie de 3 veces de la concentración inicial de 20 pg / ml. Las células se lavaron en 1x PBS y se añadieron 50 pl de las diluciones de anticuerpos preparadas y 50 pl de ligandos marcados con PD-L1 His o PD-L2 His (10 mg / ml) a la placa que contenía células. Las células se incubaron a 4°C durante 30 minutos y se lavaron dos veces con 1x PBS. Se añadió a cada pocillo anticuerpo anti-His APC (50 pl) preparado a una dilución de 1:50 en PBS y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces, se resuspendieron en PBS y se adquirieron en LSR II Fortessa (BD Biosciences, San José, CA).

8.1.7. Ensayo alogénico de reacción de linfocitos mixtos humanos (MLR) utilizando células T CD4 purificadas y células dendríticas

Se aislaron PBMC humanas a partir de capas leucocitarias compradas en Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Brevemente, las capas leucocitarias se diluyeron en una relación 1:1 con PBS sin magnesio y calcio. La sangre diluida (30 ml) se colocó sobre 15 ml de Ficoll-Paque Plus al 90 % preparado en PBS sin magnesio y calcio contenido en tubos SepMate. Los tubos se centrifugaron a 1200 g durante 10 minutos. La interfase se recogió y se lavó dos veces en PBS 1x. Las células se resuspendieron a 1 x 108 por ml en medio AIM-V que contenía beta mercaptoetanol. Las células dendríticas (DC) se obtuvieron cultivando PBMC adherentes al plástico en matraces T75 en presencia de 80 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4 durante 7 días. El día 5, se añadieron 50 pg/ml de IL-1a y 200 pg/ml de TNF-a a los cultivos de DC. En el día 7, las DC se recogieron de los matraces, irradió durante 7,3 minutos a 414 R/min, y se resuspendió a una concentración final de 1 x 105 células/ml en medio completo (RPMI con L glutamina que contiene 10% de FBS, 1x no vitaminas esenciales, solución Pen/Strep al 1%, piruvato de sodio al 1%, HEPES al 1%). Se aislaron células T CD4 humanas alogénicas usando el kit de aislamiento de células T CD4. Se añadieron DC (1 x 104/pocillo) y células T CD4 purificadas (1 x 105/pocillo) a una placa de fondo en U. Se añadió anticuerpo de prueba o control de isotipo (10 pg/ml) a la placa que contenía DC y células T. Después de cinco días de incubación, se recogió el sobrenadante y se analizó la IL-2 y el IFN-y utilizando el kit de matriz de perlas citométricas Milliplex. Se midió el IFN-y usando BioRad Bioplex System (Bioplex manager 6.0).

8.1.8. Respuesta de recuerdo de antígeno al toxoide tetánico

Se aislaron PBMC humanas a partir de capas leucocitarias compradas en Stanford Blood Center como se describió anteriormente. Las células se resuspendieron hasta una concentración final de 2 x 106 células / ml en medio AIM-V que contenía beta mercaptoetanol. PBMC (2 x 105) se utilizaron por pocillo con 0,2 g / ml de toxoide del tétanos. Se tituló el anticuerpo y las placas se incubaron durante cinco días. Los sobrenadantes se recogieron el día 5 y se evaluaron para IFN-^yusando un kit de matriz de perlas citométricas Milliplex. Se midió el IFN-^yusando BioRad Bioplex System (Bioplex manager 6.0).

Ejemplo 2: Generación y humanización de anticuerpos anti-PD-1 de ratón

Los ratones se inmunizaron de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica (E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). El isotipo de cada anticuerpo monoclonal se determinó mediante el uso del kit de isotipaje de ratón (Roche). Los clones de hibridoma que producen los anticuerpos de interés se purificaron y se caracterizaron posteriormente en cuanto a su afinidad por resonancia de plasmones de superficie y por competencia por el ligando por FACS.

La clonación y la construcción del vector de expresión se lograron mediante métodos conocidos en la técnica para la expresión de anticuerpos monoclonales recombinantes.

La humanización de la región V del anticuerpo se llevó a cabo como se describe por Queen, C. y otros (Proc. Natl.

Acad. Sci. EE. UU., 1989; 86:10029-10033). Las estructuras canónicas de las CDR se determinaron de acuerdo con Huang y otros (Methods, 2005; 36:35-42). Se identificaron secuencias de línea germinal variable humana con las mismas o más similares estructuras canónicas de CDR, y se seleccionaron secuencias apropiadas de segmentos Vh, Vl y J humanos para proporcionar los marcos para la región variable anti-PD-1. En las posiciones marco en las que el modelo informático sugería un contacto significativo con las CDR, los aminoácidos de las regiones V anti-PD-1 murinas se sustituyeron por los aminoácidos del marco humanos originales (retromutaciones). Las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V h y V l de anticuerpos ilustrativos de ratón y humanizados se muestran en la FIG. 2.

El anticuerpo de ratón anti-PD-1 Mu12A11 se humanizó de acuerdo con el método descrito anteriormente. Las versiones humanizadas de Mu12A11 V h fueron Hu12A11.1b V h y Hu12A11.2b V h. Hu12A11.1b V h tenía regiones marco V h 7-4-1, con cuatro mutaciones inversas de V2I, M48V, f67L y A93T. Hu12A11.2b V h tenía regiones marco V ^h1-69, con siete mutaciones inversas de V2I, M48V, V67L, I69F, A71L, E73T y A93T. Cualquiera de los dos V ^hhumanizados podría combinarse con la cadena ligera humanizada Hu12A11.1a V l que tenía regiones marco V l 2 28, con una mutación inversa de 12V.

Ejemplo 3: Estabilidad de los anticuerpos anti-PD-1

La estabilidad de los anticuerpos ilustrativos se determinó midiendo la unión de PD-1 de los anticuerpos después del tratamiento en condiciones oxidativas o de temperatura variable.

Una evaluación de los motivos de riesgo identificó un residuo de metionina conservado en la posición 99 de Kabat (M99) que se creía que estaba expuesto al disolvente y era propenso a la desamidación. Se expusieron muestras del anticuerpo progenitor M99 Hu12A11.2b1 a condiciones de degradación acelerada para potenciar la desamidación potencial (Figura 3A). Las muestras tratadas con peróxido de hidrógeno al 1% (HP al 1%) o hidroperóxido de terc-butilo al 1% (TBHP al 1%) demostraron pérdida de afinidad de unión, lo que sugiere el potencial de oxidación del residuo de metionina-99. Se construyó un conjunto de anticuerpos que contenían mutaciones puntuales en la posición M99, incluyendo isoleucina (M99I, Hu12A11.2b2 que tiene un V h según SEQ ID NO: 34), valina (M99V, Hu12A11.2b3 que tiene un V ^hsegún SEQ ID NO: 35) y leucina (M99L, Hu12A11.2b4 que tiene un V H según SEQ ID NO: 36). Las variantes de anticuerpos se seleccionaron para la unión a PD-1 en las células Jurkat transfectadas humanas y CE 50 Se determinaron los valores (Fig. 3B). Los tres anticuerpos que contienen mutación puntual se unieron a la superficie celular PD-1 de manera similar, pero el anticuerpo variante M99L mostró una mayor actividad de unión en comparación con las variantes M99V o M99I.

Se encontró que la variante de M99L Hu12A11.2b4 conservaba completamente la capacidad de unión después de la prueba de estabilidad de temperatura (figura 3C). La incubación de Hu12A11.2b4 a -80, 5, 25, o 40 ° C proporcionó ninguna pérdida significativa de la actividad en términos de CE 50 o la intensidad de fluorescencia máxima (MFI). Ejemplo 4: Afinidad de unión de los anticuerpos anti-PD-1

La Tabla 4-1 a continuación muestra los datos de afinidad de unión in vitro del anticuerpo ilustrativo Hu12A11.2b4 en comparación con el anticuerpo anti-PD-1 nivolumab de la literatura preparado de acuerdo con los procedimientos encontrados en la Patente de Los Estados Unidos N° 9.073.994. Hu12A11.2b4 exhibió propiedades de unión similares a PD-1 en comparación con nivolumab según la resonancia de plasmones superficiales, ensayo ELISA con PD-1 humano (Hu) o cynomolgus (Cyno), o en células Jurkat humanas según se midió en los ensayos del Ejemplo 1.

Ejemplo 5: Actividad biológica del anticuerpo anti-PD-1 Hu12A11.2b4

Se evaluó la actividad biológica de Hu12A11.2b4 en varios ensayos de células humanas in vitro descritos en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Tabla 5-1, Hu12A11.2b4 demostró una unión de 180 pM a PD-1 en células T CD4 . Además, se demostró que la actividad anti-PD-1 de Hu12A11.2b4 está mediada, al menos en parte, por su capacidad para bloquear la interacción de PD-L1 o PD-L2 con PD-1 según se evaluó mediante citometría de flujo. Esta actividad biológica fue consistente con la actividad de Hu12A11.2b4 en células T Jurkat recombinantes que expresan el gen de luciferasa de luciérnaga bajo el control de elementos de respuesta a NFAT con expresión constitutiva de PD-1 humana (ensayo Jurkat NFAT).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-PD-1 humano, en donde el anticuerpo comprende (i) una cadena Vh que comprende tres CDR; y (ii) una cadena Vl que comprende tres CDR, en donde:

la CDR#1 de la V^hes GYTFTHYGMN (SEQ ID NO: 11);

la CDR#2 de la Vh es WVNTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 12);

la CDR#3 de la V^hes EGEGLGFGD (SEQ ID NO: 13);

la CDR#1 de la Vl es RSSQSIVHSHGDTYLE (SEQ ID NO: 14);

la CDR#2 de la V^les KVSNRFS (SEQ ID NO: 15); y

la CDR#3 de la Vl es FQGSHIPVT (SEQ ID NO: 16).

2. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 1, que es humanizado.

3. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 2, que comprende una cadena Vh correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 36; y una cadena V^lcorrespondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 42.

4. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 3, que es una IgGi y que comprende un dominio CH2 variante que tiene sustituciones de aminoácidos L234A y L235A.

5. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 3, que es una IgG4 y que comprende una región Fc variante que tiene una sustitución de aminoácido S228P.

6. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 3, que es una IgG y que comprende una región constante ligera kappa.

7. El anticuerpo anti-PD-1 humano de la reivindicación 3, que comprende una cadena pesada correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 51 o a la SEQ ID NO: 52, y una cadena ligera correspondiente en secuencia a la SEQ ID NO: 61.

8. Uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo anti-PD-1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Uno o más vectores que comprenden el uno o más ácidos nucleicos de la reivindicación 8.

10. Una célula huésped eucariota transformada con el uno o más vectores de la reivindicación 9, en donde la célula huésped es:

a) procariota; o

b) eucariota, opcionalmente en donde la célula huésped es una célula huésped de mamífero.

11. Un método para producir un anticuerpo anti-PD-1 humano, que comprende: (a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 10 y, (b) recuperar el anticuerpo anti-PD-1 humano.