JPWO2013051718A1 - キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、細胞内ドメインとしてグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体(GITR)の細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸、当該キメラ抗原受容体を発現する細胞及び当該細胞を製造する方法が提供される。

Description

本発明は腫瘍に対する養子免疫遺伝子治療の分野において有用な、キメラ抗原受容体をコードする核酸及びキメラ抗原受容体を発現する細胞に関する。
腫瘍に対する治療戦略として、特定の抗原に結合するT細胞受容体(TCR)遺伝子を任意のT細胞に導入することにより、目的の抗原を標的とするT細胞を作製することが期待できる。これに基づき、多くの腫瘍抗原、例えばWT1、MART1、gp100、CEA、CD19及びmHAG HA−2抗原を標的としたTCR遺伝子による養子免疫遺伝子治療が試みられている。
腫瘍に対する新たな養子免疫遺伝子治療として、遺伝子改変T細胞療法が注目されている。この治療法は腫瘍細胞の表面抗原への特異性とT細胞の活性化能を有するキメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor:CAR)をコードする核酸をT細胞に導入し、得られた遺伝子導入T細胞を体外で増殖させて輸注する方法である。この方法は抗体医薬に比べて抗腫瘍効果がより強力で、効果もより長期間持続すると考えられており、その臨床効果に大いに期待がもたれている。
代表的なCARの構造は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する単鎖抗体(single chain variable fragment:scFv)、膜貫通ドメインとT細胞を活性化させるTCR複合体CD3ζの細胞内ドメインから構成される。このような構成のCARは第一世代CARと呼ばれている。単鎖抗体部分の遺伝子は、例えば標的とする抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離される。CARを発現するT細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合抗原クラスIの発現とは無関係に腫瘍細胞の表面抗原を直接認識し、同時にT細胞を活性化することで、効率よく腫瘍細胞を殺傷することが可能である。
第一世代CARのT細胞活性化能を増強する目的で、T細胞の共刺激分子であるCD28の細胞内ドメインを連結した第二世代CARが開発されている。さらなる改良型として、更に腫瘍壊死因子(TNF)受容体スーパーファミリーであるCD137(4−1BB)又はCD134(OX40)由来の細胞内ドメインをタンデムに連結した第三世代CARも開発され、様々な腫瘍抗原を標的とした多くのCAR分子が報告されている(非特許文献1)。しかしながら、現在報告されている第二世代及び第三世代CARで細胞内ドメインとして使用されている共刺激分子は限られている。CARに連結した際に、T細胞の共刺激分子由来の細胞内ドメインが一様に強くT細胞を刺激して標的とする腫瘍細胞を傷害するわけではないことが知られている。例えばCD137由来の細胞内ドメインを連結した第二世代CARは第一世代CARと同程度の細胞傷害活性しか示さない、すなわち当該細胞内ドメインはCARの機能向上に効果が認められないことが報告されている(非特許文献2)。したがって、CARに連結した時に有効な新たな共刺激分子を見出すことが求められていた。
T細胞のサブセットである制御性T細胞において発現している遺伝子として見出されたグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体(GITR)は、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、TNF受容体スーパーファミリーの一員である(非特許文献3)。GITRは、非活性化T細胞上に構成的に存在することが示されている。GITRは、GITRリガンド(以下GITRLと記載する)と称される別の膜貫通タンパク質に結合する。GITRに対する作動性抗体は、制御性T細胞の免疫抑制活性を解除することが示されていることから、GITRLはGITRを介して制御性T細胞の活性を制御するという機能的な役割を果たしていることが示唆されている(非特許文献4参照)。
カレント オピニオン イン イムノロジー(Current Opinion in Immunology)、第21巻、第215−223頁(2009) ザ ジャーナル オブ イムノロジー(J.Immunology)、第172巻、第104−113頁(2004) イムノロジカル レビューズ(Immunol.Rev.)、第182巻、第18−32頁(2001) イムニティ(Immunity)、第16巻、第311−323頁(2002)
本発明の目的は、標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対する高い細胞傷害活性を細胞に付与するCARをコードする核酸及び当該CARを発現する細胞を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、GITRの細胞内ドメインを有するCARを発現する細胞は標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対して高い細胞傷害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明を概説すれば、
[1] 抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むCARをコードする核酸であって、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインを含むことを特徴とするCARをコードする核酸、
[2] 抗原が腫瘍抗原である[1]記載のCARをコードする核酸、
[3] 抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である[1]記載のCARをコードする核酸、
[4] 細胞内ドメインとして更にCD3ζ細胞内ドメインを含む[1]記載のCARをコードする核酸、
[5] GITRの細胞内ドメインがCD3ζ細胞内ドメインよりC末端側に配置される[4]記載のCARをコードする核酸、
[6] 抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むCARであって、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインを含むことを特徴とするCAR、
[7] 抗原が腫瘍抗原である[6]記載のCAR、
[8] 抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である[6]記載のCAR、
[9] 細胞内ドメインとして更にCD3ζ細胞内ドメインを含む[6]記載のCAR、
[10] GITRの細胞内ドメインがCD3ζ細胞内ドメインよりC末端側に配置される[9]記載のCAR、
[11] [1]〜[5]のいずれかに記載の核酸を細胞に導入する工程を含むCAR発現細胞の製造方法、
[12] 細胞がT細胞又はT細胞を含有する細胞集団である[11]記載のCAR発現細胞の製造方法、
[13] [1]〜[5]のいずれかに記載の核酸が導入されたCAR発現細胞、
[14] 細胞がT細胞又はT細胞を含有する細胞集団である[13]記載のCAR発現細胞、に関する。
本発明により、腫瘍抗原等の抗原を標的にした養子免疫遺伝子治療の分野において有用なキメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸及びキメラ抗原受容体を発現する細胞が提供される。本発明のキメラ抗原受容体は導入された細胞での発現量が高く、導入された細胞は高い細胞傷害活性を示す。
実施例で使用するCARの作製手順を示す図である。抗CEA(carcinoembryonic antigen)モノクローナル抗体のscFvを「CEA−scFv」、ヒンジドメインを「CD8 hinge」、CD28の膜貫通ドメインを「CD28 TM」、CD28の細胞内ドメインを「CD28 ICD(IntraCellular Domain)」、CD3ζ細胞内ドメインを「CD3ζ」、末端反復配列を「LTR」、スプライスドナー配列を「SD」、スプライスアクセプター配列を「SA」、パッケージングシグナル配列を「ψ」と表示する。 実施例で使用するCARの構造を示す図である。抗原に結合する抗体のscFvを「scFv」、スペーサードメインを「Spacer domain」、CD28の膜貫通ドメインを「CD28 TM」、CD28の細胞内ドメインを「CD28 ICD」、GITRの膜貫通ドメインを「GITR TM」、GITR細胞内ドメインを「GITR ICD」、CD3ζ細胞内ドメインを「CD3ζ」と示す。本明細書中、各CDRの構造を(1)z、(2)28z、(3)z28、(4)Gz、(5)zG、(6)28Gz、(7)G28z、(8)zG28、(9)28zG、および(10)z28Gと略して表示する。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞にCEAが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞に結合する標識したCEAの蛍光強度を示す図である。 CARが導入された細胞にCEAが結合する割合を示す図である。 CARが導入された細胞に結合する標識したCEAの蛍光強度を示す図である。 CARが導入された細胞の細胞傷害活性を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞にCEAが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞に結合する標識したCEAの蛍光強度を示す図である。 CARが導入された細胞の細胞傷害活性を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞にCEAが結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞に結合する標識したCEAの蛍光強度を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインIFNγを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインIFNγの産生量を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインTNFαを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインTNFαの産生量を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞にEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)が結合する割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、CARが導入された細胞に結合する標識したEGFRの蛍光強度を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインを産生する細胞の割合を示す図である。 レトロウイルスコピー数に対する、サイトカインの産生量を示す図である。
本明細書において「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、抗原に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を示す。「キメラ抗原受容体(CAR)」は、「キメラ受容体」、「T−body」、「キメラ免疫受容体(CIR)」と呼ばれることがある。「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、ある抗原に結合することができる任意のオリゴ又はポリペプチドを示し、「細胞内ドメイン」は細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。
本明細書において「腫瘍抗原」とは、細胞のがん化に伴って新たに発現が認められるようになる、抗原性を有する生体分子を意味する。腫瘍抗原の検出、例えば免疫学的な検出は、がん化した細胞とその母細胞の区別に有用である。本発明における腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原(腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原)、又は腫瘍関連抗原(他の臓器・組織又は異種異系の正常細胞にも存在する抗原、発生・分化の途上において発現する抗原)を含む。
本明細書において「グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体(GITR)」とは、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子(Glucocorticoid−induced TNF receptor−family related gene)の産物であるタンパク質を示す。GITRは、細胞表面の膜貫通タンパク質受容体であり、TNF受容体(TNFR)スーパーファミリーの一員である。GITRは、非活性化T細胞上に構築的に存在することが示されており、GITRリガンド(GITRL)と称する別の膜貫通タンパク質に結合する。GITRのアミノ酸配列はNCBI Reference Sequence(NCBI RefSeq):NP_004186.1、カレント バイオロジー(Curr.Biol.)、第9巻、第4号、第215−218頁(1999)に記載される。
本明細書において「単鎖抗体(scFv)」とは、抗原との結合能力を保持した、抗体由来の一本鎖ポリペプチドを意味する。例えば組換えDNA技術により形成され、スペーサー配列を介して免疫グロブリン重鎖(H鎖)及び軽鎖(L鎖)フラグメントのFv領域を連結した抗体ポリペプチドが例示される。scFvの各種作製方法が公知であり、米国特許第4694778号公報、サイエンス(Science)、第242巻、第423−442頁(1988)、ネイチャー(Nature)、第334巻、第54454頁(1989)、サイエンス(Science)、第242巻、第1038−1041頁(1988)に記載されている方法が挙げられる。
本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の一領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる(フォールディングされる)領域を意味する。
(1)本発明のCAR
本発明のCARは、N末端側から順に抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含み、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインを含むことを特徴とする。本発明のCARは細胞での発現量が高く、本発明のCARを発現する細胞は細胞の増殖率、サイトカインの産生量が高く、CARが結合する抗原を表面に有する細胞に対して高い細胞傷害活性を有する。
(a)細胞外ドメイン
本発明のCARに使用される「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、標的とする抗原に結合することができるオリゴ又はポリペプチドを含むドメインであり、例えば、抗体の抗原結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメインが含まれる。このドメインは、抗原、例えば細胞表面に存在する抗原と結合し、相互作用することによりCARを発現する細胞に特異性を付与する。本発明において特に有用な細胞外ドメインとしては、抗体(H鎖及びL鎖)、TCRの可変領域(TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ)、CD8α、CD8β、CD11A、CD11B、CD11C、CD18、CD29、CD49A、CD49B、CD49D、CD49E、CD49F、CD61、CD41、又はCD51に由来するものが例示される。これらのタンパク質全体を使用するのが有効なこともあるが、特に抗原やリガンドに結合するドメイン、例えば、抗体Fabフラグメント、抗体可変領域[H鎖のV領域(VH)及びL鎖のV領域(VL)]又は受容体の細胞外ドメインを使用することができる。特にscFvが好適に使用できる。
本発明のCARの細胞外ドメインは、1種類の抗原又はリガンドにのみ結合するものでもよく、2種以上の抗原又はリガンドに結合する細胞外ドメインでもよい。また、本発明には、1つの細胞外ドメインを含むCAR及び2つ以上の細胞外ドメインを含むCARのいずれもが含まれる。
細胞外ドメインは、標的とする抗原を認識する抗体又は前記抗原と相互作用する分子から選択することができる。この抗原は例えば、ウイルス抗原、細菌(特に感染性細菌)抗原、寄生虫抗原、特定の病状に関係した標的細胞上の細胞表面マーカー(例えば腫瘍抗原)や免疫関連細胞の表面分子を包含する。
本発明の一つの態様として、例えばレトロウイルス科(retroviridae、例えば、HIV−1及びHIV−LPのような、ヒト免疫不全ウイルス)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae、例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス)、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科(Adenoviridae)、ヘルペスウイルス科[Herpesviridae、例えば、1型及び2型の単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス]、ポックスウイルス科(Poxviridae、例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス)、C型肝炎ウイルスに由来する抗原に結合するCARが提供される。
本発明の別の態様として、ブドウ球菌属(Staphylococci)の菌種、連鎖球菌属(Streptococcus)の菌種、大腸菌(Escherichia coli)の菌種、シュードモナス属(Pseudomonas)の菌種及びサルモネラ属(Salmonella)の菌種に由来する抗原に結合するCARが含まれる。特に、感染性細菌、例えば、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、マイコバクテリウム属(Mycobacteria sps)の菌種(例えば、M.tuberculosis、M.avium、M.intracellulare、M.kansaii、M.gordonea)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、A群連鎖球菌、B群連鎖球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、破傷風菌(Clostridium tetani)に由来する抗原に結合するCARが提供される。
本発明の別の態様として、5T4、アルファ5β1−インテグリン、707−AP、AFP、ART−4、B7H4、BAGE、β−カテニン/m、Bcr−abl、MN/C IX抗原、CA125、CAMEL、CAP−1、CASP−8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp−B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6−AML1、G250、GAGE、GnT−V、Gp100、HAGE、HER−2/new、HLA−A*0201−R170I、HPV−E7、HSP70−2M、HST−2、hTERT(又はhTRT)、iCE、IGF−1R、IL−2R、IL−5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART−1/melan−A、MART−2/Ski、MC1R、ミオシン/m、MUC1、MUM−1、MUM−2、MUM−3、NA88−A、PAP、プロテイナーゼ−3、p190マイナーbcr−abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1又はRU2、SAGE、SART−1又はSART−3、サバイビン、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP−1、TRP−2、TRP−2/INT2、VEGF、WT1、NY−Eso−1又はNY−Eso−Bなどの腫瘍抗原に結合するCARが提供される。また、細胞表面接着分子、自己免疫疾患において出現する炎症細胞の表面分子、及び自己免疫を起こすTCRに結合するCARも提供される。
(b)細胞内ドメイン
本発明に使用される細胞内ドメインは、同一分子内に存在する細胞外ドメインが抗原と結合(相互作用)した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。
本発明のCARは、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインを含むことを特徴とする。GITRの細胞内ドメインは、同一の機能を有するその変異体を含む。用語「変異体」は、1個又は数個〜複数個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む任意の変異体を意味するが、ただし、当該変異体は元の配列が保持していたものと同一の機能を実質的に保持する。例えば、本発明に使用するGITRの細胞内ドメインは、GITR(NCBI RefSeq:NP_004186.1)のアミノ酸番号193〜241(配列番号28)を含む細胞内ドメインが例示される。
本発明のCARはGITRの細胞内ドメインに加えて他のポリペプチドに由来する細胞内ドメインを使用することができる。このような細胞内ドメインは、TCR複合体及び共刺激分子に由来する細胞質配列、並びにそれらの配列の同一の機能を有する任意の変異体が含まれる。
TCR複合体のみを介して発生されたシグナルはT細胞の活性化に不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。天然のT細胞活性化は、2つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちTCR複合体を介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列(一次細胞質シグナル伝達配列)及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列(二次細胞質シグナル伝達配列)によって伝達されている。好適な態様において、本発明のCARは、細胞内ドメインとして、前記一次細胞質シグナル伝達配列及び/又は二次細胞質シグナル伝達配列を含む。
一次細胞質シグナル伝達配列は、TCR複合体の一次活性化を調節する。活性化を刺激する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)として知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある[ネイチャー(Nature)、第338巻、第383−384頁(1989)]。一方、抑制的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ(ITIM)として知られるシグナル伝達モチーフを含む[ジャーナル オブ イムノロジー(J Immunol.)、第162巻、第2号、第897−902頁(1999)]。本発明には、ITAM又はITIMを有する細胞内ドメインが使用できる。
本発明で使用できるITAMを有する細胞内ドメインは、例えば、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するITAMを包含する。具体的には、CD3ζ(NCBI RefSeq:NP_932170.1)のアミノ酸番号51〜164(配列番号26)、FcεRIγ(NCBI RefSeq:NP_004097.1)のアミノ酸番号45〜86、FcεRIβ(NCBI RefSeq:NP_000130.1)のアミノ酸番号201〜244、CD3γ(NCBI RefSeq:NP_000064.1)のアミノ酸番号139〜182、CD3δ(NCBI RefSeq:NP_000723.1)のアミノ酸番号128〜171、CD3ε(NCBI RefSeq:NP_000724.1)のアミノ酸番号153〜207、CD5(NCBI RefSeq:NP_055022.2)のアミノ酸番号402〜495、CD22(NCBI RefSeq:NP_001762.2)のアミノ酸番号707〜847、CD79a(NCBI RefSeq:NP_001774.1)のアミノ酸番号166〜226、CD79b(NCBI RefSeq:NP_000617.1)のアミノ酸番号182〜229、CD66d(NCBI RefSeq:NP_001806.2)のアミノ酸番号177〜252の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。なお、本明細書に記載するNCBI RefSeq IDやGenBankのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体(シグナルペプチド配列などを含む)を全長として付された番号である。
本発明で使用できる二次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインには、例えば、CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS、及びCD154に由来する配列が含まれる。具体的には、CD2(NCBI RefSeq:NP_001758.2)のアミノ酸番号236〜351、CD4(NCBI RefSeq:NP_000607.1)のアミノ酸番号421〜458、CD5(NCBI RefSeq:NP_055022.2)のアミノ酸番号402〜495、CD8α(NCBI RefSeq:NP_001759.3)のアミノ酸番号207〜235、CD8β(GenBank:AAA35664.1)のアミノ酸番号196〜210、CD28(NCBI RefSeq:NP_006130.1)のアミノ酸番号181〜220(配列番号25)、CD137(4−1BB、NCBI RefSeq:NP_001552.2)のアミノ酸番号214〜255、CD134(OX40、NCBI RefSeq:NP_003318.1)のアミノ酸番号241〜277、ICOS(NCBI RefSeq:NP_036224.1)のアミノ酸番号166〜199の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。
本発明は、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインのみを含むCAR、GITRの細胞内ドメインの他に1つ又は複数、例えば2つ又は3つの細胞内ドメインを含むCARを含む。特に好適には、細胞内ドメインとして、GITRの細胞内ドメイン及びCD3ζの細胞内ドメインを含むCAR、GITRの細胞内ドメイン、CD3ζの細胞内ドメイン及びCD28の細胞内ドメインを含むCARが例示される。同じ種類の細胞内ドメインを複数個タンデムに連結したCARも本発明に含まれる。本発明の一態様は、GITRの細胞内ドメインがCD3ζの細胞内ドメインよりC末端側に配置されるCARである。すなわち、N末端側からCD3ζの細胞内ドメイン、GITRの細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むCARである。このCARに更にCD28の細胞内ドメインを追加して、N末端側からCD28の細胞内ドメイン、CD3ζの細胞内ドメイン、GITRの細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むCAR、N末端側から順にCD3ζの細胞内ドメイン、GITRの細胞内ドメイン、CD28の細胞内ドメインの順に連結された細胞内ドメインを含むCARも本発明に含まれる。本発明の別の態様として、GITRの細胞内ドメインがC末端側に配置されるCARも本発明に含まれる。
複数の細胞内ドメインを含むCARは、それらの細胞内ドメインの間にオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを挿入して連結することができる。好ましくは長さが2〜10個のアミノ酸からなるリンカーが使用できる。特にグリシン−セリン連続配列を有するリンカーを使用することができる。
(c)膜貫通ドメイン及びスペーサードメイン
本発明のCARは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは天然のポリペプチドに由来するものでもよく、人為的に設計したものでもよい。天然のポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から取得することができる。例えば、T細胞受容体のα、β鎖、CD3ζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITRの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。また、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、例えば長さが2〜10個のアミノ酸配列からなるリンカーを、膜貫通ドメインと前記(b)の細胞内ドメインとの間に配置することができる。特にグリシン−セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。
本発明の一態様として、膜貫通ドメインはCD28(NCBI RefSeq:NP_006130.1)のアミノ酸番号153〜180(配列番号24)の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。更に別の態様として、GITR(NCBI RefSeq:NP_004186.1)のアミノ酸番号162〜183(配列番号27)の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。
本発明のCARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、又は細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメインを配置することができる。スペーサードメインは、膜貫通ドメインと細胞外ドメイン及び/又は膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを連結する働きをする任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、300個までのアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは25〜50個のアミノ酸を含む。
スペーサードメインは、CARと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが好ましい。結合を促進すると予想されるアミノ酸は、システイン、荷電アミノ酸又は潜在的なグリコシル化部位内のセリン又はスレオニンなどのアミノ酸が例示され、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用することができる。
スペーサードメインは、CD8α(NCBI RefSeq:NP_001759.3)のヒンジ領域であるアミノ酸番号118〜178(配列番号23)、CD8β(GenBank:AAA35664.1)のアミノ酸番号135〜195、CD4(NCBI RefSeq:NP_000607.1)のアミノ酸番号315〜396、又はCD28(NCBI RefSeq:NP_006130.1)のアミノ酸番号137〜152の全部又は一部分を使用することができる。また、スペーサードメインは、抗体H鎖又はL鎖の定常領域の一部(CH1領域又はCL領域、例えば配列番号34に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド)も使用することができる。さらに、人工的に合成した配列であってもよい。
本発明のCARは、多量体、特に二量体となるよう設計することができる。例えば、スペーサードメイン及び/又は膜貫通ドメインにシステインを挿入することにより、CARが多量体化(二量体化)される。
更に、本発明のCARは、N末端にシグナルペプチド配列を連結することができる。シグナルペプチド配列は多くの分泌タンパク質、膜タンパク質のN末端に存在し、15〜30アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして前記に例示したタンパク質分子の多くはシグナルペプチド配列を有していることから、これらのシグナルペプチドを本発明のCARのシグナルペプチドとして使用することができる。
(2)CARをコードする核酸
本発明は、前記(1)に記載するCARをコードする核酸を提供する。CARをコードする核酸は、特定されたCARのアミノ酸配列から常法により容易に作製することができる。前記に記載した各ドメインのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明の核酸を作製できる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明の核酸を作製することができる。
本発明の核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等(例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン)により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、核酸の効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に本発明の核酸に加えて、当該核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子(例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等)を組み込んでもよい。
本発明は、本発明の核酸を活性成分として、薬学的に許容できる賦形剤と共に含む組成物を提供する。適している薬学的に許容できる賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(例えば、0.01Mリン酸塩、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH7.4)、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの溶液及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びpH緩衝剤も使用することができる。薬学的に許容できる賦形剤としては、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.、N.J.1991)(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されるものを適宜使用できる。組成物は、非経口投与、例えば、注射又は注入に適した公知の形態とすることができる。更に、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び/又は分散剤などの製剤補助剤、保存中の有効期限を延ばすために保存剤を使用することができる。組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。微粒子仲介投与用には、顕微鏡サイズの金粒子などの粒子上にDNAをコーティングすることができる。
本発明の核酸を生体外で細胞に導入する場合には、本発明の核酸は上記の賦形剤に加えて細胞への核酸の移行を促進する物質、例えばリポソーム、カチオニックリピドのような核酸導入用試薬と組み合わせてもよい。また、後述のように本発明の核酸を保持するベクターも有用である。特に、適切なベクターに保持された本発明の核酸を含有する、生体への投与に適した形態の組成物は、in vivo遺伝子治療に好適である。
本発明の核酸を活性成分として含む組成物は、該核酸がコードするCARが結合する抗原にもよるが、例えば、がん[血液がん(白血病)、固形腫瘍など]、炎症性疾患/自己免疫疾患(喘息、湿疹)、肝炎や、インフルエンザ、HIVなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、MRSA、VRE、深在性真菌症等の疾患の治療のために投与することができる。本発明の核酸を活性成分として含む組成物は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。
(3)CARを発現する細胞の製造方法
本発明のCARを発現する細胞の製造方法は、前記(2)に記載するCARをコードする核酸を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は生体外(ex vivo)で実施される。例えば、本発明の核酸を含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液(末梢血、臍帯血など)、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞(PBMC)、免疫細胞[樹状細胞、B細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、NK細胞又は血球系細胞(好中球、好塩基球)]、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にT細胞、T細胞の前駆細胞(造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等)又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。T細胞には、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。T細胞及びT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、PBMCが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたCARを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが好ましい。
本発明のCARをコードする核酸をベクターに挿入して、このベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター(オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する)、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス(EBV)ベクター、HSVベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
また、リポソーム及び国際公開第96/10038号パンフレット、国際公開第97/18185号パンフレット、国際公開第97/25329号パンフレット、国際公開第97/30170号パンフレット及び国際公開第97/31934号パンフレット(いずれも、出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも本発明に使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、DEAE−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。
例えばレトロウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているLTR配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばPG13(ATCC CRL−10686)、PA317(ATCC CRL−9078)、GP+E−86やGP+envAm−12(米国特許第5,278,056号公報)、Psi−Crip[米国科学アカデミー紀要、第85巻、第6460−6464頁(1988)]のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い293細胞や293T細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。
核酸を細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる[例えば、国際公開第95/26200号パンフレット、国際公開第00/01836号パンフレット(いずれも出典明示により本明細書の一部とする)]。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン(RetroNectin、登録商標、CH−296、タカラバイオ社製)として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、V型コラーゲン、ポリリジン又はDEAE−デキストランを使用することができる。
本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器(プレート、シャーレ、フラスコ又はバッグ等)又は担体(マイクロビーズ等)に固定化された状態で使用することができる。
(4)CARを発現する細胞
本発明のCARを発現する細胞は、前記(3)の製造方法により、前記(2)のCARをコードする核酸が導入・発現した細胞である。
本発明の細胞は、CARを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。CARを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やCARの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン(腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど)の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、B細胞、樹状細胞、NK細胞、マクロファージ等を刺激する。
CARを発現する細胞は疾患の治療剤として使用することができる。該治療剤は、CARを発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいてもよい。該賦形剤としては、例えば、本発明の核酸を活性成分として含む組成物に関して記載された上述の薬学的に許容できる賦形剤、種々の細胞培養培地、等張食塩水などが挙げられる。CARを発現する細胞が投与される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん[血液がん(白血病)、固形腫瘍など]、炎症性疾患/自己免疫疾患(喘息、湿疹)、肝炎や、インフルエンザ、HIVなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、MRSA、VRE、深在性真菌症が例示される。前記の疾患において減少もしくは消失が望まれる細胞が有している抗原、すなわち腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等に結合する本発明のCARを発現する細胞がこれら疾患の治療のために投与される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。CARを発現する細胞を活性成分として含む治療剤は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については2001年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス(T.Maniatis)ら編集、モレキュラー クローニング:ア ラボラトリー マニュアル第3版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.)(出典明示により本明細書の一部とする)に記載の方法によった。
実施例1 抗CEA−CAR発現ベクターの作製
まず、pMSCVneo(Clontech社製)を鋳型に配列番号1記載の3MSCV5プライマー及び配列番号2記載の3MSCV3プライマーでPCRを行い、MSCV3’LTR部位を増幅した。得られた増幅断片を制限酵素XhoIとEcoRIで切断し、pMベクター[ジーン セラピー(Gene Therapy) 第7巻、第797−804頁(2000)に記載されているpMベクター]のXhoI−EcoRIサイトにクローニングし、pMS−MCを作製した。更に、pMEI−5ベクター(タカラバイオ社製)を制限酵素MluIとXhoIにて切断し、pMS−MCのMluI−XhoIサイトへ挿入し、pMS3−MCを作製した。pMS3−MCは、5’末端から順にMMLV由来の5’LTR、MMLV由来のSD、MMLV由来のψ、ヒトEF1α遺伝子由来のSA、U3領域はMSCV由来で残りの領域はMMLV由来の3’LTRを含む。
図1A、Bに示すように、配列番号3に示す塩基配列の人工合成遺伝子(図1A中、抗CEA−28z−CARと表記する)及び、配列番号4に示す塩基配列の人工合成遺伝子(図1B中、抗CEA−z28−CARと表記する)を作製した。これらの人工合成遺伝子は、がん抗原CEA(carcinoembryonic antigen)と結合する抗CEAモノクローナル抗体のscFv(アミノ酸配列を配列番号22に記載する)、配列番号23に記載するアミノ酸配列を有するCD8α鎖ヒンジドメイン、配列番号24に記載するアミノ酸配列を有するCD28膜貫通ドメイン、配列番号25に記載するアミノ酸配列を有するCD28細胞内ドメイン、配列番号26に記載するアミノ酸配列を有するCD3ζ細胞内ドメインから成る1分子のキメラタンパク質をコードする。図1において、抗CEAモノクローナル抗体のscFvを「CEA−scFv」、ヒンジドメインを「CD8 hinge」、膜貫通ドメインを「CD28 TM」、CD28の細胞内ドメインを「CD28 ICD(IntraCellular Domain)」、CD3ζ細胞内ドメインを「CD3ζ」、末端反復配列を「LTR」、スプライスドナー配列を「SD」、スプライスアクセプター配列を「SA」、パッケージングシグナル配列を「ψ」と表示する。これらの人工合成遺伝子を含む核酸断片を、BglII−BamHIにて消化したpMS3−MCベクターにクローニングし、CD28細胞内ドメインがCD3ζ細胞内ドメインに対してN末端側に配置されるCARを発現するpMS3−CEA−28z−CARベクターを作製した。逆に、CD3ζ細胞内ドメインがCD28細胞内ドメインに対してN末端側に配置されるCARを発現するpMS3−CEA−z28−CARベクターを作製した。
実施例2 GITR遺伝子を搭載したCAR発現ベクターの作製
配列番号5に示す人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は配列番号27に記載するアミノ酸配列を有するGITR膜貫通ドメイン及び配列番号28に記載するアミノ酸配列を有するGITR細胞内ドメインをコードする。この人工合成遺伝子を鋳型とし、配列番号6に示す28TM−G−Fプライマーと配列番号7に示すG−z−Rプライマーを用いたPCRを行って増幅DNA断片Aを、配列番号8に示すz−G−Fプライマーと配列番号9に示すG−MC−Rプライマーを用いたPCRを行って増幅DNA断片Bを、配列番号10に示す28SD−G−Fプライマーと配列番号7に示すG−z−Rプライマーを用いたPCRを行って増幅DNA断片Cを、配列番号11に示すhinge−G−Fプライマーと配列番号12に示すG−28SD−Rプライマーを用いたPCRを行って増幅DNA断片Dを、配列番号8に示すz−G−Fプライマーと配列番号13に示すG−28SD−R2プライマーを用いたPCRを行って増幅DNA断片Eをそれぞれ得た。
実施例1で作製したpMS3−CEA−28z−CARベクターを鋳型とし、配列番号14に示す28TM−Rプライマーと配列番号15に示すz−Fプライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に、In−Fusion Advantage PCR Cloning Kit(クロンテック社製)を使用して増幅DNA断片Aをクローニングし、pMS3−CEA−Gz−CARベクターを作製した。
以下同様に、実施例1で作製したpMS3−CEA−z28−CARベクターを鋳型とし、配列番号16に示すz−Rプライマーと配列番号17に示すEND−MC−Fプライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に増幅DNA断片Bをクローニングし、pMS3−CEA−zG−CARベクターを作製した。このベクターが発現するCEA−zG−CARのアミノ酸配列を配列番号29に示す。
pMS3−CEA−28z−CARベクターを鋳型とし、配列番号18に示す28SD−Rプライマーと配列番号15に示すz−Fプライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に増幅DNA断片Cをクローニングし、pMS3−CEA−28Gz−CARベクターを作製した。
pMS3−CEA−28z−CARベクターを鋳型とし、配列番号19に示すhinge−Rプライマーと配列番号20に示す28SD−Fプライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に増幅DNA断片Dをクローニングし、pMS3−CEA−G28z−CARベクターを作製した。
pMS3−CEA−z28−CARベクターを鋳型とし、配列番号16に示すz−Rプライマーと配列番号21に示す28SD−F2プライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に増幅DNA断片Eをクローニングし、pMS3−CEA−zG28−CARベクターを作製した。このベクターが発現するCEA−zG28−CARのアミノ酸配列を配列番号30に示す。
pMS3−CEA−28z−CARベクターを鋳型とし、配列番号16に示すz−Rプライマーと配列番号17に示すEND−MC−Fプライマーを用いたPCRを行った。こうして得られた増幅産物に増幅DNA断片Bをクローニングし、pMS3−CEA−28zG−CARベクターを作製した。
作製した各ベクターが発現するCARの構造は、図2に示される構造(2)〜(9)に対応する。すなわち、pMS3−CEA−28z−CARベクターは(2)28z、pMS3−CEA−z28−CARベクターは(3)z28、pMS3−CEA−Gz−CARベクターは(4)Gz、pMS3−CEA−zG−CARベクターは(5)zG、pMS3−CEA−28Gz−CARベクターは(6)28Gz、pMS3−CEA−G28z−CARベクターは(7)G28z、pMS3−CEA−zG28−CARベクターは(8)zG28、pMS3−CEA−28zG−CARベクターは(9)28zGの構造を有するCARを発現する。
実施例3 レトロウイルス溶液の作製
実施例1及び2で作製したプラスミドベクターにより大腸菌JM109をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持するプラスミドDNAをQIAGEN Plasmid Midi Kit(キアゲン社製)を用いてそれぞれ精製し、トランスフェクション用DNAとして以下の操作に供した。
調製したトランスフェクション用DNAのそれぞれとRetorovirus Packaging Kit Eco(タカラバイオ社製)に含有されるpGPベクター、pEecoベクターを293T細胞にそれぞれトランスフェクトした。この操作は前記キットの製品プロトコールに従って行った。得られた形質導入細胞のそれぞれよりエコトロピックウイルスを含有する上清液を獲得し、0.45μmフィルター(Milex HV、ミリポア社製)にてろ過した。この上清を用いて、ポリブレンを使用する方法によりPG13細胞(ATCC CRL−10686)にエコトロピックウイルスを感染させた。得られた細胞の培養上清を回収し、0.45μmフィルターによりろ過し、抗CEA−CAR発現用レトロウイルス溶液とした。各ウイルスは発現するCARの構造からそれぞれ(2)CEA−28z、(3)CEA−z28、(4)CEA−Gz、(5)CEA−zG、(6)CEA−28Gz、(7)CEA−G28z、(8)CEA−zG28、(9)CEA−28zGと命名した。
実施例4 ヒトPBMCへの抗CEA−CARレトロウイルスの感染1
インフォームドコンセントを得て採取されたヒト末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC)に、実施例3で作製した各抗CEA−CAR発現用レトロウイルス溶液を、レトロネクチン(登録商標、タカラバイオ社製)を用いた標準的な方法で2回感染させ、抗CEA−CAR発現PBMCをそれぞれ作製した。各レトロウイルス溶液について3群のPBMCを準備し、2倍、4倍、8倍の3段階に希釈したレトロウイルス溶液を用いて感染を実施した。2回目のウイルス感染から5日後の細胞よりFastPure DNA Kit(タカラバイオ社製)を用いてゲノムDNAを抽出し、Provirus Copy Number Detection Primer Set,Human(タカラバイオ社製)とCycleavePCR Core Kit(タカラバイオ社製)を用いて、ゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数の測定を行った。
また、2回目のウイルス感染から3日後の細胞にBiotin−Labeling Kit−NH(同仁化学社製)によりビオチン標識したCEAタンパク質を添加した後、ストレプトアビジン−PE(フィコエリスリン:ベクトンディッキンソン社製)及びFITC標識抗Human CD8 抗体(ベクトンディッキンソン社製)により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、FITC陽性細胞中のPE陽性である細胞の割合、すなわちCD8陽性細胞中のCEAに結合するCARが陽性である細胞の割合を測定した。また、蛍光色素PEの平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗CEA−CAR陽性細胞における、抗CEA−CARの発現量を反映している。その結果、いずれの細胞においても細胞表面のCARが陽性であることを確認した。特に、(5)CEA−zGを感染させた細胞は(4)CEA−Gzを感染させた細胞に比べて抗CEA−CARの陽性率及び平均蛍光強度が高かった。(2)CEA−28z、(3)CEA−z28、(5)CEA−zGを感染させた細胞について、図3に抗CEA−CAR陽性率(縦軸)とゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数(横軸)の関係を示し、図4にビオチン標識したCEAタンパク質が陽性である細胞に由来するPEの平均蛍光強度(縦軸)とゲノムに組み込まれたレトロウイルスコピー数(横軸)の関係を示す。図3及び図4に示すように、抗CEA−zG−CARを導入したPBMC[(5)CEA−zG]は、GITR細胞内ドメインを有していない他の抗CEA−CAR導入PBMCと比べて、高い抗CEA−CAR陽性率が得られ、また、抗CEA−CARの発現量も高いことが分かった。
実施例5 ヒトPBMCへの抗CEA−CARレトロウイルスの感染2
インフォームドコンセントを得て採取されたヒトPBMCに、実施例3で作製した抗CEA−CAR発現用レトロウイルス溶液のうち、(2)CEA−28zを4倍、6倍、8倍希釈、(5)CEA−zGを原液、2倍、4倍希釈、(9)CEA−28zG又は(8)CEA−zG28を2倍、4倍、8倍希釈し、レトロネクチン(登録商標、タカラバイオ社製)を用いた標準的な方法で2回感染を行い、抗CEA−CAR発現PBMCをそれぞれ作製した。2回目のウイルス感染6日後に細胞を回収し、実施例4と同様にしてゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定を行った。比較的レトロウイルスコピー数の近い各抗CEA−CAR発現細胞[(2)CEA−28z:0.27コピー、(5)CEA−zG:1.3コピー、(9)CEA−28zG:0.81コピー、(8)CEA−zG28:0.65コピー)を選び、実施例4と同様に染色した細胞について、CD8陽性細胞中の抗CEA−CARが陽性である細胞の割合及びPEの平均蛍光強度を測定した。図5に抗CEA−CARの陽性率を示し、図6に当該陽性細胞のPE平均蛍光強度を示す。図5及び図6に示すように、(5)CEA−zG、(9)CEA−28zG及び(8)zG28を感染させた細胞は、(2)CEA−28zを感染させた細胞と比べて、抗CEA−CARを発現する細胞の割合が高く、また、抗CEA−CARの発現量も高いことが分かった。
また、2回目のウイルス感染11日後に細胞を回収し、96−wellプレートにてCalsein release assayによって細胞傷害活性を測定した。Calsein−AM(同仁化学社製)を取り込ませたCEA陽性細胞株MKN−45及びCEA陰性細胞株MKN−1(いずれも理研バイオリソースセンターから入手可能)を1.0×10cells/mLとなるように懸濁した後、1ウェルあたり100μL添加した。また、上記抗CEA−CAR導入PBMC及びコントロールとしてベクターを導入しなかったPBMC(NGMC)を懸濁し、ET比が30、10、3、1となるように100μL添加した。PBMCの代わりに、Low controlとして培地を、High controlとして0.1% Triton X−100を100μL添加するウェルを用意した。細胞及びコントロールを調製した後、96−wellプレートを5.0%COガスで平衡化した37℃ COインキュベーター中で4時間保温した。次いで、上清100μLについてλex=490nm、λem=515nmにて蛍光強度を測定し、放出Calsein量を測定した。細胞傷害活性(Lysis)を下式によって算出した結果を図7に示す。
細胞傷害活性(%)=100×(各ウェルの測定値−Low controlの測定値)/(High controlの測定値−Low controlの測定値)
図7に示すように、CEA陽性細胞株MKN−45において抗CEA−CARを導入したPBMCによる細胞傷害活性が見られた。特に、(5)CEA−zG導入PBMC、(9)CEA−28zG導入PBMC及び(8)CEA−zG28導入PBMCで強い細胞傷害活性が得られ、GITRの細胞内ドメインを有するCARががんの処置において有用であることが示された。
実施例6 CEA−zG28の再作製、及び、レトロウイルス溶液の作製
実施例5で使用したCEA−zG28のCD28細胞内ドメインのコード領域にフレームシフトが見つかったため、このフレームシフトを修復したプラスミドDNAを作製し、QIAGEN Plasmid Midi Kit(キアゲン社製)を用いて精製した。この精製プラスミドDNAをトランスフェクション用DNAとして実施例3と同様の方法でウイルス溶液を調製した。得られたレトロウイルス溶液を(8)CEA−zG28_rと命名した。
実施例7 ヒトPBMCへの抗CEA−CARレトロウイルスベクターの感染3
インフォームドコンセントを得て採取されたヒトPBMCに、実施例6で作製した(8)CEA−zG28_r及び(9)CEA−28zGを原液、2倍、4倍希釈、8倍希釈し、実施例4と同様にしてヒトPBMCに感染させた後、ゲノムに組み込まれたウイルスコピー数の測定と、CD8陽性細胞中の抗CEA−CARが陽性である細胞の割合及びPEの平均蛍光強度を測定した。図8にコピー数に対する抗CEA−CARの陽性率を示し、図9にコピー数に対するPE平均蛍光強度を示す。図8及び図9に示すように、(8)CEA−zG28_rを感染させた細胞は、抗CEA−CARを発現することを確認した。
また、2回目のウイルス感染6日後に比較的レトロウイルスコピー数の近い各抗CEA−CAR発現細胞[(9)CEA−28zG:2.22コピー、(8)CEA−zG28_r:2.12コピー)を選び、細胞を回収し、実施例5と同様に、CEA陽性細胞株MKN−45及びCEA陰性細胞株MKN−1に対する細胞傷害活性を測定した。その結果を図10に示す。図10に示すように、CEA陽性細胞株MKN−45において、いずれの抗CEA−CARを導入したPBMCでも同等の細胞傷害活性が見られた。
実施例8 ヒトPBMCへの抗CEA−CARレトロウイルスベクターの感染4
実施例3で作製した(5)CEA−zG及び(9)CEA−28zGを原液、2倍、4倍希釈、8倍希釈した希釈液、(2)CEA−28zを原液、2倍、4倍、8倍、16倍希釈した希釈液をそれぞれ調製した。インフォームドコンセントを得て採取されたヒトPBMCについて、これらのレトロウイルスベクター希釈液とレトロネクチン(登録商標)を用いた標準的な方法で2回感染を行い、抗CEA−CAR発現PBMCをそれぞれ作製した。2回目のウイルス感染5日後に細胞を回収し、実施例4記載の方法によりゲノムに組み込まれたウイルスコピー数を測定するとともに、CD8陽性細胞中の抗CEA−CARが陽性である細胞の割合及びPEの平均蛍光強度を測定した。図11にコピー数に対する抗CEA−CARの陽性率を示し、図12にコピー数に対するPE平均蛍光強度を示す。図11及び図12に示すように、コピー数に対する抗CEA−CARを発現する細胞の割合はいずれも同等であり、コピー数に対するPEの平均蛍光強度、すなわち発現量は(5)CEA−zGが最も高かった。
また、2回目のウイルス感染6日後に細胞を回収し、96−wellプレートにて細胞内サイトカインの染色を以下の通り行った。細胞内輸送阻害剤BrefeldinA(シグマ社製)を含む培地で上記抗CEA−CAR導入PBMCを1.0×10cells/mLとなるように懸濁した懸濁液を、前記プレートの1ウェルあたり100μL添加した。さらに、CEA陽性細胞株MKN−45の1.0×10cells/mL懸濁液を100μL添加し、5時間共培養させた。共培養させた細胞をAPCcy7標識抗Human CD8 抗体(ベクトンディッキンソン社製)により染色した後、IntraPrep Reagent(ベックマンコールター社製)処理を行い、PE標識抗Human IFNγ 抗体(ベックマンコールター社製)及びAPC標識抗Human TNFα 抗体(eBioscience社製)により染色を行った。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、CD8陽性細胞中のIFNγ産生細胞の割合と蛍光色素PEの平均蛍光強度を測定し、また、CD8陽性細胞中のTNFα産生細胞の割合と蛍光色素APCの平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗CEA−CAR陽性細胞におけるIFNγ及びTNFαの細胞内サイトカイン量を反映している。
図13にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対する、IFNγ産生細胞率(縦軸)の関係を示し、図14にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対するPE平均蛍光強度(縦軸)の関係を示す。図13に示すように、IFNγ産生率は(2)CEA−28zに比べ(9)CEA−28zGが低いにも関わらず、図14に示すように、(9)CEA−28zGのIFNγ産生量は(2)CEA−28zと同等であることが確認された。すなわち、IFNγ産生細胞におけるIFNγ産生量は(9)CEA−28zG導入細胞が高くなった。
また、同様に図15にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対する、TNFα産生細胞率(縦軸)の関係を示し、図16にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対するAPC平均蛍光強度(縦軸)の関係を示す。図15に示すように、TNFα産生率は(9)CEA−28zGは(2)CEA−28zよりも下回るにも関わらず、図16に示すように、TNFα産生量は(9)CEA−28zGが上回った。すなわち、IFNγと同様に、TNFα産生細胞におけるIFNγ産生量は(9)CEA−28zG導入細胞が高いという結果になった。
以上より、CD28の細胞内ドメインを有するCARにさらにGITRの細胞内ドメインを搭載させることにより、サイトカイン産生能が増強された細胞を製造することが可能となることが示された。
実施例9 抗EGFR−CAR発現レトロウイルスベクターの作製
配列番号31に示す塩基配列の人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は抗EGFR−CARであるEGFR−z、すなわち、配列番号32に記載するアミノ酸配列を有するヒトIgGリーダー配列、配列番号33に記載するアミノ酸配列を有するがん抗原EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)と結合する抗EGFRモノクローナル抗体のscFv、配列番号34に記載するアミノ酸配列を有するヒトIgG−LC(軽鎖定常領域)ドメイン、配列番号24に記載するアミノ酸配列を有するCD28膜貫通ドメイン、配列番号26に記載するアミノ酸配列を有するCD3ζ細胞内ドメインからなる1分子のキメラタンパク質をコードする。この人工合成遺伝子を含む核酸断片を、NotI−XhoIにて消化したpMS3−MCベクターにクローニングし、細胞内ドメインとしてCD3ζ細胞内ドメインのみを有する(1)EGFR−zを発現するpMS3−EGFR−LC−z−CARを作製した。なお、該CARの構造は、図2中の(1)に対応する。
実施例10 GITR遺伝子を搭載した抗EGFR−CAR発現ベクターの作製
実施例9で作製したpMS3−EGFR−LC−z−CARを基に、配列番号35に記載するアミノ酸配列を有する(2)EGFR−28zを発現するpMS3−EGFR−LC−28z−CARを作製した。以下同様に、配列番号36に記載するアミノ酸配列を有する(5)EGFR−zGを発現するpMS3−EGFR−LC−zG−CAR、配列番号37に記載するアミノ酸配列を有する(9)EGFR−28zGを発現するpMS3−EGFR−LC−28zG−CAR、配列番号38に記載するアミノ酸配列を有する(10)EGFR−z28Gを発現するpMS3−EGFR−LC−z28G−CAR、配列番号39に記載するアミノ酸配列を有する(7)EGFR−G28zを発現するpMS3−EGFR−LC−G28z−CARを作製した。なお、これらのCARの構造は、各々、図2中の(2)、(5)、(9)、(7)および(10)に対応する。
実施例11 レトロウイルス溶液の作製
実施例9及び10で作製したプラスミドベクターから、実施例3と同様の方法でウイルス溶液を調製した。各ウイルスは発現するCARの構造からそれぞれ(1)EGFR−z、(2)EGFR−28z、(5)EGFR−zG、(9)EGFR−28zG、(10)EGFR−z28G、(7)EGFR−G28zと命名した。
実施例12 ヒトPBMCへの抗EGFR−CARレトロウイルスベクターの感染
インフォームドコンセントを得て採取されたヒトPBMCに、実施例11で作製した各ウイルス溶液を、原液、2倍、4倍、8倍希釈し、レトロネクチン(登録商標)を用いた標準的な方法で2回感染を行い、抗EGFR−CAR発現PBMCをそれぞれ作製した。
2回目のウイルス感染5日後の細胞に、C末端がHis−tag修飾されたRecombinant Human EGFR(Sino Biological社製)を添加した後、ビオチン標識抗His−tag抗体(ミルテニーバイオテク社製)を添加した。その後、ストレプトアビジン−PE(フィコエリスリン:ベクトンディッキンソン社製)及びFITC標識抗Human CD8 抗体(ベクトンディッキンソン社製)により染色した。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、FITC陽性細胞中のPE陽性である細胞の割合、すなわちCD8陽性細胞中のEGFRに結合するCARが陽性である細胞の割合を測定した。また、蛍光色素PEの平均蛍光強度を測定した。さらに、2回目のウイルス感染5日後に細胞を回収し、実施例4と同様にしてゲノムに組み込まれたウイルスコピー数を測定した。図17にレトロウイルスのコピー数に対する抗EGFR−CARの陽性細胞率を示し、図18にレトロウイルスのコピー数に対するPE平均蛍光強度を示す。図17及び図18に示すように、全ての抗EGFR−CARの発現が確認された。
また、2回目のウイルス感染6日後に細胞を回収し、EGFR陽性細胞株Helaを使用する以外は実施例8と同様にして細胞内サイトカインの染色を行った。さらに、IFNγ及びTNFαに加えて、FITC標識抗Human IL−2(べクトンディッキンソン社製)によるIL−2の染色を行った。フローサイトメーターを使用し、染色後の細胞について、各サイトカインの産生細胞の割合と蛍光色素の平均蛍光強度を測定した。平均蛍光強度は抗CEA−CAR陽性細胞におけるIL−2、IFNγ及びTNFαの細胞内サイトカイン量を反映している。
図19にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対する、各サイトカイン産生細胞率(縦軸)の関係を示し、図20にレトロウイルスのコピー数(横軸)に対する平均蛍光強度(各サイトカイン産生量)(縦軸)の関係を示す。図19、図20に示すように、GITRの細胞内ドメインを搭載したCARは、CARの発現量に対するサイトカイン産生量が高い傾向が確認された。
本発明により、標的とする抗原に特異的に結合し、標的とする細胞に対する高い細胞傷害活性を細胞に付与するCAR、当該CARをコードする核酸及び当該CARを発現する細胞が提供される。これらのCAR、核酸、細胞は、腫瘍抗原等の抗原を標的にした養子免疫遺伝子治療の分野において有用である。
SEQ ID NO:1: 3MSCV5 primer
SEQ ID NO:2: 3MSCV3 primer
SEQ ID NO:3: Anti CEA-28z-CAR fragment sequence
SEQ ID NO:4: Anti CEA-z28-CAR fragment sequence
SEQ ID NO:5: GITR transmembrane region and cytoplasmic domain coding sequence
SEQ ID NO:6: 28TM-G-F primer
SEQ ID NO:7: G-z-R primer
SEQ ID NO:8: z-G-F primer
SEQ ID NO:9: G-MC-R primer
SEQ ID NO:10: 28SD-G-F primer
SEQ ID NO:11: hinge-G-F primer
SEQ ID NO:12: G-28SD-R primer
SEQ ID NO:13: G-28SD-R2 primer
SEQ ID NO:14: 28TM-R primer
SEQ ID NO:15: z-F primer
SEQ ID NO:16: z-R primer
SEQ ID NO:17: END-MC-F primer
SEQ ID NO:18: 28SD-R primer
SEQ ID NO:19: hinge-R primer
SEQ ID NO:20: 28SD-F primer
SEQ ID NO:21: 28SD-F2 primer
SEQ ID NO:22: Anti CEA scFv
SEQ ID NO:23: Human CD8 alpha chain hinge domain
SEQ ID NO:24: Human CD28 transmembrane domain
SEQ ID NO:25: Human CD28 cytoplasmic domain
SEQ ID NO:26: Human CD3 zeta chain cytoplasmic domain
SEQ ID NO:27: Human GITR transmembrane domain
SEQ ID NO:28: Human GITR cytoplasmic domain
SEQ ID NO:29: Anti CEA-zG-CAR sequence
SEQ ID NO:30: Anti CEA-zG28-CAR sequence
SEQ ID NO:31: Anti EGFR-LC-z-CAR coding sequence
SEQ ID NO:32: Human IgG leader sequence
SEQ ID NO:33: Anti EGFR monoclonal antibody scFv sequence
SEQ ID NO:34: Human IgG CL sequence
SEQ ID NO:35: Anti EGFR-28z-CAR sequence
SEQ ID NO:36: Anti EGFR-zG-CAR sequence
SEQ ID NO:37: Anti EGFR-28zG-CAR sequence
SEQ ID NO:38: Anti EGFR-z28G-CAR sequence
SEQ ID NO:39: Anti EGFR-G28z-CAR sequence

Claims (14)

  1. 抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸であって、細胞内ドメインとしてグルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体(GITR)の細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  2. 抗原が腫瘍抗原である請求項1記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  3. 抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である請求項1記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  4. 細胞内ドメインとして更にCD3ζ細胞内ドメインを含む請求項1記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  5. GITRの細胞内ドメインがCD3ζ細胞内ドメインよりC末端側に配置される請求項4記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
  6. 抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも1つの細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、細胞内ドメインとしてGITRの細胞内ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体。
  7. 抗原が腫瘍抗原である請求項6記載のキメラ抗原受容体。
  8. 抗原に結合する細胞外ドメインが抗原に結合する抗体の単鎖抗体である請求項6記載のキメラ抗原受容体。
  9. 細胞内ドメインとして更にCD3ζ細胞内ドメインを含む請求項6記載のキメラ抗原受容体。
  10. GITRの細胞内ドメインがCD3ζ細胞内ドメインよりC末端側に配置される請求項9記載のキメラ抗原受容体。
  11. 請求項1〜5のいずれか1項記載の核酸を細胞に導入する工程を含むキメラ抗原受容体発現細胞の製造方法。
  12. 細胞がT細胞又はT細胞を含有する細胞集団である請求項11記載のキメラ抗原受容体発現細胞の製造方法。
  13. 請求項1〜5のいずれか1項記載の核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞。
  14. 細胞がT細胞又はT細胞を含有する細胞集団である請求項13記載のキメラ抗原受容体発現細胞。
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