KR101576559B1 - 종양 괴사인자―α 인간화 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간화(humaniezed) 항-TNF 단일클론(monoclonal) 항체 및 이의 용도를 제공한다. 상기 인간화 항-TNF 단일클론 항체는 보존적 마우스 키메라(chimeric) 항체와 비교하여, 항원을 인식하는 항체의 능력을 유지하면서 쥐-항체의 면역원을 상당히 감소시킨다. 따라서, 임상학적 적용에 있어서 상기 항체의 안전성이 개선되었다.

Description

종양 괴사인자―α 인간화 항체{Tumor necrosis factor-α humanized antibody}

관련 출원에 대한 상호 참조( CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATION)

본 출원은 2011년 2월 28일에 출원된, 중국 특허 출원 번호 CN 201110048505.1; 2012년 2월 7일에 출원된, 중국 특허 출원 번호 CN　201210026698.5; 및 2012년 2월 13일에 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/CN2012/071079에 대한 우선권을 주장한다. 각각의 상기 공개된 출원의 전체 내용들은 본 명세서에 참조로서 통합된다.

기술분야

본 발명은 최소한, 인간화 항 종양 괴사인자-α(humanized anti tumor necrosis factor-α, TNFα) 또는 특정부위 또는 변형(variants)을 포함하는 이의 단편, 및 인간화 항-TNFα 항체를 암호화하는 핵산 및 그 상보적 핵산(complementary nucleic acid), 벡터(vector), 숙주 세포(host cells) 및 그 제조방법, 및 인간화 항-TNFα 항체를 포함하는 조성물 및 키트, 및 그 용도에 관한 것이다.

인간 종양 괴사인자-α(TNFα)는, 단핵구(monocyte) 및 대식세포(macrophage)에서 생성된 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이며, 세포 내 N 말단(N terminal) 및 세포외 C 말단에서 처음 생성될 때 26 kDa 전 단백질(precursor protein)로서, 막횡단 타입(transmembrane type) TNFα라고 부른다. Pennica et al.이 TNFα 유전자 cDNA를 1984년에 처음으로 클론하였으며(cloned), 인간 TNFα 분자가 157개 아미노산 잔기(amino acid residue)로 구성되었으며, 그 중량은 약 17 KD 라고 밝혔다(Pennica D, et al, Nature 1984; 312:724). 인간 TNF는 TNFα 및 TNFβ,두 가지 분자형태(molecular form)를 가진다. TNFα는 활성화(activated) 대식세포 또는 단핵구에서 생성되며, 종양적 조직 출혈성 괴사(neoplastic tissues hemorrhagic necrosis)를 유발하며, 그래서 카켁틴(cachectin)으로도 부른다. TNFβ는 활성 T 림파구(lymphocyte)에서 주로 분비된다. 둘 다 비슷한 발열성(pyrogenesis)을 가진다. TNFα는 종양세포(oncocytes) 표면의 수용기(receptors)에 작용하며, 그리고 세포를 인지, 결합 및 흡수(endocytosing)함으로써 리소좀(lysosome)으로 들어가고, 그 후 리소좀 및 프로테아제(proteases)를 활성화시켜 세포사멸(cell death)을 유발한다. TNFα 는 면역반응(immune response), 염증(inflammation) 및 외상반응(response to injury)에 중요한 역할을 하며, 세포증식(cell proliferation) 및 세포 사멸(cell apoptosis)의 조절에 주로 영향을 미친다. 세포독성(cytotoxicity), 세포용해(cytolysis), 세포사멸 유도 및 세포증식 억제 등의 종양세포에 대한 효과 이외에, TNFα는 골수성 백혈병 세포(myeloid leukemia cell)를 대식세포로 만드는 세포분화(cell differentiation)를 또한 촉진시켜서, 호중구 과립세포(neutrophile granulocyte)의 식세포 활성(phagocytic activity)을 개선시킨다.

TNFα의 적절한 용량은 신체의 면역(immunity)을 강화하도록 면역체계(immune system)를 활성화할 수 있고, 숙주(host)가 병원균 침입(microbial invasion)에 저항하는 방어체계(defense system) 및 종양억제에 중요한 역할을 한다. 그러나 과잉발현(over expressed) 되면, TNFα는 다른 염증 인자들과 함께 몇몇 병리적 위해(pathologic damage)를 유발할 수 있다. 그러므로, 수용기에 접근하는 것을 차단하고, 신호 전달(signal transduction)의 결과를 피하도록, 다른 수준으로 TNFα의 활성이 억제되거나 또는 중화(neutralized)될 수 있다.

비-인간(non-human) 항체를 사용함으로써 유발되는 관련 문제를 극복할 목적으로, HAMA에 의해 개시되는 생물면역생성력(organism immunogenicity)을 감소시키기 위해 인간-쥐(murine) 키메라(chimeric) 항체를 만드는 것은 비교적 효과적인 치료의 전략이다. 그런 종류의 키메라 항체는 비-인간 항체의 고유한 중쇄(heavy chain), 경쇄(light chain) 가변 영역(variable region)의 아미노산 서열(sequence)을 유지하면서 비-인간 항체 가변 영역을 인간항체 불변 영역(constant region)과 통합함으로써 만들어진다(참조, Daddona, P.E et al. PCT publication WO92/16553, Le, J. et al., U.S. Patent NO. 5,919,452, Kang, Heui H et al. PCT publication WO2005/047329, Jin BOquan et al. Chinese patent publication CN1544466A), Jin Yihui et al. chinese patent publication CN 10117745는 인간 종양 괴사인자와 결합할 수 있는 키메라 항체를 제공한다. 비-인간 항체와 비교하여, 키메라 항체의 면역생성력은 감소하지만, 그러나, 특별하게는 피부점박반응(skin mucosa reaction), 알러지 반응(allergic reaction), 부정맥(arrhythmia) 및 심장협착(stenocardia), 신장무력(renal insufficiency), 심할 경우 심지어 혼수(coma)까지 포함하는, 키메라 항체 내 쥐 유래 부분(portion)이 여전히 높기 때문에 다양한 정도로 HAMA 반응을 유발할 수 있다. 그러므로, 이러한 종류의 키메라 항체를 임상에 응용하는 것은 크게 제한된다.

이종(heterogenous) 단백질로서 이러한 종류의 키메라 항체를 인간에게 투여할 때, 생물 면역체계(즉, 인간 항 마우스 항체(Human anti mouse antibody), HAMA 반응)에 의해서 이종 단백질의 면역거부반응(immunological rejecting response)을 유발할 수 있음이 임상시험으로 밝혀졌다. 그 반응은 인체 내 쥐(murine) 항체의 급속제거(rapid clearance), 그리고 짧은 반감기(short half life)를 유도한다. 반복 투여하면 심지어 심한 과민성 쇼크(anaphylactic shock)가 일어날 수 있다. 더욱이 “외부(foreign)" 항체가 면역 항체에 의해 공격받을 수 있어서, 약리효과(pharmaceutical effect)를 나타내기 이전에 중화될 수 있다.

발명자들은 전술한 발명의 근거로 키메라 항체 내 쥐유도부분을 최소화할 목적으로 유전공학(genetic technology)을 활용하여 인간화 항체를 제조하기 위한 새로운 기술을 개발하였다. 이 기술은 쥐 항체 중쇄 가변영역(heavy chain variable region) 및 경쇄 가변영역(light chain variable region)의 상보성 결정영역(complementary determining regions, CDRs)을 각각 인간 항체 구조형성영역(framework region, FR)과 통합하는 것을 포함한다. 획득된 인간화 항체는 구조상 인간 서열(sequence)와 비슷한 것이 가능한데, 동시에, 부모 비-인간 항체와 비슷한 CDR 구조를 유지할 수 있다. 부모 비-인간 항체 및 키메라 항체와 비교하여, 공학적 만들어진(engineered) 인간화 항체 내 부모 비-인간 아미노산 서열 부분은 감소하고, 한편으로는, 항원(antigen)을 인지하는 항체의 능력은 유지되고; 반면에, 쥐 항체의 면역생성능력은 크게 감소한다. 그러므로, 임상적용에서 항체의 안정성이 개선되었다.

결과적으로, 본 발명은 선행 발명에서의 쥐 키메라 항체와 비교하여, 인체 내에서 더 안전하고, 더 긴 반감기와 더 유의한 효과를 가지는, 인간화 항체를 제공한다.

발명의 요약

하나의 측면에서, 본 발명은 최소한 하나의 인간화 항 종양 괴사인자 단일클론 항체(humanized anti tumor necrosis factor monoclonal ahtibody)를, 또는 특정 상보성 결정 영역(complementary determining regions), 중쇄(heavy chain) 또는 경쇄(light chain) 가변 영역(variable region), 중쇄 또는 경쇄 불변 영역(constrant region), 구조형성 영역(framework region), 또는 모든 다른 임의 부분을 제공한다. 본 발명의 항체는 모든 포유류(mammals), 예를 들면, 인간, 마우스(mouse), 랫트(rat), 설치류(rodent), 영장류(primate) 또는 그것의 모든 조합으로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 TNF 단백질, 서브유닛(subunit), 단편(fragment), 그 부분(part), 또는 그것의 모든 조합의 최소한 하나의 항원결정기(epitope)에 특이하게 결합한다. 언급한 최소한 하나의 항원결정기는 최소한 항체결합부위(antibody binding area)를 포함할 수 있다. 언급한 최소한 하나의 항원결정기는 선택적으로는 최소한 하나의 상보성 결정 부위(complementary determining area, CDR) (예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역) 및/또는 최소한 불변 또는 가변 구조형성 영역(FR) 또는 모든 임의 부분을 포함할 수 있다. 언급한 최소한 항체의 아미노산 서열은 바람직하게 선택적으로는 최소한 하나의 아미노산 잔기의 삽입(insertion), 결실(deletion) 또는 보존적 치환(conservatively substitution)을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 최소한 하나의 핵산분자를 제공하는데, 상기 핵산분자가, 그 항체가 최소한 하나의 특정 서열, 영역(domain), 부분 또는 그 변형을 함유하는 것을 특징으로 하는, 최소한 하나의 본 발명 인간화 항 종양 괴사인자 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 함유하거나, 또는 최소한 하나의 본 발명 인간화 항 종양 괴사인자 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 상보적이거나 또는 잡종화된 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간화 항 종양 괴사인자 항체를 암호화하는 핵산분자를 함유하는 재조합 백터(recombinant vector), 핵산 및/또는 재조합 백터를 함유하는 숙주세포(host cell), 및 핵산, 벡터 및/또는 숙주세포의 제조방법 및/또는 용도를 제공한다.

최소한 하나의 본 발명 항체는, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지는 않는 L929 표적세포(target cell)에 대한 rhTNFα 독성의 중화, TNF와 수용체 및/또는 예를 들면, 그러나 휴미라(Humira)에 한정되지는 않는 다른 단일클론 항체와의 결합을 억제 및/또는 경쟁하는, 최소한 하나의 활성을 가진다.

다른 측면에서, 본 발명은 hTNFα 연관 질환이 농혈증(pyaemia), 자가면역질환(autoimmune disease), 악성 종양(malignant tumor), 폐기능장애(lung function disorder), 이식 거부(tramsplant rejection), 박테리아 수막염(bacteria meningitis), 뇌 말라리아(cerebral malaria), 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 후천성 면역결핍증 관련 증후군(AIDS related complex, ARC), 이식 후 이차 사이토메갈로 바이러스 감염(secondary cytomegalorirus infection)으로 구성된 군(group)에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 항체 및/또는 조성물의 hTNFα 활성 억제를 위한 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간화 항 종양 괴사인자 항체가 분자를 탐지(detecting) 함으로써 표지될 수 있고 그리고/또는 표지될 수 없고, 그리고 표지 (label)는 방사선 동위원소(radioactive isotope); 형광표지법(fluoroscence label); 다양한 종류의 효소 기질 마크(enzyme substrate mark)를 포함하는 것을 특징으로 하는, hTNFα의 진단분석(diagnostic analysis)에 있어서 약제 제조의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 그 분석방법이 경쟁적 결합 분석(competitive binding analysis), 직접 또는 간접 샌드위치 분석(sandwich analysis), 또는 면역침강 분석(immunoprecipitation analysis)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 항체 및/또는 조성물의 분석방법에의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 인간화 항 종양 괴사 항체 및/또는 그 암호화하는 핵산, 약리적으로 수용된 벡터, 부형제들(excipients), 희석제(diluent), 및 첨가제(additive)로부터 선택된, 그러나 이에 한정되지는 않는 하나 또는 그 이상의 보조물(auxiliaries)을 포함하는, 최소한 하나의 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바람직하게 선택적으로 최소한 하나의 다른 항체, 핵산, 보조물들 또는 모든 조합을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 미리 정해진 용량의 시약 및 지시서(instruction)를 포함하는 키트를 제공하는데, 상기 시약은 본 발명의 항체, 핵산 및/또는 조성물을 함유한다. 상기 키트는 바람직하게 예를 들면, 그러나 이에 한정되지는 않는 안정제(stabilizer), 완충제들(buffers)의 다른 첨가물을 포함한다.

당업자는 다음 그림들이 본 발명을 묘사하기 위한 목적인 것이며, 어떠한 형태로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것임을 이해할 수 있다.
도 1은 U937을 죽이는 TNFα 효과를 중화하는 항체의 곡선을 나타낸 도이다.
도 2는 Ⅱ형 콜라겐(type Ⅱ collagen)으로 유도되는 랫트(rat) 관절 종창(joint swelling) 정도의 점수(score)를 나타낸 도이다.
도 3a는 Tg197 마우스 관절염(mouse arthritis)의 수치를 나타낸 도이고, 도 3b는 Tg197 마우스 치료군의 조직평가(histology evaluation)를 나타낸 도이며, 도 3c는 Tg197 마우스 치료군 효과를 관절염 점수(arthritis score, AS) 및 조직 점수(histology score, HS)로 나타낸 도이다.

항 종양 괴사인자 항체( Anti tumor necrosis factor antibody )

본 발명의 항체는 모든 적합한 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 또는 모든 분리 또는 제조된 항체에 의하여 암호화된 항체 아미노산 서열(sequence)를 포함한다. 인간화 항체 또는 항원 결합 단편(antigen binding fragment)은 인간 종양 괴사 인자(human tumor necrosis factor)에 바람직하게 결합하며, 그 결과로, 부분적으로, 상당히 또는 완전히 최소한 하나의 인간 종양 괴사인자 활성을 중화시키고, 따라서 TNF와 TNF 수용기의 결합에 의해 중개되는 신호 전달 방법(signal transduction process) 및 생리적 과정(physiological process)을 억제한다.

본 발명의 인간화 항체는 모든 타입(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 등) 또는 이소타입(isotype)일 수 있으며, κ 또는 λ 경쇄(light chains), 및 α, μ, γ, ε 또는 δ 중쇄(heavy chains)를 포함할 수 있다.

본 발명의 최소한 하나의 항체는 TNF 단백질, 서브유닛(subunit), 단편(fragment), 그 부분, 또는 그것의 모든 조합의 최소한 하나의 항원결정기(epitope)에 결합한다.

최소한 하나의 항 종양 괴사인자 단일클론(monoclonal) 항체는, 항체의 중쇄 가변 영역(heavy variable region)의 아미노산 서열이 서열번호: 1로 기재된 바와 같고, 항체의 경쇄 가변 영역(light variable region)의 아미노산 서열이 서열번호: 2로 기재된 바와 같은 것을 특징으로 하는, 하기 아미노산 서열을 포함한다.

서열번호: 1:

QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS

서열번호: 2:

ENVLTQSPPILSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK

상기 중쇄 가변 영역의 상보성 결정영역(complementary determining region) CDR-H1은 서열번호: 3으로 기재되는 서열; CDR-H2는 서열번호: 4로 기재되는 서열; CDR-H3은 서열번호: 5로 기재되는 서열을 갖고; 상기, 구조형성영역(framework region) FR-H1 내에, 아미노산 잔기 위치 16에서 A가 E로 치환, 위치 17에서 S가 T로 치환, 위치 20에서 I가 V로 치환될 수 있고(예를 들어, 서열번호: 11로 기재된 바와 같이); FR-H2 내에, 위치 3에서 K가 R로 치환, 위치 9에서 G가 S로 치환될 수 있고(예를 들어, 서열번호: 12로 기재된 바와 같이); FR-H3 내에, 위치 3에서 T가 V로 치환, 위치 7에서 E가 D로 치환, 위치 10에서 V가 T로 치환, 위치 14에서 F가 Y로 치환, 위치 19에서 S가 T로 치환, 위치 27에서 T가 V로 치환될 수 있고(예를 들어, 서열번호: 13으로 기재된 바와 같이); 그리고 상보성 결정영역 CDR-L1은 서열번호: 6으로 기재되는 서열; CDR-L2는 서열번호: 7로 기재되는 서열; CDR-L3은 서열번호: 8로 기재되는 서열을 갖고; 상기, 구조형성영역 FR-L1 내에, 위치 11에서 L이 M으로 치환, 위치 18에서 R이 E로 치환, 위치 21에서 M이 I로 치환될 수 있고(예를 들어, 서열번호: 14로 기재된 바와 같이); FR-L2 내에, 위치 13에서 W가 L로 치환될 수 있고(예를 들어, 서열번호: 15로 기재된 바와 같이); FR-L3 내에, 위치 4에서 S가 A로 치환, 위치 22에서 L이 V로 치환,위치 27에서 A가 F로 치환(예를 들어, 서열번호: 16으로 기재된 바와 같이)될 수 있다.

서열번호: 3:

HYGMH

서열번호: 4:

WINTYTGEPTYDADFQG

서열번호: 5:

YDFDGFDY

서열번호: 6:

RASSSITFNYLH

서열번호: 7:

STSNLVS

서열번호: 8:

QQYSDYPYT

서열번호: 9:

QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFTHYGMHWV(K/R)QTPGR(S/G)LKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS

서열번호: 10:

ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKV(W/L)IYSTSNLVSGVP(A/S)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK

서열번호: 11:

QVQLVQSGPELKKPG(E/A)(T/S)VK(I/V)SCKASGYTFT

서열번호: 12:

WV(K/R)QTPGR(S/G)LKWVG

서열번호: 13:

RF(T/V)FSL(E/D)TS(T/V)STA(F/Y)LQIN(T/S)LKDEDLA(T/V)YFCAR

서열번호: 14:

ENVLTQSPPI(M/L)SASPGE(E/R)VT(M/I)TC

서열번호: 15:

WYQQKSGDSPKV(W/L)IY

서열번호: 16:

GVP(S/A)RFSGSGSGTSYSLTISS(V/L)EAED(A/F)ATYYC

본 발명의 하나의 실시예에서, 인간 항 종양 괴사인자 항체의 중쇄 불변영역(constant region) 서열은 인간 IgG1의 중쇄 불변영역이다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 인간 항 종양 괴사인자 항체의 경쇄 불변영역 서열은 인간 항체의 경쇄 불변영역이다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시예에서, 인간 항 종양 괴사인자 단일클론 항체의 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-5 아미노산 잔기를 삽입(inserting), 결실(deleting) 또는 보존적 치환(conservatively substituting)함으로써 변형될 수 있다.

모든 조합 형태로 하나 또는 그 이상의 삽입, 결실 또는 보존적 치환으로 변형 또는 변이된 단일클론 항체는 아미노산 서열에 있어서 차이점을 가질 수 있다. 바람직한 변형에서, 상기 변형(modification)은 본 발명의 언급된 단일클론 항체로부터 아미노산 보존적 치환에 의해 획득된다. 보존적 치환은 특정 아미노산이 비슷한 성질을 가진 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 비-제한적으로 하기에 기재된 아미노산은 보존적으로 교환가능한(비슷한 성질로서) 것으로 고려된다: a) 알라닌(alanine), 세린(serine) 및 스레오닌(threonine); b) 글루탐산(glutamic acid) 및 아스파르트산(aspartic acid); c) 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine); d) 아르기닌(arginine) 및 라이신(lysine); e) 이소류신(isoleucine), 류실라이드(leucylacid), 메티오닌(methionine) 및 발린(valine); 및 f) 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan).

본 발명의 기능적으로 동등한 단일클론 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-5 아미노산 잔기가 보존적으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 변형이다. 상기 보존적 치환에는 다음이 포함된다: 방향족(aromatic) 아미노산 Ala, Val, Leu 및 lle 중 어떤 하나가 다른 것으로 치환될 수 있다; 하이드록실(hydroxyl) 잔기 Ser 및 Thr이 교환가능하다; 산 잔기 Asp 및 Glu 가 교환가능하다; 아마이드(amide) 잔기 Asn 및 Glun이 교환가능하다; 염기성(basic) 잔기 Lys 및 Arg가 교환가능하다; 방향족 잔기 Phe 및 Tyr이 교환가능하다.

바람직하게, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열과 최소한 50% 동일성을 가지는 아미노산 서열, 또는 그 단편, 그리고 동등한 기능을 가지는 아미노산 서열을 밝혔다. 하나의 실시예에서, 아미노산 서열이 본 발명에 따른 아미노산 서열 서열번호:1 또는 2와 최소한 75% 동일성을 가지고, 더욱 바람직하게는 최소한 85% 동일성, 더 더욱 바람직하게는 최소한 90% 동일성, 더 더욱 바람직하게는 최소한 95% 동일성, 더 더욱 바람직하게는 최소한 97% 동일성, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 99% 동일성을 가진다.

몇몇 종류의 항체들이 본 발명 범위에 있다. 예를 들어, 항 hTNFα 항체는 전장(full-length) 항체(예를 들어, 완전한 인간 Fc 영역을 포함); 또는 항체 단편(예를 들어, Fv, scFv, Fab, Fab' 및 (Fab')2)일 수 있다. 더욱이, 항체가 탐지 가능한 표지로 표지될 수 있고, 고체 담체(solid phase carrier)에 고정될 수 있으며, 그리고/또는 이성 화합물(heterologous compounds)(세포독소 물질(cytotoxin materials)과 같은)과 연결될 수 있다.

Fab는 프로테아제/파파인(protease/papain)으로 IgG 항체 분자를 처리하여 만들어진다. 그것은, 파파인 처리(아미노산 잔기 224에서 H 사슬(chain) 절단)로 얻어진 단편에서, N-말단으로부터의 H 사슬 약 1/2 및 전체 L 사슬이 이산화황 결합(disulfide bond)에 의해 서로 결합되는 것을 특징으로 하는, 분자량 약 50,000이며 항원결합활성(antigen binding activity)을 가지는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab는 또한 원핵생물(prokaryotes) 발현 벡터(expression vectors) 및/또는 진핵생물(eukaryotes) 발현 벡터로 항체의 Fab를 암호화한 DNA를 삽입하여 만들어질 수 있다.

Fab'는 항체결합활성을 가지며, (Fab')2 힌지 영역(hinge region)에서 이산화황 결합을 절단하여 만들어지고, 분자량은 약 50,000인 항체단편이다. 본 발명의 Fab'는 원핵생물 발현 벡터 및/또는 진핵생물 발현 벡터에 항체의 Fab'를 암호화한 DNA를 삽입하고, 그리고 그 다음으로 Fab'를 발현하도록 벡터를 원핵생물 및/또는 진핵생물에 넣음으로써 또한 만들어질 수 있다.

(Fab')2는, IgG 항체를 프로테아제/펩신(protease/pepsin) 처리(아미노산 잔기 234에서 H 사슬 절단)하여 얻어진 단편에서, 힌지 영역에서 이산화황 결합으로 서로 결합된 Fab 항체 단편이 약간 더 큰 것을 특징으로 하는, 항원결합활성을 가지며, 분자량 약 50,000인 항체 단편이다. 본 발명의 (Fab')2는 펩신으로 항체를 처리하여 만들어 질 수 있다. 이외에, 본 발명의 (Fab')2는 Fab'를 티오에테르 결합(thioether bond) 또는 이산화황 결합에 연결함으로써 또한 만들어 질 수 있다.

scFv는 항원결합활성을 가지며, 적절한 펩타이드 연결부위(peptide joint)로 연결되는 사슬 V_H 및 사슬 V_L로 구성되는 항체 단편이다. 본 발명의 scFv는 항체의 V_H 및 V_L을 암호화하는 cDNAs를 얻고, scFv를 암호화하는 DNA를 구성하고, scFv를 암호화하는 DNA를 원핵생물 발현 벡터 및/또는 진핵생물 발현 벡터에 삽입하고, 그리고 그 다음으로 scFv를 발현하도록 벡터를 원핵생물 및/또는 진핵생물에 넣음으로써 만들어질 수 있다.

핵산( Nucleic Acid )

본 발명의 핵산은 최소한 서열번호: 1-16 중 하나를 암호화하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열, 특정 단편, 그 변형, 또는 공통 서열(consensus sequence)의 최소한 70-100% 연속 아미노산 서열이다. 최소한 하나의 항 TNF 항체를 암호화하는 핵산 분자들은 본 발명에서 기술한 방법 또는 당업계에 알려진 방법으로 얻을 수 있다.

본 발명의 핵산 분자들은, mRNA, hnRNA, tRNA 또는 어떤 다른 형태와 같은, RNA의 형태, 또는 cDNA 및 클로닝 또는 합성으로 만들어서 얻어진 게놈 DNA(genomic DNA), 또는 그 어떤 조합을 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중가닥(triple-stranded), 이중가닥(double-stranded) 또는 단일가닥(single-stranded), 또는 그 어떤 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA 가닥의 최소한 하나의 부분은 센스 가닥(sense strand)으로도 알려진, 코딩 가닥(coding strand), 또는 안티센스 가닥(anti-sense strand)으로도 또한 표기되는, 비코팅 가닥(non-coding strand)일 수 있다.

여기에서 지적한대로, 항 TNF 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는, 혼자서 스스로(by itself) 항체 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들; 전체 항체 또는 그 부분을 위한 코딩 서열(coding sequence); 최소한 하나의 인트론(intron), 함께 전사(transcription), 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐레이션 신호들(polyadenylation signals)(예를 들어- 리보솜(ribosome) 결합 및 mRNAT의 안정성(stability))를 포함하는, mRNA 프로세싱(processing)에 역할을 하는 전사된(transcribed), 비번역된(non-translated) 서열과 같은, 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, 부가적, 비코딩 서열과 같은, 앞에 언급한 부가적 코딩 서열과 같이 또는 없이, 최소한 하나의 신호 선도(signal leader) 또는 융합 펩타이드(fusion peptide)의 암호 서열과 같은 부가적 서열뿐만 아니라, 항체, 단편 또는 부분을 위한 코딩 서열; 부가적 기능을 제공하는 것들과 같은, 부가적 아미노산을 암호화하는 부가적 코딩 서열을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 그러므로, 항체를 암호화하는 서열은 항체 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 항체(fused antibody)의 정제(purification)를 가능하게 하는 펩타이드를 암호화하는 서열과 같은, 마커 서열(marker sequence)에 융합될 수 있다.

본 발명의 핵산은 당업계에 잘 알려진 바와 같이, (a) 재조합 방법(recombinant methods), (b) 합성기술(synthetic techniques), (c) 정제기술(purification techniques), 또는 그 조합을 사용하여 만들어질 수 있다.

RNA, DNA, 게놈 DNA, 또는 그 어떤 조합 등의, 본 발명의 핵산 조성물은, 당업자에게 알려진 모든 수의 클로닝 방법론들(cloning methodologies) 중 어느 하나를 사용하여 생물학적 자원(biological source)로부터 획득될 수 있다. 일부 실시예에서, 엄격한 상태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는(hybridize) 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probes)가 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리(library)에서 바람직한 서열을 식별하기 위해 사용된다. RNA 분리(isolation), 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구성은 당업자에게 잘 알려져 있다.

cDNA 또는 게놈 라이브러리는 여기에서 밝혀진 것들 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 근거하여 프로브를 선별될 수 있다. 프로브는 동일한 또는 상이한 생물(organism) 내의 상동 유전자(homologous gene)을 분리하기 위하여 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 함께 혼성화하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 이 시험분석에서 혼성화의 다양한 정도의 엄격함(stringency)이 적용될 수 있으며; 그리고 혼성화 또는 세척 배지(wash medium)도 엄격할 수 있음을 평가할 것이다. 혼성화 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 이중 형성(duplex formation)을 발생시키기 위하여 프로브 및 표적 사이에 더욱 큰 정도의 상보성(complementarity)이 있어야 한다. 엄격함의 정도는 하나 또는 그 이상의 온도, 이온 강도(ionic strength), pH 및 포름아마이드(formamide)와 같은 부분 변성 용매(partially denaturing solvent)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격함은 예로서, 포름아마이드 농도를 0% 내지 50% 범위에서 조작함으로써 반응 용액(reactant solution)의 극성(polarity)을 변화시켜서 편리하게 다양화시킬 수 있다. 탐지할 수 있는 결합에 필요한 상보성 정도(서열 동일성(sequence identity))는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격함에 따라 다양할 것이다. 상보성 정도는 최대 100%, 또는 70-100%, 또는 그 안의 어떤 범위 또는 수치일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머(primers) 내의 작은 서열 다양성은 혼성화 및/또는 세척 배지의 엄격함을 감소시킴으로써 보상될 수 있음을 이해하여야 한다.

RNA 또는 DNA 증폭(amplification) 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 그리고 여기에서 제시된 가르침(teaching) 및 안내(guidance)에 근거하여, 지나친(undue) 실험 없이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산은 알려진 방법에 의한 직접 화학 합성(direct chemical synthesis)으로 제조될 수 있다. 화학 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 만드는데, 이것은 상보적 서열과 혼성화함으로써, 또는 단일 가닥을 주형(template)으로 사용하여 DNA 중합효소(polymerase)와 중합(polymerization)함으로써 이중가닥 DNA로 전환될 수 있다.

인간화 단일클론 항체 발현 벡터의 구성

5' 단편은 주형으로서 인간화 항체 중쇄 가변 영역 V_H 유전자 단편, 5' 프라이머 FVHX (5'-CGCGCAAG-CTTCCTCGAG-3' 서열번호: 17) 및 3' 프라이머 RVCG(5'-CGATGGGCCCTTGGTGGA-3' 서열번호: 18)을 포함하는 플라스미드(plasmid) (pHu-V_H)를 사용하여 획득되고, 이것은 인간화 항체 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 인간 IgG₁ 중쇄 불변 영역 (C_γ1)의 5'-말단에 7개 아미노산을 포함한다. 한편, 인간 IgG₁ 중쇄 불변 영역 (C_γ1) 암호화 서열을 포함하는 유전자(A gene)는 역전사(reverse transcription) 및 PCR을 통해 5' 프라이머 HuCGF(5'-ACCAAGGGCCCATCGGTCTTC-3' 서열번호: 19) 및 3' 프라이머 HUCGE(5'-CGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3' 서열번호: 20)을 사용하여 인간 백혈구(leucocyte)로부터 제조된 RNA로부터 획득된다. 마지막으로, 인간화 항체 중쇄 가변 영역 및 인간 C_γ1 유전자의 단편은 중쇄 암호화 서열을 포함하는 약 1400 bp 길이의 유전자 단편을 획득하기 위하여 5' 프라이머(FVHX, 서열번호: 17) 및 3' 프라이머(HUCGE, 서열번호: 20)을 사용하여 PCR에 의해 연결된다. 상기 유전자 단편은 엔도뉴클레아제(endonuclease) Hind III 및 EcoR1과 함께 처리되고, 그 후 PUC19(참조: Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119)와 같은 벡터에 삽입된다.

5' 단편은 주형으로서 인간화된 항체 경쇄 가변 영역 V_L 유전자 단편, 5' 프라이머 FVHX(서열번호: 17) 및 3' 프라이머 VKCKO(5'-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG CTT GAT CTC CAG CTT GGT GCC -3' 서열번호: 21)을 포함하는 플라스미드(pHu-V_L)을 사용하여 획득되고, 이것은 인간화 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) 및 인간 κ 경쇄 불변 영역(C_κ)의 5'-말단에 7개 아미노산을 포함한다. 한편, 인간 κ 경쇄 불변 영역(C_κ) 암호화 서열을 포함하는 유전자(A gene)는 역전사 및 PCR을 통해 5' 프라이머 HuCKF(5'-GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC -3' 서열번호: 22) 및 3' 프라이머 HUCKB(5'-TGC GGA TCC CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA -3' 서열번호: 23)를 사용하여 인간 백혈구로부터 제조된 RNA로부터 획득된다. 마지막으로, 인간화 항체 경쇄 가변 영역 및 인간 C_κ 유전자의 단편은 경쇄 암호화 서열을 포함하는 약 700 bp 길이의 유전자 단편을 획득하기 위하여 5' 프라이머(FVHX, 서열번호: 17) 및 3' 프라이머(HUCKB, 서열번호: 23)을 사용하여 PCR에 의해 연결된다. 상기 유전자 단편은 엔도뉴클레아제 Hind III 및 Bam H1과 함께 처리되고, 그 후 PUC19(참조: Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119.)와 같은 벡터에 삽입된다.

중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 cDNA 또는 앞에 언급한 방법으로 얻은 그 변형 산물을 암호화하는 cDNA는 Hu_항-TNFα(Hu_anti-TNFα) 인간화 발현 벡터를 구성하기 위하여 pcDNA3(Invitrogen USA, Carlsbad, CA, USA)벡터에 삽입시켰다. 발현 벡터 플라스미드는 포유류 세포에서 높은 단계의 발현에 필요한 사이토메갈로 바이러스 초기 유전자 프로모터-인핸서(cytomegalovirus early gene promoter-enhancer)를 포함한다. 한편으로, 벡터 플라스미드는 박테리아 내 엠피실린 저항성(ampicillin resistance)을 갖기 위하여, 포유류 세포 내 G418 저항성을 갖기 위하여, 선택적인 마커 유전자(optional maker gene)를 또한 포함한다. 더욱이, 벡터 플라스미드는 DHFR 유전자를 포함한다. 적합한 숙주세포에서, 키메라 항체 유전자 및 DHFR 유전자는 Methotrexate(MTX, Sigma)로 동시 증폭될(co-amplified) 수 있다(참조, 예를 들어, Axel,r., et al. US Patent NO. 5.179.017; Kaufman, R. and Sharp,p.,J.mol, Biol. 159 : 601-621,1982).

항체 숙주세포( Antibody Host Cell )

본 발명은 재조합 벡터 유전공학(gene engineered) 숙주세포, 및 당업계의 재조합 기술을 사용하여 최소한 하나의 항 TNF 항체의 제조와 또한 연관되어 있다.

폴리뉴클레오티드는 숙주에서의 증폭을 위하여, 선택적인 표지를 포함하는 벡터에 선택적으로 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘(calcium phosphate)과 같은, 침전물(precipitate)에 넣어지거나, 또는 전하를 띠는 지질(charged lipid)를 함유하는 복합체(complex)에 넣어진다.

위에서-언급한 숙주세포를 위한 적절한 배양 배지(culture medium) 및 조건들은 당업계에 알려져 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 쉽게 식별될 것이다. 숙주세포에 벡터 컨스트럭트(construct)를 인도하는 것은 인산 칼슘 형질감염(transfection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran) 매개 형질감염, 양이온성 지질(cationic lipid)-매개 형질감염, 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 감염(infection) 또는 다른 알려진 방법에 의해 영향 받을 수 있다.

본 발명의 인간화 항 종양 괴사인자 단일클론 항체를 위한 숙주세포는 항-TNFα 유전자 코드(code)를 포함하는 플라스미드와 형질감염 함으로써 얻어지는, 차이니즈 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary cell)에서 유래되며, 다음으로 약제 선별(drug screening)을 포함한, 일련의 엄격한, 특정 선별, 유전자 증폭, 그리고 fanal 세포주를 만들기 위한 단일 세포 클로닝이 이어진다. 본 발명의 숙주세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포주 CHO HUAT 132는 기탁번호(Deposit NO.) C201117로 2011년 3월 7일 CCTCC에 기탁되었다.

상기 세포주의 세포는 무혈청배지(serum free medium)에 현탁되었을 때; 2 L 발효조(Fermenter)에서 배양되었을 때, 번식될 수 있다, 배지 내 분비된 항-TNFα의 수준은 16-20일의 배양 주기가 끝난 후 1 g/L 보다 낮지 않을 것이다. 세포주에 의하여 생성된 항-TNFα는 인간화 단일클론 항체이다.

TNF α 에의 결합 활성

본 발명의 인간화 항 종양 괴사인자 단일클론 항체는 재조합 인간 종양 괴사인자(rh TNFα, 표적 분자들)에 특이 친화성(specific affinity)을 가질 뿐이고, 어떤 다른 단백질 분자에는 교차결합하지 않는다. 상기 표적분자들에 대한 친화성의 경쟁적 분석(competitive assay)에서, 본 발명의 인간화 항 종양 괴사인자 단일클론 항체는 휴미라(Humira)와 비슷한 친화성을 가지는 것으로 판정되었다.

본 발명의 인간화 항 종양 괴사인자 단일클론 항체는 또한 L929 표적세포에 대한 rh TNFα의 독성을 중화하는 활성을 가지며, 그리고 그 EC₅₀은 휴미라의 그것과 비슷하여, 20.4 ng/mL 및 50 ng/mL 사이였다.

치료 용도( Therapeutic u se )

항 hTNFα 항체는 hTNFα 연관 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여 사용될 수 있으며, 상기 hTNFα 연관 질환은, 예를 들어, 농혈증(pyaemia), 자가면역질환(autoimmune disease), 악성종양(malignant tumor), 폐기능 장애(lung function disorder), 이식 거부(transplant rejection), 박테리아 수막염(bacterial meningitis), 뇌 말라리아(cerebral malaria), 후천성 면역 결핍증(AIDS) 및 후천성 면역결핍증 관련 증후군(AIDS related complex, ARC), 이식 후 이차 사이토메갈로 바이러스 감염(secondary cytomegalovirus infection)일 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 성분들을 hTNFα 연관 질환의 치료에 사용하는 것은 하기에 더 검토될 것이다:

1) 패혈증(Sepsis)

패혈증 병리(sepsis pathology)에서의 종양괴사인자의 역할, 그리고 그 생물학적 효과는 저혈압(hypotension), 심근압박(myocardial depression), 혈관 누출증(vascular leak stndrome), 장기 괴사(organ necrosis)를 포함한다(예를 들어, US patent 5,231,024 참조). 그러므로, 본 발명의 인간화 항체 및 항체성분들은 임상적 배경과 함께, 패혈성 쇼크(septic shock), 내독성 쇼크(endotoxic shock), 그람-음성(gram-negative) 패혈증 및 독성 쇼크증(toxic shock syndrome)을 포함하는 어떠한 패혈증의 치료에 사용될 수 있다.

2) 자가면역 질환(Autoimmune diseases)

종양괴사인자가 다양한 자가면역 질환의 병리생리(pathophysiology)에 역할을 하는 것이 밝혀졌는데, 예로서, TNFα가 조직염증(tissue inflammation) 활성에 관여하고, 그리고 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에서 관절 파괴(joint destrution)를 일으키는 것으로 밝혀졌다(예로서, us patent 5,231,024: Moeller, A.et.al.(1990) Cytokine 2:162-169 참조). TNFα가 당뇨병(diabetes)에서 췌도세포사멸(islet cell death)의 촉진에 관여하고 그리고 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)에 대한 세포독성(cytotoxicity)을 매개하고 그리고 염증성 돌(inflammatory plague)을 유발함이 또한 밝혀졌다.

본 발명의 인간화 항체 및 항체성분은 자가면역질환, 특히 류마티스 관절염, 류마티스 척수염(rheumatoid myelitis), 골관절염(osteoarthritis) 및 통풍 관절염(gout arthritis), 알러지(allergy), 다발 경화증(multiple sclerosis), 자가면역 당뇨병(autoimmune diabets), 자가면역 안구포도막염(autoimmune eye uveitis), 및 신장증(nephrotic syndrome)을 포함하는, 염증관련 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

3) 악성 종양(Malignant Tumors)

악성 종양에서 발견되는 종양 괴사인자가 악액질(cacjexia) 유발, 종양성장(tumor growth) 자극, 전이 잠재성(metastatic potential) 강화 및 세포독성 매개에 관여함이 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 항체성분들은 악성 종양을 치료, 종양성장 또는 전이를 억제 및/또는 악성의 이차적 악액질을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 항체 또는 항체성분은 전신적으로(systemic) 또는 종양부위(tumor site)에 국소적으로(local) 투여될 수 있다.

4) 폐기능 장애(Pulmonary Function disorders)

종양 괴사인자는 백혈구세포-내피세포 활성(white blood cell-endothelial cell activation), 폐 세포에서 유래된 세포독성 자극 및 혈관 누출증 유발을 포함하는, 성인 호흡기 곤란증(adult respiratory distess syndrome, ARDS)의 병리생리에 관여함이 알려졌다. 그러므로, 본 발명의 항체 및 항체성분들은 성인 호흡기 곤란증, 만성 폐렴(chronic pneumonia), 폐 유육종증(pulmonary sarcoidosis), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 및 규폐증(silicosis)를 포함하는, 폐기능 장애 치료에 사용될 수 있다.

5) 장기능 장애(Intestinal dysfunction)

본 발명의 인간 항체들 및 항체성분들은 두 증상, 크론병(Crohn) 및 궤양성 결정염(ulcerative colitis)을 포함하는, 특발성 염증성 장 질환(idiopathic inflammatory bowel disease)과 같은 장 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

6) 이식(Transplantation)

종양괴사인자가 동종이식 거부반응(allograft rejection) 및 이식편대숙주병(transplant plants versus-host disease, GVHD)의 핵심 매개자(Key mediator) 일 수 있고, 그리고 T-세포 수용체 CD3 복합체(T-cell receptor CD3 complex)를 표적으로 하는 랫트(rat) 항체 OKT3에 의한 신장이식 거부반응(Crenal transplant rejection)의 억제에서 관찰되는 부작용을 매개함이 밝혀졌다(예를 들어, Suthanthiran, Mo, and Strom, TB(1994) New Engl J,Med. 331: 365-375 참조).

그러므로, 본 발명의 항체 및 항체성분들은 동종이식 및 이종이식(xenograft) 거부반응을 포함한, 이식거부반응을 억제하고, 그리고 GVHD를 억제하는데 사용될 수 있다.

7) 감염성 질환(Infectious diseases)

본 발명의 항체들 및 항체성분들은 박테리아 수막염, 뇌 말라리아, 후천성 면역결핍증 및 후천성 면역결핍증 관련 증후군(ARC), 이식 후 이차 사이토메갈로바이러스 감염을 포함한, 감염성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 항체들 및 항체성분들은 또한 감염(예 인플루엔자(influenza))이 원인인 고열(fever) 및 근육통(muscle pain), 그리고 감염 이차 악액질(AIDS 또는 이차 ARC 등)을 포함하는, 감염성 질환 연관 증상들(symptoms)을 감소시키는데 사용될 수 있다.

분석 및 진단 목적

본 발명의 항체는 경쟁적 결합 분석법(competitive binding assays), 직접 또는 간접 샌드위치 분석(direct or indirect sandwich analysis) 및 면역침강 분석(immunoprecipitation analysis)와 같은, 어떠한 알려진 분석방법에 사용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies:Technical Manual "(Monoclone Antibodies;A Manual of Techniques), pp.147-158(CRC Press, Inc.,1987).

경쟁적 결합 분석은 측정된 샘플(sample)에서 제한된 용량의 항체에 결합하기 위해 분석물(analyte)과 경쟁하는 표지된 표준 물질(marked standard material)의 능력에 의존한다. 표준 물질의 용량은 측정된 샘플에서 hTNFα와 결합된 항체의 용량에 역 비례이다. 결합된 표준 물질의 용량 측정을 가능하게 하기 위하여, 항체들이 보통 경쟁(competition) 전 또는 후에 불용성이므로, 결합된 표준 물질 및 분석물을 결합되지 않은 표준 물질 및 분석물 분리로부터 격리하는 것이 편리할 것이다.

샌드위치 분석은 두 개의 항체 사용을 포함하고, 각각 표적 단백질의 상이한 면역원성 부위(immunogenicity site) 또는 항원결정기(epitope)에 결합한다. 샌드위치 분석에서, 측정된 샘플 분석물이 고체상 담체에 고정된 첫 번째 항체에 결합되고, 그 후 두 번째 항체가 분석물에 결합하고, 따라서 불용성 세 성분 복합체(three-component complex)를 형성한다. US Patent 4,376,110 참조. 두 번째 항체 그 자체는 탐지 가능한 부분으로 표시될 수 있고(직접 샌드위치 분석), 또는 탐지 가능한 부분으로 표지된 항-면역글로블린(anti-immunoglobulin) 항체들을 사용하여 탐지될 수 있다(간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 샌드위치 분석 중 하나는, 탐지 가능한 부분이 효소(enzyme)인, ELISA이다.

항-hTNFα 항체는, hTNFα의 진단 분석, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청(serum) 내 발현을 탐지하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 이 진단방법은 자가면역 질환의 원인 진단에 사용될 수 있다.

항체는 보통 탐지 가능한 분자로 표지될 수 있다. 많은 마커들이 사용될 수 있으며, 일반적으로 상기 마커들은 다음과 같이 분류된다:

(a) 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S 등의, 방사성 동위원소(redioisotope). Current Protocols in Immunology, Volume 1 and 2, Coligen eds, Wiley-Interscience, New York, New York, the Pubs(1991)에 기술된 방법에 따라서 항체를 방사성활성 동위원소(radioactive isotope)로 표지할 수 있는데, 여기에서 방사성 활성(radioactivity)은 섬광계수법(scintillation counting method)으로 측정될 수 있으며, 그리고 질환 부위(diseased site)는 면역-플래시 촬영(immune-flash photography)을 사용하여 파악할 수 있다.

(b) 희토류 킬레이팅제(rare earth chelating agent)(유로피움 킬레이터(europium chelator)), 또는 루시퍼라제(luciferase) 및 그 유도체, 로다민(rhodamine) 및 그 유도체, 단실(dansyl), 리싸민(lissamine), 피코에리트린(phycoerythrin) 및 텍사스레드(Texas Red)와 같은, 형광 마커(fluorescent marker). 예를 들어, 위에서 언급한 Current Protocols in Immunology에 기술된 방법을 사용하여 형광 마커를 항체와 결합시킬 수 있다. 형광성(fluorescence)은 형광계(fluorometer)로 정량화될 수 있다.

(c) 다양한 기질 마커들(substrate marker)을 사용할 수 있고, 그리고 US Patent 4,275,149가 그들 중 일부를 설명하고 있다. 효소는 보통 여러 가지 기술로 탐지될 수 있는 다양한 발색성(chromogenic) 기질들의 화학 변화를 촉매한다. 예를 들어, 효소가 분광광도계(spectrophotometer)로 측정될 수 있는, 기질의 색 변화를 촉매하거나, 또는 효소가 기질의 형광성 또는 화학발광성(chemiluminescence)을 변화시킨다. 이전에, 형광성 변화의 정량분석(quantitative determination) 기술에 대하여 기술하였다. 화학발광 기질(chemiluminescent substrate)은 화학반응 때문에 전기적으로 흥분되고(excited), 그 후 조명된다(illuminate). 방출된 광선은 측정되거나(화학 광도계(chemical photometer)의 사용 등) 또는 에너지를 형광수용기 (fluorescent receptor)에 제공한다. 효소 마커들은 루시퍼라제(예를 들어, 반딧불(firefly) 루시퍼라제 및 박테리아 형광 루시퍼라제; U.S. Patent 4,737,456), 루시페린(luciferin), 2,3-dihydrophthalazinediones, 말레이트 탈수소효소(malate dehydrogenase), 우레아제(urease), 호스라디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRPO)와 같은 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), b-갈락토시다아제(b-galactosidase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 라이소자임(lysozyme), 당 산화효소(sugar oxidase)(예 포도당 산화효소(glucose oxidase enzyme), 갈락토스 산화효소(galactose oxidase) 및 글루코오스-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase)), 헤테로사이클릭 산화효소(heterocyclic oxidases)(유리카아제(uricase) 및 잔틴 산화효소(xanthine oxidase)와 같은), 락토퍼옥시다아제(lactoperoxidase), 마이크로-퍼옥시다아제(micro-peroxidase) 등을 포함한다. O'Sullivan은 Methods for the Preparation of Enzyme - Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay (Methods In Enzym .) (by J. Langone, and H. the Van Vunakis ed.), Academic press, New York, ,73:147-166 (1981)에서 항체에 효소를 접합하는 기술을 기술하였다.

효소-기질의 조성물은 예를 들어, 하기를 포함한다:

(i) 기질로서 호스라디시 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase, HRP) 및 과산화수소(hydrogen peroxidase), 상기, 과산화수소는 염료 전구물질(dye precursor)(예, o-페닐렌디아민(o-phenylenediamine, OPD) 또는 염산(hydrochloric acid) 내지 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB))을 산화한다;

(ii) 발색성 기질로서 알칼라인 포스파타아제(AP) 및 p-니트로페닐 인산(p-nitrophenyl phosphate);

(iii) b-D-갈락토시다아제 탈수효소(b-D-galactosidase anhydrase, b-D-Gal) 및 발색성 기질(예를 들어, 니트로페닐-b-D-갈락토시다아제(nitrophenyl-b-D-galactosidase)) 또는 형광 기질 및 4-메틸 움벨리페론-b-D-갈락토시다아제(4-methyl umbelliferone-b-D-galactosidase).

당업자는 다른 많은 효소-기질 조합을 알 수 있다. 이들 조합의 검토는 US patent 4,275,149 및 4,318,980에서 찾아볼 수 있다. 때때로, 마커들 및 항체들이 간접적으로 결합된다. 당업자는 언급된 조성물을 얻기 위한 모든 종류의 방법 또한 알 수 있다. 예를 들어, 항체가 바이오틴(biotin)과 결합할 수 있고, 그리고 마커의 상기 세 가지 범주의 어떤 하나가 아비딘(avidin)과 결합할 수 있으며, 또는 그 반대의 경우일 수 있다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하고, 그리고 마커는 항체와 간접적으로 결합될 수 있다. 또는, 마커가 항체와 간접적으로 결합되기 위하여, 항체가 작은 합텐(hapten)(예 디곡신(digoxin))과 결합될 수 있으며, 반면에 다른 타입의 마커들 중 하나는 항-합텐 항체(예 항-디곡신 항체)와 결합될 수 있다. 그러므로, 항체와 마커의 간접적 결합이 얻어진다.

본 발명의 다른 실시예에서, 항-hTNFα 항체를 표시할 필요는 없고, 그 존재는 hTNFα 항체와 결합하는 표시된 항체에 의해서 탐지될 수 있다.

친화성 정제 키트( affinity purification kit )

본 발명의 항체는 친화성 정제 시약으로 사용될 수 있다. 이 방법에서, 항체는 고체상(solid-phase)에서, 예로서, 당업계에 알려진 방법에 의해서 세파덱스 수지(Sephadex resin) 또는 여과지(filter paper)에 고정될 수 있다. 정제되기 위하여 고정된 항체를 hTNFα-함유 샘플과 접촉하고, 그 후 담체가 적합한 용매로 세척되고, 그리고 상기 용매는 다른 물질을 충분히 제거하여 hTNFα가 고정화된 항체와 결합되는 것을 기대할 수 있다.

약학적 조성물 및 투여 방식

본 발명의 항체 및 항체성분은, 약학적 조성물이 본 발명의 항체 및 약리적으로 수용가능한(acceptable) 부형제를 함유하고, 그리고 약학적 부형제가 생리적으로 적용가능한(applicable) 용매, 분산 배지(dispersion media), 항균제(antibacterial agent), 항진균제(antifungal agent), 등장제(isotonic agent), 코팅(coating), 흡수 지연제(absorption delay agent) 중 그 어떤 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 환자에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 액체 반고체(liquid semi-solid) 및 고체(solid) 투약 형태(dosage form)과 같은, 다양한 형태를 가질 수 있다.

약리적으로 수용가능한 투약 형태에 있어서 본 발명의 항-hTNF 항체는 알려진 방법을 사용하여 인간에 투여될 수 있다. 그 방법은 정맥내(intravenous)(예를 들어, 기간 내에 농축된 약(블루스(bolus)) 정맥내 주사(injection) 또는 주입(infusion)), 근육내 (intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 뇌척추강(cerebrospinal cavity), 피하(subcutaneous), 동막내(intra-arterial), 활액막강(synovial carity), 경막내 주사(intrathecal injection), 구강(oral), 국소주사(local injection), 또는 흡입(inhalation)을 포함한다.. 항체는 또한 종양내(intratumor), 종양 주변, 손상부위 내, 손상부위 주위를 통해서 국소적 및 전신적 치료효과를 얻기 위하여 적절히 투여 될 수 있다. 복막내 주사는 예를 들어, 난소암(ovarian cancer) 치료에 특별히 유용한 것으로 예상된다.

질환을 예방 또는 치료하기 위하여, 주치의 독자적 판단에 따를 것뿐만 아니라, 항체의 적절한 용량(dose)은 위에서 정의한 바와 같이 치료될 질환의 타입, 질환의 심한 정도(severity) 및 질환의 경과 시간, 예방 또는 치료를 위하여 투여된 항체, 이전의 치료, 및 환자의 병력 및 항체 반응에 의존할 것이다. 항체는 환자에게 1회(one-off) 또는 계속 용법(series doses)으로 투여하기 적합하다.

질환의 타입 및 심한 정도에 따라서, 1회 또는 수회의 분리 용법(separated dose), 또는 연속 주입을 불문하고, 1 μg/kg 내지 50 mg/kg(예를 들어 0.1-20 mg/kg)의 항체가 환자에 대한 초기 후보 용량이다. 위에서 언급한 요인에 따라서, 전형적인 1일 용량 또는 주 용량은 약 1 mg/kg-20 mg/kg 또는 그 이상이다. 수 일 또는 그 이상(상태에 따름) 내에 반복 용량에 대해서는, 질병 증상이 바라는대로 억제될 때까지 치료가 계속되어야만 한다. 그러나, 다른 요양법(regimen) 역시 사용될 수 있다. 치료의 과정은 전통적인 기술 및 분석방법을 사용하여 용이하게 관찰될 수 있다.

산물( Product )

1) 주입( injection )

본 발명의 또다른 실시예는 상기 질병들의 치료를 위해 사용되는 재료를 포함한 산물을 제공하는 것이다. 상기 산물은 용기 및 라벨(label)을 포함한다. 상기 적합한 용기들은 일반 유리병들, 약병들, 주사기들 및 시험관들을 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은, 다양한 재료들로 만들어질 수 있다. 상기 용기들은 질병들을 치료하기 위한 효과적인 조성물을 포함하고, 그리고 멸균 입구(예를 들어, 상기 용기는 플러그드 정맥 수액 백(plugged intravenous infusion bag) 또는 병일 수 있고, 상기 마개는 피하 주사바늘(hypodermic needle)을 사용하여 관통할 수 있다)를 포함한다. 상기 조성물에 있는 유효성분은 항-TNFα 항체이다. 상기 용기에 있는 또는 관련된 상기 용기와 관련된 라벨은 조성물에 의해 치료되는 특정 조건들을 명시한다. 상기 산물들은 또한 인산버퍼(phosphate buffer), 링거(Ringer? solution) 및 글루코스 용액(glucose solution)과 같은, 약학적으로 수용가능한 버퍼를 포함하는, 또다른 용기를 가질 수 있다. 사업상 필요 또는 사용자의 필요에 따라, 상기 용기는 다른 버퍼들, 희석제들(diluents), 여과기들(filters), 바늘들, 주사기들과 같은 다른 재료들, 및 설명서를 포함할 수 있다.

2) 서방형 제제( Sustained Release Formulations )

본 발명의 인간화 항-종양 괴사인자 단일클론 항체들은 서방형 제제의 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 적합한 서방형 제제는 상기 항체들의 고체 소수성 중합체를 포함하는 반투과성막 매트릭스 본체(semi-permeable matrix body)와 같은 것을 포함하고, 그리고 상기 매트릭스 본체는 필름 또는 마이크로캡슐(microcapsules)과 같은 만질 수 있는 물질이다. 상기 서방형 매트릭스 본체는 폴리에스터(polyesters), 하이드로겔(hydrogels)(예를 들어, 폴리(메타크릴산 2-히드록시 에틸(poly(methacrylic acid 2-hydroxy ethyl)) 또는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)), 폴리락타미드(polylactide)(U.S. Patent 3,773,919), L-글루탐산(L-glutamic acid) 및 L-글루탐산 에틸 에스터 공중합체(L-glutamic acid ethyl ester copolymer), 난분해성 에틸렌 비닐 아세테이트(non-degradable ethylene vinyl acetate), Lupron DepotTM(락탄산-글리콜산 공중합체(lactic acid-glycolic acid copolymer) 및 류프로라이드 아세테이트(leuprolide acetate))로 구성된 주입가능한 미세구(microspheres))와 같은 분해성 락탄산-에탄올 산 공중합체(degradable lactic acid-ethanol acid copolymer), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부탄산(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)과 같은 것을 포함한다. 에틸렌 비닐 아세테이트 및 락탄산-글리콜산과 같은 분자 중합체들(molecular polymers)은 100일 또는 그 이상 동안 지속하는 분자를 방출할 수 있지만, 반면 몇몇 하이드로겔들은 단시일에 단백질들을 방출한다. 캡슐화된 항체들이 장시간 동안 상기 본체에 유지되어 있을 때, 37℃에서 물과 접촉하기 위해 변성(denaturation) 또는 접착(cohesion)될 수 있고, 그 결과 생물학적 활성이 감소하고 그리고 면역원성(immunogenicity)에 있어서 변화를 이끌 수 있다. 합리적으로 안정된 전략은 메커니즘(mechanism)에 따라 설계될 수 있다. 예를 들어, 만약 응축 메커니즘이 황-이산화황 교환 반응(sulfur-disulfide interchange reaction)에 의한 분자간 S-S 결합의 형성이라면, 안정화는 티올(thiol) 잔기를 변형, 산성 용액을 동결건조, 수분 함량을 조절, 적합한 첨가제를 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물을 설계함으로써 달성할 수 있다.

키트( Kit )

편의상, 본 발명의 항체는 키트의 형태로 제공될 수 있으며, 다시 말해서, 사전결정된 시약들의 양 및 진단 분석을 위한 설명서가 함께 동봉될 수 있다. 만약 항체가 효소 표시된다면, 키트는 상기 효소를 위해 요구되는 기질 및 보조인자들(cofactors)(탐지 가능한 발색단(chromophores) 및 형광단(fluorophores)을 제공하는 기질 전구체들과 같은)을 포함할 것이다. 뿐만 아니라, 상기 키트는 또한 안정화제들(stabilizers), 버퍼들(차단 버퍼(blocking buffer) 또는 용해 버퍼(lysis buffer)와 같은)과 같은 다른 첨가제들을 포함할 수 있다. 상기 제공되는 시약 농도가 분석의 최고 감도를 달성할 수 있도록 하기 위하여, 다양한 시약들의 상대적인 양을 상당히 바꿀 수 있다. 특히, 상기 시약은 일반적으로 동결 건조된 분말 형태인, 건조 분말일 수 있고, 그리고 부형제들이 포함될 수 있다. 상기 시약들은 용해 하에 적절한 농도를 가지는 시약 용액을 형성할 것이다.

이하, 본 발명을 하기 구체적인 실시예에 의하여 추가적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서, 특정 조건을 기재하지 않은 실험 방법은 일반적으로 종래의 조건, 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning : Laboratory Manual (New York; the Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에서 기술된 조건, 또는 당해 업자에 의해 추천되는 조건으로 수행된다.

실시예

실시예 1: 항-hTNFα 마우스(mouse) 단일클론 항체의 제조

1) 면역(Immune)

몇몇 7-11주 된 암컷 Balb/c 마우스는 재조합 hTNF(Pepro Tech Inc.로부터 구입한, rhTNFα)를 가지고 IP 또는 ID 면역화되었고, 그리고 상기 재조합 인간 TNFα는 최종 부피 100-400 μL로 동일한 부피의 TITERMAX 또는 프로인드 완전보조제(Freund's complete adjuvant)를 사용하여 에멀션화되었다. 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 및/또는 21-34 일 후, 각각의 마우스는 동일한 부피의 TITERMAX 또는 프로인드 완전보조제로 에켤션화된 TNF를 가지고 IP(1-400 μg) 및 SC(1400 μg×2) 되었다. 12-25 및 25-40 일 후에, 혈액 샘플들은 항응고제 없는(non-anticoagulant) 조건에서 고관절천자(hip puncture)에 의해 마우스로부터 획득되었다. 그리고 상기 혈액은 혈청을 획득하기 위해 RT에서 1 시간 동안 응고시킨다. 역가(Titers)는 알려진 방법에 따라 TNFα ELA를 사용하여 제조되었다. 반복된 주입이 역가에 있어서 증가를 유도하지 않을 때, 융합이 수행되었다. 상기 시점에서, 100 μL의 셀라인(saline)으로 희석된 1-400 μg의 TNFα는 마지막 추가 접종(booster shots)을 위해 상기 마우스에 주입될 수 있다. 3일 후, 상기 마우스는 경추 탈골에 의해 희생되고, 그리고 비장은 멸균 조건에서 분리되고, 그리고 1000 U/mL 페니실린(penicillin), 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin), 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B(amphotericin B, PSA)를 포함한 10 mL의 차가운 염산 완충 셀라인(hydrochloric acid buffered saline, PBS)에 담궜다. 비장세포는 PSA-PBS를 가지고 상기 비장을 멸균 관류함으로써 수득되고, 그리고 트립판 블루(trypan blue) 염색 제거 방법으로 수가 계산되고, 그리고 25 mM Hepes를 포함한 RPMI 1640 배지로 재현탁되었다.

2) 혈청 테스트( Serum Test )

플레이트(plate)는 PBS에 있는 2 μg/mL의 TNFα로 하루 동안 코팅되었다. 0.02%(v/v) Tween 20을 포함한 0.15 M 셀라인으로 세척한 후, 각각의 웰(well)은 PBS에 있는 1%(w/v) BSA, 200 μL/웰을. RT에서 사용하여 1 시간 동안 차단되었다. 상기 플레이트는 즉시 사용되거나 또는 추후 사용을 위해 -20℃에서 동결되었다. 50 μL/웰의 마우스 혈청 희석제는 RT에서 1 시간 동안 TNFα 코팅된 플레이트 위에서 배양되었다. 상기 플레이트는 세척되고, 그 후 1% BSA-PBS에서 1:30000 특이적 희석된 50 μL/웰의 HRP 표지된 IgG Fc 프로브로 RT에서 1 시간 동안 모니터 되고, 다시 세척되고, RT에서 15 분 동안 100 μL/웰의 구연산-인산염 기질 용액(citrate-phosphate substrate solution)(0.1 M 구연산(citric acid) 및 0.2 M 황산나트륨(sodium sulfate), 0.01% H₂O₂ 및 1 mg/mL OPD)이 첨가되고, 그 후 25 μL/웰 종결용액(4N 황산(sulfuric acid))이 첨가되었다. 그리고 OD값은 자동화 플레이트 분광광도계(spectrophotometric photometer)를 가지고 490 nm에서 판독되었다.

3) 세포 융합( Cell Fusion )

상기 혈청 테스트로 혈청 내 고수준의 항-hTNFα 항체가 확인된 살아있는 비장세포는 1:1 내지 10:1의 비율로 마우스 골수종세포(myeloma cells)와 융합되었다. 한정되지 않는 실시예로서, 상기 비장세포 및 골수종세포는 공동-침강되고, 그리고 1 mL의 50%(w/v) PEG/PBS 용액(PEG 분자량 1450, sigma)으로 37℃에서 30 초 또는 그 이상 동안 재현탁되었다. 상기 융합을 종결하기 위하여, 25 mM Hepes(37℃)가 포함된 10.5 mL의 RPMI 1640 배지로 1 분 또는 그 이상 동안 종결시켰다. 상기 융합된 세포는 500-1500 rpm으로 5분 동안 원심분리 되었고, 그 후 HAT 배지(25 mM Hepes, 10% Fetal the Clone I serum(Hyclone), 1 mM 피부르산나트륨(sodium pyruvate), 4 mM L-글루타민(L-glutamine), 10 μg/mL of celebration Trappe factors, 2.5% Origen 배양 보충제(Origen culture supplement)(Fisher), RPMI 1640/Hepes 배지로 조절된 10%의 653, 50 μM 2-메캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 100 μM 히포키산틴(hypoxanthine) 및 16 μM 티미딘(thymidine))로 재현탁되고, 그리고 200 μL/웰로 15개의 96-웰 평탄한-바닥(flat-bottom) 플레이트에 처리되었다. 그 후 상기 플레이트는 37℃ 배양기에서 5% CO₂ 및 95% 습도로 7-10 일 동안 놓여졌다.

실시예 2: 항- hTNF α 쥐( murine ) 항체의 정성 테스트

두 종류의 정성 테스트가 항-TNFα 항체를 위해 사용될 수 있다. 하나의 테스트에서, 상기 항체 및 휴미라(Humira)는 hTNFα와 결합에 있어서 경쟁적이고, 그리고 상기 경쟁이 측정된다. 다른 테스트에서, hTNFα를 중화시키는 상기 항체의 능력은 L929 세포 독성을 측정하는 분석법으로 측정된다. 하기에서, 상기 두 방법들 및 실험 결과들이 각각, 기술된다.

1) 휴미라에 대하여 경쟁적 결합 분석법

호스라디시 페록시다아제(horseradish peroxidase(HRP))로 표지된 상기 항-hTNFα 인간 항체 휴미라는 시약으로서 사용되었다. Elisa 플레이트들은 rhTNF(50 μl의 0.05 g/mL)로 코팅되고, 그리고 하루 동안 상온에 놓여졌다. 상기 코팅 용액은 제거되고, 그리고 각각의 웰은 약 0.5 시간 동안 인산완충셀라인(PBS)에 있는 1% 스킴밀크(skim milk)로 차단되고, 그리고 0.05% Tween 20를 포함한 PBS로 세척되었다. 그 후 50 μl의 성장배지 및 50 μl의 HRP 표지된 휴미라 혼합물이 각 웰에 첨가되었다. 비표지된 휴미라 및 항체-유리(antibody-free) 배지는 양성 및 음성 대조군들로서 사용되었다. 상기 방법은 rhTNFα에 HRP-표지된 휴미라가 결합하는 것을 강하게 억제할 수 있는 마우스 단일클론 항체를 조사할 수 있다. HRP-표지된 휴미라 및 rhTNFα의 결합이 억제된 상기 웰 Kong은 증폭되고 서브클론되고, 그 다음 억제 효과를 보이는 몇몇 마우스 단일클론 항체를 분석하고, 그리고 마지막으로 하이브리도마 세포(hybridoma cells)가 조사되었다. 상기 하이브리도마 세포는 중간배양되고, 그리고 상등액은 정제를 위해 수득되고, 그리고 마우스 단일클론 항체 TM2-11-12 및 TM2-6-3가 정제된다. 상기 정제된 마우스 단일클론 항체 TM2-11-12 및 TM2-6-3은 경쟁적 결합 분석법으로 테스트된다. 1 μg/mL 이상의 농도에서도, 상기 마우스 항체 TM2-6-3이 유일하게 약 50%의 hTNFα에 결합하는 휴미라에 경쟁하였다. 또다른 마우스 항체 TM2-11-12은 비표지된 휴미라만큼 좋은 경쟁력을 보였지만, 반면 약 0.05 μg/mL (3×10^-10 M과 동등함)의 농도에서, 상기 항체는50%의 hTNFα에 결합하는 휴미라에 경쟁할 수 있다.

2) 항-hTNFα 쥐 항체의 정성 테스트: hTNFα를 중화하는 체외(in vitro) 활성의 측정

hTNFα 생물학적 활성을 중화하는 항-hTNFα 마우스 항체 및 키메라(chimeric) 항체 모두의 생물학적 활성은 하기 설명과 같이 L929 독성 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 96-웰 배양 플레이트의 각 웰은 7.5×10³ 의 L929 세포(ATCC)(10⁵/mL, 75 μl)가 주입되었고, 그리고 24 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에 놓여졌다. L929 세포를 위한 성장배지는 5% 우태하혈청(fetal bovine serum)(GIBCO)을 포함한 RPMI-1640였다. 또 다른 96-웰 배양 플레이트를 사용하여, 항-hTNFα 항체를 포함한 용액은 1/2 연속적으로 RPMI 성장 배지로 희석되었고, 그리고 rhTNFα는 각각의 샘플 웰에 5 ng/mL의 rhTNFα의 최종 농도로 첨가되었다. 혼합물들을 포함한 상기 플레이트는 2 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에 놓여진 후, 항체 및 rhTNFα의 혼합물이 L929 세포 웰에 첨가되었다. 각 라인에, 각 웰에서 항체의 농도는 대략 0.001 내지 2 μg/mL였다. 상기 배양 플레이트는 37℃, 5% CO₂ 배양기에 놓여졌다. 살아남은 세포들이 3 일 후 측정될 때, 2.5 mg/mL 3-(4, 4-디메틸-티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸 브로마이드 염(3-(4,4-dimethyl-thiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazole bromide salt, MTT; Sigma Biochemicals로부터 구매된)을 포함한 20 μl의 PBS가 첨가되고, 그리고 4 시간 동안 37°C에서 배양되고, 그 후 소듐 도데실 황산염(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함한 100 μl의 0.01 N HCl이 하루 동안 첨가되었다. 그 다음, 540/690 nm 광학 밀도가 각 웰당 테스트 되었다. 광학 밀도의 정도 및 항체 농도를 위한 곡선이 나타내어 졌다. IC₅₀은 결합 곡선을 분석함으로써 얻어졌고, 상기, IC₅₀은 L929 세포에서 50%의 rhTNFα 독성이 중화될 수 있는 농도를 의미한다. 그러므로, IC₅₀ 값은 hTNFα 세포 독성을 억제하는 항체의 능력을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 항-hTNFα 쥐 항체(TM2-11-12, TM2-10-20, TM2-2-2) 및 휴미라의 IC₅₀ 값은 모두 0.01 내지 0.04 μg mL의 범위 내였고, 이는 상기 항체들 모두 rhTNFα에 의해 야기되는 L929 독성을 중화하는 유사한 능력을 가짐을 의미한다. 상기 항-hTNFα 마우스 항체 TM2-11-12는 바람직하게 상기 키메라 항체의 제조를 위해 선택되었다.

실시예 3: TM2 -11-12 쥐 항체 중쇄 ( heavy chain ) 및 경쇄(light chain)의 클로닝( cloning )

1) TM2-11-12 쥐 항체 중쇄 가변 영역(variable region)의 클로닝

쥐 항체의 인간화(humanization)를 설계하기 위하여, 쥐 항체 TM2-11-12 중쇄 및 경쇄 가변 영역 암호화 서열을 포함한 DNA 단편들이 처음에 획득되어야 한다. cDNA(GeneRacer kit, Invitrogen, Corp.)를 제조하기 위하여, RNA는 RNA 정제 키트(purification kit)( Invitrogen Corp.)를 가지고 TM2-11-12 마우스 하이브리도마 세포로부터 분리되었다. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해, 5' 프라이머(primer)(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3', 서열번호: 24) 및 3' 프라이머(5'-TCCAGGGGCCAGTGGATAGAGAGA-3', 서열번호: 25)을 이용하여, 중쇄 가변 영역 DNA 단편이 cDNA로부터 분리되었다. 3' 프라이머는 마우스 IgG1 중쇄 불변 영역(constant region)에 동종 안티센스(homologous antisense)이다. 상기 획득된 DNA 단편들은 TOPO TA 벡터(Invitrogen)로 클로닝 되고 서열분석 되었다. 상기 중쇄 가변 영역 아미노산 서열은 서열번호: 34이다: QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRSLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSTSTAFLQINTLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS. 상보성 결정 영역(complementary determining regions )에 있는 아미노산 서열은 CDR-H1(서열번호: 3), CDR-H2(서열번호: 4) 및 CDR-H3(서열번호: 5)이다. 상보성 결정 영역에 대한 정의는 Kabat E. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242에서 찾을 수 있다.

2) TM2-11-12 쥐 항체 경쇄 가변 영역의 클로닝

상기 중쇄 가변 영역 클로닝의 PCR 방법과 유사하게, 5' 프라이머로서 서열번호:29 및 마우스 면역글로블린(immunoglobulin) κ 경쇄 불변 영역(5'-CACTGGATGGTGGGAAGATGGATA-3', 서열번호: 26)에 동종 안티센스인 다른 3' 프라이머를 사용하여, 경쇄 가변 영역 DNA 단편이 cDNA로부터 분리되었다. 상기 획득된 DNA 단편들은 TOPO TA 벡터로 클로닝 되고 서열화 되었다. 두 가지 형태의 클론들(clones)이 발견되었다. 상기 클론들의 약 3/4는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열의 일부가 판독 가능한 아미노산 서열(서열을 기재하지 않음)로 번역되지 않는 것으로 나타난다. 이런 클론들은 돌연변이된 경쇄 전령 RNA(messenger RNA)였고, 이는 기능성 항체 경쇄 단백질을 암호화할 수 없다. 클론들의 나머지 약 1/4는 상보적으로 판독 가능한 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이런 클론들은 기능성 경쇄 전령 RNA로부터 유래된다. 상기 획득된 DNA 단편들은 TOPO TA 벡터(Invitrogen)로 클로닝 되고 서열분석 되었다. 상기 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열번호: 35이다: ENVLTQSPPIMSASPGEEVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK. 상보성 결정 영역에 있는 아미노산 서열은 CDR-L1(서열번호: 6), CDR-L2(서열번호: 7) 및 CDR-L3(서열번호: 8)이다. 상기 아미노산 서열은 인간화 경쇄를 설계하기 위해 사용되었다.

실시예 4: 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 설계

항원 결합 활성을 유지하기 위하여, 경쇄 및 중쇄 고도가변 영역(hypervariable regions) 내에 있는 모든 아미노산 서열은 인간화 과정 동안 여전히 TM2-11-12 쥐 항체의 아미노산 서열과 동일하다. 항체 결합 친화도(affinity)를 증가시키거나 또는 항체 면역원성을 감소시키기 위하여, 인간화 설계는 인간 항체의 서열에 따라 구조형성영역들(framework regions) 내 아미노산 잔기들을 변형하고, 변형(modification)의 다양성을 가지는 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변영역를 설계하고, 그리고 컴퓨터 시뮬레이션(simulation) 기술에 의해 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열의 올리고뉴클레오티드 부위들(oligonucleotides sites)을 특정 돌연변이(directed mutating)시키는 것을 포함한다.

인간화된 항체 중쇄 가변 영역(서열번호: 1)을 위하여, 구조형성영역 FR-H1 내에, 아미노산 잔기 위치 16에서 A가 E로 치환될 수 있고, 위치 17에서 S가 T로 치환될 수 있고, 위치 20에서 I가 V로 치환될 수 있고; FR-H2 내에, 위치 3에서 K가 R로 치환될 수 있고, 위치 9에서 G가 S로 치환될 수 있고; FR-H3 내에, 위치 3에서 T가 V로 치환될 수 있고, 위치 7에서 E가 D로 치환될 수 있고, 위치 10에서 V가 T로 치환될 수 있고, 위치 14에서 F가 Y로 치환될 수 있고, 위치 19에서 S가 T로 치환될 수 있고, 위치 27에서 T가 V로 치환될 수 있다.

인간화된 항체 경쇄 가변 영역(서열번호: 2)을 위하여, 구조형성영역 FR-L1 내에, 위치 11에서 L이 M으로 치환될 수 있고, 위치 18에서 R이 E로 치환될 수 있고, 위치 21에서 M이 I로 치환될 수 있고; FR-L2 내에, 위치 13에서 W가 L로 치환될 수 있고; FR-L3 내에, 위치 4에서 S가 A로 치환될 수 있고, 위치 22에서 L이 V로 치환될 수 있고, 위치 27에서 A가 F로 치환될 수 있다.

적어도 하나의 상기 전술한 아미노산 변형을 소개함으로써, 몇몇 인간화 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 다양한 아미노산 서열들이 설계된다. 인간화 항체 중쇄 가변 영역 VH 및 VL의 몇몇 아미노산 서열들은 하기 [표 1]에 기재되었다:

인간화 항체 중쇄 가변 영역 VH 및 경쇄 가변 영영 VL의 아미노산 서열들

번호	아미노산 서열	서열번호:
E001VH	QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS	1
E002VH	QVQLVQSGPELKKPGASVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLDTSVSTAFLQINSLKDEDLAVYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS	27
E003VH	QVQLVQSGPELKKPGESVKISCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSTSTAYLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS	28
E004VH	QVQLVQSGPELKKPGATVKVSCKASGYTFTHYGMHWVKQTPGRSLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAFLQINTLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS	29
E005VH	QVQLVQSGPELKKPGASVKVSCKASGYTFTHYGMHWVRQTPGRGLKWVGWINTYTGEPTYDADFQGRFTFSLETSVSTAYLQINSLKDEDLATYFCARYDFDGFDYWGQGTTLTVSS	30
F001VL	ENVLTQSPPILSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK	2
F002VL	ENVLTQSPPILSASPGEEVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDFATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK	31
F003VL	ENVLTQSPPIMSASPGERVTMTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVLIYSTSNLVSGVPSRFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK	32
F004VL	ENVLTQSPPILSASPGERVTLTCRASSSITFNYLHWYQQKSGDSPKVWIYSTSNLVSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEAEDAATYYCQQYSDYPYTFGGGTKLEIK	33

실시예 5: pHu _항- H1L1 -의 TNF α 인간화 항체 발현 벡터( vector )의 구성

1) 인간화 항체 경쇄를 위한 유전자(gene)의 구성

먼저, 인간화 항체 경쇄 가변 영역(F001VL)을 위한 유전자 단편(fragment)은 합성 방법에 의해 제조된다. 그리고 상기 제조 절차는 유전자 코돈들(genetic codons)에 따라 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열로부터 역번역(reverse translation)에 의해 뉴클레오티드 서열을 획득하고; 5' 말단에 코작(Kozak) 서열 및 경쇄 선도 서열(leader sequence)을 추가하고; 합성 방법에 의해 경쇄 가변 영역을 위한 상기 유전자 단편을 제조하는 것을 포함한다. 상기 유전자 단편은 pHu-VL1 플라스미드(plasmid)를 획득하기 위해 적합한 벡터들에 클로닝되었다. 그 다음, 5' 단편은 주형으로서 pHu-VL 플라스미드, 5' 프라이머 FVHX(서열번호: 17) 및 3' 프라이머 VKCKO(서열번호: 21)를 사용하여 획득되고, 이는 인간화 항체 경쇄 가변 영역(V_L)을 위한 유전자 및 인간 κ 경쇄 불변 영역(C_κ)의 5'-말단에 7개 아미노산을 포함한다. 한편, 인간 κ 경쇄 불변 영역(C_κ) 암호화 서열을 포함한 유전자(A gene)는 역전사 및 PCR을 통해 5' 프라이머 HuCKF(서열번호: 22) 및 3' 프라이머 HUCKB(서열번호: 23)를 사용함으로써 인간 백혈구(leucocyte)로부터 제조된 RNA로부터 획득된다. 마지막으로, 인간화 항체 경쇄 가변 영역 및 인간 C_κ유전자의 단편은 경쇄 암호화 서열을 포함한 약 700 bp 길이의 유전자 단편을 획득하기 위해 5' 프라이머(FVHX, 서열번호: 17) 및 3' 프라이머(HUCKB, 서열번호: 23)를 이용하여 PCR에 의해 연결된다. 상기 유전자 단편은 엔도뉴클레아제(endonuclease) Hind III 및 Bam H1과 함께 처리되고, 그 후 PUC19(참조: Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119.)와 같은 벡터들에 삽입된다.

2) 인간화 항체 중쇄를 위한 유전자의 구성

먼저, 인간화 항체 중쇄 가변 영역(E001VH)을 위한 유전자 단편은 합성 방법에 의해 제조된다. 그리고 상기 제조 절차는 유전자 코돈들에 따라 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 위한 역번역에 의해 뉴클레오티드 서열을 획득하고; 5' 말단에 코작 서열 및 중쇄 선도 서열을 추가하고; 합성 방법에 의해 중쇄 가변 영역을 위한 상기 유전자 단편을 제조하는 것을 포함한다. 상기 유전자 단편은 pHu-VH1 플라스미드를 획득하기 위해 적합한 벡터들에 클로닝되었다. 그 다음, 5' 단편은 주형으로서 인간화 항체 중쇄 가변 영역 V_H 유전자 단편을 포함한 플라스미드(pHu-V_H), 5' 프라이머 FVHX(서열번호: 17) 및 3' 프라이머 RVCG(서열번호: 18)를 사용하여 획득되고, 이는 인간화 항체 중쇄 가변 영역(V_H)을 위한 유전자 및 인간 IgG₁ 중쇄 불변 영역(C_γ1)의 5'-말단에 7개 아미노산을 포함한다. 한편, 인간 IgG₁ 중쇄 불변 영역(C_γ1) 암호화 서열을 포함한 유전자(A gene)는 역전사 및 PCR을 통해 5' 프라이머 HuCGF(서열번호: 19) 및 3' 프라이머 HUCGE(서열번호: 20)를 사용함으로써 인간 백혈구로부터 제조된 RNA로부터 획득된다. 마지막으로, 인간화 항체 중쇄 가변 영역 및 인간 C_γ1 유전자의 단편은 중쇄 암호화 서열을 포함한 약 1400 bp 길이의 유전자 단편을 획득하기 위해 5' 프라이머(FVHX, 서열번호: 17) 및 3' 프라이머(HUCGE, 서열번호: 20)를 이용하여 PCR에 의해 연결된다. 상기 유전자 단편은 엔도뉴클레아제 Hind III 및 EcoR1과 함께 처리되고, 그 후 인간화 항체 중쇄 단백질을 발현하기 위해 PUC19(참조: Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. (1985) Gene, 33, 103-119.)와 같은 벡터들에 삽입된다. 상기 유전자 단편의 서열은 DNA 서열분석(sequencing)에 의해 올바른지 입증되었다.

3) 인간화 항체 단쇄(single-chain) 발현 벡터

전술한 방법으로 획득된 상기 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 cDNA는 pHu_항-H1L1-TNF 인간화 발현 벡터를 제작하기 위해 pcDNA3(Invitrogen USA, Carlsbad, CA, U.S.A.로부터 구입된) 벡터에 삽입된다. 상기 발현 벡터 플라스미드는 포유동물 세포들에서 고수준 발현을 위해 요구되는 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus) 초기 유전자 프로모터-인핸서(promoter-enhancer)를 포함한다. 한편, 박테리아에서 엠피실린(ampicillin) 저항성을 갖고, 포유동물 세포에서 G418 저항성을 갖기 위해, 상기 벡터 플라스미드는 또한 선택적 마커(optional maker) 유전자를 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 벡터 플라스미드는 DHFR 유전자를 포함한다. 적합한 숙주세포들(host cells)에서, 키메라 항체 유전자 및 DHFR 유전자는 메토트렉세이트(Methotrexate) (MTX, Sigma) (참조, 예를 들어, Axel, R., et al. U.S Patent No. 5,179,017; Kaufman,R. and Sharp,P., J.Mol. Biol. 159:601-621,1982)에 의해 공동-증폭될 수 있다.

실시예 6: 인간화 항체들의 발현

상기 제작된 재조합 발현 플라스미드는 항-hTNFα 인간화 항체를 발현하기 위해 포유류 숙주세포로 형질감염되었다. 고수준의 발현을 안정화하기 위하여, 상기 바람직한 숙주세포들은 다이하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate reductase, DHFR) 결핍 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포(참조, 예를 들어, Chasind, L., et al, U.S. Patent 4,818,679)이다. 상기 형질감염(transfection)의 바람직한 방법은 일렉트로포레이션(electroporation)이고, 그리고 다른 방법들은 또한 인산칼슘 공침전법(calcium phosphate coprecipitation), 지질 형질감염(lipid transfection) 및 원형질 융합(protoplast fusion)을 포함하여 사용될 수 있다. 일렉트로포레이션에 있어서, 250V 전기장(electric field) 및 960 μFd 커패시터(capacitor)에서 Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) 세트가 사용되고, 0.8 mL의 PBS에서 현탁된 2×10⁷ 세포는 큐벳(cuvette)에 첨가되고, 상기 큐벳은 또한 PvuI(TakaRa)를 사용함으로써 선형화된 10 μg 발현 플라스미드 DNA를 포함한다. 2일 동안 형질감염한 후, 0.2 mg/mL의 G418 및 200 nM 메토트렉세이트(methotrexate 또는 MTX)가 첨가된다. 고수준의 발현을 달성하기 위하여, 상기 형질감염된 인간화 항체 유전자는 MTX 약물들에 의해 억제되는 DHFR 유전자를 사용함으로써 공동-증폭된다. 서브클로닝 형질감염체(subcloning transfectants)는 희석되고, 그리고 다양한 세포주들의 분비율은 고-수준 발현의 인간화 항체를 가지고 세포주를 확인하기 위해 측정된다.

실시예 7: L929 세포에서 TNF α 사멸 효과( killing effect )를 중화하는 항체들 연구

L929 세포는 트립신화되고(trypsinized), 원심분리되고, 10% FCS가 보충된 1640 배지로 재현탁되고, 수가 계산되고, 그리고 특정 농도에서 96-웰 플레이트의 1 내지 11 컬럼(column)에 첨가되었다. 그 후, 적절한 농도의 TNFα가 96-웰 플레이트의 1 내지 10 컬럼에 첨가되었다. 각각, 아달리무맙(adalimumab)(Abbott Laboratories로부터 구입된)의 2배 구배 희석체, 상기 실시예 5 및 6에 따라 제조된 아미노산 비변형된 키메라 항체 AT(CE)-1, AT132, AT135, AT143, AT151, AT164가 저에서 고로(컬럼 1 내지 9) 연속적인 농도로, 열(row) A, B, C, D, E, F, G 및 H에 첨가되었다. 그리고 컬럼 10은 TNFα 대조군이고, 컬럼 11은 세포 대조군이고, 그리고 컬럼 12는 배지 대조군이다. 첨가 후, 상기 플레이트는 배양을 위하여 37℃ 이산화탄소(carbon dioxide) 배양기에 놓여졌다. 배양이 완료된 후, 발색시약(color reagent)이 첨가되고, 그리고 계속 배양되었다. 그 후 흡광도(absorbance)는 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정되었다. 결과는 [표 2]에 기재되었다.

L929 세포에서 항체들이 TNFα 사멸 효과를 중화한다

항체 타입(type)	중쇄(heavy chain)	경쇄(light chain)	EC50(ng/mL)
AT132	E001VH	F001VL	20.4
AT135	E002VH	F001VL	50
AT143	E003VH	F003VL	39.8
AT151	E001VH	F002VL	42.1
AT164	E002VH	F003VL	45.5
AT(CE)-1	--	--	15.2
휴미라(Humira)	--	--	19.1

[표 2]에 기재된 결과는 FR 영역에서 돌연변이에 의해 획득된 인간화 항체들이 여전히 TNFα를 중화하는데 좋은 활성을 가지는 것으로 보여준다. AT132의 EC₅₀, 20.4 ng/mL는 휴미라의 EC₅₀과 유사하다.

실시예 8: 인간 U937 세포(인간 림프종( lymphoma ))에서 TNF α 사멸 효과를 중화하는 AT132 연구

좋은 상태에 있는 U937 세포 수가 계산되고 10% FCS를 포함한 1640 배지로 3.75×10⁴/웰의 세포 농도로 조절되었다. 그 후 96-웰 플레이트에, 75 μl/웰로 첨가되었다. 120 ng/mL의 TNFα를 포함한 세포 배양 배지가 AT132 표준 샘플 및 테스트 샘플을 각각 구배 희석하기 위해 사용되었다. 첫 웰에서 농도는 600 ng/mL였고, 희석 구배는 1.5배였다. 희석 후, 상기 샘플들은 25 μl/웰로 96-웰 플레이트에 첨가되었다. 상기 플레이트는 40 시간 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양되었다. 배양 완료 후, 각 웰에 10 μl의 CCK8 발색 시약이 첨가되었고, 3 시간 동안 배양되고, 490nm/630nm 이중 파장(dual-wavelength)에서 마이크로플레이트 판독기로 측정되었다. 4-파라미터(parameter) 곡선적합(cure fitting)이 표준 샘플 및 테스트 샘플들의 ED50을 얻고, 특이적 활성(공식: 100% × 표준 샘플의 ED50/ 테스트 샘플의 ED50)을 계산하기 위해 수행되었다.

도면 1은 U937 세포의 TNFα 사멸 효과를 중화하는 항체의 곡선을 나타낸다.

도면 1의 분석 결과는, 극도로 낮은 농도의 AT132에서, TNFα가 세포를 죽이는 것을 나타낸다. AT132의 농도가 증가하면서, TNFα 사멸 효과는 점차적으로 중화된다(antagonized). AT132농도가 약 80 ng/mL에 도달하면, TNFα 사멸 효과가 완전히 중화된다. 명확히, 이는 몇몇 실험의 결과에 따라 용량-의존적(dose-dependent)이다. 30 ng/mL의 TNFα를 중화시키는 AT132의 평균 중간 효과적인 농도는 24.1 ng/mL이다.

실시예 9: AT132 친화도 측정

AT132 친화도는 Biacore X100에 의해 측정되었고, 그리고 Biacore X100 동역학/친화도(kinetics/affinity) 분석 소프트웨어로 분석되었다. 간접 캡처 방법을 사용하여, 염소(goat) 항-인간 IgG Fc 다클론 항체가 Amine Coupling kit를 이용함으로써 캡처 분자로서 CM5 칩의 표면에 결합되었다. 계산에 의해, AT132 및 대조군으로서 휴미라가 요사이 리간드로서, 그리고 TNFα가 분석물로서 사용되기 위해 특정 농도로 각각 희석되었다. 분석물들은 5 농도로 희석되었고, 그리고 한 주기로 각 농도가 희석되었다. 먼저, 3 주기 동안 수행하기 위해 HBS-EP 버퍼를 사용하고, 2 주기 동안 수행하기 위해 0 농도의 분석물 농도를 설계하고, 그리고 마지막으로, 한 주기 동안 수행하기 위해 반복 분석물 농도를 설계한다. 전체 과정은 11 주기를 수행하고, 그리고 각 주기는 곡선을 그릴 수 있다. 측정된 항체 및 휴미라의 동역학/친화도 데이터는 Biacore X100 동역학/친화도 분석 소프트웨어에 의해 분석되었다.

결과: 1.19×10^-11 M 의 AT132 해리 상수(dissociation constant)(Kd), 즉, 8.4×10¹⁰ M^-1의 친화도 상수(affinity constant)(Ka), 1.08×10^-10 M의 휴미라 해리 상수, 즉, 9.3×10⁹ M^-1의 친화도 상수.

실시예 10: 마우스 TNFα 및 원숭이 TNFα 에 대한 AT132 결합 활성

플레이트 상에, 상온에서 각각의 염소 재조합 인간 TNFα 5 ng/웰, 마우스 TNFα 25 ng/웰, 및 원숭이 TNFα 5 ng/웰을, 1시간 동안 차단하고, 세척하였다. 그 후 AT132의 1.8배 구배 희석제가 250 ng/mL의 초기 농도로 첨가되고, 그리고 25℃에서 2 시간 동안 배양되고, 세척되고, HRP-표지된 항-인간 Fc 항체가 첨가되고, 그리고 상온에서 1 시간 동안 배양되고, 세척되고, 그리고 기질 용액이 100 μl/웰로 첨가되고, 37℃에서 30분 동안 암실에 놓여졌다. 첨가된 발색 시약의 절차에 따라, 0.2 M H₂SO₄, 50 μl/웰이 반응을 종결하기 위해 첨가되었다. 종결 후 약 5분 내에, OD값이 마이크로플레이트 판독기로 450 nm/630 nm에서 측정되었고, 그리고 중간(median) 효과적인 농도가 4-파라미터 적합에 의해 획득되었다. 다른 출처의 TNFα에 대한 AT132 결합 활성과 비교한다.

마우스 TNFα 결합 활성 결과는 AT132가 마우스 TNFα에 결합하지 못함을 보여준다. 코팅 농도 및 AT132 샘플 농도에 기반된 계산은 마우스 TNFα에 대한 AT132 결합 활성이 인간 TNFα에 대한 결합 활성보다 적어도 1,000배 낮음을 나타낸다.

원숭이 TNFα 결합 활성 결과는 원숭이 TNFα에 대한 AT132 결합 활성이 인간 TNFα에 대한 결합 활성의 약 50%였음을 나타낸다.

실시예 11: 주사액의 제조

AT132, AT135 주사액 제조의 제조는 하기와 같다:

1) 20-L 버퍼(밀도: 1.009 g/mL인 20.180 kg 용액과 동등)의 제조

하기 무게로 성분들 무게측정: 240.0 g 만니톨(mannitol), 26.1 g 구연산 일수화물(monohydrate citric acid), 6.1 g 구연산 나트륨(sodium citrate), 30.6 g 이수화된 인산수소이나트륨(dihydrated disodium hydrogen phosphate), 17.2 g 이수화 인산일나트륨(dihydrate phosphate monobasic sodium), 123.3 g 염화나트륨(sodium chloride), 20.0 g 소르비탄 폴리옥시에틸렌(20) 에테르 올레이트(sorbitan polyoxyethylene(20) ether oleate) 및 19715.7 내지 19716.1 g 물.

수산화나트륨(sodium hydroxide) 용액 제조를 위한 주사액을 위한 40.0 g 수산화나트륨 및 1000.8 g 물 혼합.

그 후, 버퍼 제조를 위한 주사액을 위해 약 90% 물로 하기 사전-저울질된 성분(상기에 설명된 바와 같이)을 용해: 만니톨 일수산화물 구연산(mannitol monohydrate citric acid), 구연산 나트륨 이수화 인산수소이나트륨(sodium citrate dihydrate disodium hydrogen phosphate), 에테르 올레이트(ether oleate), 인산이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate), 염화나트륨 및 소르비탄 폴리옥시에틸렌(20) 에테르 올레이트.

모든 상기 버퍼 성분을 첨가한 후, 상기 방법으로 제조된 1M 염화나트륨으로 용액의 pH 조절. 염화나트륨 첨가 후, 최종 무게의 물 첨가. 그 후, 상기 버퍼는 여과 막(친수성 폴리(비닐리덴 플루오라이드)(hydrophilic poly(vinylidene fluoride), 0.22 μm 기공(pore) 크기)을 통해 멸균 용기로 여과된다. 여과에 사용된 여과 매체(media)는 살균(disinfection)을 위한 암모니아이다.

2) 40 L 제제(40.88 kg과 동등)의 제조

여과된 버퍼 용액은 항체 농축물(concentrate)(약학적 제제의 유효성분)에 첨가되고, 하기 방법에 따라 해동되고 혼합되었다. 약학적 제제의 제조 전, 항체(농축물)은 해동을 위해 수욕조(water bath)에 놓여졌다. 34.207 g 항체 농축물이 사용되었고, 이는 2.0 kg의 단백질, 60 mg 단백질/mL의 농도를 가지는 단백질 농축물과 동등하였다. 농축물의 밀도는 1.0262 g/mL였다. 25.655-37.316 내에 모든 단백질 농축물이 사용될 수 있고, 이는 단백질 농축물에 있는 50-80 mg/mL 단백질의 농도와 동등하다. 교반(stirring) 중에, 상기 버퍼가 총 용액의 최종 무게에 도달할 때까지 첨가되었다.

그 후, 모든 성분을 포함한 상기 제제는 두 층의 멸균 0.22 μm 막여과기에 의해 여과되는 것을 제외하고 상기 방법에 따라 여과되었다. 멸균 후, 상기 제제는 사용을 위해 바이알(vial) 또는 사전충전식(pre-filled) 주사기(syringe)에 포장되었다.

실시예 12: AT132 급성(acute) 독성 테스트

테스트 샘플들: AT132 냉동건조 분말(lyophilized powder), 20 mg/병; 보강제(adjuvant) 대조군: AT132 버퍼(히스티딘(histidine), 트레할로오스(trehalose)를 포함); 용매: 주입을 위한 멸균된 물. 테스트 동물 그룹화 및 주입량(dose): 60 Kunming (KM) 마우스, 4-6 주된, 18-22 g 체중, 절반 수컷 및 절반 암컷, SPF 레벨. 상기 동물들은 무작위로 세 그룹들로 나뉘었고, 각 그룹은 20 마리, 절반 수컷 및 절반 암컷이었다. 단일 주입하고 14일 동안 관찰하였다. [표 3]은 주입량 및 투여 경로를 나타낸다.

주입량(dose) 및 투여 경로

번호	그룹	무게에 따른 주입량(mg/kg)	부피에 따른 주입량(mL/kg)
1	보강제(adjuvant) 대조군	―	―
2	테스트 샘플, 피하(subcutaneous) 주입	500	25
3	테스트 샘플, 정맥(intravenous) 주입	500	25

결과 측정: 체중, 음식 섭취량, 심리 상태(mental state), 행동, 대변(stool). 시험 관찰 기간의 종료 후, 상기 동물들은 안락사(euthanasia) 되었고 그리고 병리 육안 해부학적(pathology gross anatomical) 관찰되었다. 그리고 비정상적 조직 또는 기관은 조직학적으로 시험되었다.

결과: 시험하는 동안, 어떤 동물도 죽거나 또는 죽어가지 않았다; 모든 동물은 좋은 심리상태, 정상 행동, 섭취, 물 마심(water drinking)을 했고, 그리고 비정상적인 수행 능력을 보이지 않았다. 각 처리 그룹 동물들의 체중은 투여량에 관련된 정상적 변화를 보이지 않았다. 병리 육안 해부학 관찰은 투여량과 관련된 비정상적 변화를 보이지 않았다.

결론: 본 실험 조건 하에, AT132 분말이 500 mg/kg 용량의 단일 주입으로 정맥(intravenous) 또는 피하(subcutaneous) 주입에 의해 마우스에 투여되었을 때, 중요한 독성이 관찰되지 않았고, 그리고 최대내약용량(maximum tolerated dose, MTD)은 500 mg/kg보다 나았다.

실시예 13: D- 갈락토사민 (D- galactosamine ) 민감 마우스에서 rhTNF α-유도 죽음으로부터 AT132 보호 효과

6 그룹으로 나뉜, 51 마리 C57BL/6 마우스, 체중 20.0±2.0 g(표 4). 그룹 2 내지 5에서, 각 마우스는 복막내로(intraperitoneally) 0.25 mL의 AT132 용액이 주입되었고, 상기, AT132의 양에 기반하여, 그룹 2의 각 마우스는 5.2 μg/마우스의 용량이 주어졌고; 그룹 3은, 26 μg/마우스; 그룹 4는, 52 μg/마우스; 그룹 5는, 26 μg/마우스의 용량이 주어졌다. 그룹 1에서, 각 마우스는 복막내로 0.25 mL pH 5.63 구연산(citrate) 버퍼가 주입되었다. 그룹 6에서, 각 마우스는 복막내로 0.25 mL의 인간 IgG1(HuIgG1, 음성 대조군), HuIgG1의 양에 기반된 26 μg/마우스가 주입되었다. 30 분 후, 각 그룹(그룹 5 제외)에 있는 모든 마우스는 복막내로 0.25 mL rhTNFα(Primegene, batch number 1030109021) 및 D-갈락토사민의 혼합 용액이 주입되었다. 그룹 5에서, 각 마우스는 복막내로 0.25 mL의 버퍼가 주입되었다. 48 시간 내에 죽은 마우스의 수를 관찰하고, 그리고 생존율을 계산하여 [표 4]에 나타내었다.

각 그룹에서 마우스의 생존율

번호	그룹	n	생존/전체	생존율(%)
1	버퍼	9	0/9	0
2	5.2 μg AT132	9	3/9	33.33
3	26 μg AT132	9	9/9	100
4	52 μg AT132	10	10/10	100
5	26 μg AT132 (rhTNF 없음)	7	7/7	100
6	26 μg HuIgG1	7	0/7	0

결과: 버퍼 및 HuIgG1 그룹의 마우스 생존율은 0이었다. 그러나 AT132는 주입량 의존적으로 rhTNFα 및 D-아미노-갈락토오스(D-amino-galactose) 민감 마우스를 보호하였다. 그러므로, AT132는 D-갈락토사민 민감 마우스에서 rhTNFα-유도 죽음으로부터 보호 효과를 나타내었다.

실시예 14: II 형 콜라겐( type II collagen )-유도 관절염( arthritis )에서 AT132의 효과 연구

40 마리 위스타(Wistar) 암컷 쥐는 무작위적으로 4 그룹으로 나뉘었고, 그리고 각 그룹은 10 마리 쥐이다. 상기 그룹은 무대조군(blank control) 그룹, 염증성(inflammatory) 대조군 그룹(모델 그룹), AT132 1 mg/kg 그룹, 및 A132 5 mg/kg 그룹이다.

무대조군 그룹을 제외한, 다른 그룹에서 쥐들은 각각 콜라겐 II 면역(immune)을 위해 등에 피내(intradermally) 주입되었다. 그리고 상기 전염증성(proinflammatory) 대조 그룹은 0.1 mol/L 아세트산(acetic acid) 및 완전 또는 불완전 프로인드 보조제 에멀젼(Freund's adjuvant emulsion)(Sigma, lot number 129K8701)이 주입되었다.

AT132 1 mg/kg 그룹 및 AT132 5 mg/kg 그룹은 면역화(immunization) 하는 날에 복막내로 AT132가 주입되기 시작했다. 첫 면역화 후 일주일에, 상기 마우스는 면역을 강화하기 위해 동일한 방법으로 다시 면역화 되고, 그리고 총 28 일 동안 투여되었다. 투여 전 및 후 다른 시간에, 쥐 관절 부종(joint swelling) 정도는 YLS-7B 발가락 부피 측정 기기(toe volume measuring instrument)에 의해 측정되었다. 상기 관절은 실험 후 병리학(pathological) 실험을 위해 사용되었다. 부종 비율 및 억제 비율이 계산되고, 그리고 그룹 간 차이가 t 테스트에 의해 비교되었다. 하기와 같이 계산되었다:

E_n = 염증 후 다른 시간에 부종 정도,

E₀ = 염증 전 부종 정도

실험 데이터는 평균값(mean values) 및 표준편차(들)(standard deviation(s))이 나타내어지고, 그리고 t 테스트는 통계 분석을 위해 사용되었다. 결과는 도면 2에 나타내었다. AT132 1 mg/kg 그룹은 19일부터 시작해서 좋은 효과와 함께, 상당한 억제 효과들을 나타내었고, 그리고 최고 효과는 63.10%였다. 이 후, 상기 억제효과는 점차적으로 감소했다. 상기 결과는 55.71%의 억제 비율로 28일에 여전히 좋았다. AT132 5 mg/kg 그룹은 19일부터 시작해서 상당한 치료 효과와 함께 상당한 억제 효과들을 나타내었다. 쥐 발(paw) 관절 부종은 점차적으로 진정되고, 그리고 활성들이 정상이 되기 시작하고, 그리고 상기 효과는 28일까지 지속되었다. 47.27%의 최고 억제 비율은 21일에 나타났고, 그리고 다른 억제 비율들은 약 40%였다.

실시예 15: Tg197 마우스 관절염 모델에서 AT132 의 약력학적(pharmacodynamic) 연구

본 실험은 Tg197 트랜스제닉 마우스(transgenic mice)(Cyagen Biosciences로부터 구입된)를 사용하였고, 그리고 상기 마우스는 6 그룹, 각 그룹당 10 마리, 절반 암컷 및 절반 수컷으로 나뉘었다. 상세하게 하기와 같다: 그룹 1: AT132 1 mg/kg; 그룹 2: 용매 그룹 (구연산 및 염화 나트륨을 포함한 버퍼); 그룹 3: AT132 30 mg/kg,; 그룹 4: AT132 10 mg/kg); 그룹 5: 휴미라 10 mg/kg; 그룹 6: AT132 3 mg/kg. 또다른 4 마리 Tg197 마우스는 무대조군 그룹으로 선택되었다.

3 주된 Tg197 마우스는 복막내로 AT132가, 1주일에 2 번, 10주 나이가 될 때까지, 주입되었다. AT132는 투여 전 바람직한 농도로 희석되었고, 그리고 각 그룹은 10 μl/g 체중의 용량이 투여되었다. 마우스 관절염 정도를 관찰하고, 그리고 마우스의 드러난 관절(bare joint)의 병리학적 점수(scores)를 평가하고, 그리고 관절염 점수 및 병리학적 점수에 기반한 억제 비율을 계산한다.

1) Tg197 마우스 관절염 정도에 있어서 AT132 의 연구

마우스 관절(joint) 형태학적 변화들은 매주 관절염의 정도를 판단하기 위해 평가되었고, 그리고 특정 관절염 점수화 기준은 하기와 같다:

0.0 = 비 관절염(겉보기(appearance) 정상, 마우스는 체중을 지탱할 수 있음, 전반적 유연성/회피(overall flexibility/evade) 능력 정상, 최대 악력(grip strength));

0.5 = 관절염의 시작(관절 및 발바닥(paw) 가벼운 부종, 겉보기 정상, 마우스는 체중을 지탱할 수 있음, 전반적 유연성/회피 능력 정상, 최대 악력);

1.0 = 경등도(mild) 관절염(관절 부종 및 변형(deformation), 발바닥 부종, 겉보기 정상, 마우스는 체중을 지탱할 수 있음, 전반적 유연성/회피 능력 정상, 최대 악력);

1.5 = 경등도와 중등도 사이(mild to moderate) 관절염(관절 및 발바닥 부종, 변형, 및 지속적 발가락(fingers) 안쪽 변형, 거의 체중을 지탱할 수 없음, 감소된 전반적 유연성, 감소된 악력);

2.0 = 중등도(moderate) 관절염(심각한 관절, 발바닥 및 발가락 부종, 발 관절들 변형, 체중 이상을 지탱할 수 없고 넘어짐, 전박적 유연성의 소실, 악력 사라짐, 기기(crawling)/먹기(eating)에 영향을 미침);

2.5 = 중등도와 중증도 사이(moderate to severe) 관절염(심각한 관절, 발바닥 및 발가락 부종, 발(feet) 관절 변형, 체중 이상을 지탱할 수 없고 넘어짐, 전반적 유연성의 소실, 악력 사라짐, 기기/먹기에 영향을 미침, 발가락 발바닥 변형, 마우스 활동(activity)이 손상됨);

3.0 = 중증도(severe) 관절염(관절 경직, 휨(bending)이 발견되고 활동이 심각하게 손상됨, 마우스가 죽어감).

Tg197 마우스 관절염 점수는 하기 도 3a에 나타내었다.

2) Tg197 마우스 무릎(ankle) 관절 조직병리학적 연구

질병 상태를 모니터하기 위하여, 4 마리 시험용(Con1 내지 Con4로 번호 붙여진) Tg197 마우스 한배 새끼들(littermates)은 처리 초기에 관절 샘플로서, 3주 때에 희생되었다. 실험용 마우스는 10 주 때에 희생되었고, 그리고 샘플 슬라이스들(slices)은 무릎 관절로부터 획득되었다. 헤마톡실린/에오진(hematoxylin/eosin) 염색 후, 관절염의 현미경 조직병리학적 점수가 가려진 상태에서, 그리고 하기와 같이 0-4의 점수로 평가되었다:

0 = 탐지되지 않는 병변(pathology)

1 = 윤활액(synovial) 확산, 다핵 백혈구(polymorphonuclear leukocytes) 침윤(infiltration)

2 = 판누스(pannus) 및 섬유세포 형성 및 연골하골 골 침식(subchondral bone erosion at focus site)

3 = 연골(cartilage) 파괴 및 골 침식

4 = 확장된 연골 파괴 및 골 침식

Tg197 마우스 조직병리학적 분석은 도 3b 및 3c에 나타내었다.

3) 관절염 및 병리학적 점수에 따른 억제 비율의 계산.

억제 비율은 하기와 같이 관절염 점수에 따라 계산되었다:

E_n = 각 그룹의 관절염 점수

E₀ = 용매 그룹의 관절염 점수

억제 비율은 하기와 같이 병리학적 점수에 따라 계산되었다:

E_n = 각 그룹의 병리학적 점수

E₀ = 용매 그룹의 병리학적 점수

결과는 하기 [표 5]에 나타내었다.

마우스 관절염 점수 억제 비율 및 병리학적 점수 억제 비율

번호	그룹	n	관절염 점수 억제 비율(%)	병리학적 점수 억제 비율(%)
그룹 1	AT132 1 mg/kg	10	15	3
그룹 2	용매	10	0	0
그룹 3	AT132 30 mg/kg	10	77	84
그룹 4	AT132 10 mg/kg	10	79	86
그룹 5	휴미라 10 mg/kg	10	65	76
그룹 6	AT132 3 mg/kg	10	46	41

결과: 다른 AT132 용량들(그룹 1, 그룹 3, 그룹 4, 그룹 6)이 투여된, 그룹은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에 있어서 상당한 억제 효과를 보이고, 이는 전형적으로 용량 의존적이다. 특히 그룹 1(1 mg/kg)부터 그룹 6(3 mg/kg)까지, 그룹 간 억제는 상당히 구별될 수 있다. 그룹 6(3 mg/kg)부터 그룹 4(10 mg/kg)까지, 그룹 간 억제 또한 상당히 구별될 수 있다. 오직 그룹 4(10 mg/kg) 그룹 및 최고 투여량 그룹 3(30 mg/kg) 사이에서, 억제가 차이가 없다. 10 mg/kg의 동일한 용량에서, AT132 처리 그룹은 휴미라 처리 그룹 5와 상당한 차이가 없고, 그리고 용매 그룹 2와 비교했을 때 관절염 조직병변(histopathology)에 있어서 상당히 개선 효과가 있다는 것이 중요하다.

실시예 16: AT132 단일클론 항체 조직 교차-반응( cross-reaction)

1) AT132 단일클론 항체 인간 조직 교차-반응

비용종 파라핀 슬라이스들(Nasal polyps paraffin slices) 및 4개 정상 인간 조직(National Institutes for Food and Drug Control, 및 National Center for Safety Evaluation of Drugs에 의해 제공된, 공여자 A, B, C, D) 파라핀 슬라이스들은 3 그룹, 즉 실험그룹(AT132 바이오틴(biotin) 마커), 양성 대조그룹(바이오틴-표지된 휴미라), 음성 대조그룹(버퍼 PBS)으로 나뉘었다. 조직 교차-반응 후 조직 슬라이서들(slicers)의 염색을 관찰한다.

실험 결과는 인간 비용종 및 정상 인간 조직의 음성 대조 그룹이 염색되지 않음을 나타낸다. 바이오틴-휴미라 양성 대조 그룹에서, 인간 비용종 대식세포(macrophages), 정상 인간 림프절(lymph nodes) 대식세포 및 폐포(lung alveolar) 대식세포가 경도와 중도 사이로(weekly to moderately) 염색되지만, 반면 다른 조직들은 염색되지 않았다. 바이오틴-AT132 실험 그룹에서는, 인간 비용종 대식세포가 경도와 중도 사이로 염색되는 것으로 나타났다. 정상 인간 조직 교차-반응은 휴미라와 유사했다.

2) AT132 단일클론 항체 게잡이원숭이(cynomolgus monkey) 조직 교차-반응

비용종 파라핀 슬라이스들 및 3 세트의 게잡이원숭이 조직(National Institutes for Food and Drug Control, 및 National Center for Safety Evaluation of Drugs에 의해 제공된 공여체 A, B, C) 파라핀 슬라이스들은 세 그룹, 즉 실험그룹(AT132 바이오틴 마커), 양성 대조 그룹(바이오틴-표지된 휴미라), 음성 대조 그룹(버퍼 PBS)으로 나뉘었다. 조직 교차-반응 후 조직 슬라이서들의 염색을 관찰한다.

실험 결과는 인간 비용종 및 정상 게잡이원숭이 조직의 음성 대조 그룹이 염색되지 않음을 나타낸다. 바이오틴-휴미라 양성 대조 그룹에서, 인간 비용종 대식세포는 경도와 중도 사이로 염색되지만, 반면 정상 게잡이원숭이 조직은 염색되지 않았다. 바이오틴-AT132 실험 그룹에서, 인간 비용종 대식세포는 경도와 중도 사이의 염색을 나타냈다. 정상 게잡이원숭이 조직 교차-반응은 휴미라와 유사하였다.

<110> Livzon Mabpharm Inc. <120> Tumor necrosis factor-a humanized antibody <130> 13fpi-08-02/CN <150> CN 201110048505.1 <151> 2011-02-28 <150> CN 201210026698.5 <151> 2012-02-07 <150> PCT/CN 2012/071079 <151> 2012-02-13 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Heavy Chain Variable Region <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Lys Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Asp Ala Asp Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Val Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Ser Leu Lys Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Phe Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody Light Chain Variable 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Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (13)

1. 하기의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 인간화(humanized) 항-TNF 단일클론 항체(monoclonal antibody):
   서열번호: 1로 기재되는 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호: 2로 기재되는 서열을 포함하는 경쇄(light chain);
   서열번호: 27로 기재되는 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호: 2로 기재되는 서열을 포함하는 경쇄(light chain);
   서열번호: 28로 기재되는 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호: 32로 기재되는 서열을 포함하는 경쇄(light chain);
   서열번호: 1로 기재되는 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호: 31로 기재되는 서열을 포함하는 경쇄(light chain); 및
   서열번호: 27로 기재되는 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) 및 서열번호: 32로 기재되는 서열을 포함하는 경쇄(light chain).
   
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4. 제 1항의 인간화 항-TNF 단일클론 항체를 암호화하는(encode) 핵산(nucleic acid).
   
5. 제 4항의 핵산을 포함하는 벡터.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 벡터는 이를 발현 가능하게 하기 위하여 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터(promoter)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
   
7. 제 5항의 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell).
   
8. 제 1항의 효과적인 양의 인간화 항-TNF 단일클론 항체를 포함하는, hTNFα의 진단분석을 위한 약제의 제조방법.
   
9. 제 1항의 인간화 항-TNF 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는, 농혈증(pyaemia), 자가면역 질환들(autoimmune diseases), 악성종양(malignant tumor), 폐 기능 장애(lung fuction disorder), 이식 거부(transplant rejection), 박테리아 수막염(bacterial meningitis), 뇌 말라리아(cerebral malaria), 후천성 면역 결핍증(AIDS), 후천성 면역결핍증 관련 증후군(AIDS related complex, ARC) 및 이식 후 이차 사이토메갈로바이러스 감염(cytomegalovirus infection)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 hTNFα 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
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11. 제 1항의 인간화 항-TNF 단일클론 항체 및 적어도 하나의 약학적으로 수용되는 부형제를 유효성분으로 포함하는, 농혈증(pyaemia), 자가면역 질환들(autoimmune diseases), 악성종양(malignant tumor), 폐 기능 장애(lung fuction disorder), 이식 거부(transplant rejection), 박테리아 수막염(bacterial meningitis), 뇌 말라리아(cerebral malaria), 후천성 면역 결핍증(AIDS), 후천성 면역결핍증 관련 증후군(AIDS related complex, ARC) 및 이식 후 이차 사이토메갈로바이러스 감염(cytomegalovirus infection)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 hTNFα 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
12. 제 1항의 인간화 항-TNF 단일클론 항체를 유효성분으로 포함하는 제2형 콜라겐-유도 관절염(type II collagen-induced arthritis)인 hTNFα 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
13. 제 1항의 인간화 항-TNF 단일클론 항체 및 적어도 하나의 약학적으로 수용되는 부형제를 유효성분으로 포함하는, 제2형 콜라겐-유도 관절염(type II collagen-induced arthritis)인 hTNFα 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    

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