ITMI20131808A1 - Metodo per il rilevamento di micotossine nel latte, suoi derivati e prodotti caseari. - Google Patents

Description

Descrizione

“METODO PER IL RILEVAMENTO DI MICOTOSSINE NEL LATTE, SUOI DERIVATI E PRODOTTI CASEARI.”

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda un metodo basato sull’ossidazione del glucosio per la rilevazione di micotossine nel latte e suoi derivati o prodotti caseari, ed opportuni kit che rendono possibile effettuare tale metodo. STATO DELLA TECNICA

Le micotossine sono metaboliti secondari, sostanze tossiche, che sono prodotte da alcune muffe. Ne sono state identificate più di 300. La tossicità per l’uomo e per l’animale è riconosciuta per alcune di esse, mentre per le altre non sono ancora conosciuti gli effetti. In ogni caso si tratta di sostanze molto stabili che persistono anche dopo la scomparsa delle muffe che le hanno prodotte.

Le micotossine provocano negli animali una riduzione di performance, un aumento dell’incidenza delle malattie ed infine dei problemi sulla riproduzione.

Nell’uomo le micotossine provocano danni per esposizione diretta ai contaminanti e danni indiretti per gli eventuali residui presenti nelle derrate alimentari.

Tuttavia la maggior parte delle micotossine non passa alle derrate alimentari perché viene bloccata o inattivata dal metabolismo dall’animale (fegato, rumine). A volte la trasformazione metabolica non porta a metaboliti inattivi ed il loro passaggio negli alimenti comporta comunque la non commestibilità di questi ultimi ancorché la tossicità dei metaboliti possa anche essere inferiore a quella delle micotossine originarie.

Le micotossine presenti negli alimenti somministrati alle vaccine provocano la presenza di residui nel latte, la non commestibilità dei prodotti se presenti in quantità superiori ai limiti di legge e possibili modifiche delle caratteristiche casearie (effetti non positivi sui microrganismi che agiscono nelle trasformazioni casearie).

Si riportano nella seguente tabella 1 le micotossine di maggiore interesse nel campo specifico, il fungo produttore di tali micotossine, l’effetto tossico e quale alimento contaminato le può contenere.

Tabella 1

Le micotossicosi sono state individuate per la prima volta quarant’anni fa, ma l’attenzione nei confronti delle micotossine è aumentata in questi ultimi anni per una serie di fattori concomitanti. Ad esempio si hanno maggiori conoscenze dei loro effetti e del fatto che vi siano annate con situazioni climatiche più favorevoli alla loro formazione. Inoltre l’aumentato livello di ingestione e la velocizzazione del passaggio degli alimenti a livello ruminale causati dalla richiesta di incremento di produttività, ha comportato una riduzione dei processi di degradazione delle micotossine a livello ruminale.

L’aumento di produttività richiesto agli allevamenti zootecnici comporta anche il fatto che si somministrano razioni di mangime con più elevati apporti di cereali e di conseguenza con maggiore rischio di ingestione di alimenti contaminati da micotossine.

Le micotossine vengono classificate a seconda dei diversi effetti che hanno sull’uomo.

Le micotossine di classe 1 sono cancerogene per l’uomo, quelle di classe 2A sono probabilmente cancerogene infine quelle di classe 2B sono possibilmente cancerogene.

Le aflatossine sono prodotte principalmente da Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. Le temperature ottimali per lo sviluppo di queste muffe sono comprese tra 27°C e 37°C. L’organismo animale si difende dall’attacco delle micotossine mediante reazioni di detossificazione che portano alla loro escrezione attraverso i liquidi corporei quali latte, bile e urine. Nel latte di vacca si ritrova quasi esclusivamente l’Aflatossina M1, mentre nel latte di bufala anche l’aflatossina M2 e la B1. L’aflatossina B1 è certamente cancerogena, epatotossica, provoca danni al DNA e provoca immunosoppressione, quindi appartiene alla suddetta classe 1, mentre la M1 è stata classificata come 2B ovvero possibilmente cancerogena.

Il legislatore europeo ha provveduto a fissare, a tutela della salute dei consumatori, limiti massimi per la presenza di residui di micotossine negli alimenti. Nel caso del latte il contenuto di aflatossina M1 non deve superare 0,050 μg/kg. Per i derivati del latte il limite viene fissato in funzione del fattore di concentrazione dei suoi componenti, ciò che significa, secondo recenti indicazioni del Ministero della Salute, 0,150 μg/kg per i formaggi a pasta tenera e per i prodotti derivati dal siero e 0,275 μg/kg per i formaggi a pasta dura.

Il latte destinato agli alimenti per la prima infanzia deve presentare un contenuto massimo di aflatossina M1 inferiore a 0,025 μg/kg.

Anche se meno tossici delle aflatossine tuttavia nel latte sono ritrovabili dei metaboliti di altre tossine.

Ad esempio i tricoteceni ritrovabili nel latte sono il deossinivalenolo (DON) ed il suo metabolita DOM-1, nonché DON glucuron coniugato, mentre le ocratossine rintracciabili nel latte di vacca sono la OTa e la OTA. Infine gli Zearalenoni ritrovabili nel latte sono i metaboliti ZEA a, b, e ZEA glucuron–coniugato e lo zearalenolo ZEL.

I metodi a tutt’oggi noti per la rilevazione di micotossine ed in particolare dell’aflatossina M1 sono

- test immunologico e valutazione mediante reazione con anticorpi M1 monoclonali

– valutazione della fluorescenza

- cromatografia HPLC .

Si tratta quindi di metodi eseguibili solo in laboratorio, non direttamente in campo(presso l’allevamento da un veterinario o da persona preposta).

Di qui la necessità di disporre di un sistema analitico di facile impiego in grado di determinare le concentrazioni di micotossine - ed in particolare di aflatossina M1 -impiegabile non solo in un laboratorio altamente specializzato ma direttamente sul posto dove si trova il bestiame, oppure in latteria o nel caseificio. Sarebbe oltremodo auspicabile disporre di un sistema rivelatore capace di misurare una molecola semplice, quale ad esempio il glucosio, purché liberata in quantità equimolecolari o comunque proporzionali alla tossina ricercata ed a condizione che il rivelatore sia in grado di misurare le eventuali infinitesime quantità presenti.

In WO 2011/150186 si descrive una metodica generale per lo sviluppo di sensori altamente sensibili e selettivi che possono consentire l’impiego di glucometri abitualmente impiegati dai diabetici per la rilevazione di alcune molecole bersaglio tra cui anche tossine.

Nella domanda di brevetto italiana NA 20009A000048 si descrive una metodica basata sulla rilevazione del glucosio per la rilevazione di batteri, virus, proteine, lipidi, tossine, enzimi e/o acidi nucleici nel sangue, nel sudore, nelle urine, nei liquidi interstiziali o nelle acque, negli alimenti.

Entrambi i metodi tuttavia prevedono l’impiego di glucometri commerciali per diabetici che presentano una serie di limitazioni. Prima di tutto il fatto che consentono la determinazione della concentrazione di glucosio in un intervallo che va da 1.0 mM a circa 12.0 mM (compatibili per misure di ipo-, normo-, e iperglicemie negli esseri umani), e quindi risultano non adatti a valutare dosaggi di glucosio nell’ambito di 0,01 mM - 0,1 mM, che sono quelli richiesti per l’applicazione specifica nel campo della rilevazione di micotossine nel latte. Inoltre un altro problema riscontrabile utilizzando glucometri commerciali per tale tipo di applicazione risiede nella scarsa riproducibilità di tali rilevazioni. I glucometri commerciali sono infatti costruiti in modo da avere delle oscillazioni di precisione anche del 20%. Una simile accuratezza strumentale non si adatta ad esempio per la rilevazione di micotossine quali la aflatossina M1 nel latte.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di individuare un metodo analitico riproducibile e di facile esecuzione nonché i relativi dispositivi analitici che abbiano una sensibilità elevata nel rilevare bassissime concentrazioni di glucosio (es.: 0,01-0,1 mM) e quindi più precisi e riproducibili nella misura.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La Richiedente ha ora trovato che è possibile superare gli inconvenienti dello stato della tecnica con il metodo di rilevazione di micotossina mediante immuno-determinazione della medesima con rilevazione di glucosio per mezzo di anticorpi primari monospecifici per la micotossina che sono opportunamente derivatizzati con un enzima che causa la formazione di glucosio a partire da zuccheri più complessi.

Questo metodo preferibilmente consente la rilevazione di glucosio comprese tra 0,01mM e 0,1mM,

Secondo una forma di realizzazione preferita comprende i seguenti stadi:

A. il trattamento del latte da analizzare, al quale è stato aggiunto metanolo alla concentrazione finale del 10%, con una molecola di riconoscimento comprendente l’anticorpo primario monospecifico per la micotossina legato all’enzima invertasi,

B. la successiva aggiunta di detto latte ad un supporto solido su cui è immobilizzata la specifica micotossina da analizzare;

C. il trattamento del supporto solido proveniente dallo stadio (B) con saccarosio ed una soluzione acquosa tamponata;

D. rilevazione del glucosio formato per reazione enzimatica dell’invertasi.

In particolare questo metodo può essere realizzato con una metodica diretta comprendente i seguenti stadi:

a. si aggiunge al latte o suo derivato opportunamente preparato una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo monospecifico per detta micotossina, legato all’enzima invertasi,

b. si aggiunge il detto latte o suo derivato proveniente dallo stadio (a) ad un supporto solido sul quale è immobilizzata la micotossina,

c. si procede al lavaggio del supporto solido;

d. si tratta il supporto solido con una soluzione tamponata di saccarosio

e. si procede alla rilevazione del glucosio formato, in presenza dell’enzima invertasi legato alla molecola di riconoscimento, glucosio che sarà tanto minore quanto maggiore è la quantità di micotossina contenuta nel latte per mezzo di un nano-glucometro in grado di rilevare quantità di glucosio a concentrazioni comprese tra 0,01 mM e 0,1mM.

In questo caso ulteriore oggetto della presente invenzione è il kit (1) che consente l’effettuazione di tale metodo diretto comprende:

i. una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo monospecifico per la micotossina: detto anticorpo è legato all’enzima invertasi;

ii. un supporto solido su cui è immobilizzata la micotossina specifica da rilevare,

iii. una soluzione acquosa tamponata di saccarosio;

iv. un insieme di dati, grafici/diagrammi sotto forma di materiale cartaceo o elettronico ad esempio CD, DVD, ecc. che permette la correlazione tra la presenza o assenza oppure l’aumento/ riduzione di glucosio, con la quantità di micotossina presente nel latte analizzato

v. un nano-glucometro in grado di rilevare concentrazioni di glucosio comprese tra 0,01mM e 0,1mM.

In alternativa il metodo dell’invenzione può essere condotto con una metodica indiretta che comprende i seguenti stadi: a’) si aggiunge al latte una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo monospecifico diretto contro la micotossina;

b’) si aggiunge il latte proveniente dallo stadio a’) ad un supporto solido su cui è immobilizzata la molecola bersaglio, c’) si procede al lavaggio del supporto solido proveniente dal precedente stadio;

d’) si immerge il supporto solido proveniente dal precedente lavaggio in una soluzione acquosa contenente un anticorpo secondario legato all’enzima invertasi, specifico contro l’anticorpo primario diretto contro la micotossina

e’) si procede al lavaggio del supporto proveniente dal precedente stadio;

f’) si aggiunge una soluzione acquosa tamponata di saccarosio; g’) si procede alla rilevazione del glucosio formato, in presenza dell’enzima invertasi legato all’anticorpo secondario, quantità di glucosio che sarà tanto minore quanto maggiore è la quantità di micotossina contenuta nel latte.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit(2) per effettuare il metodo oggetto della presente invenzione secondo la metodica indiretta e che comprende i seguenti componenti: i’) una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo specifico per la micotossina

ii’) un supporto solido su cui è immobilizzata la micotossina specifica da rilevare,

iii’) una soluzione acquosa tamponata contenente almeno un anticorpo secondario legato all’enzima invertasi, diretto contro l’anticorpo specifico primario contro la micotossina (molecola di riconoscimento)

iv’) una soluzione acquosa tamponata di saccarosio;

v’)un insieme di dati, grafici/diagrammi sotto forma di materiale cartaceo o elettronico ad esempio CD, DVD, ecc. che permette la correlazione tra la presenza o assenza oppure l’aumento/ riduzione di glucosio, con la quantità di micotossina presente nel latte analizzato,

vi’)un nano-glucometro in grado di rilevare concentrazioni di glucosio comprese tra 0,01 mM e 0,1mM.

Ulteriore oggetto della presente invenzione è il nanoglucometro contenuto nei kit secondo la presente invenzione in grado di rilevare concentrazioni comprese nel suddetto intervallo che è stato opportunamente modificato ed è in grado di rilevare variazioni di corrente dell’ordine nanoampere e quindi di almeno 1000 volte inferiori rispetto a quelle impiegate per i nanoglucometri tradizionali

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La figura 1 rappresenta una foto di una lastra per TLC in eluente diclorometano:metanolo per verificare il completamento della reazione descritta nell’esempio C.

La figura 2 è una foto della lastra a seguito dell’esperimento Western Blot descritto nell’esempio C, su cui il dimero coniugato Gln-BP-AFM1 e Gln-BP previamente disciolte in tampone Laemmli sono state fatte correre in un esperimento di SDS-PAGE al 12% assieme a marker di peso molecolare specifico in kDa indicati con WM.

La figura 3 rappresenta il diagramma dell’immmunoreattività di IgG di conigli nei confronti di GLNBP-AFM1, come descritto nel saggio ELISA dell’esempio D, dove in ordinata si riporta la densità ottica a 450nm ed in ascissa si riporta il reciproco della diluizione (1/diluizione) ed in cui NO–Coating sta ad indicare nessun rivestimento, cntr+ sta ad indicare controllo positivo, mentre contr- sta ad indicare il controllo negativo. La figura 4 rappresenta una foto del gel, su cui sono state caricate le seguenti frazioni IgG:

• IgG non legate alla resina EAH – AFM1 indicate nella foto con la sigla FT;

• IgG allontanate durante i lavaggi indicate nella foto con W1-5,

• IgG eluite a seguito di drastico cambiamento di pH indicate nella foto con E1-E7

• Marker di peso molecolare specifico in kDa indicati con WM,

che sono state fatte correre in SDS-PAGE al 12% come riportato nel saggio E.

La figura 5 riporta in forma di diagramma a blocchi il saggio ELISA di reattività delle IgG misurata in funzione dell’assorbimento di luce misurata a lunghezza d’onda di 450nm nel caso di IgG non rivestite (no coating) e nei confronti di GlnBP-AFM1, GlnBP e BSA a diluizione 1:8000 come riportato nell’esempio E.

La figura 6 mostra i risultati del saggio ELISA competitivo indiretto della reattività delle IgG monospecifiche espressa come % di inibizione di legame IgG antiAFM1 per l’aflatossina M1 in soluzione in funzione della concentrazione di aflatossina, come descritto nell’esempio G.

La Figura 7 riporta la fotografia di una provetta contenente una membrana per dialisi chiusa da 2 pinze su cui viene condotto il saggio enzimatico e le reazioni coinvolte.

LA figura 8 rappresenta le reazioni coinvolte nel metodo secondo la presente invenzione.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.

Per gli scopi della presente invenzione nella definizione di latte ricadono tutti i tipi di latte di mammiferi quale ad esempio latte vaccino, latte di bufala, ovino quale ad esempio latte di capra, pecora, suini quale latte di scrofa, cinghiale, equini quale ad esempio latte di asina o di cavalla. Come derivati del latte si intende ad esempio la panna ed anche prodotti di fermentazione quale yogurt, kefir, ecc.

Come prodotti caseari si intendono oltre ai formaggi, siano essi freschi (a pasta filata e non) oppure stagionati, molli, duri o semiduri, anche prodotti del caseificio quali burro, formaggi fusi, siero, ricotta e cacioricotta.

Per gli scopi della presente invenzione i prodotti caseari prima di essere sottoposti a questo metodo vengono trattati con una soluzione di citrato sodico per solubilizzare la caseina.

Per gli scopi della presente invenzione si intende come molecola di riconoscimento una molecola comprendente un anticorpo primario diretto contro la micotossina eventualmente presente nel latte e la micotossina immobilizzata nel supporto solido, legato ad invertasi.

Si intende come molecola bersaglio la micotossina immobilizzata sul supporto solido (ii) ed in grado di competere con la stessa micotossina eventualmente contenuta nel latte.

Per gli scopi della presente invenzione si intende come nanoglucometro (iv) uno strumento in grado di rilevare concentrazioni di glucosio comprese tra 0,01mM e 0,1M.

Questo strumento è un glucometro tradizionale opportunamente modificato in grado di rilevare variazioni di corrente dell’ordine nano-ampere e quindi di almeno 1000 volte inferiori rispetto a quelle impiegate per i glucometri tradizionali.

Per gli scopi della presente invenzione si intende come anticorpo primario un anticorpo monospecifico nei confronti della aflatossina da analizzare nel latte.

Si riportano qui di seguito più in dettaglio alcune forme di realizzazione preferite di alcuni dei componenti fondamentali per condurre il metodo oggetto della presente invenzione e contenute rispettivamente nel kit(1) e (2).

MOLECOLA DI RICONOSCIMENTO

La molecola di riconoscimento (i) oggetto della presente invenzione impiegata nel metodo per la rilevazione di micotossine eventualmente presenti nel latte suoi derivati o prodotti caseari e nel kit per effettuare tale metodo comprende a sua volta un anticorpo primario monospecifico di detta micotossina legato ad invertasi.

Questa molecola di riconoscimento, quando viene a contatto con il latte, un suo derivato o un prodotto caseario contaminato da una micotossina ad esempio AFM1, lega la micotossina presente che compete con quella immobilizzata al supporto solido. Tale molecola di riconoscimento venuta poi a contatto con la soluzione di saccarosio, produce quantità di glucosio minore rispetto alla quantità di glucosio prodotta in assenza di tale micotossina.

In base alla quantità di glucosio prodotto è quindi possibile risalire alla quantità di micotossina.

Preferibilmente l’enzima invertasi in essa contenuto è legato direttamente a detto anticorpo monospecifico mediante un agente di coniugazione che, secondo una forma di realizzazione preferita, è la glutaraldeide. In particolare l’anticorpo presente nella molecola di riconoscimento è monospecifico nei confronti di una micotossina presente nel latte ed in particolare appartenente ad esempio ad aflatossine, zearalenoni, tricoteceni e ocratossine.

Molecole di riconoscimento preferite sono quelle contenenti anticorpi monospecifici nei confronti di aflatossine, dal momento che le aflatossine sono le micotossine più pericolose e di più frequente ritrovamento nel latte e suoi derivati. Molecole di riconoscimento particolarmente preferite sono quelle contenenti anticorpi monospecifici nei confronti dell’Aflatossina M1, B1 e M2 ed ancora più preferibilmente sono quelle contenenti anticorpi monospecifici nei confronti di Aflatossina M1.

SUPPORTO SOLIDO

Il supporto solido (ii),impiegato nel metodo di rilevazione di micotossine e contenuto nel kit secondo la presente invenzione è generalmente costituito da un materiale solido di tipo noto e caratterizzato da proprietà quali ad esempio:

- una superficie di attivazione, la quale, a seguito di una stimolazione, è capace di formare con la molecola bersaglio secondo la presente invenzione,

- inerzia chimica in maniera tale che le aree sul supporto non occupate dalla molecola di riconoscimento in grado di legarsi alla molecola bersaglio, non formano legami aspecifici o, se li formano, questi ultimi sono facilmente rimuovibili senza rimuovere la molecola di riconoscimento.

Il supporto solido può possedere caratteristiche che favoriscono il legame tra la molecola di riconoscimento e la molecola bersaglio immobilizzata nel supporto. Il supporto solido possiede inoltre un enzima immobilizzato in grado di ossidare il glucosio, prodotto dall’invertasi, contenuta nella molecola di riconoscimento. Questo tipo di enzima è preferibilmente la glucosio ossidasi che permette la rilevazione del glucosio mediante il nano-glucometro.

La superficie di un supporto solido può essere attivata con processi chimici in grado di formare stabili legami con il supporto solido. Tuttavia qualsiasi altro metodo può essere impiegato per gli scopi oggetto della presente invenzione quali ad esempio interazioni ioniche, interazioni idrofobiche, covalenti e simili.

In una forma di realizzazione preferita il supporto solido è in forma di sferetta sub-micronica o micronica. Queste sferette possono essere costituite da metallo, derivati di metallo, quali ad esempio ossidi metallici, derivati, di non metallo, particelle magnetiche.

In un’altra forma di realizzazione preferita i supporti solidi sono porosi, preferibilmente in forma di un materiale come carta, membrana, polimero insolubile in acqua. Per esempio il supporto solido può comprendere una membrana che lascia passare alcuni materiali e ne intrappola selettivamente altri. Preferibilmente questo materiale comprende nitrocellulosa. In alcune forme di realizzazione preferita i supporti solidi quali la nitrocellulosa sono in forma di fogli, strisce, come quelli in uso in un dispositivo a flusso laterale.

In un’altra forma di realizzazione preferita il supporto solido è costituito da un polimero organico quale ad esempio polipropilene, polietilene, polibutilene, poliisobutilene, polibutadiene, poliisoprene, polivinilpirrolidone, polivinilidenfluoruro, politetrafluoroetilene, ecc.

Il supporto solido può essere ad esempio sotto forma di rivestimento o laminato disposto sopra un materiale inerte come carta, vetro, film in plastica o tessuti.

Il supporto solido può essere di qualsiasi forma come piastre per micro-titolo, piastre per ELISA, sonde per test, barrette ad immersione, dispositivi a flusso laterale.

Secondo una soluzione particolarmente preferita il supporto solido preferibilmente sotto forma di una striscia di carta, più preferibilmente di nitrocellulosa su cui è immobilizzata la molecola bersaglio in grado di legare la molecola di riconoscimento (vedi figura 8).

SOLUZIONE ACQUOSA DI SACCAROSIO:

La concentrazione del saccarosio impiegata nel metodo secondo la presente invenzione non è un parametro critico per la metodica oggetto dell’invenzione anche se preferibilmente si utilizzano soluzioni acquose di saccarosio con concentrazioni tra 5 e 20% in peso/volume ancora più preferibilmente tra 8 e 15% p/v.

RILEVATORE DI GLUCOSIO (NANOGLUCOMETRO)

Il rilevatore nano-glucometrico impiegato nel metodo secondo la presente invenzione nei 2 kit ulteriore oggetto della presente invenzione preferibilmente comprende un software che consente l’effettuazione di un numero elevato di determinazioni di glucosio in poco tempo ad esempio 10 determinazioni al minuto e fornire il valore medio di tali determinazioni.

Inoltre può comprendere LED in grado di riportare il valore di glucosio e/o di LED colorati che si illuminano a seconda della presenza o assenza di aflatossine e/o della loro concentrazione.

Il nano-glucometro può essere collegato wireless mediante GPS, GSM e Wi-Fi, ad un centro operativo dove i risultati possono essere registrati e/o elaborati.

METODICA DIRETTA/METODICA INDIRETTA

Utilizzando il metodo diretto si ottiene una misurazione più veloce, al contrario impiegando il metodo indiretto si possono eseguire misurazioni su più tipi di micotossine utilizzando lo stesso anticorpo secondario legato ad invertasi e diversi anticorpi specifici primari diretti contro differenti micotossine. Con il metodo oggetto della presente invenzione, che consente di rilevare concentrazioni di glucosio compresi tra 0.1 μM a 100 μM è possibile valutare in maniera affidabile la quantità di micotossine nel latte, suoi derivati e prodotti caseari, senza bisogno di apparecchiature complesse da laboratorio.

Si riporta a scopo illustrativo il metodo dell’invenzione nel dettaglio.

Selezione dei glucometri più adatti per lo scopo dell’invenzione

I glucometri che sono risultati idonei per questa strategia utilizzano come enzima rilevatore sulle strisce reattive la Glucosio Ossidasi. I glucometri che usano altri sistemi enzimatici danno risultati non affidabili per la presenza di Lattosio riconosciuto come substrato (ESEMPIO A)

Ottenimento degli anticorpi anti-Aflatossina M1

Per ottenere un alto titolo di anticorpi diretti contro la AFM1due conigli sono stati iper-immunizzati con una preparazione di BSA coniugata alla AFM1(commerciale). Una volta confermata la reattività dei sieri contro la AFM1(cimentandoli contro la AFM1coniugata alla GlnBP),i due conigli sono stati sacrificati per il prelievo finale dei sieri, di circa 50 mL per coniglio. Da questi sieri sono state purificate le IgG utilizzando una resina di affinità con Proteina A (ESEMPIO B).

Ottenimento Aflatossina M1coniugata alla proteina GlnBP (Glutamine Binding Protein) e saggio

Per ottenere un antigene utilizzabile per le prove di specificità degli anticorpi la aflatossina è stata coniugata con una proteina differente da quella utilizzata come carrier nell'immunizzazione. (GlnBP-AFM1) (ESEMPIO C).

Validazione

Le IgG sono state cimentate in un saggio di Western Blot ed hanno identificato una banda di circa 50 KDa, corrispondente ad un dimero di GlnBP formatosi durante la coniugazione come principale prodotto coniugato alla AFM1. Tale esperimento ha permesso di confermare la specificità del riconoscimento delle IgG del coniugato GlnBP-AFM1, che è quindi stato utilizzato per condurre tutti i saggi ELISA

Saggi ELISA delle IgG purificate con l’antigene di riferimento GlnBP-AFM1

Tali esperimenti hanno permesso di confermare un titolo elevato di IgG reattive in entrambi i conigli immunizzati (n°068 e n°069) rilevabile fino ad una diluizione di 1:16.000 con un coating di 12.5 ng di GlnBP-AFM1per pozzetto(ESEMPIO D).

IgG monospecifiche anti-Aflatossina M1

Le IgG monospecifiche per l’ Aflatossina M1(IgGMS) sono state ottenute purificandole dalle IgG totali per cromatografia di affinità.

a. Preparazione della resina di affinità

b. Purificazione degli anticorpi monospecifici (ESEMPIO E) Le IgGMS sono state cimentate in saggi ELISA i quali hanno permesso di dimostrare, rispetto alle IgG totali, una riduzione significativa della reattività per la BSA utilizzata come carrier durante l’immunizzazione e di confermare un alto titolo delle IgG reattive contro la GlnBP-AFM1ad una diluizione di 1:8000, e nessuna reattività contro la GlnBP non coniugata.

Saggio competitivo

I saggi ELISA competitivi indiretti hanno permesso di confermare l’alta avidità delle IgGMS per l’Aflatossina M1in soluzione, che ha permesso di mettere a punto un saggio altamente sensibile.(ESEMPIO F)

Derivatizzazione degli anticorpi (IgG totali) con l’enzima Invertasi

La strategia del progetto prevede di rilevare il legame antigene (AFM1) con gli anticorpi mediante l'attività della Invertasi. E’ stato messo a punto un protocollo che utilizza la glutaraldeide come agente legante omofunzionale e bifunzionale, che ha permesso di ottenere un coniugato delle IgG totali con l'Invertasi (Saccharomyces cerevisiae, FLUKA). Il coniugato è stato immobilizzato per affinità su una resina in grado di legare le IgG.(ESEMPIO G)

Saggi per verificare che la coniugazione con gli anticorpi non ha distrutto l’attività enzimatica dell’Invertasi

In seguito è stata saggiata la attività invertasica del coniugato. Il saggio enzimatico ha permesso di confermare l’attività invertasica dei coniugati con le IgG totali a 15 min con una produzione di Glucosio alla concentrazione di 2 mg/dl, anche tenendo conto del tempo necessario alla diffusione dei substrati e dei prodotti e del volume di diluizione. (ESEMPIO H)

Purificazione del coniugato

Il coniugato è stato purificato con una resina d’affinità in grado di legare la porzione costante degli anticorpi. (ESEMPIO I).

Saggio per verificare la attività anticorpale del coniugato I coniugati purificati sono stati cimentati in un saggio Dot blot, dopo un tempo di incubazione di 5 min. i quadratini di 1 cm<2>su cui era stata adsorbita la BSA risultano essere positivi per l’attività invertasica, mentre quelli su cui era stata adsorbita la GlnBP risultano essere negativi.(ESEMPIO J) Complessivamente questi saggi dimostrano che la procedura di coniugazione preserva sia la reattività anticorpale che quella enzimatica.

Purificazione degli anticorpi monospecifici anti aflatossina M1 coniugati (ESEMPIO K).

Saggi immunoenzimatici delle IgGMS-M1-INV

Per questi saggi è stata usata una proteina coniugata ad aflatossine (HRP-AFL) che è commercialmente disponibile, il saggio ha permesso di rilevare la proteina derivatizzata con le Aflatossine (HRP-AFL), e non le altre proteine messe ad incubare con il coniugati IgGMS-M1-INV.(ESEMPIO L)

Saggio di verifica interferenza delle condizioni di Binding in presenza di latte e metanolo

L’esperimento ha permesso di dimostrare che non vi era interferenza del latte durante l’incubazione del coniugato IgGMS-M1-INV con le striscette di nitrocellulosa ed è stato possibile rilevare attività invertasica dopo 1h di incubazione a temperatura ambiente. Inoltre è stato verificato che non vi era interferenza nel legame da parte delle IgGMS-M1-INV contro la HRP-AFL, aggiungendo il 10% di metanolo alla soluzione. Il solvente nella soluzione sarà necessario per aggiungere l’Aflatossina M1libera nei successivi saggi competitivi o permettere la solubilizzazione dell’Aflatossina M1nel latte eventualmente contaminato (ESEMPIO M).

Saggio competitivo in presenza di latte

Dopo l’incubazione in assenza di AFM1è stato prodotto circa 1,5 μg di Glucosio, ed è stato possibile rilevare una riduzione del 80% e del 50% del Glucosio prodotto con una incubazione di AFM1libera rispettivamente di 54 ppt e 27 ppt (ESEMPIO N).

ESEMPIO A

• Saggio attività saccarasica

Materiale:

o 1.0 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6.

o 0.5 mL Soluzione al 10% W/V di Saccarosio (preparata al momento).

o 0.1 mL Invertasi (Saccharomyces cerevisiae, FLUKA) 7 U/mL o acqua (Sample Blank (BIANCO)).

o 0.4 mL 0.3 M Buffer Tris Base (Stop Solution).

Procedimento:

o Aggiungere 0.1 mL di enzima alla soluzione per saggiare l’attività invertasica: 1 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 e 0.5 mL di una soluzione al 10.0% W/V di saccarosio ed incubare per 5 min a temperatura ambiente.

o Aggiungere la Stop Solution agitare bene e porre in ghiaccio.

Saggio Glucosio prodotto (D-GLUCOSE GOPOD-FORMAT Megazyme)

Materiale:

o 0.1 mL Saggio Invertasi.

o 0.1 mL Standard Glucose 100 mg/dL (1 ug/uL).

o 1.0 mL mix assay.

Procedimento:

o Incubare a 45°C per 20 min e leggere l’assorbimento allo spettrofotometro a 510 nm.

o Lettura contro Sample Blank (bianco) e determinazione concentrazione Glucosio prodotta.

Saggio Glucosio con Breeze 2 (BAYER) e con ACCU CHEK AVIVA (ROCHE).

o 2 μL Saggio Invertasi.

o 2 μL Sample Blank.

o Condizioni saggio 0.7 U Invertasi a RT per 5 min.

I GLUCOMETRI

Sono state ottimizzate le condizioni necessarie per condurre saggi enzimatici della attività invertasica, misurando il Glucosio prodotto, sia con glucometri commerciali, che in parallelo come controllo con un kit da laboratorio per la rilevazione del Glucosio negli alimenti.

In seguito sono stati individuati i glucometri commerciali che adottavano striscette reattive che utilizzavano enzimi che riconoscevano solo il Glucosio e non altri zuccheri semplici o complessi come substrato (Breeze 2, BAYER).I glucometri che sono risultati idonei a questo scopo utilizzano come enzima rilevatore sulle striscette reattive la Glucosio Ossidasi.

ESEMPIO B

• Protocollo Iper-immunizzazione di 63 giorni

Materiale:

o Coniugato BSA-AFM1400 ug.

o Conigli 068 e 069 (Covalab).

Procedimento:

o Iniezione giorni 14, 28 e 42.

o Prelievi per test giorni 0, 39, 53.

o Prelievo finale giorno 63.

• Purificazione IgG totali

Materiale:

o 0.5 mL di resina nProtein A SepharoseTM 4 Fast Flow (GE Healthcare).

o Binding Buffer Tris Buffer 50 mM pH 7.4.

o Colonnine per cromatografia di affinità da 10 mL (Biorad).

o 2 mL sieri conigli 068 e 069 filtrati e diluiti 1:1 in Binding Buffer.

Procedimento:

o Lavare la resina con acqua e Binding Buffer ed aggiungere i sieri diluiti incubare ON a 4°C in lenta agitazione.

o Lavare a RT con 5 mL di Binding Buffer.

o Eluire a RT con 5 frazioni da 1 mL in Buffer Glicina 0.1 M pH 3 e tamponare a pH 7 con Tris Buffer pH 8.8. o Quantizzare allo spettrofotometro e su SDS-PAGE le frazioni contenenti le IgG, poi riunirle in un unico campione.

OTTENIMENTO DEGLI ANTICORPI ANTI AFLATOSSINA M1

A tale scopo è stato acquistato un coniugato BSA-AFM1; 0.4 mg del coniugato sono stati inviati alla società Covalab per immunizzare due conigli, al fine di ottenere anticorpi diretti contro l’Aflatossina M1.

Due conigli definiti rispettivamente 068 e 069, sono stati sottoposti ad un protocollo di iper-immunizzazione della durata di 63 giorni. Sono state eseguite 3 iniezioni (boost) del coniugato BSA-AFM1al giorno 14, 28 e 42; e prelevati campioni di siero al giorno 0, 39 e 53 del protocollo di immunizzazione prima del prelievo finale al 63° giorno.

Durante le varie fasi del protocollo di immunizzazione di concerto con la Covalab, sono stati monitorati nel nostro laboratorio il titolo e la reattività delle IgG presenti nei sieri prelevati a vari tempi del protocollo di immunizzazione. Per fare ciò sono state purificate le IgG dal siero dei due conigli, mediante cromatografie di affinità grazie all’uso di una resina di Sefarosio coniugata alla Proteina A, la quale è in grado di legare con alta affinità la porzione costante delle IgG di coniglio per la loro successiva purificazione ad elevata efficienza.

A tale scopo 2 ml dei sieri dei conigli sono stati purificati con 0.5 mL di resina nProtein A Sepharose<TM>4 Fast Flow (GE Healthcare). Per testare la reattività delle IgG contro la sola Aflatossina M1e non contro la BSA (Bovine Serum Albumin), proteina carrier, utilizzata per l’immunizzazione, sono stati effettuati saggi ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) cimentando le IgG contro l’Aflatossina M1coniugata ad un’altra proteina (Glutamine Binding Protein).

In seguito, confermata la reattività contro un’altra proteina coniugata alla AFM1,i due conigli sono stati sacrificati per il prelievo finale dei sieri, di circa 50 mL per coniglio.

ESEMPIO C

• Derivatizzazione AFM1con braccetto carbossilico Materiale:

o 1 mg Aflatossina M1.

o 3 mg braccetto carbossilico (O-(Carbossimetil)-idrossilammina, emicloridrato, Sigma-Aldrich).

Procedimento:

o Incubare a reflusso per 2h in H2O:Py:Met-OH (1:1:4). o Portare a secco.

o Riprendere il grezzo in H2O e alcalinizzare con NaOH (pH 8).

o Lavare 3 volte in CH2Cl2.

o Acidificare la fase acquosa con HCl pH 3.

o Estrazione in CH2Cl23 volte.

• Coniugazione alla GlnBP

Materiale:

o 3.3 mg di EDC-HCl (N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimide idrocloruro) (Sigma-Aldrich).

o 160 μL GlnBP (Glutamine Binding Protein) 0.7 mg/mL.

Procedimento:

o Portare a secco.

o Risospendere in H2O Et-OH 20%.

o Aggiunge 1.1 mg EDC-HCl incubare 5 min a RT.

o Aggiungere GlnBP ed incubare per 48h a RT in lenta agitazione.

o Aggiunge nuovamente 1.1 mg EDC-HCl a 16 e 32h.

CONIUGAZIONE DI AFLATOSSINA M1A GLNBP E VALIDAZIONE

A tale scopo è stata purificata la proteina GlnBP (Glutamine Binding Protein), attraverso una cromatografia a scambio ionico che prevede l’uso della DEAE-Sepharose.

L’Aflatossina M1commerciale è stata modificata chimicamente introducendo un braccetto contenente un gruppo carbossilico che, adeguatamente attivato, ha permesso di coniugare,mediante un legame peptidico, l’Aflatossina M1alle catene laterali dei residui di glutammina presenti nella GlnBP.

A tale scopo 1 mg Aflatossina M1e 3 mg del braccetto O-(Carbossimetil)-idrossilammina, emicloridrato (Sigma-Aldrich) sono stati messi a reagire a reflusso per 2 ore in 1.2 mL di una soluzione di Piridina, acqua deionizzata e Metanolo avente il seguente rapporto 1:1:4.

Alla fine della reazione viene eseguita una cromatografia su strato sottile (TLC) per verificare la formazione del derivato, utilizzando una soluzione eluente di Di-clorometano e Metanolo, nel rapporto 95:5.

Verificata la formazione del derivato della Aflatossina M1, la miscela di reagenti viene fatta essiccare.

Per purificare il derivato della Aflatossina M1con il braccetto carbossilico è stata eseguita una estrazione liquido-liquido per allontanare i reagenti in eccesso. La miscela essiccata dei reagenti è stata risospesa in una soluzione di acqua deionizzata portata pH 8, e sono stati eseguiti tre lavaggi da 1 mL in Diclorometano.

Dopo i lavaggi la soluzione acquosa è stata acidificata a pH 3, e sono state eseguite tre estrazioni da 1 mL in Diclorometano. In seguito è stata eseguita una cromatografia su strato sottile (TLC) del derivato recuperato dalle tre estrazioni, utilizzando le stesse condizioni di corsa precedentemente descritte (vedi Figura 1).

Tutto il derivato ottenuto è stato portato a secco e risospeso in una soluzione al 20% di Etanolo ed incubato per 5 min con 1.1 mg di EDC-HCl (N-(3-Dimetilamminopropyl)-N′-etilcarbodiimide idrocloruro) (Sigma-Aldrich) per attivare il gruppo carbossilico, ed è stato fatto reagire con 260 ug di GlnBP di modo da avere un rapporto molare di 1: 250 rispetto al derivato dell’Aflatossina M1.

La reazione è avvenuta a temperatura ambiente per 48 ore durante le quali è stato aggiunto altre due volte 1.1 mg EDC. Il coniugato così ottenuto è stato testato in un esperimento di Western Blot. Nell’esperimento 0.1 μg del coniugato GlnBP-AFM1ed 1 ug di GlnBP sono state disciolte in Laemmli Buffer e corse su SDS-PAGE al 12%. Le proteine sono state trasferite su una membrana PVDF (Millipore), precedentemente attivata in metanolo, usando il trans Blot Semy-dry System (Biorad Laboratories), e saggiate con le IgG del coniglio 068 come anticorpo primario ad una diluizione di 1: 500.

Le IgG hanno identificato una banda di circa 50 KDa, corrispondente ad un dimero di GlnBP formatosi durante la coniugazione come principale prodotto coniugato alla AFM1; non riconoscono la GlnBP da sola che ha un peso molecolare di circa 27 KDa. Tale esperimento ha permesso di confermare la specificità del riconoscimento delle IgG del coniugato GlnBPAFM1, il quale è stato utilizzato per condurre tutti i saggi ELISA.

Lastra dopo Western Blot (FIG.2):

La freccia indica il coniugato GlnBP-AFM1 riconosciuta dagli anticorpi dei conigli immunizzati con BSA-AFM1.

La banda del marcatore di peso molecolare a 66kD è la BSA. La GlnBP da sola ha un peso molecolare di 27KD.

ESEMPIO D

• Saggi ELISA indiretti

Materiale:

o Piastre MaxiSorp™ (Nunc) da 96 pozzetti.

o Coating Buffer Buffer Carbonato 25 mM pH 9.6

o Wash Buffer TBST 0.05% .

o Blocking Solution Ovalbumina (OVA) allo 0.5% in Buffer TBS (20 mM tris 130 mM NaCl).

o Diluting solution Ovalbumina allo 0.25% in Buffer TBST 0.05% .

o Soluzione per lo sviluppo TMB (3, 3’ ,55’-Tetramethylbenzidine, Sigma).

o Stop Solution 2.5 M HCl.

Procedimento:

o Per adsorbire il coniugato GlnBP-AFM1nei pozzetti delle piastre è stato usato il Coating Buffer e posto ON a 4°C.

o Incubare 50 μL di varie diluizioni del coniugato GlnBP-AFM1in Coating Buffer, a partire da una soluzione concentrata 2 ng/μL (100 ng totali) ON (tutta la notte) a 4°C.

Eseguire 3 lavaggi da 50 uL per 10 min con il Wash Buffer.

Saggiare diluizioni seriali 1: 2 del coniugato GlnBP-AFM1con diluizioni seriali di IgGTot purificate da entrambi i conigli 068 e 069, utilizzare ad una diluizione iniziale di 1: 4000 e diluizioni seriali 1: 2 fino a 1: 32000, ed eseguire ogni punto in duplicato. Aggiungere la Blocking Solution 50 uL per pozzetto ed incubare a 37°C per 1 h.

Eseguire 3 lavaggi da 50 μL per 10 min con il Wash Buffer.

Diluire gli anticorpi primari e secondari in Diluting Solution, aggiungere 50 μL per ogni pozzetto ed incubare per 1 h a 37°C.

Eseguire 3 lavaggi da 50 μL per 10 min con il Wash Buffer.

Utilizzare L’anticorpo secondario anti-rabbit ad una diluizione 1: 6000.

Eseguire 3 lavaggi da 50 μL per 10 min con il Wash Buffer.

Aggiungere 100 uL di TMB per lo sviluppo, 10 min al buio, e bloccare la reazione aggiungendo 100 μL di Stop Solution.

o Eseguire la lettura all’analizzatore di piastre misurando l’assorbimento a 450 nm.

SAGGI ELISA DEGLI ANTICORPI (IGG) CON L’ANTIGENE DI RIFERIMENTO GLNBP-AFM1

Le immunoglobuline purificate sono state cimentate in saggi ELISA indiretti, i quali prevedono l’utilizzo di un anticorpo secondario coniugato alla Perossidasi, in grado di riconoscere le IgG di coniglio.

A tale scopo per i saggi ELISA sono state utilizzate piastre MaxiSorp™ (Nunc) da 96 pozzetti.

Per adsorbire il coniugato GlnBP-AFM1nei pozzetti delle piastre (coating) è stato usato un Coating Buffer Carbonato 25 mM pH 9.6 e posto ON a 4°C.

In ogni pozzetto sono state incubate 50 uL di varie diluizioni del coniugato GlnBP-AFM1(coating) a partire da una soluzione concentrata 2 ng/uL (100 ng totali). Diluizioni seriali 1: 2 del coniugato sono state saggiate con diluizioni seriali di IgG totali purificate da entrambi i conigli 068 e 069. Le IgG sono state utilizzate ad una diluizione iniziale di 1: 4000 e diluizioni seriali 1: 2 fino a 1: 32000, ogni punto è stato eseguito in duplicato.

Dopo il coating sono stati eseguiti 3 lavaggi per 10 min con il Buffer TBST 0.05% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20). In seguito è stata utilizzata una soluzione di OVA (Ovalbumina) allo 0.5% in tampone TBS (20 mM tris 130 mM NaCl) come soluzione di Blocking 50 μL per ogni pozzetto e la piastra è stata posta in un incubatore a 37°C per 1 h.

Sono stati eseguiti 3 lavaggi per 10 min con il Buffer TBST 0.05% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20).

Gli anticorpi sono stati diluiti in una soluzione di OVA (Ovalbumina) allo 0,25% TBST 0.05% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20), sono stati utilizzati 50 μL per ogni pozzetto ed incubati per 1 h a 37°C.

Sono stati eseguiti 3 lavaggi per 10 min a RT con il Buffer TBST 0.05% .

L’anticorpo secondario anti Rabbit è stato utilizzato ad una diluizione 1: 6000 .

Finiti i lavaggi dopo l’incubazione del secondario, per lo sviluppo della reazione della Perossidasi i pozzetti sono stati incubati al buio per 10 min con 0.1 mL di TMB (3, 3’ ,5 5’-Tetrametil-benzidina, Sigma). Per fermare la reazione colorimetrica si aggiungono 0.1 mL di una soluzione 2.5 M HCl. La lettura dell’assorbanza viene eseguita all’analizzatore di piastre alla lunghezza d’onda di 450 nm.

Tali esperimenti hanno permesso di confermare un titolo elevato di IgG reattive in entrambi i conigli immunizzati 068 e 069 ad una diluizione di 1:16.000 con un coating di 12.5 ng di GlnBP-AFM1per pozzetto. Nel saggio ELISA sono stati usati come controllo positivo 25 ng BSA e come controllo negativo 25 ng di GlnBP (Vedi Fig.3).

ESEMPIO E

Preparazione della resina di affinità

Materiale:

o 1.2 mL EAH SepharoseTM 4B (GE Healthcare).

o 1.0 mg di derivato carbossilico utilizzato nell’esempio B

o Colonnine per cromatografia di affinità da 10 mL (Biorad).

o Acqua deionizzata a pH 4.5 .

o EDC-HCl da usare alla concentrazione finale 0.1 M . Procedimento:

o Disciogliere il derivato in 2 mL di Et-OH .

o Aggiungere l’EDC-HCl alla concentrazione finale 0.1 M ed incubare per 5 min a RT.

o Aggiungere la resina EAH SepharoseTM 4B portare al volume di 4 mL ed incubare a 4°C in lenta agitazione ON.

Purificazione degli anticorpi monospecifici

Materiale:

o 8 mg IgG totali (2 mg/ml) diluiti 1:1 in Binding Buffer.

o Binding Buffer Tris Buffer 50 mM pH 7.4 .

o 1.2 mL Resina EAH-AFM1(GE Healthcare).

o Washing Buffer 50 mM Tris pH 7.4 .

o Colonnine per cromatografia di affinità da 10 mL (Biorad).

Procedimento:

o Lavare la resina con acqua e Binding Buffer ed aggiungere le IgG diluite incubare tutta notte a 4°C sotto lenta agitazione.

o Lavare a temperatura ambiente con 12 mL di Binding Buffer.

o Eluire a temperatura ambiente con 10 frazioni da 1 mL in Buffer Glicina 0.1 M pH 3 e tamponare a pH 7 con Tris Buffer pH 8.8 .

o Quantizzare allo spettrofotometro e su SDS-PAGE le frazioni contenenti le IgGMS, poi riunire in un unico campione.

o Test ELISA per verifica reattività contro la BSA e la GlnBP-AFM1.

ISOLAMENTO DI IgG MONOSPECIFICHE ANTI-AFLATOSSINA M1 a)Preparazione della resina di affinità

Per la messa a punto del biosensore, una volta verificato un alto titolo di IgG occorre isolare le IgG monospecifiche. A tale scopo sono state generate una resina coniugata al derivato carbossilico dell’Aflatossina M1. Tale coniugazione è avvenuta attraverso la formazione di un legame peptidico con un gruppo amminico primario esposto mediante un braccetto di 10 atomi legato alla resina EAH Sepharose<TM>4B (GE Healthcare), il quale permette la formazione del complesso antigene anticorpo necessario per la successiva purificazione per affinità delle IgG monospecifiche.

A tale scopo 1.2 mL di resina sono state messe a reagire ON a 4°C in continua agitazione con 1 mg di una nuova preparazione del derivato carbossilico della AFM1disciolta prima in 2 ml di Etanolo al 100%, e diluita in un volume finale di 4 ml in acqua deionizzata acidificata a pH 4.5, in presenza dell’attivatore del gruppo carbossilico EDC alla concentrazione finale di 0.1 M.

b) Purificazione degli anticorpi monospecifici

La resina così generata ha permesso di purificare con una cromatografia di affinità 1,8 mg di IgG monospecifiche con alta resa dirette contro la sola Aflatossina M1.

La purificazione è stata condotta cimentando la resina con 8 mg di IgG totali in un tampone 50 mM Tris pH 7.4 (Binding Buffer), successivamente sono seguiti lavaggi pari ad un volume 10 volte superiore a quello della resina sedimentata (12 mL finali). L’eluizione è stata eseguita con il tampone Glicina 0.1 M pH 3.0. Le frazioni sono state immediatamente tamponate a pH 7 con Tris 1.0 M pH 8.8. Le frazioni sono state controllate con una SDSPAGE al 12 % ed è stata determinata la concentrazione proteica allo spettrofotometro misurando l’assorbimento a 280 nm. (Figura 4)

La purificazione per affinità sulla resina così generata ha permesso di purificare con alta resa IgG monospecifiche contro l’Aflatossina M1. Le prime 4 frazioni da 2 mL contenenti le IgG monospecifiche anti AFM1sono state riunite in 8 ml ad una concentrazione di 0.22 ug/uL (IgGMS-M1).

Le IgG sono state cimentate in saggi ELISA, i quali hanno permesso di dimostrare una riduzione significativa della reattività per la BSA, utilizzata come carrier durante l’immunizzazione e confermare un alto titolo delle IgG reattive contro la GlnBP-AFM1ad una diluizione di 1:8000, e nessuna reattività contro la sola GlnBP (Figura 5).

ESEMPIO F

• Saggi ELISA indiretti competitivi

Materiale:

o Piastre MaxiSorp™ (Nunc) da 96 pozzetti.

o Coating Buffer Buffer Carbonato 25 mM pH 9.6 .

o Wash Buffer TBST 0.05% .

o Blocking Solution Ovalbumina (OVA) allo 0.5% in Buffer TBS (20 mM Tris 130 mM NaCl).

o Diluting solution Ovalbumina allo 0.25% in Buffer TBST 0.05% .

o Soluzione per lo sviluppo TMB (3, 3’ ,55’-Tetramethylbenzidine, Sigma).

o Stopping Solution 2.5 M HCl .

Procedimento:

o Per adsorbire il coniugato GlnBP-AFM1 nei pozzetti delle piastre è stato usato il Coating Buffer e posto ON a 4°C .

o Eseguire 3 lavaggi da 50 uL per 10 min con il Wash

Buffer.

Incubare 50 uL del coniugato GlnBP-AFM1 0.5 ng/uL in Coating Buffer (25 ng totali) ON a 4°C.

Aggiungere la Blocking Solution 50 uL per pozzetto ed incubare a 37°C per 1 h.

Eseguire 3 lavaggi da 50 uL per 10 min con il Wash Buffer.

Diluire gli anticorpi primari e secondari in Diluting Solution, aggiungere 50 uL per ogni pozzetto eseguire ogni punto in duplicato, ed incubare per 1 h a 37°C. Saggiare il Coating con le IgGMS-M1 purificate come anticorpi primario, utilizzarle ad una diluizione di 1: 6000 .

Prima di saggiare il coating con le IgGMS-M1, preincubarle per 30 min a 37°C con diverse concentrazioni finali di AFM1libera da 0.12 ppt fino a 8 ppt, aggiungere una soluzione 10 volte più concentrata in un volume di metanolo pari al 10% del volume finale.

Eseguire 3 lavaggi da 50 uL per 10 min con il Washing Buffer.

Utilizzare l’anticorpo secondario anti-rabbit ad una diluizione 1:6000 .

Eseguire 3 lavaggi da 50 uL per 10 min con il Washing Buffer.

Aggiungere 100 uL di TMB per lo sviluppo, 10 min al buio, e bloccare la reazione aggiungendo 100 μL di Stopping Solution.

o Si esegue la lettura all’analizzatore di piastre misurando l’assorbimento a 450 nm.

MESSA A PUNTO DEL SAGGIO COMPETITIVO

Le IgG monospecifiche così ottenute sono state cimentate in saggi ELISA indiretti competitivi. In questi saggi sono stati utilizzati 25 ng di GlnBP-AFM1per pozzetto di reazione.

I saggi competitivi sono stati condotti pre-incubando diluizioni opportune di questi anticorpi con quantità crescenti di Aflatossina M1in soluzione prima di eseguire il saggio ELISA tradizionale indiretto. Prima di effettuare un saggio ELISA indiretto competitivo si è proceduto a determinare le condizioni di linearità del segnale in risposta a differenti concentrazioni degli anticorpi e quantità differenti di Coating (adsorbimenti) utilizzate. Sono stati utilizzati 50 uL di diluizioni seriali 1:2 dalla concentrazione iniziale di 2 ng/uL di GlnBP-AFM1(100 ng in 50 uL). Tali Coating sono stati cimentati con diluizioni crescenti degli anticorpi a partire da diluizioni 1: 4000 fino a 1: 16000. Dunque sono state ottimizzate le condizioni per eseguire un saggio ELISA competitivo indiretto utilizzando un coating di 25 ng di GlnBP-AFM1(0.5 ng/uL) per pozzetto ed una diluizione 1: 6000 delle IgGMS-M1. Si è preceduto ad incubare preventivamente per 30 minuti le IgGMS-M1 con concentrazioni crescenti di AFM1libera a partire da 0.12 ppt fino a 8 ppt, ed in seguito è stato eseguito un saggio ELISA. In questo intervallo di concentrazioni si è osservata una inibizione crescente dal 40% fino all’80% del legame delle IgGMS-M1 alla GlnBP-AFM1adsorbita al pozzetto di reazione.

I saggi ELISA competitivi indiretti hanno permesso di confermare l’alta avidità delle IgG per l’Aflatossina M1in soluzione, che ha permesso di mettere a punto un saggio altamente sensibile,che ha permesso di rilevare un’alta avidità delle IgG per l’antigene AFM1libero in soluzione come mostrato nel grafico di Fig. 6 dove in particolare all’aumentare della concentrazione libera,il legame delle IgG monospecifiche all’antigene adeso al pozzetto decresce.

ESEMPIO G

• Protocollo per la derivatizzazione degli anticorpi (IgG totali) con l’enzima Invertasi da Saccharomyces cerevisiae

Materiale:

o 6.5 mg Invertasi di lievito (Saccharomyces cerevisiae, FLUKA) concentrata 6.5 mg/mL in 0.1 M Buffer Fosfato di sodio pH 6.8 .

o Glutaraldeide 25% (SIGMA).

o 0.2 mL di IgG Tot concentrate 8 mg/mL (1,6 mg).

o Buffer Carbonato di Sodio 0.5 M pH 9.6 .

o Etanolammina 0.2 M pH 7 (SIGMA).

Procedimento:

o Dializzare 10 mg Invertasi concentrata 10 mg/mL in Buffer Fosfato di Sodio pH 6.8 .

o Prendere 1 mL di questa preparazione 6.5 mg/mL ed aggiungere la Glutaraldeide alla concentrazione finale di 1.25% .

o Incubare in blanda agitazione a temperatura ambiente per 12 ore.

o Allontanare l’eccesso di Glutaraldeide dializzando 3 volte per 2 h a 4°C contro 250 mL 0.1 M Buffer Fosfato di Sodio pH 6.80.15 M NaCl.

o Aggiungere 0.8 mL di Buffer Carbonato di Sodio 0.5 M pH 9.6 a 0.2 mL di IgG Tot 8 mg/mL 10 mM Buffer Fosfato di Sodio pH 7.4 .

o Aggiungere 1 mL di Invertasi 6.5 mg/mL attivata con la Glutaraldeide ed incubare ON a 4°C in blanda agitazione.

o Aggiungere 0.1 mL di una soluzione di Etanolammina 0.2 M pH 7 ed incubare la soluzione in blanda agitazione 2 h a 4°C .

o Il coniugato è stato centrifugato a 12000 g per 10 min a 4 °C, ed il surnatante è stato dializzato contro 5 volte con 200 mL di Tris Buffer 50 mM pH 7.4 .

MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO PER LA DERIVATIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI (IgG TOTALI) CON INVERTASI

In seguito è stato messo a punto un protocollo sperimentale per la coniugazione della Invertasi di lievito (Saccharomyces cerevisiae, FLUKA) con le IgG purificate. Dato che le IgG dei due conigli non hanno mostrato differenze significative nel titolo e nella avidità di legame per GlnBP-AFM1, per le coniugazioni sono state utilizzate le IgG purificate dai sieri riuniti di entrambi i conigli, ed in un secondo momento sono state condotte purificazioni per affinità dei coniugati generati. Per la messa a punto di un protocollo di coniugazione IgG Invertasi sono state adottate diverse strategie di coniugazione che utilizzavano la Glutaraldeide come agente crosslincante omobifunzionale.

Si è proceduto con l’attivazione della Invertasi con la Glutaraldeide e la successiva aggiunta delle IgG nel Buffer appropriato che permette la coniugazione.

A tale scopo 10 mg di Invertasi di lievito sono state dializzate 4 volte per 2 h a temperatura ambiente contro 250 mL 0.1 M Buffer Fosfato di Sodio pH 6.8. In seguito è stata aggiunta la Glutaraldeide alla concentrazione finale 1.25% ad 1 mL di Invertasi (6.5mg) ed è stata posta la soluzione in blanda agitazione ON a temperatura ambiente.

In seguito l’eccesso di Glutaraldeide è stato allontanato dializzando 3 volte per 2 h a 4°C contro 250 mL 0.1 M Buffer Fosfato di Sodio pH 6.80.15 M NaCl.

Il rapporto molare tra la Invertasi e le IgG in questa reazione è stato di 5: 1. A tale scopo 0.2 mL di una nuova preparazione di IgG concentrate 8 mg/mL (1,6 mg), ottenute dai sieri dei due conigli, sono state disciolte in 0.8 mL di Buffer Carbonato di Sodio 0.5 M pH 9.6 e sono state poste in una eppendorf da 2 mL.

In seguito è stato aggiunto 1 mL contenente 6.5 mg di Invertasi attivata con la Glutaraldeide, il tutto è stato posto a 4°C in blanda agitazione ON.

In seguito sono stati aggiunti 0.1 mL di una soluzione di Etanolammina 0.2 M pH 7 e la soluzione è stata posta in agitazione 2 h a 4°C. Il coniugato è stato centrifugato a 12000 g per 10 min a 4 °C, e dializzato 5 volte contro 200 mL di Tris Buffer 50 mM pH 7.4 .

ESEMPIO H

• Purificazione delle IgG coniugate dalla Invertasi ancora libera

Materiale:

o 0.3 mL di resina nProtein A SepharoseTM 4 Fast Flow (GE Healthcare).

o Binding Buffer Tris Buffer 50 mM pH 7.4 .

o Colonnine per cromatografia di affinità da 10 mL (Biorad).

o Coniugato IgG Tot INV è stato portato a 4 mL in Buffer 50 mM pH 7 .

Procedimento:

o Lavare la resina con acqua e Binding Buffer ed aggiungere il coniugato diluito ed incubare over night a 4 °C in lenta agitazione.

o Lavare a RT con Binding Buffer fino a quando non fosse più rilevabile l’attività invertasica.

o Prelevare 100 μL da ogni lavaggio e saggiare l’attività invertasica, come descritto nell’esempio A.

o Prelevare la resina e porla in una membrana da dialisi KO 30KD e sigillarla.

• Saggio enzimatico della Invertasi coniugata

o Porre la membrana in un tubo da 50 mL contenente 30 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 e 15 mL di una soluzione al 10% W/V di saccarosio preparata al momento

o Porre in un incubatore a 37°C in continua lenta agitazione.

o Prelevare a vari tempi 0.1 mL della soluzione esterna alla dialisi.

o Determinare la quantità di Glucosio presente con il kit D-GLUCOSE (Megazyme).

TESTS PER VERIFICARE LA QUALITÀ ED EFFICIENZA DELLA CONIUGAZIONE

Purificazione delle IgG coniugate dalla Invertasi ancora libera

Per verificare che ci fossero IgG coniugate e verificare che ci fosse ancora attività invertasica, la miscela della reazione di coniugazione è stata portata a 4 mL in Tris Buffer 50 mM pH 7.4 e messa ad incubare con 0.3 mL di resina Protein A Sepharose<TM>4 Fast Flow (GE Healthcare) ON a 4°C in blanda agitazione. Tale resina è in grado di legare con alta affinità le IgG ed allontanare la quota di Invertasi che non ha reagito. A tale scopo la resina è stata lavata con Tris Buffer 50 mM pH 7.4 fino a quando non vi fosse nei lavaggi eseguiti alcuna attività invertasica rilevabile. A tale scopo 0.1 mL di ogni lavaggio sono stati saggiati per l’attività invertasica residua, aggiungendo 1 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 0.5 mL di una soluzione al 10% W/V di Saccarosio preparata al momento, incubando per 15 min a 37°C. La reazione è stata bloccata aggiungendo 0.4 mL 0.3 M Buffer Tris base e subito posta in ghiaccio. Terminata la reazione 33 uL sono stati saggiati per determinare la quantità di Glucosio prodotta attraverso un kit commerciale per la determinazione del Glucosio negli alimenti (D-GLUCOSE GOPOD-FORMAT Megazyme) che utilizza la Glucosio Ossidasi come enzima rivelatore. Dunque la fase di lavaggio della resina è stata conclusa dopo che non era più rilevabile alcuna quantità di Glucosio con questo kit.

Saggio enzimatico della Invertasi coniugata

In seguito la resina è stata posta all’interno di una membrana da dialisi, tale membrana chiusa alle estremità è stata immersa in un tubo da 50 mL contenente 30 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 e 15 mL di una soluzione al 10% W/V di Saccarosio preparata al momento, il tutto è stato posto in un incubatore a 37°C in continua lenta agitazione. Successivamente a vari tempi sono stati prelevati 0.1 mL di soluzione esterna alla dialisi, ed è stata determinata la quantità di Glucosio presente con il kit D-GLUCOSE (Megazyme). IL saggio enzimatico schematicamente illustrato in Figura 7 ha permesso di confermare l’attività invertasica dei coniugati con le IgG totali già a 15 min con una concentrazione di Glucosio prodotta di 2 mg/dL, anche tenendo conto del tempo necessario alla diffusione dei substrati e dei prodotti e del volume di diluizione.

ESEMPIO I

• Purificazione degli anticorpi coniugati

Procedimento:

o Recuperare la resina dal tubo da dialisi e porre in una colonnina per cromatografie di affinità.

o Eseguire 2 lavaggi da 0.5 mL in 50 mM tris Buffer pH 7.4.

o Eluire a RT con 5 frazioni da 1 mL in Buffer Glicina 0.1 M pH 3 e tamponare a pH 7 con Buffer Tris pH 8.8 . o Monitorare allo spettrofotometro l’assorbimento a 280 nm delle frazioni contenenti le IgGTOT-INV, poi riunire in un unico campione.

PURIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI CONIUGATI

In seguito la resina con i coniugati legati è stata recuperata dal tubo da dialisi ed è stata posta in una colonna per la successiva purificazione dei coniugati. Sono stati eseguiti 2 lavaggi da 0.5 mL in 50 mM tris Buffer pH 7.4, e successivamente eseguite 3 eluizioni da 1 mL in 0.1 M Glicina pH 3 immediatamente tamponate con 50 μL 1 M Buffer Tris pH 8.8. E’ stato monitorato l’assorbimento allo spettrofotometro delle frazioni a 280 nm, e le prime due frazioni da 1 mL sono state riunite ed utilizzate per i successivi saggi.

ESEMPIO J

• Verifica dell’ attività di anticorpi e di enzima dei coniugati

Materiale:

o 0.50 μg di BSA in TBS come controllo positivo depositato su 1 cm<2>.

o 0.50 μg GlnBP in TBS come controllo negativo depositato su 1 cm<2>.

o Coniugato purificato IgGTOT-INV.

o Fogli di nitrocellulosa da 25 cm<2>.

o Blocking Solution 5% OVA TBS.

o Diluting Solution 1% OVA TBST 0.05% .

Procedimento:

o Adsorbire 2 uL delle soluzioni di proteine BSA e GlnBP 0.250 μg/uL in modo da avere vari spot di 1 cm<2>. o Bloccare i siti reattivi della nitrocellulosa con Blocking Solution. 1h a temperatura ambiente in blanda agitazione.

o Eseguire 3 lavaggi da 10 min in TBST 0.05% .

o Diluire tutto il coniugato purificato in Diluting Solution ed incubare con il foglio di nitrocellulosa ON a 4° in blanda agitazione.

o Eseguire 3 lavaggi da 10 min in TBST 0.05% .

o Tagliare il foglio in tante striscioline quante erano le proteine deposte.

o Incubarle 5 min con 50 uL della soluzioni per saggiare l’attività saccarasica secondo l’Esempio A

o Prelevare 33 μl e saggiarli con D-GLUCOSE GOPOD-FORMAT (Megazyme) per determinare la concentrazione di glucosio prodotto.

VERIFICA DELL’ ATTIVITÀ DI ANTICORPI E DI ENZIMA DEI CONIUGATI Per verificare che nei coniugati purificati dalla resina gli anticorpi abbiano conservato la loro struttura e siano ancora in grado di riconoscere un antigene si è proceduto ad eseguire un saggio Dot Blot utilizzando il carrier della immunizzazione ovvero la BSA (Bovine Serum Albumin) come antigene di controllo.

Sono state fatte adsorbire 0.5 μg di BSA come controllo positivo e 0.5 ug di GlnBP come controllo negativo su un foglio di nitrocellulosa in modo che ogni spot abbia le dimensioni massime di 1 cm<2>. Ogni spot è stato evidenziato in quanto sarà tagliato e testato singolarmente per la attività invertasica.

In seguito il foglio di nitrocellulosa con gli spot delle proteine adsorbite è stato immerso in una soluzione di Blocking (saturazione) al 5% di OVA in Buffer TBS (20 mM tris 130 mM NaCl) 1 h a temperatura ambiente in blanda agitazione. Sono stati eseguiti 3 lavaggi in Buffer TBS da 10 min a temperatura ambiente. Il coniugato IgG totali Invertasi è stato portato ad un volume di 10 ml in una soluzione al 1% di OVA in Buffer TBS ed è stato incubato con il foglio di nitrocellulosa in blanda agitazione a 4 °C tutta notte.

Sono stati eseguiti 3 lavaggi in TBS per 10 min a temperatura ambiente, ed in seguito il foglio è stato tagliato in modo da ottenere una quadrato di 1 cm<2>per ogni spot di proteina deposta.

Ogni quadratino è stato posto in una eppendorf da 1.5 mL ed è stato saggiato per l’attività invertasica data dal coniugato IgG totali-Invertasi che vi si è legato. A tale scopo è stata preparata una soluzione per saggiare l’attività invertasica con 1 mL 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 0.5 mL di una soluzione di Saccarosio al 10% W/V.

Su ogni quadratino di nitrocellulosa inserita nella eppendorf sono stati posti 50 uL di questa soluzione, è stata chiusa l’eppendorf e messo ad incubare a temperatura ambiente.

A vari tempi sono stati prelevati 33 μL da ogni eppendorf ed è stata determinata la quantità di Glucosio prodotta attraverso il kit D-GLUCOSE GOPOD-FORMAT (Megazyme).

Dopo un tempo di incubazione di 5 min i quadratini su cui era stata adsorbita la BSA risultano essere positivi per l’attività invertasica, mentre quelli su cui era stata adsorbita la GlnBP risultano essere negativi. Quindi la procedura conserva sia la reattività anticorpale che quella enzimatica.

ESEMPIO H

• Purificazione degli anticorpi monospecifici anti-Aflatossina M1coniugati con Invertasi

Materiale:

o Coniugato IgGTOT-INV preparato come in Esempio G.

o 250 μL resina EAH-AFM1preparata come descritto in Esempio E .

o Wash Buffer 50 mM Tris pH 7.4 .

Procedimento:

o Incubare il coniugato con 250 μL di resina EAH-AFM1in una eppendorf da 2 mL tutta notte a 4°C sotto lenta agitazione.

o Eseguire 2 lavaggi in eppendorf ed un ultimo lavaggio per il trasferimento in colonna da 0.8 mL in Buffer 50 mM Tris pH 7.4 .

o Eseguite 10 eluizioni da 0.1 mL in Buffer 0.1 M Glicina pH 3 immediatamente tamponato a pH 7 con 1 M Tris pH 8.8.

o Monitorare allo spettrofotometro l’assorbimento a 280 nm e riunite le frazioni contenenti il coniugato con le IgG monospecifiche anti-Aflatossina M1(IgGMS-M1-INV). o Aggiungere l’isodiazide come conservante alla concentrazione finale di 5 μM.

Purificazione degli anticorpi monospecifici anti-Aflatossina M1coniugati con Invertasi

Confermata l’attività invertasica e la capacità di riconoscere antigeni dei coniugati così generati, si è proceduto a produrre un altro coniugato IgG-Invertasi da purificare sulla resina (EAH Sepharose<TM>4B) coniugata al derivato carbossilico dell’Aflatossina M1EAH-AFM1)

a. Purificazione di anticorpi e produzione di coniugati a Invertasi preparati come in esempio G

b. Purificazione degli anticorpi monospecifici coniugati a Invertasi

Il coniugato è stato incubato con 250 μL di resina EAH-AFM1in una eppendorf da 2 mL ON a 4°C in lenta agitazione. Sono stati eseguiti 2 lavaggi in eppendorf ed un ultimo lavaggio per il trasferimento in colonna da 0.8 mL in Buffer 50 mM Tris pH 7.4. In seguito sono state eseguite 10 eluizioni da 0.1 mL in Buffer 0.1 M Glicina pH 3 immediatamente tamponato a pH 7 con 1 M Tris pH 8.8. Le frazioni sono state monitorate allo spettrofotometro misurando l’assorbimento a 280 nm e riunite in una nuova eppendorf cui è stata aggiunta come conservante l’isodiazide alla concentrazione finale di 5 uM .

ESEMPIO L

• Saggi immunoenzimatici dei coniugati monospecifici Materiale:

o Strisce di nitrocellulosa da 1 cm per 3 cm.

o Coniugato IgGMS-M1-INV diluito 1:100 e 1: 250 .

o Blocking Solution 0.5% OVA TBST 0.05% .

o Diluting Solution Buffer TBST 0.05% OVA 0.25% .

o Buffer attività saccarasica (2/3 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 1/3 di una soluzione al 10.0% W/V di saccarosio).

o Perossidasi -Aflatossine (HRP-AFL ORSell )

o OVA 0.1%.

o GlnBP 0.7 mg/mL.

Procedimento:

o Incubare 150 ug di OVA e GlnBP e 50 μL HRP-AFL (6.6 ug/uL) in eppendorf da 1.5 mL in 1 mL TBS 1h a temperatura ambiente.

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubate le striscette con 1 mL di Blocking Solution per 1h a temperatura ambiente in lenta agitazione. o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare le striscette con le due diluizioni di coniugato IgGMS-Inv tutta notte a 4°C .

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare le striscette con 500 uL di Buffer per saggiare l’attività saccarasica.

o Prelevare 33 μL a vari tempi e misurare la concentrazione di Glucosio prodotta, con il kit D-GLUCOSE (Megazyme).

SAGGI IMMUNOENZIMATICI DEI CONIUGATI MONOSPECIFICI

Il coniugato purificato su resina è stato cimentato su strisce di nitrocellulosa preventivamente incubate con diverse soluzioni di proteine. Le striscette della dimensione 1 cm per 3 cm sono state poste in eppendorf ed incubate con 1 mL di Buffer TBS in cui erano state diluite le diverse proteine. A tale scopo sono state utilizzate 150 ug di BSA e GlnBP come controlli negativi dopo la purificazione per affinità dei coniugati su una resina EAH-AFM1. In questo esperimento è stata verificata la capacità dei coniugati di monitorare una proteina commerciale coniugata a varie aflatossine utilizzata in saggi ELISA competitivi quantitativi. A tale scopo 50 μL di una soluzione di coniugato Perossidasi-Aflatossine (HRP-AFL ORSell ) è stato diluito in 1 mL TBS prima di incubarlo con la striscia di nitrocellulosa 1 h a RT in lenta agitazione. Successivamente le strisce di nitrocellulosa sono state incubate con 1 mL 0.5% OVA TBST 0.05% per 1h a temperatura ambiente in lenta agitazione. Sono stati eseguiti 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05%, e le striscette sono state incubate ON a 4°C con 2 diluizioni dei coniugati IgG monospecifiche anti-AFM1-Invertasi (IgGMS-M1-Inv). I coniugati IgGMS-M1-Inv sono stati utilizzati ad una diluizione 1: 250 e 1: 500 in Buffer TBST 0.05% OVA 0.5% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20). Sono stati eseguiti 3 lavaggi per 10 min con il Buffer TBST 0.05% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20).

Le striscette sono state incubate a temperatura ambiente con 0.5 mL di una soluzione tampone ottimale per verificare l’attività invertasica contenente un eccesso di substrato (2/3 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 1/3 di una soluzione al 10% W/V di Saccarosio).

Dopo vari tempi di incubazione sono stati eseguiti dei prelievi da 33 uL e 100 uL finali, i quali sono stati saggiati con il kit D-GLUCOSE (Megazyme) per il dosaggio del Glucosio, prodotto per azione del coniugato IgGMS-M1-INV.

Il saggio ha permesso di rilevare la proteina derivatizzata con le Aflatossine (HRP-AFL), e non le altre proteine messe ad incubare con il coniugati IgGMS-M1-INV.

ESEMPIO M

• Saggi dei coniugati monospecifici in presenza di latte e metanolo

Materiale:

o Strisce di nitrocellulosa da 1 cm per 3 cm.

o Coniugato IgGMS-M1-INV diluito 1:100.

o Blocking Solution 0.5% OVA TBST 0.05% .

o Diluting Solution latte intero Granarolo al 33% in TBST 0.05% o Buffer TBST 0.05% OVA 0.25%, più il 10% di Met-OH.

o Buffer attività saccarasica (2/3 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 1/3 di una soluzione al 10.0% W/V di Saccarosio).

o Perossidasi -Aflatossine (HRP-AFL ORSell).

o 10ug/uL OVA in TBS.

Procedimento:

o Incubare 100 uL OVA (10 ug/uL) e 100 uL HRP-AFL (6.6 ug/uL) in eppendorf da 1.5 mL in 1 mL TBS ON a 4°C. o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubate le striscette con 1 mL di Blocking Solution per 7h a 4°C in lenta agitazione.

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare le striscette con la diluizione di coniugato 1:100 IgGMS-M1-INV ON a 4°C.

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 15 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare le striscette con 0.5 mL di Buffer per saggiare l’attività saccarasica.

o Prelevare 100 uL a due ore e misurare la concentrazione di glucosio prodotta con il kit D-GLUCOSE (Megazyme).

SAGGI DEI CONIUGATI MONOSPECIFICI IN PRESENZA DI LATTE E METANOLO

In seguito è stato verificato che tale saggio funzionasse in presenza di latte e Metanolo.

Il saggio è stato eseguito diluendo il coniugato IgGMS-M1-INV in una soluzione di latte intero Granarolo al 33% in TBST 0.05% (20 mM tris 130 mM NaCl 0.05% Tween-20) oppure in una soluzione di OVA 0.125% in TBST 0.05% aggiungendo in ogni campione il 10% di Metanolo.

In questo esperimento le striscette di nitrocellulosa sono state incubate con 100 uL di coniugato HRP-AFL (6,6 ug/uL) diluito in TBS e posto ad incubare ON a 4°C in lenta agitazione. Sono stati eseguiti 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% per 15 min a 4°C in lenta agitazione. In seguito le striscette sono state incubate con 1 mL di una soluzione di OVA 0.5% per 7h a 4 °C in lenta agitazione per saturare tutti i siti di legame presenti sulle striscette. Sono stati eseguiti 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05%. per 15 min a 4°C in lenta agitazione. Successivamente sono stati aggiunti i coniugati diluiti 1: 100 .

Sono stati eseguiti 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% per 15 min a 4 °C in lenta agitazione. Le striscette di nitrocellulosa sono state incubate a temperatura ambiente con 0.5 mL di una soluzione 2/3 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 1/3 di una soluzione al 10% W/V di Saccarosio. A vari tempi sono stati eseguiti vari prelievi da 33 μL ed uno finale da 100 uL per il dosaggio del Glucosio rilasciato con il kit D-GLUCOSE (Megazyme).

L’esperimento ha permesso di dimostrare che non vi era interferenza del latte durante l’incubazione del coniugato IgGMS-M1-INV con le striscette di nitrocellulosa ed è stato possibile rilevare attività invertasica dopo 1h di incubazione a temperatura ambiente. Inoltre è stato verificato che non vi era interferenza nel legame da parte delle IgGMS-M1-INV contro la HRP-AFL, aggiungendo il 10% di Metanolo alla soluzione. Il solvente nella soluzione sarà necessario per aggiungere l’Aflatossina M1libera nei successivi saggi competitivi o permettere la solubilizzazione dell’Aflatossina M1nel latte eventualmente contaminato.

ESEMPIO N

• Saggi competitivi dei coniugati monospecifici in presenza di latte

Materiale:

o Coniugato IgGMS-M1-INV diluito 1: 100 .

o Blocking Solution 0.5% OVA TBST 0.05% .

o Diluting Solution Granarolo al 33% in TBST 0.05% o Buffer TBST 0.05% OVA 0.25%, più il 10% di Met-OH.

o Buffer attivtà saccarasica (2/3 0.1 M Buffer Acetato pH 4.6 ed 1/3 di una soluzione al 10.0% W/V di saccarosio).

o Perossidasi -Aflatossine 6.6 ug/μL (HRP-AFL ORSell). o OVA in TBS10 ug/uL.

Procedimento:

o Porre 100 uL OVA 10 ug/uL di OVA e 100 uL HRP-AFL (6.6 ug/uL) in eppendorf da 1.5 mL in 1 mL TBS ON a 4°C. o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 30 min a 4 °C in lenta agitazione.

o Porre la striscetta in nuove eppendorf da 1.5 mL.

o Incubate le striscette con 1 mL di Blocking Solution per ON a 4 °C in lenta agitazione.

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 30 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare 1 h a temperatura ambiente i coniugati IgGMS-M1-INV diluiti 1: 100 in diluting solution con 54 ppt e 27 ppt di AFM1disciolta in Met-OH.

o Incubare le striscette con la diluizione di coniugato 1: 100 IgGMS-M1-INV già preincubato con la soluzione di Aflatossina M1in Met-OH, ON a 4 °C.

o Eseguire 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% 30 min a 4°C in lenta agitazione.

o Incubare le striscette con 1.0 mL di Buffer per saggiare l’attività saccarasica.

o Prelevare 100 uL a due ore e misurare la concentrazione di Glucosio prodotta con il kit D-GLUCOSE (Megazyme). SAGGI COMPETITIVI DEI CONIUGATI MONOSPECIFICI IN PRESENZA DI LATTE

Per condurre saggi competitivi, il saggio è stato opportunamente ottimizzato per permettere un confronto accurato dei risultati con gli opportuni controlli e verificare la riduzione del segnale dopo l’aggiunta di Aflatossina M1libera.

A tale scopo si è reso necessario: i) aumentare il tempo di incubazione dei lavaggi fino a 30 min a 4 °C per ridurre la possibilità di avere falsi positivi; ii) porre le striscette in nuove eppendorf da 1.5 mL dopo l’incubazione con la proteina coniugata con le aflatossine, di modo da verificare solo l’attività ottenuta dall’HRP-AFL legata alle striscette di nitrocellulosa; iv) aumentare il tempo di incubazione della soluzione di Blocking ON per sfavorire legami aspecifici del coniugato con la plastica dell’eppendorf; v) in fine di aumentare il volume per il saggio dell’attività invertasica ad 1 mL per permettere una ottimale incubazione della soluzione sulle striscette nelle eppendorf da 1.5 mL, quest’ultima eseguita a temperatura ambiente senza agitazione, consci che questo prolungherà i tempi di incubazione per ottenere un segnale rilevabile.

Per i saggi competitivi i coniugati IgGMS-M1-INV, diluiti in una soluzione di latte intero Granarolo al 33% in TBST 0.05%, sono stati prima incubati 1h a temperatura ambiente in lenta agitazione con varie concentrazioni di Aflatossina M1,rispettivamente di 54 ppm e 27 ppm, aggiungendo un volume di Metanolo pari al 10% del volume totale della soluzione, in cui era disciolta una opportuna diluizione della Aflatossina M1libera. In seguito 1 mL di questa soluzione è stata incubata con ogni striscetta ON a 4 °C in lenta agitazione. Sono stati eseguiti 3 lavaggi da 1 mL in TBST 0.05% per 30 min a 4°C in lenta agitazione.

Dopo aver aggiunto 1 mL della soluzione per saggiare l’attività invertasica, sono stati prelevati dopo due ore 100 uL saggiati con il kit D-GLUCOSE (Megazyme). Dopo l’ incubazione nella eppendorf in assenza di AFM1è stato prodotto circa 1,5 ug di glucosio, ed è stato possibile rilevare una riduzione del 80% e del 50% del Glucosio prodotto con una incubazione di AFM1libera rispettivamente di 54 ppt e 27 ppt.

Saggio competitivo dei coniugati in presenza di latte

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La tabella mostra che in presenza di 54 ppt di Aflatossina M1libera disciolta nel latte il legame delle IgG coniugate alla Invertasi e di conseguenza la quantità di Glucosio prodotta si riduce drasticamente.In presenza di un’altra proteina Ovalbumina (OVA) legata alle striscette non si osserva produzione di Glucosio.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1.Metodo di rilevazione di micotossine nel latte, suoi derivati e prodotti caseari, mediante immunodeterminazione e rilevazione di glucosio ad opera di un anticorpo primario specifico per la micotossina legato ad un enzima, che causa la formazione di glucosio da uno zucchero più complesso. 2.Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui il rilevatore di glucosio è un nanoglucometro in grado di rilevare quantità di glucosio comprese tra 0,01mM e 0,1 mM. 3.Metodo di rilevazione di micotossine nel latte per immunodeterminazione, secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente: A)il trattamento del latte con una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo primario specifico per la micotossina e legato ad invertasi, detta molecola di riconoscimento si lega alla micotossina eventualmente presente nel latte; B)la successiva aggiunta di detto latte proveniente dallo stadio A)ad un supporto solido su cui è immobilizzata la specifica micotossina, la micotossina immobilizzata si legherà alla molecola di riconoscimento che non si è legata all’ aflatossina dopo lo stadio (A) immobilizzando in questo modo l’ invertasi sul supporto solido; C) il trattamento del supporto solido proveniente dallo stadio (B) con una soluzione acquosa tamponata di saccarosio e D)rilevazione della micotossina tramite il glucosio formato per reazione enzimatica dell’invertasi legata alla molecola di riconoscimento dopo reazione con la micotossina immobilizzata; 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, effettuato con una metodica diretta che comprende i seguenti stadi: f. si aggiunge al latte o suo derivato una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo specifico per detta micotossina, legato ad invertasi, g. si aggiunge il detto latte o suo derivato proveniente dallo stadio (a) ad un supporto solido sul quale è immobilizzata la micotossina (di seguito molecola bersaglio), h. si procede al lavaggio del supporto solido; i. si tratta il supporto solido con una soluzione di saccarosio, j. si procede alla rilevazione del glucosio formato, in presenza dell’enzima invertasi liberata e legato alla molecola di riconoscimento, glucosio che sarà tanto minore quanto maggiore è la quantità di micotossina contenuta nel latte. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazione 1 -3 condotto secondo la metodica indiretta che comprende i seguenti stadi: a’) si aggiunge al latte una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo primario diretto contro la micotossina; b’) si aggiunge il latte proveniente dallo stadio b’) ad un supporto solido su cui è immobilizzata la molecola bersaglio, c’) si procede al lavaggio del supporto solido proveniente dal precedente stadio; d’) si immerge il supporto solido proveniente dal precedente lavaggio in una soluzione acquosa contenente un anticorpo secondario legato ad invertasi specifico contro l’anticorpo primario diretto contro la micotossina e’) si procede al lavaggio del supporto proveniente dal precedente stadio; f’) si aggiunge una soluzione acquosa di saccarosio tamponata; g’) si procede alla rilevazione del glucosio formato, in presenza dell’enzima invertasi legato all’anticorpo secondario che ha legato l’anticorpo primario, glucosio che sarà tanto minore quanto maggiore è la quantità di micotossina contenuta nel latte per mezzo di un glucometro in grado di rilevare quantità di glucosio a concentrazioni comprese tra 0,01 e 0,1mM. 6. Kit (1) per la rilevazione di micotossine secondo la metodica diretta della rivendicazione 4 e comprendente: i)una molecola comprendente un anticorpo specifico per la micotossina, detto anticorpo è legato ad invertasi; ii)un supporto solido su cui è immobilizzata la micotossina specifica da rilevare, iii)una soluzione acquosa tamponata di saccarosio; iv) un insieme di dati, grafici/diagrammi sotto forma di materiale cartaceo o elettronico ad esempio CD, DVD, ecc che permette la correlazione tra la presenza o assenza oppure l’aumento/ riduzione di glucosio, con la quantità di micotossina presente nel latte analizzato v) un nanoglucometro in grado di rilevare concentrazioni di glucosio comprese tra 0,01 e 0,1mM. 7. Kit (2) per l’esecuzione del metodo di rilevazione secondo la metodica indiretta rivendicata nella rivendicazione 5 e comprendente: i’) una molecola di riconoscimento comprendente un anticorpo specifico per la micotossina, ii’)un supporto solido su cui è immobilizzata la micotossina specifica da rilevare, iii’)una soluzione acquosa tamponata contenente almeno un anticorpo secondario, legato ad invertasi, diretto contro l’anticorpo specifico primario contro la micotossina iv’) una soluzione acquosa tamponata di saccarosio. v’)un insieme di dati, grafici/diagrammi sotto forma di materiale cartaceo o elettronico ad esempio CD, DVD, ecc che permette la correlazione tra la presenza o assenza oppure l’aumento/ riduzione di glucosio, con la quantità di micotossina presente nel latte analizzato v’)un nano-glucometro in grado di rilevare concentrazioni di glucosio comprese tra 0,01mM e 0,1mM. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, kit(1) secondo la rivendicazione 7, o kit (2) secondo la rivendicazione 6, in cui nella molecola di riconoscimento l’anticorpo primario è legato ad invertasi, mediante un agente di coniugazione. 9. Metodo, kit (1) o Kit (2) secondo la rivendicazione 8 in cui detto agente di coniugazione è la glutaraldeide. 10.Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazione 1-5 o il kit (1) secondo la rivendicazione 6 ed il kit(2) secondo la rivendicazione 7 per la rilevazione di micotossine scelte nella classe costituita da: aflatossine, zearalenoni, tricoteceni e ocratossine. 11. Metodo, kit(1) o Kit(2) secondo la rivendicazione 9, in cui la micotossina è scelta tra aflatossina M1, B1 e M2. 12. Metodo, kit(1) o kit (2) secondo la rivendicazione 12, in cui la micotossina è aflatossina M1.