WO2013031643A1 - 膵液を含む生体試料中の標的粒子の検出方法 - Google Patents

膵液を含む生体試料中の標的粒子の検出方法 Download PDF

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    • G01N2021/6432—Quenching

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting target particles in a biological sample containing pancreatic juice using an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • Fluorescence Correlation Spectroscopy using a laser confocal microscope optical system and photon counting technology, Fluorescence intensity from fluorescent molecules entering or leaving the microregion in the solution or fluorescently labeled molecules (such as fluorescent molecules) is measured.
  • the average residence time (translational diffusion time) of fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the measured autocorrelation function value of the fluorescence intensity and the average number of staying molecules are determined. Based on the average residence time and the average number of molecules staying in the minute region, information such as the speed or magnitude of movement of the fluorescence molecules and the concentration can be acquired.
  • the micro area is a focal area where laser light from a microscope is collected, and is called a confocal volume.
  • Fluorescence-Intensity Distribution Analysis (FIDA, for example, Patent Document 3) and Photon Counting Histogram (PCH, for example, Patent Document 4) are measured in the same manner as FCS.
  • a histogram of fluorescence intensities of fluorescent molecules entering and leaving the volume is generated. Then, by fitting a statistical model formula to the histogram distribution, the average value of the intrinsic brightness of fluorescent molecules and the average number of molecules staying in the confocal volume are calculated. .
  • Patent Documents 5 and 6 propose a method of detecting a fluorescent substance based on the time lapse of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 7 weak light from fluorescent fine particles circulated in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate is measured using a photon counting technique, and the fluorescence in the flow or on the substrate is measured.
  • a signal calculation processing technique for detecting the presence of fine particles has been proposed.
  • the sample required for measurement has an extremely low concentration compared with the conventional method. It can be very small (the amount used in one measurement is about several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (measurement of time on the order of seconds is repeated several times in one measurement). . Therefore, these techniques are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the fields of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for bioactive substances, etc. When the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • pancreatic fluid which is a kind of body fluid, is an important biological sample for knowing the state of the pancreas, and is used for examinations and research such as cytology and measurement of various biomolecules. For example, it can be expected that the onset of pancreatic cancer can be diagnosed by examining a tumor marker in pancreatic juice.
  • a biological sample such as pancreatic juice usually contains a wide variety of substances, and often contains a substance having autofluorescence.
  • target particles in a biological sample are artificially labeled with a luminescent probe and then detected by an optical analysis technique, non-specificity is caused by various contaminants derived from biological samples including autofluorescent substances. Signal is generated.
  • a photoanalysis technique when target particles in a biological sample containing blood are detected by a photoanalysis technique, the target particles are labeled with a chromophore that emits red and near infrared spectrum wavelengths of 550 to 1300 nm.
  • a method for detection is disclosed. By using light in the wavelength region of 550 to 1300 nm for detection of the target particles, it is possible to suppress the generation of nonspecific signals by endogenous autofluorescent substances such as hemoglobin.
  • the magnitude of the temporal fluctuation of the measured fluorescence intensity is calculated by statistical processing, and the sample solution is based on the magnitude of the fluctuation.
  • Various characteristics such as fluorescent molecules entering and exiting the minute region are determined. Therefore, in order to obtain a significant result in the above optical analysis technique, the concentration or number density of the fluorescent molecules to be observed in the sample solution must be as long as one second in the equilibrium state. It is preferable that the number of fluorescent molecules that can be statistically processed within the measurement time is adjusted so as to enter and exit the minute region.
  • the concentration or number density is preferably adjusted so that there is always about one fluorescent molecule or the like in a minute region.
  • the concentration of the fluorescent molecule or the like is preferably about 1 nM or more.
  • the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is significantly lower than the possible level of statistical processing, for example, significantly lower than 1 nM, the observation target is a minute region. A state that rarely enters within the measurement time occurs.
  • the measurement result of the fluorescence intensity a state where the observation target object is not present in the minute region is included for a long period of time, and the observation amount of the significant fluorescence intensity is reduced.
  • the optical analysis technique based on the statistical fluctuation of the fluorescence intensity as described above cannot obtain a significant or accurate analysis result.
  • Patent Documents 5 and 6 the statistical processing relating to the fluctuation of the fluorescence intensity as described above is not performed, and the measurement time over several seconds is used.
  • the presence or absence of a fluorescent molecule or the like to be observed in the sample can be specified by the presence or absence of the generation of a significant intensity fluorescent signal.
  • a correlation is obtained between the frequency of the fluorescent signal having a significant intensity and the number of fluorescent molecules in the sample.
  • Patent Document 6 suggests that detection sensitivity is improved by generating a random flow that stirs the sample solution.
  • Patent Document 7 individually detects the presence of fluorescent fine particles in a flow in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate.
  • the technique described in Patent Document 7 is for detecting particles such as molecules or colloids dissolved or dispersed in a normal state in a sample solution, that is, particles moving randomly in the sample solution. Is not a technology.
  • Patent Document 7 cannot quantitatively calculate the concentration or number density of particles dissolved or dispersed in the sample solution. Moreover, the technique of patent document 7 includes processes, such as measurement in a flow cytometer, or the fixation process of the fluorescent particle on a board
  • optical analysis techniques such as FCS, FIDA, PCH, etc.
  • An object of the present invention is to provide a target particle detection method in a pancreatic juice-containing biological sample that does not require statistical processing performed by optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH.
  • optical analysis techniques such as FCS, FIDA, and PCH.
  • the present inventors have obtained the following knowledge.
  • detection of the particles bound to the fluorescent probe is performed by a scanning molecule counting method.
  • the sample solution contains an autofluorescent substance derived from pancreatic juice by setting the wavelength of the fluorescence detected from the fluorescent probe bound to the target particles to 600 nm or more.
  • the target particles can be detected while effectively suppressing the generation of non-specific signals.
  • the present inventor has found the above knowledge and completed the present invention.
  • the scanning molecule counting method is a novel optical analysis technique proposed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 filed in Japan.
  • a method for detecting target particles in a biological sample containing pancreatic juice comprising: (a) preparing a sample solution containing a biological sample containing pancreatic juice and a fluorescent probe that binds to the target particles; And (b) a probe binding step for binding the target particle contained in the biological sample and the fluorescent probe, and (b) binding to the fluorescent probe present in the sample solution prepared in the step (a).
  • a calculation step of calculating the number of molecules of the target particle, and the generation characteristics of the light emitted from the fluorescent probe are different between a state of being bound to the target particle and a state of being alone, and The wavelength of light emitted in a state of being bound to the target particle is 600 nm or more, and the calculation of the number of molecules of the target particle bound to the fluorescent probe in the step (b) is performed using a confocal microscope or a multiphoton microscope.
  • optical signals from individual target particles bound to the fluorescent probe are detected, and detected in the detection step of individually detecting the target particles bound to the fluorescent probe.
  • the target according to any one of (1) to (3), wherein it is detected that one target particle combined with a fluorescent probe has entered the light detection region based on the shape of a time-series optical signal. Particle detection method.
  • the fluorescent probe has an energy donor site and an energy acceptor site that generate a fluorescence energy transfer phenomenon when they are close to each other, and binds to the target particle and binds to the target particle.
  • the distance between the energy donor site and the energy acceptor site is different between the state in which the fluorescent probe is not bonded and the state in which the energy donor site and the energy acceptor site are bound to the target particle,
  • the target particle detection method according to any one of (1) to (5), wherein the emitted light has different emission characteristics.
  • the target particle is a nucleic acid, and the fluorescent probe specifically hybridizes with the target particle, and at least one of a fluorescent substance that serves as an energy donor and a substance that serves as an energy acceptor in a fluorescence energy transfer phenomenon. 6.
  • the method for detecting a target particle according to any one of (1) to (6) above, wherein one is a single-stranded nucleic acid molecule to which one is bound.
  • the target particle detection method of the present invention In the scanning molecule counting method used in the target particle detection method of the embodiment of the present invention (hereinafter referred to as the target particle detection method of the present invention), statistical processing such as calculating fluctuations in fluorescence intensity is not executed. Therefore, the target particles in the sample can be detected by the target particle detection method of the present invention even when the target particles to be analyzed are present in a very small amount. Furthermore, in the method for detecting a target particle of the present invention, the fluorescent probe bound to the target particle is detected as a fluorescent light having a wavelength of 600 nm or more as an optical signal in the scanning molecule counting method. The influence of the substance can be eliminated. As a result, target particles in a biological sample containing pancreatic juice can be detected with high accuracy.
  • FIG. 5 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region while performing Brownian motion. It is a figure which shows the example of the time change of photon count (light intensity) under the condition shown to FIG. 3A.
  • FIG. 5 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region while performing Brownian motion. It is a figure which shows the example of the time change of photon count (light intensity) under the condition shown to FIG. 3A.
  • FIG. 6 is a model diagram when the observation target particle crosses the light detection region by moving the position of the light detection region in the sample solution at a speed faster than the diffusion movement speed of the observation target particle. It is a figure which shows the example of the time change of the photon count (light intensity) under the condition shown to FIG. 4A. It is a figure showing the processing procedure for counting particles from the time change of photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method in the form of a flowchart. It is a figure explaining the example of the signal processing process of the detection signal in the processing procedure for counting particles from the time change of the photon count (light intensity) measured by the scanning molecule counting method.
  • FIG. 7 shows an actual measurement example (bar graph) of photon count data measured by the scanning molecule counting method, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the peak existence region. Show. In the figure, a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • the scanning molecule counting method will be described.
  • particles that emit light that moves randomly and moves in the sample solution while scanning the sample solution by the minute region (hereinafter referred to as “luminescent particles”) cross the minute region.
  • the light emitted from the light emitting particles in the minute region is detected.
  • a sample required for measurement may be in a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L) as in the optical analysis technique such as FIDA.
  • the measurement time in the scanning molecule counting method is short.
  • the “particles dispersed in the sample solution and moving randomly” may be particles (such as those that emit light or those that do not emit light) such as atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in the sample solution. In other words, it means particles that are not fixed to a substrate or the like and are free to Brownianly move in the solution.
  • Luminescent particles mean particles that emit light by fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, and the like.
  • a combination of the target particle and the fluorescent probe is a luminescent particle.
  • the “light detection region” of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope is a minute region where light is detected in the confocal microscope or the multiphoton microscope.
  • illumination light When illumination light is given from the objective lens, it corresponds to a region where the illumination light is collected. In the confocal microscope, this light detection region is determined by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the scanning molecule counting method In the scanning molecule counting method, light is sequentially detected while moving the position of the light detection region in the sample solution, that is, while scanning the sample solution with the light detection region. Then, when the moving light detection region includes a light emitting probe that is bound or associated with a randomly moving particle, light from the light emitting probe is detected. As a result, the presence of one particle is detected. (Depending on the mode of the experiment, the luminescent probe may be dissociated from the particle upon detection of light after binding to the particle (target particle) to be detected once). obtain.). And in the light detected sequentially, the optical signal from a light emission probe is detected separately.
  • the presence of the particles (coupled with the luminescent probe) is detected individually and sequentially, and various information regarding the state of the particles in the solution is obtained.
  • the number of particles detected individually may be counted to count the number of particles detected during the movement of the position of the light detection region (the number of particles). Counting).
  • information relating to the number density or concentration of particles in the sample solution can be obtained by combining the number of particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the number density or concentration of the particles is concrete. Can be calculated automatically.
  • the scanning molecule counting method is configured to move the position of the light detection region by changing the optical path of the optical system. Thereby, the movement of the light detection region is fast, and mechanical vibration and hydrodynamic action are not substantially generated in the sample solution.
  • the scanning molecule counting method it is possible to measure light in a stable state where the particles to be detected are not affected by the mechanical action (if vibration or flow acts on the sample solution) , The physical properties of the particles may change.)
  • measurement and analysis can be performed with a very small amount of sample solution (about 1 ⁇ L to several tens of ⁇ L) as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the luminescent probe bonded to one particle is a state in which one luminescent probe is bonded to one particle, and a plurality of luminescent probes are connected to one particle. It includes a state in which it is bound to one particle and a state in which it is a luminescent probe that has been bound to one particle and then dissociated from the particle according to the experimental mode.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is based on the characteristics of the luminescent probe bound to the particles or the number density or concentration in the sample solution. It may be changed as appropriate. As will be appreciated by those skilled in the art, the manner of light detected from a luminescent probe bound to a particle can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution. In particular, as the moving speed of the light detection region increases, the amount of light obtained from the light emitting probe bonded to one particle decreases, so that light from the light emitting probe bonded to one particle can be measured with high accuracy or sensitivity. The moving speed of the light detection region is preferably changed as appropriate.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably set so that the light emitting probe (that is, the present invention) In the target particle detection method, it is set to be higher than the diffusion movement speed (average movement speed of the particles due to Brownian motion) of the luminescent probe in a state of being bonded to the target particles.
  • the scanning molecule counting method when the photodetection region passes through the position of the luminescent probe bonded to one particle, the light emitted from the luminescent probe is detected, and the luminescent probe is individually detected. To detect.
  • the moving speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion moving speed of the light emitting probe bonded to the particle, and thereby the light emitting probe bonded to one particle is represented by one (representing the presence of the particle). ) It is possible to correspond to an optical signal.
  • the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics (particularly the diffusion constant) of the luminescent probe bonded to the particle. It is preferable. In this embodiment, specifically, it sets so that it may move at a speed
  • the optical path of the optical system for moving the position of the light detection region may be changed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • the scanning molecule counting method is configured to detect light from the light detection region of the confocal microscope or the multiphoton microscope, as in the case of the optical analysis technology such as FIDA, the light detection mechanism itself, The amount of sample solution may be trace as well.
  • the scanning molecule counting method statistical processing such as calculation of fluctuations in fluorescence intensity is not performed, so the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is necessary for the optical analysis technique in which the particle number density or concentration is FIDA or the like. Applicable to sample solutions that are significantly lower than
  • each particle dispersed or dissolved in the solution is individually detected. Therefore, using the information, it is possible to quantitatively count particles, calculate the concentration or number density of particles in the sample solution, or obtain information on the concentration or number density. That is, according to the scanning molecule counting method, the particles passing through the light detection region and the detected light signals are detected one by one so that the particles are detected one by one. Particle counting is possible. Therefore, according to the scanning molecule counting method, it is possible to determine the concentration or number density of particles in the sample solution with higher accuracy than before.
  • the target particle in the sample solution is bound. Even if the concentration of the fluorescent probe is lower than the concentration that can be determined based on the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader, the target particles can be detected.
  • the sample solution is not affected by mechanical vibration or hydrodynamic action.
  • the sample solution is observed in a mechanically stable state.
  • particles, luminescent probes or conjugates or other substances in the solution may be altered or denatured by the hydrodynamic action due to the flow. improves.
  • measurement can be performed in a state where there is no influence or artifact due to mechanical action on particles to be detected in the sample solution.
  • the scanning molecule counting method is a combination of an optical system of a confocal microscope capable of executing FCS, FIDA, etc. and a photodetector as schematically illustrated in FIG. 1A. It can be realized by an analyzer.
  • the optical analysis device 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA (Numerical Aperture) at the emission end of the light, and is collimated by the collimator 4 and reflected by the dichroic mirror 5 and the reflection mirrors 6 and 7. , And enters the objective lens 8.
  • a microplate 9 in which sample containers or wells 10 into which a sample solution of 1 ⁇ L to several tens of ⁇ L is dispensed is arranged.
  • the laser light emitted from the objective lens 8 is focused in the sample solution in the sample container or well 10, and a region (excitation region) having a high light intensity is formed.
  • particles to be observed and luminescent probes that bind to the particles typically molecules to which a luminescent label such as a fluorescent dye is added are dispersed or dissolved.
  • a luminescent label such as a fluorescent dye is added
  • the luminescent probe When particles bound or associated with the luminescent probe (in some experimental modes, the luminescent probe once bound to the particle and then dissociated from the particle) enter the excitation region, the luminescent probe is excited and light is emitted during that time.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, passes through the pinhole 13, and passes through the barrier filter 14.
  • the pinhole 13 is arranged at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8. Thereby, only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region as schematically shown in FIG. 1B, passes through the pinhole 13, and the light from other than the excitation region is blocked.
  • 1B is usually a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 fL to 10 fL (typically, the light intensity is at the top of the center of the region).
  • the effective volume is the volume of a substantially elliptical sphere bounded by the plane where the light intensity is 1 / e 2), and is called the confocal volume.
  • light from a conjugate of one particle and a luminescent probe or light from a luminescent probe for example, faint light from one or several fluorescent dye molecules is detected.
  • an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is used.
  • a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 may be provided on a microscope stage (not shown) in order to change the well 10 to be observed.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18.
  • the optical path of the optical system is changed and the sample solution is scanned with the light detection region. That is, a mechanism for moving the position of the focal region (ie, the light detection region) in the sample solution is provided.
  • a mechanism for moving the position of the light detection region for example, a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG. 1C.
  • the mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope. Further, in order to achieve a desired movement pattern of the position of the light detection region, the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement locus of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (in the program in the computer 18, various movement patterns can be selected. Good.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down. As described above, if the position of the light detection region is moved by changing the optical path of the optical system instead of moving the sample solution, mechanical vibrations and hydrodynamic actions are caused in the sample solution. No substantial occurrence. As a result, it is possible to eliminate the influence of the dynamic action on the observation object, and stable measurement is achieved.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating the excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • a plurality of excitation light sources 2 may be provided as shown in FIG. 1A, and the wavelength of the excitation light is appropriately determined according to the wavelength of the light that excites the combined particle or luminescent probe or the luminescent probe. You may be able to choose.
  • a plurality of photodetectors 16 may be provided, and when a sample includes a combination of a plurality of types of particles having different wavelengths and a combination of luminescent probes or a luminescent probe, the light from them is changed depending on the wavelength. It may be possible to detect them separately.
  • a spectroscopic analysis technique such as FIDA is superior to a conventional biochemical analysis technique in that it requires an extremely small amount of sample and can perform inspection quickly.
  • the concentration and characteristics of the observation target particles are calculated based on fluctuations in fluorescence intensity.
  • the concentration or number density of the observation target particles in the sample solution is at a level at which about one observation target particle is always present in the light detection region CV during the measurement of the fluorescence intensity. It is required that a significant light intensity (photon count) is always detected during the measurement time.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, if the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV, a significant light intensity (photon count) is measured. It appears only in a part of the time, and it is difficult to calculate the fluctuation of the light intensity with high accuracy. Also, if the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which one observation target particle is always present in the light detection region during measurement, the light intensity fluctuation calculation is affected by the background. The measurement time is long in order to easily obtain significant light intensity data sufficient for calculation. In contrast, the scanning molecule counting method can detect characteristics such as the number density or concentration of particles to be observed even when the concentration of particles to be observed is lower than the level required by spectroscopic techniques such as FIDA. It is.
  • the optical path is changed by driving a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • a mechanism for moving the position of the photodetection region, as described briefly.
  • light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • a region in which one particle a fluorescent dye is bound as a luminescent probe in the drawing
  • the light detection region CV moves (time t0 to t2 in the drawing).
  • a significant light intensity (Em) is detected as depicted in FIG. 2B.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles is measured from the fluorescence intensity measured by a fluorescence spectrophotometer or a plate reader. It is possible to measure to a lower concentration than when doing so.
  • the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the concentration of the fluorescently labeled particles when the concentration of the fluorescently labeled particles is sufficiently low, the amount of noise signal with respect to the amount of signal due to the light emitted from the fluorescently labeled particles increases (deterioration of the S / N ratio), and fluorescence The proportional relationship between the concentration of labeled particles and the amount of optical signal is broken. As a result, the accuracy of the determined density value deteriorates.
  • the noise signal is excluded from the detection result, and only the signal corresponding to each particle is counted to obtain the concentration. calculate. Thereby, it is possible to detect even a lower concentration than when the concentration is detected on the assumption that the fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescently labeled particles.
  • the fluorescence intensity is fluorescently labeled. Therefore, the measurement accuracy of the particle concentration on the higher particle concentration side is improved as compared with the conventional method of determining the concentration under the assumption that the concentration is proportional to the concentration of the generated particles.
  • the luminescent probe relatively binds to the particles when the concentration of the target target particle increases.
  • the measurement of the light intensity in the optical analysis of the scanning molecule counting method is that the mirror deflector 17 is driven during the measurement to move the position of the light detection region in the sample solution (scanning in the sample solution). It may be executed in the same manner as the light intensity measurement step in FCS or FIDA. In the operation process, typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and a light during the movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and a light during the movement of the position of the light detection region).
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanometer mirror) to move the position of the light detection region in the well 10 under the control of the processing operation according to the program of the computer 18.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18.
  • the computer 18 generates and stores time-series light intensity data from the transmitted optical signal in an arbitrary manner.
  • the photodetector 16 is an ultrasensitive photodetector that can detect the arrival of one photon. Therefore, the detection of light is executed in a mode in which the number of photons arriving at the photodetector is measured every predetermined unit time (BINTIME), for example, every 10 ⁇ s, over a predetermined time.
  • the time-series light intensity data may be time-series photon count data.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the moving speed is basically preferably a constant speed, but is not limited to this.
  • the position of the light detection region is moved.
  • the velocity is a random number of particles to be observed (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle, in this embodiment, a target particle that is bound to a fluorescent probe). It is preferably set to a value that is faster than the movement speed, ie, the movement speed due to Brownian movement.
  • the observation target particle of the photoanalysis technique of the scanning molecule counting method is a particle that is dispersed or dissolved in a solution and moves freely at random, the position moves with time by Brownian motion. Therefore, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly in the region as schematically illustrated in FIG. 3A. As a result, the light intensity changes randomly as shown in FIG. 3B (as already mentioned, the excitation light intensity in the light detection region decreases outward with the center of the region as the apex), and the individual observation target particles. It becomes difficult to specify a significant change in light intensity corresponding to. Therefore, preferably, as illustrated in FIG.
  • the moving speed of the position of the light detection region is set to an average moving speed (diffusion moving speed) due to the Brownian motion of the particle so that the particle crosses the light detection region in a substantially straight line. ) Is set faster.
  • the profile of the change in light intensity corresponding to each particle becomes substantially uniform, and the correspondence between each observation target particle and the light intensity is easy. Can be identified.
  • the light intensity change profile is substantially the same as the excitation light intensity distribution.
  • an observation target particle having a diffusion coefficient D (more precisely, a conjugate of a particle and a luminescent probe, or a luminescent probe that is decomposed and released after binding to the particle) has a photodetection region having a radius Wo due to Brownian motion.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to a value sufficiently faster than that with reference to the Vdif.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is approximately 10 times that.
  • the profile of the change in the light intensity by setting the moving speed of the position of the light detection region in various ways is expected (typically, the excitation light intensity distribution).
  • a preliminary experiment for finding a condition that is substantially the same as that described above may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 performs processing according to the program stored in the storage device (light signals from the individual luminescent particles are individually detected from the detected light). Depending on the detection procedure, the following light intensity analysis may be performed.
  • the predetermined range for the threshold value Io and the time width ⁇ for the light intensity is a combination of the observation target particle and the luminescent probe that moves relative to the light detection region at a predetermined speed (or is decomposed after the combination with the particle). It is determined based on the profile assumed as the intensity of light emitted from a free luminescent probe.
  • the specific value may be arbitrarily set experimentally, and is selectively determined according to the characteristics of the conjugate of the observation target particle and the luminescent probe (or the luminescent probe that has been decomposed and released after binding to the particle). May be.
  • I A ⁇ exp ( ⁇ 2t 2 / a 2 ) (4)
  • the intensity A and the width a calculated by fitting the expression (4) to a significant light intensity profile (a profile that can be clearly determined not to be background) are within a predetermined range.
  • the profile of the light intensity corresponds to that one observation target particle has passed through the light detection region, and one observation target particle may be detected.
  • the intensity A and the width a are outside the predetermined range, they may be ignored in the analysis as noise or foreign matter.
  • Counting of observation target particles may be performed by counting the number of particles detected by the above-described detection target particle detection method using an arbitrary method. However, when the number of particles is large, the processing illustrated in FIGS. 5 and 6B may be performed, for example.
  • time-series optical signal data (photon count data) is acquired by performing scanning and photon counting in the sample solution using the light detection region (step 100).
  • the time series optical signal data (FIG. 6B, uppermost “detection result (unprocessed)”) is subjected to smoothing (step 110, upper “smoothing” in FIG. 6B).
  • smoothing (step 110, upper “smoothing” in FIG. 6B).
  • the light emitted from the combination of the particle and the luminescent probe or the light emitted from the luminescent probe is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time.
  • the smoothing process can ignore the missing data values as described above.
  • the smoothing process may be performed by a moving average method, for example.
  • the parameters for executing the smoothing process such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning speed) of the position of the light detection region at the time of optical signal data acquisition.
  • BIN TIME may be set as appropriate.
  • a first-order differential value for the time of the time-series optical signal data after the smoothing process is calculated.
  • the time differential value of the time-series optical signal data has a large change in value at the time when the signal value changes, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. 6B. Therefore, it is possible to advantageously determine the start point and end point of a significant signal (peak signal) by referring to this time differential value.
  • a significant signal is sequentially detected on the time-series optical signal data, and it is determined whether or not the detected peak signal is a signal corresponding to the observation target particle.
  • peak signal a significant signal
  • the start point and the end point of one peak signal are searched and determined, A peak presence region is identified (step 130).
  • the bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series optical signal data in the peak existence region (“bell-shaped function fitting” in the lower part of FIG. 6B).
  • parameters such as the peak intensity Imax, peak width (full width at half maximum) w of the bell-shaped function, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function.
  • the calculated bell-shaped function parameter is assumed as a bell-shaped profile parameter drawn by an optical signal detected when a combination of one particle and the light-emitting probe or the light-emitting probe passes through the light detection region. It is determined whether it is within the range, that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range (step 150).
  • the range that is, whether the peak intensity, the peak width, and the correlation coefficient are each within a predetermined range
  • the calculated bell-shaped function parameter is within an expected range in the optical signal corresponding to the combination of one particle and the luminescent probe or the luminescent probe.
  • the determined signal is determined to be a signal corresponding to one observation target particle. Thereby, one observation target particle is detected and counted as one particle (the number of particles is counted up, step 160).
  • a peak signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the peak signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly executed over the entire area of the time-series optical signal data, and is counted as particles every time one observation target particle is detected.
  • the search for the peak signal in the entire area of the time series optical signal data is completed (step 170)
  • the particle count value obtained so far is set as the number of observation target particles detected in the time series optical signal data.
  • (Iii) Determination of the number density or concentration of the observation target particles
  • the total volume of the region through which the light detection region passes during acquisition of time-series optical signal data is used.
  • the number density or concentration of the particles is determined.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of the excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. Accordingly, it is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution (reference solution) with a known particle concentration, the light intensity measurement, particle detection, and counting described above are performed under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the region through which the light detection region has passed that is, the relationship between the number of detected particles and the concentration is determined from the number of detected particles and the concentration of the reference solution particles. It's okay.
  • the particles of the reference solution are preferably luminescent labels (fluorescent dyes or the like) having the same luminescent properties as the particles formed by the observation target particles and the luminescent probe conjugate (or the luminescent probe released after binding to the observation target particles). It may be. Specifically, for example, assuming that the number of detected particles for a reference solution having a particle concentration C is N, the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed is given by the following equation.
  • Vt N / C (5)
  • a plurality of solutions having different concentrations are prepared as reference solutions, and measurement is performed on each of the solutions.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be.
  • the number density c of the sample solution particles whose particle counting result is n is given by the following equation.
  • c n / Vt (6)
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the optical analyzer of the present embodiment information on the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles (formula (5)) is assumed for the assumed movement pattern of the light detection region.
  • the information stored in advance in the storage device of the computer 18 may be used by the user of the device when the optical analysis is performed.
  • the target particle detection method of the present embodiment is a method for detecting target particles in a biological sample containing pancreatic juice, and detects the target particles labeled by binding with a fluorescent probe by a scanning molecule counting method.
  • the scanning molecule counting method is a measurement method that can measure luminescent particles on a particle-by-particle basis when the molecules are in a discrete state. Therefore, it can measure even relatively low concentrations of luminescent particles below the pM order. Is possible. For this reason, the target particle detection method of this embodiment can count the target particles bound to the fluorescent probe with high sensitivity even when the concentration of the target particles to be analyzed in the sample solution is very low. it can.
  • the wavelength of the optical signal detected from the fluorescent probe bound to the target particle is 600 nm or more.
  • the sample solution contains an autofluorescent substance originally contained in the biological sample.
  • the biological sample containing pancreatic juice contains an autofluorescent substance having a fluorescence wavelength of less than 600 nm.
  • non-specific signal generation by an autofluorescent substance derived from a biological sample including pancreatic juice is detected by detecting an optical signal of 600 nm or more out of the fluorescence emitted from the fluorescent probe bound to the target particle.
  • the fluorescent probe bound to the target particle can be detected with high accuracy.
  • the target particle detection method of the present embodiment includes the following steps (a) to (b).
  • (A) A sample solution containing a biological sample containing pancreatic juice and a fluorescent probe that binds to a target particle is prepared, and the target particle contained in the biological sample and the fluorescent probe are combined in the sample solution A probe binding step,
  • a sample solution containing a biological sample containing pancreatic juice and a fluorescent probe that binds to a target particle is prepared, and the target particle contained in the biological sample and the fluorescent probe are combined in the sample solution A probe binding step
  • step (a) a sample solution containing a biological sample containing pancreatic juice and a fluorescent probe that binds to a target particle is prepared, and in the sample solution, the target particle contained in the biological sample and the A fluorescent probe is bound.
  • Pancreatic juice is a bodily fluid drained from the pancreatic duct.
  • a biological sample containing pancreatic juice means a sample containing a body fluid containing a pancreatic juice-derived component.
  • the body fluid containing the pancreatic juice-derived component include pancreatic fluid collected directly from the pancreas from a catheter, fluid collected from the duodenum (duodenal fluid), and the like.
  • duodenal fluid also includes bile discharged from the nipple, fluid originally present in the duodenum, blood, and the like.
  • pancreatic juice and duodenal juice can be collected by a conventional method.
  • the biological sample containing a pancreatic fluid component may be composed of only a body fluid containing a pancreatic fluid-derived component, or may be a solution obtained by diluting the body fluid with an appropriate buffer or the like. What added various additives to the liquid may be used. Examples of the additive include a surfactant, a degrading enzyme inhibitor, a pH adjuster, a pH indicator and the like for suppressing the decomposition of pancreatic juice-derived components.
  • the target particle is a molecule that is dispersed in the sample solution and moves randomly, and is a target molecule to be detected in the sample solution.
  • target particles include biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, nucleic acid analogs, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate biological objects such as viruses and cells, or non-living objects. And the like (eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.).
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or artificially amplified such as cDNA.
  • Nucleic acid analogues include those in which side chains of natural nucleotides (naturally occurring nucleotides) such as DNA and RNA are modified with functional groups such as amino groups, and labeled with proteins, low molecular compounds, etc. And the like. More specifically, for example, Bridged Nucleic Acid (BNA), nucleotides in which the 4′-position oxygen atom of natural nucleotides is substituted with sulfur atoms, and hydroxyl groups in the 2′-position of natural ribonucleotides are substituted with methoxy groups. Nucleotides, Hexitol Nucleic Acid (HNA), peptide nucleic acid (PNA) and the like.
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • HNA Hexitol Nucleic Acid
  • PNA peptide nucleic acid
  • the fluorescent probe used in the present invention is a substance that binds or adsorbs specifically or non-specifically to a target particle, and is released in a state of being bound to the target particle and a state of being alone.
  • the fluorescent light having a wavelength of 600 nm or more is emitted in a state where the light emission characteristics of the emitted light are different and in combination with the target particles.
  • the fluorescent probe used in the present invention is excited by light having a wavelength of 600 nm or more when bound to the target particle, but is not excited by light having a wavelength of 600 nm or more when present alone.
  • the fluorescent probe used in the present invention is preferably a probe that emits fluorescence with a wavelength of 630 to 1300 nm and more preferably a probe that emits fluorescence with a wavelength of 630 to 820 nm in a state where it is bound to a target particle. .
  • the fluorescence emission characteristics of the fluorescent probe differ between the state bound to the target particle and the state where the target particle is present alone. It means that the strength is different.
  • By differentiating the intensity of light of a specific wavelength between the state in which the fluorescent probe is present alone and the state in which it is bound to the target particle (for example, by making the fluorescence intensity different), both are detected in the scanning molecule counting method. It can be distinguished and detected.
  • the fluorescent probe can be produced, for example, by binding a fluorescent substance to a substance (labeling probe) that specifically or non-specifically binds or adsorbs to the target particle.
  • a fluorescent substance it can be appropriately selected from fluorescent dyes and quantum dots used in FCS, FIDA, and the like.
  • the fluorescent probe is obtained by binding a fluorescent substance to an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, a nucleic acid binding protein bound with a fluorescent substance, or a nucleic acid.
  • a fluorescent substance examples thereof include fluorescent dye molecules that bind.
  • the oligonucleotide may be DNA, RNA, artificially amplified, such as cDNA, and a nucleotide chain or base pair in the same manner as a natural nucleobase.
  • the nucleic acid-like substance capable of forming a part may be included in part or all.
  • the fluorescent probe can be an antigen or antibody against the target particle, or a ligand or receptor labeled with a fluorescent substance labeled with a fluorescent substance.
  • the fluorescent substance can be bound to a substance that specifically or non-specifically binds or adsorbs to target particles such as nucleic acids and proteins by a conventional method.
  • the fluorescent probe used in the present embodiment may bind non-specifically to the target particle, but specifically binds or the like from the viewpoint of target particle detection or quantification accuracy. It is preferable.
  • the fluorescent probe that specifically binds to the target particle may be any probe that binds to the target particle preferentially rather than to other substances having similar physical or chemical properties to the target particle. It does not have to be completely unbound with substances other than particles.
  • the target particle is a nucleic acid
  • the oligonucleotide labeled with a fluorescent substance used as a fluorescent probe may have a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the target particle. It may have a base sequence having a mismatch with the base sequence.
  • the target particle is a protein
  • a dye for example, a fluorescent dye such as a hydrophobic probe ANS, MANS, or TNS
  • the fluorescent probe itself may not emit light.
  • the fluorescent probe is an oligonucleotide that hybridizes with the target particle, and fluorescence that specifically binds to a double-stranded structure in the sample solution together with the fluorescent probe.
  • the luminescence characteristics can be made different between a state where the fluorescent probe is present alone and a state where it is bound to the target particle.
  • the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to the double-stranded structure include a fluorescent intercalator and a groove binder to which a fluorescent substance is bound.
  • a fluorescent probe there is a substance composed of at least two components, and by binding to the target particle, a substance that emits fluorescence by changing the position of the at least two components relative to each other. It may be adopted. Examples of such substances are fluorescent proteins that change structure when bound to a certain particle and emit strong fluorescence, or aggregate when bound to a certain particle to form a fluorescent metal complex. Molecule (ligand of the complex). According to this configuration, in any case, the fluorescent probe alone or the fluorescent probe that is not bound to the target particle emits little light or has a wavelength different from that of the conjugate of the target particle and the fluorescent probe even when the light is emitted. Therefore, it becomes possible to selectively detect light from the conjugate of the target particle and the fluorescent probe.
  • a substance that binds to a target particle includes a fluorescent substance that serves as an energy donor in FRET and a substance that serves as an energy acceptor (fluorescent substance or quenching substance), and FRET occurs when a fluorescent probe is present alone, A fluorescent probe that is bound so that FRET does not occur in the state of binding to the target particle can be used. Since FRET does not occur from the fluorescent probe bound to the target particle, fluorescence is emitted from the fluorescent material serving as an energy donor.
  • fluorescence emitted from a fluorescent substance serving as an energy donor is not detected or attenuated from a fluorescent probe present alone. Therefore, by detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance serving as an energy donor, the target particle bound to the fluorescent probe can be detected separately from the fluorescent probe present alone.
  • an oligonucleotide that forms an intramolecular structure in the state of a single-stranded nucleic acid molecule a fluorescent substance that serves as an energy donor in FRET, and an energy acceptor Beacon probe in which FRET occurs in the state of a single-stranded nucleic acid molecule and so that FRET does not occur in the state of an aggregate formed by hybridizing with another single-stranded nucleic acid molecule can be preferably used as a fluorescent probe.
  • a fluorescent substance serving as an energy donor or a substance serving as an energy acceptor is bound to the 3 ′ end side, one remaining on the 5 ′ end side is bound, and the 3 ′ end side It is preferable to have a base sequence complementary to each other in the region and the 5 ′ end side and to form an intramolecular structure (so-called stem-loop structure) by forming a base pair in these base sequences.
  • the complementary regions forming the intramolecular base pair of the molecular beacon probe may be present so as to sandwich the region that hybridizes with the target particle, and the 3 ′ end region and the 5 ′ end region. Each may be a region containing the 3 ′ end or 5 ′ end, or a region not containing it.
  • the number of bases and the base sequence in the region forming the base pair are lower than the stability of the formed base pair compared to the stability of the aggregate with the target particle, and can form a base pair under measurement conditions. Any degree is acceptable.
  • a fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance that specifically binds to a double-stranded structure is used, and FRET is caused between the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and a fluorescent substance labeled with a fluorescent probe. It is possible to distinguish between a fluorescent probe present alone and a fluorescent probe bound to a target particle. That is, one of the fluorescent double-stranded nucleic acid binding substance and the fluorescent substance that labels the fluorescent probe serves as an FRET energy donor, and the other serves as the FRET energy acceptor. From the fluorescent probe present alone, the fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the fluorescent probe is detected.
  • the fluorescent probe it is preferable to design the fluorescent probe so that the region forming the double strand in the aggregate of the fluorescent probe and the target particle is 400 bp or less.
  • two types of fluorescent probes may be used.
  • two fluorescent probes are designed to hybridize adjacent to each other when the target particle is a nucleic acid or nucleic acid analog, and one fluorescent probe is used as an energy donor in FRET. And the other fluorescent probe is labeled with a substance serving as an energy acceptor in the FRET.
  • FRET does not occur with a fluorescent probe present alone, but by binding to the target particle, the two types of fluorescent probes are close to each other and FRET occurs. For this reason, the target particle couple
  • step (a) first, a sample solution containing a biological sample containing pancreatic juice and a fluorescent probe that binds to target particles is prepared.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not inhibit detection of light emitted from the fluorescent probe bound to the target particle and detection of the fluorescent probe bound to the target particle by the scanning molecule counting method. These can be used by appropriately selecting from buffers generally used in this technical field. Examples of the buffer include a phosphate buffer such as PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), a Tris buffer, and the like.
  • target particles and the fluorescent probe can coexist in the same solution and both can be bound, after preparing the sample solution, simply incubating the sample solution for a predetermined time if necessary.
  • the target particle and the fluorescent probe can be bound in the solution.
  • the target particle or the fluorescent probe is a nucleic acid having a double-stranded structure or a nucleic acid-like substance
  • “denaturing a nucleic acid or a nucleic acid-like substance” means dissociating base pairs.
  • a base pair formed by mutually complementary base sequences in a molecular beacon probe is dissociated and the intramolecular structure is released to form a single-stranded structure, or a double-stranded nucleic acid molecule is converted to a single-stranded nucleic acid molecule. It means to do.
  • the fluorescent probe is an oligonucleotide containing a nucleic acid-like substance such as PNA, even if the target particle is a double-stranded nucleic acid molecule, the association between the fluorescent probe and the target particle is performed without any special denaturation treatment. In some cases, coalescence can be formed.
  • the denaturation treatment examples include denaturation by high temperature treatment (thermal denaturation) and denaturation by low salt concentration treatment.
  • thermal denaturation high temperature treatment
  • low salt concentration treatment it is preferable to perform heat denaturation because the influence on the fluorescent substance is relatively small and the operation is simple.
  • the heat denaturation can denature nucleic acids and the like in the sample solution by subjecting the sample solution to high temperature treatment. Generally, it can be denatured by keeping it at 90 ° C. for DNA and 70 ° C. for RNA for several seconds to 2 minutes, but the temperature for denaturation varies depending on the base length of the target particle. If it can be modified, it is not limited to this temperature.
  • the denaturation by the low salt concentration treatment can be performed by adjusting the salt concentration of the sample solution to be sufficiently low, for example, by diluting with purified water or the like.
  • target particles in the sample solution and fluorescent probes are associated.
  • the temperature of the sample solution is lowered to a temperature at which the target particles and the fluorescent probe can specifically hybridize, thereby appropriately associating both in the sample solution.
  • the salt concentration of the sample solution is increased to a concentration at which the target particle and the fluorescent probe can specifically hybridize by adding a salt solution or the like.
  • the two in the sample solution can be appropriately associated.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can be determined from the melting curve of the aggregate composed of both.
  • the melting curve can be obtained, for example, by changing the temperature of a solution containing only both from a high temperature to a low temperature and measuring the absorbance and fluorescence intensity of the solution. From the obtained melting curve, the temperature ranges from the temperature at which the two denatured single-stranded nucleic acid molecules started to form an aggregate to the temperature at which almost all became an aggregate. It can be set as the temperature which can be soybean.
  • the salt concentration in the solution from a low concentration to a high concentration instead of the temperature, the melting curve is determined in the same manner, and the concentration at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize is determined. Can be sought.
  • the temperature at which two single-stranded nucleic acid molecules can specifically hybridize can generally be substituted with a Tm value (melting temperature).
  • Tm value melting temperature
  • the Tm value 50% of double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA
  • Temperature can be calculated.
  • the temperature of the sample solution in order to suppress non-specific hybridization, it is preferable to lower the temperature of the sample solution relatively slowly when forming an aggregate. For example, after denaturing nucleic acid molecules by setting the temperature of the sample solution to 70 ° C. or higher, the liquid temperature of the sample solution can be lowered at a temperature decrease rate of 0.05 ° C./second or higher.
  • a surfactant such as a surfactant, formamide, dimethyl sulfoxide, urea or the like to the sample solution in advance.
  • These compounds may be added alone or in combination of two or more. By adding these compounds, nonspecific hybridization can be made difficult to occur in a relatively low temperature environment.
  • the number of molecules of target particles existing in the prepared sample solution and bound to the fluorescent probe is counted by a scanning molecule counting method.
  • the sample solution after the target particles are bound to the fluorescent probe is placed in the optical analyzer for the scanning molecule counting method, and the fluorescent probe in a state of being bound to the target particles by the above method.
  • the number of molecules of target particles bound to the fluorescent probe is counted by detecting and analyzing the light emitted from the fluorescent probe.
  • the number of molecules of the target particles bound to the counted fluorescent probe is the number of target particles contained in the measurement sample.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with an optical system of a confocal fluorescence microscope and a photon counting system is used. Time-series photon count data was obtained. At that time, the excitation light was irradiated using a laser beam of 488 nm, 543 nm, 633 nm, or 670 nm at a rotation speed of 6,000 rpm and 300 ⁇ W.
  • BIN TIME was 10 ⁇ s, and the measurement time was 20 seconds.
  • the time series data obtained by the measurement was smoothed by the Savinzky-Golay algorithm, and then the peak was detected by differentiation. Of the regions regarded as peaks, a region that can be approximated to a Gaussian function was extracted as a signal.
  • Table 1 shows the measurement results.
  • the values shown in the column labeled “Buffer” are the results of measuring the Tris buffer.
  • the value shown in the column labeled “pancrease” is the result of measuring a 10-fold diluted solution of a duodenal fluid specimen.
  • the number of peaks was significantly smaller when the excitation light wavelengths were 633 nm and 670 nm than when the excitation light wavelengths were 488 nm and 543 nm. From this result, it was suggested that most of the autofluorescent substances contained in the duodenal fluid specimens are substances that emit fluorescence having a wavelength of less than 600 nm.
  • Example 1 The target particle detection method of the present invention was performed using a sample obtained by adding single-stranded nucleic acid molecules as target particles to the three duodenal fluid samples used in Reference Example 1 as a biological sample containing pancreatic juice.
  • a single-stranded nucleic acid molecule consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was used as the target particle.
  • the nucleic acid is referred to as a target nucleic acid molecule.
  • TAMRA registered trademark
  • BHQ-2 was added to the 3 ′ end.
  • Table 2 shows the base sequences of the target nucleic acid molecule and molecular beacon probe.
  • the underlined bases in the molecular beacon probe are regions that hybridize with each other when forming an intramolecular structure.
  • each duodenal fluid specimen is diluted 10-fold with Tris buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0) so that the final concentration of the target nucleic acid is 100 pM, 10 pM, or 0 pM.
  • Tris buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 400 mM NaCl, pH 8.0
  • molecular beacon probe 1 or molecular beacon probe 2 was added so that the final concentration was 100 pM to prepare a sample solution.
  • the target nucleic acid was added to Tris buffer so that the final concentration was 100 pM, 10 pM, or 0 pM
  • molecular beacon probe 1 or molecular beacon probe 2 was added so that the final concentration was 100 pM.
  • a sample solution was also prepared.
  • Each sample solution is 95 ° C for 10 minutes, 80 ° C for 10 minutes, 70 ° C for 10 minutes, 60 ° C for 10 minutes, 50 ° C for 10 minutes, 40 ° C for 10 minutes, 30 ° C for 10 minutes, 20 ° C.
  • An annealing treatment for 10 minutes was performed to form an aggregate composed of the target nucleic acid molecule A and the nucleic acid probe A.
  • the number of molecules of the aggregate in each sample solution after the temperature lowering treatment was counted by a scanning molecule counting method. Specifically, the measurement was performed in the same manner as in Reference Example 1 except that the excitation light was 633 nm or 670 nm laser light and the measurement time was 5 seconds. Table 3 shows the measurement results. In Table 3, the value shown in the column labeled “Buffer” is the result of measuring a sample solution that does not contain a duodenal fluid specimen. In Table 3, the value shown in the column labeled “pancrease” is the result of measuring a sample solution containing a duodenal fluid specimen.
  • a sample solution containing a duodenal fluid specimen (a specimen containing pancreatic juice), which contains an equal amount of target nucleic acid, does not contain a duodenal juice specimen.
  • a large signal was generated as compared with the solution (reference), and almost the same number of peaks were detected in any sample solution having a target nucleic acid concentration of 100 pM, 10 pM, and 0 pM.
  • a target particle derived from pancreatic juice which is present only at a very low concentration in a sample solution mixed with an autofluorescent substance derived from a biological sample, is highly accurate by a scanning molecular counting method Therefore, the method for detecting a target particle of the present invention can be used particularly in the field of analysis / inspection and the like for analyzing a pancreatic juice-derived component.
  • Optical analyzer confocal microscope
  • Light source 3 Single mode optical fiber
  • Collimator lens 5 Dichroic mirror 6, 7, 11 Reflection mirror 8
  • Objective lens 9
  • Microplate 10 Well (sample solution container)
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 12
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Abstract

　膵液を含む生体試料中の標的粒子を、当該標的粒子の濃度又は数密度が従来の光分析技術よりも低い溶液中で検出する方法を提供する。膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製し、生体試料中の標的粒子と蛍光プローブとを結合させるプローブ結合工程と、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を、走査分子計数法により算出する算出工程とを有する。蛍光プローブが標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とでは、放出される光の発光特性が異なる。蛍光プローブが標的粒子と結合した状態では、波長が６００ｎｍ以上の蛍光が放出される。

Description

膵液を含む生体試料中の標的粒子の検出方法
　本発明は、共焦点顕微鏡や多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、膵液を含む生体試料中の標的粒子を検出する方法に関する。
　本願は、２０１１年８月３０日に、日本に出願された特願２０１１－１８７６０１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出および測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。
　例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１から３参照）に於いては、レーザ共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度が測定される。その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値が決定される。この微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報を取得することができる。さらに、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象も検出することができる。なお、前記微小領域とは、顕微鏡のレーザ光が集光された焦点領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。
　また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon Counting Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成される。そして、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定される。そして、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などを推定することができる。
　更に、特許文献５、６に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献７には、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光を、フォトンカウンティング技術を用いて計測して、フロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術が提案されている。
　特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学及び生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
　医療診断において、体液は臓器の状態を知るための重要な生体試料である。この体液の一種である膵液も膵臓の状態を知るための重要な生体試料であり、細胞診ならびに各種生体分子の測定などの検査や研究に用いられている。例えば、膵液中の腫瘍マーカーを検査することにより、膵臓癌の発症の診断が可能となることが期待できる。
　膵液をはじめとする生体試料中には、通常、多種多様な物質が含まれており、自家蛍光を有する物質が含まれている場合も多い。生体試料中の自家蛍光を利用した検査方法もある。例えば、励起光の照射により病変組織および正常組織から発生する自家蛍光の強度分布に差が生じることを利用して、生体試料から発生する自家蛍光を検出し、この自家蛍光を分析することにより各種疾患に伴う組織性状の変化を識別する診断装置が研究されている。励起光の照射により生体組織から発生する自家蛍光の波長領域の長波長側には、生体の組織性状の違いによって大きく異なる強度を示す波長領域が存在する。しかし、生体組織から発生する自家蛍光の最大強度は、４８０ｎｍ近傍の短波長側の波長領域に存在し、長波長領域の自家蛍光の強度は微弱である。この、微弱な長波長領域の自家蛍光の強度をより正確に検出するために、例えば、特許文献８記載の装置が報告されている。この装置では、生体組織に自家蛍光を発生させる第１の励起光と、この励起光の照射により生体組織から発生する自家蛍光の波長領域の中間波長帯の波長を持つ第２の励起光とを同時に生体組織に照射する。これにより、長波長側の波長領域の自家蛍光の発光強度が高められる。その結果、この長波長側の波長領域の自家蛍光に混入するノイズ成分の割合を相対的に減少させることができる。
　しかしながら、生体試料中の標的粒子を、発光プローブで人為的に標識した後に光分析技術によって検出しようとした場合には、自家蛍光物質をはじめとする生体試料由来の各種夾雑物により、非特異的なシグナルが発生する。そこで、例えば特許文献９には、血液を含む生体試料中の標的粒子を光分析技術によって検出する際に、標的粒子を５５０～１３００ｎｍの赤及び近赤外スペクトルの波長を放射する発色団によって標識して検出する方法が開示されている。標的粒子の検出に５５０～１３００ｎｍの波長領域の光を用いることにより、ヘモグロビンをはじめとする内在性の自家蛍光物質による非特異的なシグナルの発生を抑制することができる。
特開２００５－０９８８７６号公報 特開２００８－２９２３７１号公報 日本国特許第４０２３５２３号公報 国際公開２００８－０８０４１７号公報 特開２００７－２０５６５号公報 特開２００８－１１６４４０号公報 特開平４－３３７４４６号公報 特開２００１－１９８０７９号公報 米国特許出願公開第２００５／０１７１４３４号明細書
金城政孝、蛋白質 核酸 酵素、１９９９年、第４４巻、第９号、第１４３１～１４３８ページ。 メイヤー－アルムス（Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence Correlation Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、第２０４～２２４ページ。 加藤則子、他４名、遺伝子医学、２００２年、第６巻、第２号、第２７１～２７７ページ。
　上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術では、概して述べれば、計測された蛍光強度の時間的なゆらぎの大きさが統計的処理により算出され、そのゆらぎの大きさに基づいて試料溶液中の微小領域内に出入りする蛍光分子等の種々の特性が決定される。従って、上記の光分析技術に於いて有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように調製されていることが好ましい。好適には、上記濃度又は数密度は、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているように調製されていることが好ましい。典型的には、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、蛍光分子等の濃度は、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であることが好ましい。
　換言すれば、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、統計的処理の可能な程度よりも大幅に下回るとき、例えば、１ｎＭを大幅に下回るとき、には、観測対象物が微小領域内に計測時間のうちに稀にしか進入してこない状態が発生する。この場合、蛍光強度の計測結果に於いて、観測対象物が微小領域内に全く存在していない状態が長期間に亘って含まれると共に、有意な蛍光強度の観測量が少なくなる。その結果、上記の如き蛍光強度の統計的なゆらぎに基づく光分析技術では、有意な又は精度の良い分析結果を得ることができなくなる。
　特許文献５、６に記載された共焦点顕微鏡の光学系を用いた蛍光性物質の検出方法では、上記の如き蛍光強度のゆらぎに関する統計的処理を行うことなく、数秒間に亘る計測時間に於ける有意な強度の蛍光信号の発生の有無により、試料中に於ける観測対象となる蛍光分子等の有無が特定できる。その結果、有意な強度の蛍光信号の頻度と試料中の蛍光分子等の粒子数とに相関が得られる。特に、特許文献６では、試料溶液中を攪拌するランダムな流れを発生させると、検出感度が向上することが示唆されている。
　しかしながら、これらの方法も、拡散により又はランダムな流れにより確率的に微小領域内に進入する蛍光分子等の存在を検出している点では、従来の方法と変わりがない。そのため、微小領域内の蛍光分子等の粒子の振る舞いを把握することはできない。また、例えば、粒子のカウンティングや粒子の濃度又は数密度を定量的に算出することもできない。
　特許文献７に記載された技術は、フローサイトメータに於けるフロー中の蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子の存在を個別に検出するものである。この特許文献７記載の技術は、試料溶液中に通常の状態にて溶解又は分散している分子やコロイドなどの粒子、即ち、試料溶液中にてランダムに運動している粒子の検出を行うための技術ではない。したがって、この特許文献７記載の技術では、試料溶液中に溶解又は分散した粒子の濃度又は数密度を定量的に算出することはできない。
　また、特許文献７の技術は、フローサイトメータに於ける計測或いは基板上への蛍光粒子の固定化処理といった過程を含む。そのために、検査に必要な試料量が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術の場合に比して大幅に多くなり、実施者に複雑で高度な操作技術を要求する。
　本発明は、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術にて実行される統計的処理を必要としない、膵液含有生体試料中の標的粒子検出方法を提供することを目的とする。この方法では、観測対象粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨなどの光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い場合でも、新規な光分析技術により、観測対象粒子の状態又は特性を検出することができる。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、以下の知見を得た。試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子を、前記粒子と結合した蛍光プローブから放出される光を指標として間接的に検出する場合、蛍光プローブと結合した粒子の検出を、走査分子計数法を用いて行うことにより、試料溶液中の観測対象の粒子の濃度が非常に低い場合であっても感度よく発光プローブと結合した粒子を検出することができる。膵液を含む生体試料中の標的粒子を検出する場合、標的粒子と結合した蛍光プローブから検出する蛍光の波長を６００ｎｍ以上にすることにより、試料溶液中に膵液由来の自家蛍光物質が含まれている場合であっても、非特異的なシグナルの発生を効果的に抑制しつつ標的粒子を検出できる。本発明者は上述の知見を見出し、本発明を完成させた。
　ここで、走査分子計数法は、日本に出願された特願２０１０－０４４７１４号に於いて提案されている新規な光分析技術である。
　以下に、本発明の態様を示す。
　（１）膵液を含む生体試料中の標的粒子を検出する方法であって、（ａ）膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記生体試料中に含まれている標的粒子と前記蛍光プローブとを結合させるプローブ結合工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する算出工程と、を有し、前記蛍光プローブから放出される光の発生特性が、前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで異なり、かつ、前記標的粒子と結合した状態で放出される光の波長が、６００ｎｍ以上であり、前記工程（ｂ）における、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数の算出を、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記蛍光プローブから放出される光信号を検出して、蛍光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する検出工程と、前記個別に検出された蛍光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の分子数を計数する計数工程と、により行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。
　（２）前記光検出領域の位置を移動する移動工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される前記（１）に記載の標的粒子の検出方法。
　（３）前記光検出領域の位置を移動する移動工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記蛍光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される前記（１）又は（２）に記載の標的粒子の検出方法。
　（４）前記検出された光から、蛍光プローブと結合した個々の標的粒子からの光信号を検出して、前記蛍光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する検出工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、蛍光プローブと結合した１つの標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される前記（１）から（３）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
　（５）前記蛍光プローブから、前記標的粒子と結合した状態で放出される蛍光の波長が６３０ｎｍから１３００ｎｍである前記（１）から（４）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
　（６）前記蛍光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し、且つ前記標的粒子に結合した状態と前記標的粒子に結合していない状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との間の距離が異なり、前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで、前記蛍光プローブから放出される光の発光特性が異なる前記（１）から（５）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
　（７）前記標的粒子が核酸であり、前記蛍光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーとなる蛍光物質及びエネルギー・アクセプターとなる物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸分子である前記（１）から（６）のいずれか一つに記載の標的粒子の検出方法。
　本発明の態様の標的粒子の検出方法（以下、本発明の標的粒子の検出方法と称する）において用いられる走査分子計数法では、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されない。そのため、本発明の標的粒子の検出方法により、解析対象である標的粒子が試料中に極微量にしか存在していない場合であっても、試料中の前記標的粒子を検出することができる。さらに、本発明の標的粒子の検出方法では、標的粒子と結合した蛍光プローブを、走査分子計数法において波長が６００ｎｍ以上の蛍光を光信号として検出することにより、夾雑物として含まれている自家蛍光物質による影響を排除することができる。そして、これらの結果、膵液を含む生体試料中の標的粒子を高精度に検出できる。
走査分子計数法のための光分析装置の内部構造の模式図である。 コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。 ミラー７の向きを変更して試料溶液内において光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 走査分子計数法のための光分析技術による光検出の原理を説明する模式図である。 計測される光強度の時間変化の模式図である。 、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図３Ａに示した状況下での、フォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合のモデル図である。 図４Ａに示した状況下での、フォトンカウント（光強度）の時間変化の例を示す図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 走査分子計数法により計測されたフォトンカウント（光強度）の時間変化から粒子のカウンティングをするための処理手順における検出信号の信号処理工程の例を説明する図である。 図７は、走査分子計数法により計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、ピーク存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
　まず、走査分子計数法について説明する。走査分子計数法では、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）が微小領域内を横切るときに、微小領域中の発光粒子から発せられる光を検出する。これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報を取得することが可能となる。走査分子計数法では、ＦＩＤＡ等のような光分析技術と同様に、測定に必要な試料が微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよい。また、走査分子計数法における、測定時間は短い。しかも、走査分子計数法では、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子について、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
　「試料溶液中に分散しランダムに運動する粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの粒子（発光するもの又は発光しないもののいずれであってもよい。）であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子を意味する。
　発光粒子は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子を意味する。本実施形態の標的粒子の検出方法においては、標的粒子と蛍光プローブとが結合したものが、発光粒子である。
　本実施形態において、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡において光が検出される微小領域である。対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する。この光検出領域は、共焦点顕微鏡においては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。
　走査分子計数法では、試料溶液内において光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している粒子に結合又は会合した発光プローブを包含したときには、発光プローブからの光が検出される。これにより、一つの粒子の存在が検出される（実験の態様によっては、発光プローブは、一旦検出したい粒子（標的粒子）と結合した後、光の検出時には、粒子から解離している場合もあり得る。）。そして、逐次的に検出された光において、発光プローブからの光信号が個別に検出される。これにより、（発光プローブと結合した）粒子の存在が、一つずつ個別に逐次的に検出され、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得される。具体的には、例えば、上記の構成において、個別に検出された粒子を計数して、光検出領域の位置の移動中に検出された粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。上述の構成によれば、粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液、又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、走査分子計数法においては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されている。これにより、光検出領域の移動は速く、且つ、試料溶液において機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しない。そのために、走査分子計数法では、検出対象となる粒子が力学的な作用の影響を受けない安定した状態で、光の計測を行うことが可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、走査分子計数法では、試料溶液を流通させる必要がないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に、微量（１μＬ～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　上記の粒子を個別に検出する工程において、逐次的に検出される光信号から、１つの粒子に結合した発光プローブ（が光検出領域に入ったか否かの判定は、時系列に検出される光信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態において、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する光信号が検出されたときに、１つの粒子に結合した発光プローブが光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。なお本実施形態において、１つの粒子に結合した発光プローブとは、１つの発光プローブが１つの粒子に結合している状態、複数の発光プローブが１つの粒子に結合している状態、及び、実験態様によって１つの粒子に結合した後粒子から解離した発光プローブである状態を含む。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、粒子に結合した発光プローブの特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者において理解される如く、粒子に結合した発光プローブから検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの粒子に結合した発光プローブから得られる光量は低減するので、１つの粒子に結合した発光プローブからの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する工程において、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる粒子に結合した発光プローブ（即ち、本発明の標的粒子の検出方法においては、標的粒子と結合した状態の発光プローブ）の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、走査分子計数法では、光検出領域が１つの粒子に結合した発光プローブの存在位置を通過したときにその発光プローブから発せられる光を検出して、発光プローブを個別に検出する。しかしながら、粒子に結合した発光プローブが溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光プローブから複数回、（検出したい粒子の存在を表す）光信号が検出されてしまい、検出された光信号と１つの検出したい粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を粒子に結合した発光プローブの拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの粒子に結合した発光プローブを、１つの（粒子の存在を表す）光信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、粒子に結合した発光プローブによって変わるので、上記の如く、粒子に結合した発光プローブの特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。本実施形態においては、具体的には、標的粒子と結合した状態の発光プローブの拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるように設定する。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。
　例えば、レーザ走査型光学顕微鏡において採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよい。しかしながら、走査分子計数法においては、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、走査分子計数法の光分析技術は、粒子の数密度又は濃度がＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。
　また、走査分子計数法では、溶液中に分散又は溶解した粒子の各々を個別に検出するようになっている。そのため、その情報を用いて、定量的に、粒子のカウンティングや試料溶液中の粒子の濃度又は数密度の算定又は濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。すなわち、走査分子計数法によれば、光検出領域を通過する粒子と検出された光信号とを１対１に対応させて粒子を一つずつ検出するため、溶液中に分散してランダムに運動する粒子のカウンティングが可能となる。従って、走査分子計数法によれば、従前に比して、精度よく試料溶液中の粒子の濃度又は数密度を決定することが可能となる。実際に、標的粒子と結合した状態の蛍光プローブを個別に検出しその数を計数して粒子濃度を決定する本実施形態の標的粒子の検出方法によれば、試料溶液中の標的粒子と結合した蛍光プローブの濃度が、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測された蛍光強度に基づいて決定可能な濃度よりも更に低い濃度であっても、標的粒子を検出することが可能である。
　更に、光学系の光路を変更して試料溶液中を光検出領域にて走査する態様によれば、試料溶液に対して機械的振動や流体力学的な作用を与えずに、試料溶液内を一様に或いは試料溶液が機械的に安定した状態で観測することになる。これにより、例えば、試料に流れを発生させる場合（流れを与える場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の粒子、発光プローブ若しくは結合体又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）に比して、定量的な検出結果の信頼性が向上する。また、試料溶液中の検出対象となる粒子に対して力学的な作用による影響又はアーティファクトの無い状態で計測が行える。
＜走査分子計数法のための光分析装置の構成＞
　走査分子計数法は、基本的な構成に於いて、図１Ａに模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１Ａを参照して、光分析装置１は、光学系２から１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザ光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ａｐｅｒｔｕｒｅ）にて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１μＬから数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されている。対物レンズ８から出射したレーザ光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である粒子と、前記粒子と結合する発光プローブ、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されている。発光プローブと結合又は会合した粒子（実験の態様によっては、粒子と一旦結合した後に粒子から解離した発光プローブ）が励起領域に進入すると、その間、発光プローブが励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。なお、当業者に於いて知られている如く、上記の構成に於いて、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されている。これにより、図１Ｂに模式的に示されている如きレーザ光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１Ｂに例示されたレーザ光の焦点領域は、通常、１ｆＬから１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となる。実効体積は、光強度が１／ｅ２ となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。また、走査分子計数法では、１つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブからの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。上述の構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
　更に、上記の光分析装置の光学系においては、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する。即ち、試料溶液内において焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。この光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１Ｃに模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。このミラー偏向器１７は、通常のレーザ走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８におけるプログラムにおいて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更することにより、光検出領域の位置が移動するようにすると、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなる。その結果、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
　粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２から５が省略されてよい。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブがりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１においては、図１Ａの如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブを励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが含まれている場合に、それらからの光を波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
＜走査分子計数法の光分析技術の原理＞
　ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定される。精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、有意な光強度（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算において、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。これに対して、走査分子計数法では、観測対象粒子の濃度がＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出が可能である。
　走査分子計数法の光分析技術において、実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２Ａにて模式的に描かれているように、試料溶液内において光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。
そうすると、例えば、図２Ａの如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０からｔ２）において１つの粒子（図中、発光プローブとして蛍光色素が結合している。）の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、図２Ｂに描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）が検出されることとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２Ｂに例示されている如き有意な光強度を一つずつ検出する。これによって、発光プローブの結合した粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できる。この走査分子計数法の光分析技術の原理においては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き、統計的な演算処理は行われず、粒子が一つずつ検出される。これにより、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能であることは理解されるべきである。
　また、走査分子計数法のように、試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光分光光度計やプレートリーダーにより計測される蛍光強度から蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合よりも、より低い濃度まで測定することが可能である。蛍光分光光度計やプレートリーダーによって或る蛍光標識された粒子の濃度を測定する場合、通常、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例すると仮定される。しかしながら、その場合、蛍光標識された粒子の濃度が十分に低くなると、蛍光標識された粒子から発せられた光による信号の量に対するノイズ信号の量が大きくなり（Ｓ／Ｎ比の悪化）、蛍光標識された粒子の濃度と光信号量との間の比例関係が崩れる。その結果、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、検出結果からノイズ信号が排除され、個々の粒子に対応する信号のみを計数して濃度を算出する。これにより、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも低い濃度まで検出できる。
　更にまた、観測対象粒子の１つに複数の発光プローブが結合する場合には、走査分子計数法のように試料溶液中の粒子を個別に検出し計数する方法によれば、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定の下に濃度を決定する従前の方法よりも、粒子濃度の高い側での粒子濃度の測定精度も向上する。観測対象粒子の一つに複数の発光プローブが結合する場合で或る量の発光プローブが試料溶液に添加されているとき、観測対象粒子の濃度が高くなると、相対的に粒子に結合する発光プローブの数が低減する。その場合、一つの観測対象粒子当たりの蛍光強度が低減するために、蛍光標識された粒子の濃度と光量との間の比例関係が崩れ、決定される濃度値の精度が悪化する。他方、走査分子計数法では、検出された光信号から個々の粒子に対応する信号を検出する工程で、一つの粒子当たりの蛍光強度の低減の影響は少なく、粒子数から濃度を算出するそのため、蛍光強度が蛍光標識された粒子の濃度に比例するとの仮定により濃度を検出する場合よりも高い濃度まで検出できる。
＜走査分子計数法による試料溶液の光強度の測定＞
　走査分子計数法の光分析における光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、ＦＣＳ又はＦＩＤＡにおける光強度の測定工程と同様の態様にて実行されてよい。操作処理において、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力する。続いて、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内において光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域における励起光の照射及び光強度の計測を開始する。この計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７は、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内において光検出領域の位置の移動を実行する。これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信する。コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された光信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器である。よって、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された観測対象粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるそのため、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となる。よって、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、計測された時系列の光強度データからの観測対象粒子の個別の検出、或いは、観測対象粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、光検出領域の位置の移動速度は、観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ、本実施形態においては、蛍光プローブと結合した標的粒子）のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。走査分子計数法の光分析技術の観測対象粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間とともに移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図３Ａに模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動する。これにより、光強度が図３Ｂの如くランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の観測対象粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。
　そこで、好適には、図４Ａに描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切るよう、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。これにより、時系列の光強度データにおいて、図４Ｂに例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり、個々の観測対象粒子と光強度との対応が容易に特定できる。粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する観測対象粒子（より厳密には、粒子と発光プローブとの結合体又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２ ＝６Ｄ・Δｔ　　　（１）
から、以下のように示される。
Δｔ＝（２Ｗｏ）２ ／６Ｄ　　　（２）
　従って、観測対象粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、以下のように示される。
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　（３）
　そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、観測対象粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２ ／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ ｍ／ｓとなるの。従って、光検出領域の位置の移動速度は、その略１０倍の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、観測対象粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
＜走査分子計数法による光強度の分析＞
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８において、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理（検出された光から個々の発光粒子からの光信号を個別に検出する手順）により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データにおいて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図４Ａに示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する光強度の変化は、図６Ａに模式的に描かれている如く、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映したプロファイル（通常、略釣鐘状）を有する。そこで、観測対象粒子の検出の一つの手法において、光強度に対して閾値Ｉｏが設定され、その閾値を超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されるようになっていてよい。光強度に対する閾値Ｉｏ及び時間幅Δτに対する所定の範囲は、光検出領域に対して所定の速度にて相対的に移動する観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）から発せられる光の強度として想定されるプロファイルに基づいて定められる。その具体的な値は、実験的に任意に設定されてよく、また、観測対象粒子と発光プローブとの結合体（又は粒子との結合後分解され遊離した発光プローブ）の特性によって選択的に決定されてよい。
　また、観測対象粒子の検出の別の手法として、光検出領域の光強度分布が、
ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２ ／ａ２ ） 　　　（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの観測対象粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの観測対象粒子の検出が為されてよい。強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析において無視されてよい。
（ii）観測対象粒子のカウンティング
　観測対象粒子のカウンティングは、上記の観測対象粒子の検出の手法により検出された粒子の数を、任意の手法により、計数することにより為されてよい。しかしながら、粒子の数が大きい場合には、例えば、図５及び図６Ｂに例示された処理により為されてよい。
　図５及び図６Ｂを参照して、時系列の光強度（フォトンカウント）データから粒子のカウンティングを行う手法の一つの例は、上記に説明された光強度の測定である。即ち、光検出領域による試料溶液内の走査及びフォトンカウンティングを行って時系列光信号データ（フォトンカウントデータ）を取得する（ステップ１００）。この時系列光信号データ（図６Ｂ、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（ステップ１１０、図６Ｂ中上段「スムージング」）。粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブの発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間においてデータ値の欠落が生じ得る。そのため、このスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法において一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光信号データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光信号データにおいて、有意な信号が存在する時間領域（ピーク存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光信号データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光信号データの時間微分値は、図６Ｂ中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点における値の変化が大きくなる。そのため、この時間微分値を参照することによって、有意な信号（ピーク信号）の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光信号データ上において、逐次的に、有意な信号（ピーク信号）を検出し、検出されたピーク信号が観測対象粒子に対応する信号であるか否かが判定される。
　具体的には、まず、時系列光信号データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのピーク信号の始点と終点とが探索され決定され、ピーク存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのピーク存在領域が特定されると、そのピーク存在領域におけるスムージングされた時系列光信号データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われる（図６Ｂ下段「釣鐘型関数フィッティング」）。これにより、釣鐘型関数のピーク強度Ｉｍａｘ、ピーク幅（半値全幅）ｗ、フィッティングにおける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブが光検出領域を通過したときに検出される光信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、ピーク強度、ピーク幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図７左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの粒子及び発光プローブの結合体又は発光プローブに対応する光信号おいて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの観測対象粒子に対応する信号であると判定される。これにより、一つの観測対象粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図７右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったピーク信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０から１６０の処理におけるピーク信号の探索及び判定は、時系列光信号データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの観測対象粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光信号データの全域のピーク信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光信号データにおいて検出された観測対象粒子の数とされる。
（iii）観測対象粒子の数密度又は濃度の決定
　観測対象粒子のカウンティングが為されると、時系列光信号データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて、観測対象粒子の数密度又は濃度が決定される。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難である。従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された粒子の数と参照溶液の粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、観測対象粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。
参照溶液の粒子としては、好ましくは、観測対象粒子が形成する粒子及び発光プローブ結合体（又は観測対象粒子に結合後遊離した発光プローブ）と同様の発光特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、粒子の濃度Ｃの参照溶液について、その粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、以下の式で与えられる。
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　（５）
　また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の粒子の数密度ｃは、以下の式で与えられる。
ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　（６）
　なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置においては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
＜標的粒子の検出方法＞
　本実施形態の標的粒子の検出方法は、膵液を含む生体試料中の標的粒子を検出する方法であって、蛍光プローブと結合させて標識した標的粒子を走査分子計数法によって検出する。
　走査分子計数法は、分子が離散的な状況において、発光粒子を一粒子毎に測定することができる測定方法であることから、ｐＭオーダー以下の比較的低濃度の発光粒子に対しても測定が可能である。このため、本実施形態の標的粒子の検出方法により、試料溶液中の解析対象の標的粒子の濃度が非常に低い場合であっても、蛍光プローブと結合した標的粒子を高感度に計数することができる。
　さらに、本実施形態の標的粒子の検出方法は、走査分子計数法による測定において、標的粒子と結合した蛍光プローブから検出する光信号の波長が６００ｎｍ以上である。試料溶液中には、生体試料中に元々含まれていた自家蛍光物質が含まれる場合が多く、特に膵液を含む生体試料中には、蛍光波長が６００ｎｍ未満である自家蛍光物質が含まれている。本実施形態においては、標的粒子と結合した蛍光プローブから放出される蛍光のうち、６００ｎｍ以上の光信号を検出することにより、膵液を含む生体試料由来の自家蛍光物質による非特異的なシグナルの発生を抑制し、標的粒子と結合した蛍光プローブを高精度に検出することができる。
　具体的には、本実施形態の標的粒子の検出方法は、下記工程（ａ）から（ｂ）を有する。
（ａ）膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記生体試料中に含まれている標的粒子と前記蛍光プローブとを結合させるプローブ結合工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する算出工程。
　以下、工程ごとに説明する。
　まず、工程（ａ）として、膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記生体試料中に含まれている標的粒子と前記蛍光プローブとを結合させる。
　膵液とは、膵管から排出される体液である。本発明及び本願明細書において、膵液を含む生体試料とは、膵液由来成分が含まれている体液を含む試料を意味する。膵液由来成分が含まれている体液としては、例えば、膵臓から直接カテーテルから採取された膵液、十二指腸で採取した液（十二指腸液）等が挙げられる。十二指腸液には、膵液に加えて、同じく乳頭部より排出された胆汁や元々十二指腸に存在している液、血液等も含まれている。なお、膵液や十二指腸液は、常法により採取することができる。膵液成分を含む生体試料としては、膵液由来成分が含まれている体液のみからなるものであってもよく、前記体液を適当なバッファー等で希釈した液であってもよく、前記体液又はその希釈液に、各種添加剤を添加したものであってもよい。添加剤としては、膵液由来成分の分解等を抑制するための界面活性剤や分解酵素抑制剤、ｐＨ調整剤、ｐＨ指示薬等が挙げられる。
　標的粒子は、試料溶液中にて分散しランダムに運動する分子であって、前記試料溶液中の検出する目的の分子である。標的粒子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、核酸類似物質、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物又は非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）等が挙げられる。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよい。核酸類似物質としては、ＤＮＡやＲＮＡのような天然型ヌクレオチド（天然に存在するヌクレオチド）の側鎖等がアミノ基等の官能基により修飾されたものや、タンパク質や低分子化合物等で標識されたもの等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。
　また、本発明において用いられる蛍光プローブは、標的粒子と、特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質であって、標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とにおいて、放出される光の発光特性が異なり、かつ標的粒子と結合した状態で、波長が６００ｎｍ以上の蛍光を放出する。本発明において用いられる蛍光プローブは、標的粒子と結合した状態では６００ｎｍ以上の波長の光によって励起されるが、単独で存在している状態では６００ｎｍ以上の波長の光で励起されないものであってもよく、標的粒子と結合した状態と単独で存在している状態の両方において、６００ｎｍ以上の波長の光で励起されるものであってもよい。本発明において用いられる蛍光プローブとしては、標的粒子と結合した状態で、波長が６３０から１３００ｎｍの蛍光を放出するプローブであることが好ましく、６３０から８２０ｎｍの蛍光を放出するプローブであることがより好ましい。
　標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とにおいて、蛍光プローブの発光特性が異なるとは、標的粒子に結合した状態と単独で存在している状態とで、特定の波長の光の強度が異なることを意味する。蛍光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、特定の波長の光の強度を異ならせる（例えば、蛍光強度を異ならせる）ことにより、走査分子計数法において両者を区別して検出することができる。
　蛍光プローブは、例えば、標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質（標識用プローブ）に、蛍光物質を結合させることによって製造することができる。蛍光物質としては、ＦＣＳやＦＩＤＡ等で使用されている蛍光色素や量子ドット等の中から適宜選択して用いることができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブは、標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに蛍光物質を結合させたもの、蛍光物質を結合させた核酸結合性タンパク質、核酸に結合する蛍光色素分子等が挙げられる。前記オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ｃＤＮＡのように、人工的に増幅させたものであってもよく、天然の核酸塩基と同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質を一部又は全部に含むものであってもよい。
　また、標的粒子がタンパク質である場合には、蛍光プローブとしては、標的粒子に対する抗原若しくは抗体、標的粒子に対するリガンド若しくはレセプターを蛍光物質で標識したものを用いることができる。なお、核酸やタンパク質等の標的粒子と特異的又は非特異的に結合又は吸着する物質への蛍光物質の結合は、常法により行うことができる。
　本実施形態において用いられる蛍光プローブは、標的粒子と非特異的に結合等するものであってもよいが、標的粒子の検出や定量の精度の点からは、特異的に結合等するものであることが好ましい。なお、標的粒子と特異的に結合する蛍光プローブとしては、物理的又は化学的性質が標的粒子と類似した他の物質に対する結合よりも、標的粒子と優先的に結合するものであればよく、標的粒子以外の物質と全く結合しないものである必要はない。例えば、標的粒子が核酸である場合には、蛍光プローブとして用いる蛍光物質で標識したオリゴヌクレオチドは、前記標的粒子の塩基配列と完全に相補的な塩基配列を有していてもよく、前記標的粒子の塩基配列とミスマッチを有する塩基配列を有していてもよい。
　標的粒子がタンパク質である場合には、タンパク質と結合して周囲環境が変化することにより蛍光強度や蛍光波長が変化する色素（例えば、疎水性プローブＡＮＳ、ＭＡＮＳ、ＴＮＳといった蛍光色素）を、蛍光プローブとして用いることができる。また、蛍光プローブは、それ自体が発光していなくてもよい。例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、蛍光プローブを前記標的粒子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとし、試料溶液中に前記蛍光プローブとともに、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を添加することによっても、蛍光プローブが単独で存在している状態と、標的粒子と結合した状態とで、発光特性を異ならせることができる。２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質としては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質を結合させたグルーブバインダー等が挙げられる。
　その他にも、例えば、蛍光プローブとして、少なくとも二つの構成要素から成る物質であって、標的粒子に結合することにより、前記の少なくとも二つの構成要素の互いの位置が変化して蛍光を発する物質が採用されてもよい。そのような物質の例としては、或る粒子に結合すると、構造変化して強い蛍光を放出するようになる蛍光性タンパク質や、或る粒子に結合すると、集合して蛍光性金属錯体を形成する分子（錯体の配位子）が挙げられる。この構成によれば、いずれの場合も、蛍光プローブ単体若しくは標的粒子に結合していない蛍光プローブは、殆ど発光しないか、発光しても、標的粒子及び蛍光プローブの結合体と波長が異なる。そのため、標的粒子及び蛍光プローブの結合体からの光を選択的に検出することが可能となる。
　また、蛍光エネルギー移動現象（ＦＲＥＴ）を利用することにより、試料溶液中に於いて単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子に結合した状態である蛍光プローブとの発光特性を異ならせることができる。例えば、標的粒子と結合する物質に、ＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質及びエネルギー・アクセプターと成る物質（蛍光物質や消光物質）を、蛍光プローブが単独で存在している状態ではＦＲＥＴが生じ、標的粒子と結合した状態ではＦＲＥＴが生じなくなるように結合させたものを、蛍光プローブとして用いることができる。標的粒子と結合した蛍光プローブからは、ＦＲＥＴが起こらないため、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から蛍光が放出される。一方で、単独で存在している蛍光プローブからは、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光は検出されないか、もしくは減弱している。そこで、エネルギー・ドナーと成る蛍光物質から放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を、単独で存在している蛍光プローブと区別して検出することができる。
　例えば、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合には、１本鎖核酸分子の状態の際に分子内構造体を形成するオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴにおいてエネルギー・ドナーと成る蛍光物質とエネルギー・アクセプターと成る物質とを、１本鎖核酸分子の状態ではＦＲＥＴが起こり、他の１本鎖核酸分子とハイブリダイズして形成された会合体の状態ではＦＲＥＴが起こらないように結合させた分子ビーコンプローブを、蛍光プローブとして好ましく用いることができる。本実施形態においては、３’末端側にエネルギー・ドナーと成る蛍光物質又はエネルギー・アクセプターと成る物質が結合されており、５’末端側に残る一方が結合されており、かつ３’末端側の領域と５’末端側とに互いに相補的な塩基配列を有し、これらの塩基配列において塩基対を形成することによって、分子内構造体（いわゆるステム－ループ構造）を形成するものが好ましい。なお、分子ビーコンプローブの分子内塩基対を形成する互いに相補的な領域は、標的粒子とハイブリダイズする領域を挟むようにして存在していればよく、３’末端側の領域及び５’末端側の領域は、それぞれ、３’末端又は５’末端を含んでいる領域であってもよく、含まない領域であってもよい。また、塩基対を形成する領域の塩基数や塩基配列は、形成された塩基対の安定性が、標的粒子との会合体の安定性よりも低く、且つ測定条件下で塩基対を形成し得る程度であればよい。
　また、２本鎖構造に特異的に結合する蛍光性２本鎖核酸結合物質を用い、前記蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識した蛍光物質との間にＦＲＥＴを起こすことによっても、単独で存在している蛍光プローブと、標的粒子と結合している蛍光プローブとを区別することができる。すなわち、蛍光性２本鎖核酸結合物質と蛍光プローブを標識する蛍光物質のいずれか一方がＦＲＥＴのエネルギー・ドナーと成り、他方が前記ＦＲＥＴのエネルギー・アクセプターと成る。単独で存在している蛍光プローブからは、前記蛍光プローブを標識する蛍光物質から放出される蛍光が検出される。これに対して、標的粒子と結合している蛍光プローブには蛍光性２本鎖核酸結合物質が結合するため、結合体からは、ＦＲＥＴにより放出される蛍光が検出される結果、単独で存在している蛍光プローブとは区別して検出することができる。
　なお、蛍光プローブと標的粒子との会合体の塩基対の間に入り込む蛍光性インターカレーターの量が多すぎる場合には、ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出する際のバックグラウンドが高くなりすぎ、検出精度に影響を及ぼすおそれがある。このため、蛍光プローブと標的粒子との会合体中の２本鎖を形成している領域が、４００ｂｐ以下となるように、蛍光プローブを設計することが好ましい。
　その他、本実施形態においては、蛍光プローブを２種類使用してもよい。例えば、２種類の蛍光プローブを、標的粒子が核酸又は核酸類似物質である場合に、標的粒子に対して互いに隣接してハイブリダイズするように設計し、一方の蛍光プローブをＦＲＥＴにおけるエネルギー・ドナーと成る蛍光物質で標識し、他方の蛍光プローブを前記ＦＲＥＴにおけるエネルギー・アクセプターと成る物質で標識させる。この場合、単独で存在している蛍光プローブではＦＲＥＴは起こらないが、標的粒子に結合することにより、前記２種類の蛍光プローブは互いに近接し、ＦＲＥＴが起こる。このため、当該ＦＲＥＴにより放出される蛍光を検出することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子を検出することができる。
　具体的には、工程（ａ）では、まず、膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製する。この溶媒は、標的粒子と結合した蛍光プローブから放出される光の検出、及び、走査分子計数法による標的粒子と結合した蛍光プローブの検出を阻害しない溶媒であれば、特に限定されるものではなく、本技術分野において一般的に用いられているバッファーの中から、適宜選択して用いることができる。このバッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。
　標的粒子と蛍光プローブを同じ溶液中に共存させるだけで、両者を結合させることができる場合には、試料溶液を調製した後、必要に応じて所定時間前記試料溶液をインキュベートするだけで、前記試料溶液中で、標的粒子と蛍光プローブとを結合させることができる。
　一方で、標的粒子や蛍光プローブが二本鎖構造の核酸又は核酸類似物質である場合には、試料溶液中の核酸等を変性させた後、両者を会合させることが好ましい。なお、「核酸又は核酸類似物質を変性させる」とは、塩基対を解離させることを意味する。例えば、分子ビーコンプローブ中の互いに相補的な塩基配列によって形成された塩基対を解離させ、分子内構造を解いて１本鎖構造にすることや、２本鎖核酸分子を１本鎖核酸分子とすることを意味する。蛍光プローブがＰＮＡ等の核酸類似物質を含むオリゴヌクレオチドである場合、標的粒子が二本鎖核酸分子であったとしても、特段の変性処理を行わずとも、前記蛍光プローブと標的粒子とからなる会合体を形成することができる場合がある。
　変性処理としては、高温処理による変性（熱変性）又は低塩濃度処理による変性等が挙げられる。中でも、蛍光物質への影響が比較的小さく、操作が簡便であるため、熱変性を行うことが好ましい。具体的には、熱変性は、前記試料溶液を、高温処理をすることにより、前記試料溶液中の核酸等を変性することができる。一般的には、ＤＮＡで９０℃、ＲＮＡでは７０℃で数秒間から２分間程度、保温することによって変性させることができるが、標的粒子の塩基の長さ等により変性する温度は千差万別であり、変性することが可能であれば、この温度に限定するものではない。一方、低塩濃度処理による変性は、例えば、精製水等により希釈することによって、前記試料溶液の塩濃度が十分に低くなるように調整することによって行うことができる。
　必要に応じて変性させた後、前記試料溶液中の標的粒子と蛍光プローブを会合させる。
　熱変性を行った場合には、高温処理後、前記試料溶液の温度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる温度にまで低下させることにより、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。また、低塩濃度処理による変性を行った場合には、塩溶液を添加する等により、前記試料溶液の塩濃度を、標的粒子と蛍光プローブとが特異的にハイブリダイズできる濃度にまで上昇させることによって、前記試料溶液中の両者を適宜会合させることができる。
　なお、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、両者からなる会合体の融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、両者のみを含有する溶液の温度を、高温から低温へと変化させ、前記溶液の吸光度や蛍光強度を測定することにより求めることができる。得られた融解曲線から、変性した２本の１本鎖核酸分子が会合体を形成し始めた温度から、ほぼ全てが会合体となった温度までの範囲の温度を、両者が特異的にハイブリダイズできる温度とすることができる。温度に代えて、溶液中の塩濃度を低濃度から高濃度への変化させることによっても、同様にして融解曲線を決定し、２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる濃度を求めることができる。
　２本の１本鎖核酸分子が特異的にハイブリダイズできる温度は、一般にはＴｍ値（融解温度）で代用することができる。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、蛍光プローブの塩基配列情報から、標的粒子とハイブリダイズする領域のＴｍ値（２本鎖ＤＮＡの５０％が１本鎖ＤＮＡに解離する温度）を算出することができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、会合体形成させる際に、試料溶液の温度を比較的ゆっくりと低下させることが好ましい。例えば、試料溶液の温度を７０℃以上にして核酸分子を変性させた後、前記試料溶液の液温を、０．０５℃／秒以上の降温速度で低下させることができる。
　また、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するために、予め試料溶液中に、界面活性剤、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又は尿素等を添加しておくことも好ましい。これらの化合物は、１種のみを添加してもよく、２種類以上を組み合わせて添加してもよい。これらの化合物を添加しておくことにより、比較的低い温度環境下において、非特異的なハイブリダイゼーションを起こりにくくすることができる。
　その後、工程（ｂ）として、調製された試料溶液中に存在する、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を、走査分子計数法により計数する。具体的には、標的粒子を蛍光プローブと結合させた後の試料溶液を、前記の走査分子計数法のための光分析装置に設置し、前記の手法により、標的粒子と結合した状態の蛍光プローブから放出される光を検出し解析することにより、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を計数する。計数された蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数が、測定試料中に含まれている標的粒子の数である。
　次に実施例等を示して本発明の態様をさらに詳細に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
　３人の被験者から採取された十二指腸液中に存在する自家蛍光物質を、検出波長で走査分子計数法により測定した。
　使用した３つの十二指腸液検体のうち、１つは薄赤色であり、１つは比較的強い黄色であり、残る１つは非常に薄い黄色であった。色の違いから、これらの十二指腸液検体は、含まれている自家蛍光物質の種類及び量が大きく相違すると推察された。
　１０μＬの各十二指腸液検体をトリス緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で１０倍希釈した液を試料溶液とし、各試料溶液を、４８８ｎｍから６７０ｎｍの励起光を用いて走査分子計数法により測定した。また、トリス緩衝液を、リファレンスとして走査分子計数法により同様に測定した。
　具体的には、計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は４８８ｎｍ、５４３ｎｍ、６３３ｎｍ、又は６７０ｎｍのレーザ光を用いて、回転速度６，０００ｒｐｍ、３００μＷで照射した。アバランシェフォトダイオードから得られるシグナルを、ＢＩＮ ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は２０秒間とした。
　測定によって得られた時系列データをＳａｖｉｎｚｋｙ－Ｇｏｌａｙのアルゴリズムでスムージングした後、微分によりピークの検出を行った。ピークとみなされた領域のうち、ガウス関数に近似できる領域をシグナルとして抽出した。
　測定結果を表１に示す。表１中、「Ｂｕｆｆｅｒ」と表記された列に示された値は、トリス緩衝液を測定した結果である。表１中、「ｐａｎｃｒｅａｓｅ」と表記された列に示された値は、十二指腸液検体の１０倍希釈液を測定した結果である。この結果、トリス緩衝液と十二指腸液検体希釈液のいずれにおいても、励起光波長が４８８ｎｍ及び５４３ｎｍの場合と比べて、励起光波長が６３３ｎｍ及び６７０ｎｍの場合には、顕著にピーク数が少なかった。この結果から、十二指腸液検体中に含まれている自家蛍光物質の大部分が、波長が６００ｎｍ未満の蛍光を発する物質であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例１］
　参考例１で用いた３つの十二指腸液検体に一本鎖核酸分子を標的粒子として添加したものを、膵液を含む生体試料とし、本発明の標的粒子の検出方法を行った。
　標的粒子として、配列番号１で表される塩基配列からなる一本鎖核酸分子を用いた。以下、本実施例においては、前記核酸を標的核酸分子という。また、前記標的核酸と結合する発光プローブとして、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）が付加され、３’末端にＢＨＱ－２が付加された分子ビーコンプローブ１、又は配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの５’末端にＡＴＴＯ（登録商標）６４７Ｎが付加され、３’末端にＢＨＱ－２が付加された分子ビーコンプローブ２を用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。標的核酸分子及び分子ビーコンプローブの塩基配列を表２に示す。表２において、分子ビーコンプローブ中の下線が付された塩基は、分子内構造体を形成する際に互いにハイブリダイズする領域である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　１０μＬの各十二指腸液検体をトリス緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，４００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で１０倍希釈した液に、標的核酸を最終濃度が１００ｐＭ、１０ｐＭ、又は０ｐＭとなるように添加し、さらに分子ビーコンプローブ１又は分子ビーコンプローブ２を最終濃度が１００ｐＭとなるように添加して試料溶液を調製した。また、リファレンスとして、トリス緩衝液に、標的核酸を最終濃度が１００ｐＭ、１０ｐＭ、又は０ｐＭとなるように添加し、さらに分子ビーコンプローブ１又は分子ビーコンプローブ２を最終濃度が１００ｐＭとなるように添加した試料溶液も調製した。
　各試料溶液を、９５℃で１０分間、８０℃で１０分間、７０℃で１０分間、６０℃で１０分間、５０℃で１０分間、４０℃で１０分間、３０℃で１０分間、２０℃で１０分間のアニーリング処理し、標的核酸分子Ａと核酸プローブＡとからなる会合体を形成した。
　降温処理後の各試料溶液中の会合体の分子数を、走査分子計数法により計数した。具体的には、励起光を６３３ｎｍ又は６７０ｎｍのレーザ光を用い、測定時間を５秒間とした以外は、参考例１と同様にして測定した。測定結果を表３に示す。表３中、「Ｂｕｆｆｅｒ」と表記されている列に示された値は、十二指腸液検体を含まない試料溶液を測定した結果である。表３中、「ｐａｎｃｒｅａｓｅ」と表記されている列に示された値は、十二指腸液検体を含む試料溶液を測定した結果である。この結果、励起波長５４３ｎｍで計測した場合には、等量の標的核酸が含まれているにもかかわらず、十二指腸液検体（膵液を含む検体）を含む試料溶液では、十二指腸液検体を含まない試料溶液（リファレンス）と比べて大きなシグナルが発生し、かつ、標的核酸の濃度が１００ｐＭ、１０ｐＭ、及び０ｐＭのいずれの試料溶液においても、ほぼ同程度の数のピークが検出された。一方、励起波長６３３ｎｍで計測した場合には、十二指腸液検体（膵液を含む検体）を含む試料溶液では、十二指腸液検体を含まない試料溶液（リファレンス）とほぼ同程度の数のピークが検出された。これらの結果から、励起波長５４３ｎｍで計測した場合には、おそらくは十二指腸液検体由来の自家蛍光物質の影響により非特異的なピークが多く発生してしまうが、励起波長６３３ｎｍで計測することにより、非特異的なピークの発生を抑え、より正確に標的粒子を検出し得ることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の標的粒子の検出方法により、生体試料由来の自家蛍光物質が混入している試料溶液中で、非常に低濃度にしか存在していない膵液由来の標的粒子を走査分子計数法により高精度に検出することができるため、本発明の標的粒子の検出方法は、特に膵液由来成分を解析対象とする解析・検査等の分野で利用が可能である。
　１　　光分析装置（共焦点顕微鏡）
　２　　光源
　３　　シングルモードオプティカルファイバー
　４　　コリメータレンズ
　５　　ダイクロイックミラー
　６、７、１１　　反射ミラー
　８　　対物レンズ
　９　　マイクロプレート
　１０　　ウェル（試料溶液容器）
　１２　　コンデンサーレンズ
　１３　　ピンホール
　１４　　バリアフィルター
　１５　　マルチモードオプティカルファイバー
　１６　　光検出器
　１７　　ミラー偏向器
　１７ａ　　ステージ位置変更装置
　１８　　コンピュータ

Claims (7)

  1. 　膵液を含む生体試料中の標的粒子を検出する方法であって、
    　（ａ）膵液を含む生体試料と、標的粒子に結合する蛍光プローブとを含む試料溶液を調製し、前記試料溶液中で、前記生体試料中に含まれている標的粒子と前記蛍光プローブとを結合させるプローブ結合工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）において調製された試料溶液中に存在する、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数を算出する算出工程と、を有し、
    　前記蛍光プローブから放出される光の発生特性が、前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで異なり、かつ、前記標的粒子と結合した状態で放出される光の波長が、６００ｎｍ以上であり、
    　前記工程（ｂ）における、蛍光プローブと結合した標的粒子の分子数の算出を、
    　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動する移動工程と、
    　前記試料溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、前記光検出領域中の前記標的粒子と結合した状態の前記蛍光プローブから放出される光信号を検出して、蛍光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する検出工程と、
    　前記個別に検出された蛍光プローブと結合した標的粒子の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記標的粒子の分子数を計数する計数工程と、により行うことを特徴とする標的粒子の検出方法。
  2. 　前記光検出領域の位置を移動する移動工程に於いて、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動される請求項１に記載の標的粒子の検出方法。
  3. 　前記光検出領域の位置を移動する移動工程に於いて、前記光検出領域の位置が、前記蛍光プローブと結合した標的粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される請求項１又は２に記載の標的粒子の検出方法。
  4. 　前記検出された光から、蛍光プローブと結合した個々の標的粒子からの光信号を検出して、前記蛍光プローブと結合した標的粒子を個別に検出する検出工程に於いて、検出された時系列の光信号の形状に基づいて、蛍光プローブと結合した１つの標的粒子が前記光検出領域に入ったことが検出される請求項１から３のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  5. 　前記蛍光プローブから、前記標的粒子と結合した状態で放出される蛍光の波長が６３０ｎｍから１３００ｎｍである請求項１から４のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  6. 　前記蛍光プローブが、互いに近接しているときに蛍光エネルギー移動現象を発生するエネルギー・ドナー部位とエネルギー・アクセプター部位とを有し、且つ前記標的粒子に結合した状態と前記標的粒子に結合していない状態との間で前記エネルギー・ドナー部位と前記エネルギー・アクセプター部位との間の距離が異なり、
    　前記標的粒子に結合した状態と、単独で存在している状態とで、前記蛍光プローブから放出される光の発光特性が異なる請求項１から５のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
  7. 　前記標的粒子が核酸であり、
    　前記蛍光プローブが、前記標的粒子と特異的にハイブリダイズし、且つ蛍光エネルギー移動現象におけるエネルギー・ドナーとなる蛍光物質及びエネルギー・アクセプターとなる物質の少なくとも一つが結合している１本鎖核酸分子である請求項１から６のいずれか一項に記載の標的粒子の検出方法。
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