JP7209550B2 - 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法 - Google Patents
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Description
(1a)標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程と、
(1b)蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
(1c)上記複数の細胞のうち、上位50%以内の上記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える。
蛍光強度の上昇速度=(Ft2-Ft1)/(t2-t1) ・・・ (1)
ただし、試料を接触させてから時間t1経過後の段階及び時間t2経過後の段階は、いずれも蛍光強度がプラトーに達する前の段階であり、t2>t1である。
蛍光強度の上昇速度=(Ft2-Ft1)/F0/(t2-t1) ・・・ (2)
蛍光強度の上昇速度=(It2-It1)/(t2-t1) ・・・ (3)
(2a)既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程と、
(2b)蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
(2c)異なる濃度の上記標的物質を含む1以上の標準試料を用いて、工程2a及び工程2bの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
(2d)未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、
(2e)上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
(2f)上記細胞のうち、上記試料又はいずれかの上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位50%以内であった任意の細胞を選択する工程と、
(2g)工程2eにおいて算出された試料の上昇速度を、工程2b及び2cにおいて算出された標準試料の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程と、を備える方法も提供する。ただし、工程2gで比較される上昇速度は、工程2fにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である。また、工程2a、2b、2c、2d、2e、及び2gはこの順に行われ、工程2fは、工程2bの後かつ工程2gの前に任意の段階で行われる。
(3a)既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程と、
(3b)蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
(3c)異なる濃度の上記標的物質を含む1以上の標準試料を用いて、工程3a及び工程3bの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
(3d)未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、
(3e)上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
(3f)工程3eにおいて算出された試料の上昇速度を、工程3b及び工程3cにおいて算出された標準試料の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程と、をこの順に備える方法を提供する。
(A1)流路23内の圧力が流路24内の圧力よりも高くなるように流路23に複数の細胞Cを含む懸濁液を導入し、流路23側の開口部31に細胞Cを捕捉する工程と、
(A2)流路23と流路24との圧力差を維持したまま、流路23に標的物質を含む試料を導入し、捕捉された細胞Cに標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備えてよい。
(1d)流路24内の圧力が流路23内の圧力よりも高くなるように流路24に液体を導入し、捕捉された細胞Cを開口部31から解放する工程と、
(1e)解放された細胞Cのうち上記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備える方法により回収することができる。
It=(Ft-F0)/F0×100(%)
300 nM、3000 nM、及び30000nMのBAL溶液を用いて同様の実験を行った。Itの経時変化を示すグラフを図3に示す。
Claims (11)
- 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法であって、
(1a)標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
前記標的物質は匂い物質であり、
前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
(1b)蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
(1c)前記複数の細胞のうち、上位50%以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える、方法。 - 第一の流路と、
前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項1記載の方法であって、
前記工程1aが、
(A1)前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程と、
(A2)前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に標的物質を含む試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備え、
前記工程1cの後に、
(1d)前記第二の流路内の圧力が前記第一の流路内の圧力よりも高くなるように前記第二の流路に液体を導入し、前記捕捉された細胞を前記開口部から解放する工程と、
(1e)前記解放された細胞のうち前記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備える、請求項1に記載の方法。 - 前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるItの時間変化率であり、
前記Itは、(Ft-F0)/F0であり、
前記F0は、前記試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
前記Ftは、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
前記所定時間は、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つの段階の間の時間である、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記工程1cにおいて、前記複数の細胞のうち、上位30%以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
(2a)既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
前記標的物質は匂い物質であり、
前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
(2b)蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
(2c)異なる濃度の前記標的物質を含む1以上の標準試料を用いて、工程2a及び工程2bの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
(2d)未知濃度の標的物質を含む試料を前記細胞に接触させる工程と、
(2e)前記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
(2f)前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位50%以内であった任意の細胞を選択する工程と、
(2g)工程2eにおいて算出された前記試料の上昇速度を、工程2b及び工程2cにおいて算出された前記標準試料の上昇速度と比較して、前記試料中の前記標的物質の濃度を算出する工程であって、前記比較される上昇速度は、工程2fにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である、工程と、を備え、
工程2a、2b、2c、2d、2e、及び2gはこの順に行われ、
工程2fは、工程2bの後かつ工程2gの前に任意の段階で行われる、方法。 - 第一の流路と、
前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項5記載の方法であって、
前記工程2aの前に、前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程を備え、
前記工程2aが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記標準試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標準試料を接触させる工程を備え、
前記工程2dが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記試料を接触させる工程を備える、請求項5に記載の方法。 - 前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるItの時間変化率であり、
前記Itは、(Ft-F0)/F0であり、
前記F0は、前記試料又は前記標準試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
前記Ftは、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
前記所定時間は、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つの段階の間の時間である、請求項5又は6に記載の方法。 - 前記工程2fにおいて、前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位30%以内であった任意の細胞を選択する、請求項5~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光強度の上昇速度が、Itの時間変化率の最大値である、請求項3又は7に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、昆虫の嗅覚受容体及びカルシウム感受性蛍光タンパク質を有する昆虫細胞である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的物質がボンビカールであり、
前記複数の細胞が、BmOR-3タンパク質及びGCaMP6sタンパク質を有するSf21細胞である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
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