JP2013027376A - 匂いセンサ - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】基板3上に設けられた容器4に、昆虫の嗅覚受容体タンパク質及び蛍光タンパク質を共発現しているスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞であって、検出対象となる匂い物質を含む試料を接触させることによって前記細胞内イオン濃度の変化に基づいて光を発する細胞を保持してなる、細胞チップと、前記光を検出すると信号を出力するセンサ12と、前記信号に基づいて前記匂い物質を検出する判定器13と、を有する、匂いセンサ。
【選択図】図1
Description
すなわち、本発明は、基板上に設けられた容器に、昆虫の嗅覚受容体タンパク質及び蛍光タンパク質を共発現しているスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞であって、検出対象となる匂い物質を含む試料を接触させることによって前記細胞内イオン濃度の変化に基づいて光を発する細胞を保持してなる、細胞チップと、前記光を検出すると信号を出力するセンサと、前記信号に基づいて前記匂い物質を検出する判定器と、を有する、匂いセンサを提供する。
基板の厚さは特に制限されないが、例えば好ましくは10〜1000μm、より好ましくは100〜500μm程度の範囲にあればよい。また、その大きさは特に限定されないが、携帯性の点から、縦3〜8cm x 横7〜12cm程度の大きさが適当である。
嗅覚受容体タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、昆虫の嗅覚受容体からmRNAを抽出し、cDNAを合成して単離することができる。mRNAの調製は、通常行われる手法により行うことができる。このようにして得られたcDNAから、適当なPCRプライマーを用いて、PCR法にて当該遺伝子の一部を取得することができる。
嗅覚受容体タンパク質をコードする遺伝子の一部は、合成した二本鎖cDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて大腸菌等を形質転換してcDNAライブラリーを作製することによって取得することもできる。cDNAは、適当な制限酵素とリガーゼを用いる通常の方法、例えば、得られたcDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法によって昆虫培養細胞発現用ベクターに組込むことができる。
ここで、流路5は、コネクタ10aから基板3上を図1の矢印方向に向かい、容器4に接続し、さらに容器4からコネクタ10bまで至る、流下溝である。流路幅は約100〜500μm、好ましくは約200μm、流路深さは約50〜200μm、好ましくは約100μmである。
コネクタ10aの手前には、匂い物質供給管9aと培養液供給管9bが接続されたバルブ11を有し、受容体発現細胞と匂い物質を移送管9cに供給している。
複数個の容器を有する細胞チップとしては、例えば、受容体発現細胞を培養するための培養液が流下する方向(図1の矢印方向)に対して並列に、溝状の流路形状を有する容器を複数個有するものでよい。このような細胞チップとしては、図1に示した、コネクタ10aから流路5を介して容器4に至り、容器4から流路5を介してコネクタ10bに至る構造部分を、図1の矢印方向に対して並列に独立させて複数個存在させた構成でもよい。あるいは、上記構造部分において、容器4を矢印方向に対して複数個並列に並べて、複数個の容器の手前に、受容体発現細胞を各容器に分配する分配器を1つ設け、分配器から分岐した流路によって各容器に受容体発現細胞を分配する構成でもよい。前者の場合には、匂い物質供給手段6及び培養液供給手段7は、各容器に一組ずつ有してもよい。
複数個の容器を有する細胞チップの別の態様として、基板の一方の表面に細胞を格納するための複数の容器(マイクロウェル)を有するマイクロウェルアレイチップを使用することもできる。
このような複数個の容器を有する細胞チップでは、各容器に、対象となる異なった種類の匂い物質に対して互いに異なった嗅覚受容体タンパク質を発現している細胞を保持することができる。このような細胞チップでは、対象となる匂い物質を接触させた時の、容器ごとに異なる蛍光強度を示すその応答パターンを確認することにより、当該匂い物質を検出することができる。また、このような細胞チップを用いれば、同一のチップ上で複数の種類の匂い物質を同時に検出することもできる。
なお、容器4に保持された細胞であっても死滅すると容器4から浮き上がるため、廃培養液として廃液回収手段にて回収される。これによって、容器4には死滅した細胞が残ることなく、匂い物質の安定した検出が可能になる。
判定器13は、プロセッサ、半導体メモリ及び周辺回路を有し、センサ12から出力された蛍光画像に基づいて対象となる匂い物質を検出する。判定器13は、センサ12から出力された蛍光画像において、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる匂い物質が接触する前の、その容器が写っている領域の平均輝度値と、当該物質が接触した後の、その領域の平均輝度値とを比較し、後者の平均輝度値が、例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上増加している場合に、その容器において対象となる匂い物質を検出できたと判定する。
別の実施態様では、判定器13は、例えば、蛍光画像上の容器の領域について、対象となる匂い物質が接触する前の輝度値よりも、当該物質が接触した後の輝度値が、所定の輝度閾値以上(例えば5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは20%以上)高くなった画素数が、その容器に対応する領域に含まれる画素数の所定の割合以上、例えば1/1000〜1/100以上検出された場合に、その容器において対象となる匂い物質が検出されたと判定してよい。
例1.昆虫の嗅覚受容体タンパク質発現細胞の作製
(1)GCaMP3を発現するベクターの作製
Looger研究室から提供を受けたGCaMP3遺伝子(アクセッション番号:HM143847.1)のcDNAの開始コドンから終止コドンまでを、開始コドン(ATG)の直前にコザック配列(GCCGCC)を付加したプライマーでPCR増幅し、昆虫培養細胞発現用ベクターpIZ/V5-His(Invtrogen社製)のマルチクローニングサイトに挿入し、GCaMP3を発現するpIZ-GCaMP3ベクターを作製した(図2)。
PCR増幅は、各100pMの濃度の以下のフォワードプライマー(配列番号1)及びリバースプライマー(配列番号2)、PrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ(株)R010A)、添付の反応バッファー及びdNTPを使用し、添付のプロトコールに従って行った。PCR反応は、94℃で1分間の反応の後、98℃で10秒間、55℃で15秒間、72℃で1.5分間の温度サイクルを30サイクル、その後72℃で5分間反応させる条件で行った。
フォワード:5'-GCGGCCGCCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’(配列番号1)
リバース:5'-GGTCTAGATTACTTCGCTGTCATCATTTGTAC-3’(配列番号2)
(2)嗅覚受容体タンパク質遺伝子及びOr83bファミリータンパク質遺伝子を共発現するデュアル発現ベクターの構築
卵母細胞を用いた本発明者らの研究(例えば、非特許文献3)に記載されているように、嗅覚受容体タンパク質遺伝子とOr83bファミリータンパク質遺伝子とを1:1の割合で発現させることで当該受容体の機能の発現が可能となることから、カイコガ(Bombyx mori)の性フェロモン受容体タンパク質遺伝子であるBmOR1(アクセッション番号:AB059431)又はBmOR3(アクセッション番号:AB186505)と、カイコガのOr83bファミリー遺伝子であるBmOR2(アクセッション番号:AB100454)を同程度発現できるデュアル発現ベクターを構築した(図3)。
まず、pIBベクター(Invtrogen社製)のマルチクローニングサイトに、カイコガの触角cDNA由来のBmOR2遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、コザック配列(GCCGCC)を付加したプライマーで増幅したBmOR2(ORFの完全長)を挿入し、pIB-BmOR2ベクターを構築した。次に、カイコガの触角cDNA由来のBmOR1遺伝子又はBmOR3遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを、それぞれコザック配列を付加したプライマーで増幅して、増幅されたBmOR1又遺伝子(ORFの完全長)又はBmOR3遺伝子(ORFの完全長)を得た。使用したプライマー配列は以下のとおりであり、PCR反応条件は「GCaMP3を発現するベクターの作製」で示した条件と同様である。
BmOR1:
フォワード:5'-GCGGCCGCCATGTTACTATCCTTCAAAGATGAC-3’(配列番号3)
リバース:5'-GGTCTAGATTATGTTGCCACCGTTCGAAG-3’(配列番号4)
BmOR3:
フォワード:5'-GCGGCCGCCATGATATTCGTCGACGATGCTG-3’(配列番号5)
リバース:5'-GGTCTAGATCATTCGGACACGGTACG-3’(配列番号6)
BmOR2:
フォワード:5'-GCGGCCGCCATGATGACCAAGGTCAAGACGC-3’(配列番号7)
リバース:5'-GGTCTAGACTACTTCAGTTGGATCAACACC-3’(配列番号8)
一方、pIZベクター(Invtrogen社製)でタンパク質発現カセット(OpIE2プロモーター(P(OpIE2))→OpIE2ポリA付加シグナル(OpIE2pA))と連なる部分)を構築し、pIB-BmOR2ベクターのBspH1部位に、増幅されたBmOR1又遺伝子又はBmOR3遺伝子を挿入し、2種類のデュアル発現ベクターpIB-BmOR1-BmOR2、及びpIB-BmOR3-BmOR2を構築した。
(3)嗅覚受容体タンパク質発現細胞の作製
前記デュアル発現ベクター及びpIZ-GCaMP3ベクターをリポフェクション法(Cellfectin;Invitrogen社製)により、Sf21細胞に導入した。
BioCoatコラーゲンディッシュ(Becton, Dickinson and Company、NJ、USA)に例1で作製したSf21細胞の溶液(約1×106 細胞数/ml)を接着させ、培養細胞カルシウムイメージング用のリンガー液(140mM NaCl, 5.6mM KCl, 2.0mM CaCl2, 2.0mM MgCl2, 5mM HEPES, 9.4mM グルコース, 1.25mM KH2PO4, pH7.4)2mlを添加し、1.5ml/分の流速でリンガー液を灌流させた。ここに、室温で、各10μMのボンビコール(BOL)、ボンビカール(BAL)のリンガー液500μlを注入し、これらの匂い物質に対する匂い応答を測定した(図5)。
その結果、嗅覚受容体タンパク質BmOR1はボンビコールに、嗅覚受容体タンパク質BmOR3はボンビカールに選択的に応答することが明らかとなった。
さらに、添加するボンビコール及びボンビカールの濃度を30nM〜10μMまで変化させながら匂い応答を測定した(図6)。
長期間安定して匂い応答を検出できる嗅覚受容体タンパク質発現細胞の安定発現系統を得るため、例1で作製したSf21細胞を希釈法とシリンダー法(InsectSelect(商標)BSD System(Invitrogen社製))によってスクリーニングした。
シリンダー法によるスクリーニングでは、前記Sf21細胞を、上記抗生物質入りの培地で培養し、形成したコロニーを回収する。コロニーは、1つの細胞から形成されるので、1つのコロニーを回収することにより、同じ形質を持った細胞が得られる。
なお、例3で「蛍光変化量の測定が可能」とは、対象となる匂い物質を接触させる前の蛍光強度に対する、当該匂い物質を接触させた後の蛍光強度の増加率が20%以上であることを意味する。
図7の結果を匂い物質に応答した細胞の割合に換算すると([容器内の全細胞数の内、20%以上の蛍光強度変化を示した細胞数]/[容器内の全細胞数]×100(%))、細胞系統によっては60%以上の細胞が応答している系統も存在することが明らかとなった(表1)。
図1に示した本発明の細胞チップと同じ構成のガラス製マイクロ化学チップ(マイクロ化学技研株式会社製)に、BmOR1-6を発現したSf21細胞を含む例2のリンガー液(約1×106〜1×105 細胞数/ml)2mlを添加して、当該細胞を接着させた。チップの流路にリンガー液を室温で流速数十〜数百μl/分で72時間流しながら、10μMのボンビコールのリンガー液を接触させて、ボンビコールに対する応答を測定した(図8)。
キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の嗅覚受容体タンパク質Or43a(アクセッション番号:NM_078923.2)又はOr47a(アクセッション番号:NM_078965.2)を発現させたSf21細胞を例1と同様に構築し(Or43a、Or47a、及びOr83の各遺伝子については、データベースFlybase(http://flybase.org/)で取得できるCDSの完全長を使用)、例2に記載の方法と同様にして、ペンチルアセテート及びシクロヘキサノンに対する匂い応答を各々測定した(図9)。その結果、Or43aはシクロヘキサノンにより選択的に応答し、Or47aはペンチルアセテートに選択的に応答することが明らかとなった。
2 細胞チップ
3 基板
4 容器
5 流路
6 匂い物質供給手段
6a 匂い物質取り込み口
7 培養液供給手段
8 廃液回収手段
9a 匂い物質供給管
9b 培養液供給管
9c 移送管
9d 廃液管
10a、10b コネクタ
11 バルブ
12 センサ
13 判定器
Claims (6)
- 基板上に設けられた容器に、昆虫の嗅覚受容体タンパク質及び蛍光タンパク質を共発現しているスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞であって、検出対象となる匂い物質を含む試料を接触させることによって前記細胞内イオン濃度の変化に基づいて光を発する細胞を保持してなる、細胞チップと、
前記光を検出すると信号を出力するセンサと、
前記信号に基づいて前記匂い物質を検出する判定器と、
を有する、匂いセンサ。 - 前記容器は複数個存在し、その複数個の容器の各々に保持された前記細胞は、検出対象となる異なった種類の匂い物質に対して互いに異なった昆虫の嗅覚受容体タンパク質を発現し、かつ前記匂い物質を含む試料を前記複数個の容器の各々に接触させることによって光を発し、
前記センサは、前記複数個の容器の各々における光を検出すると信号を出力し、
前記判定器は、前記各信号に基づいて異なった種類の匂い物質を検出する、請求項1に記載の匂いセンサ。 - 前記出力するセンサが光の強度に応じた信号を出力し、かつ、前記判定器が前記信号の強度に基づいて前記匂い物質を検出する、請求項1又は2に記載の匂いセンサ。
- 前記細胞チップは、前記容器中を細胞培養液を流下させる手段をさらに有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の匂いセンサ。
- 前記蛍光タンパク質は、カルシウム感受性蛍光タンパク質である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の匂いセンサ。
- 前記カルシウム感受性蛍光タンパク質は、GCaMP3である、請求項5に記載の匂いセンサ。
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Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017122338A1 (ja) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | 株式会社日立製作所 | 人工嗅覚センシングシステム |
WO2018003186A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 株式会社日立製作所 | 分子識別方法 |
WO2018043533A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人東京大学 | 検出装置及び細胞含有物体 |
JP2018113957A (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 国立大学法人 東京大学 | 匂いセンサ |
WO2018135550A1 (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 国立大学法人東京大学 | 匂いセンサ |
WO2018180792A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | 富士フイルム株式会社 | 虫の検知方法、虫検知用ガスセンサー、虫検知用ガスセンサーアレイ、及び電機製品 |
JP2020510417A (ja) * | 2017-02-17 | 2020-04-09 | コニク インコーポレイテッド | 検出のためのシステム |
WO2020152940A1 (ja) | 2019-01-25 | 2020-07-30 | 浜松ホトニクス株式会社 | 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法 |
WO2021045233A1 (ja) * | 2019-09-06 | 2021-03-11 | 国立大学法人東京大学 | 匂い検出キット、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法 |
EP3670656A4 (en) * | 2017-08-17 | 2021-10-13 | Komi Hakko Corporation | ODOR QUANTIFICATION PROCESS, CELLS USED IN THIS PROCESS AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF SUCH CELLS |
US11336285B2 (en) | 2018-08-10 | 2022-05-17 | Koniku Inc. | Stacked integrated platform architecture |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003100057A1 (fr) * | 2002-05-28 | 2003-12-04 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Systeme de detecteur chimique |
JP2005027659A (ja) * | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Nitto Denko Corp | 細胞マイクロチップ |
JP2005046121A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Japan Science & Technology Agency | オンチップバイオアッセイ方法及びキット |
JP2011007741A (ja) * | 2009-06-29 | 2011-01-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | においセンサおよびにおい検知方法 |
WO2011056975A2 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Howard Hughes Medical Institute | Genetically encoded calcium indicators and methods of use |
-
2011
- 2011-07-29 JP JP2011167293A patent/JP5854686B2/ja active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003100057A1 (fr) * | 2002-05-28 | 2003-12-04 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Systeme de detecteur chimique |
JP2005027659A (ja) * | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Nitto Denko Corp | 細胞マイクロチップ |
JP2005046121A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Japan Science & Technology Agency | オンチップバイオアッセイ方法及びキット |
JP2011007741A (ja) * | 2009-06-29 | 2011-01-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | においセンサおよびにおい検知方法 |
WO2011056975A2 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | Howard Hughes Medical Institute | Genetically encoded calcium indicators and methods of use |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
AIDAN KIELY: "Functional and StructuralAnalyses of anOlfactory Receptor fromDrosophila melanogaster", A THESIS SUBMITTED IN FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTSOF DOCTOR OF PHILOSOPHY IN BIOLOGICAL SCIENCE, JPN6015044497, October 2008 (2008-10-01), ISSN: 0003188959 * |
JOURNAL OF NEUROSCIENCE METHODS, vol. 159, JPN6015044489, 2007, pages 189 - 194, ISSN: 0003188958 * |
NATURE, vol. 452, no. 24, JPN6015044499, 2008, pages 1007 - 1012, ISSN: 0003188960 * |
PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 107, no. 35, JPN6015011661, 31 August 2010 (2010-08-31), pages 15340 - 15344, ISSN: 0003036535 * |
神崎 亮平: "昆虫の超高感度化学感覚機能を応用した化学センサの開発", 東京大学産学連携プロポーザル, vol. 整理番号5713, JPN6015011659, 30 November 2010 (2010-11-30), ISSN: 0003036534 * |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10338046B2 (en) | 2016-01-15 | 2019-07-02 | Hitachi, Ltd. | Artificial olfactory sensing system |
JPWO2017122338A1 (ja) * | 2016-01-15 | 2018-05-31 | 株式会社日立製作所 | 人工嗅覚センシングシステム |
WO2017122338A1 (ja) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | 株式会社日立製作所 | 人工嗅覚センシングシステム |
WO2018003186A1 (ja) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | 株式会社日立製作所 | 分子識別方法 |
WO2018043533A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人東京大学 | 検出装置及び細胞含有物体 |
JPWO2018043533A1 (ja) * | 2016-09-02 | 2019-07-11 | 国立大学法人 東京大学 | 検出装置及び細胞含有物体 |
JP2018113957A (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 国立大学法人 東京大学 | 匂いセンサ |
WO2018135550A1 (ja) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | 国立大学法人東京大学 | 匂いセンサ |
JP2020510417A (ja) * | 2017-02-17 | 2020-04-09 | コニク インコーポレイテッド | 検出のためのシステム |
JP2021118734A (ja) * | 2017-02-17 | 2021-08-12 | コニク インコーポレイテッド | 検出のためのシステム |
US11474103B2 (en) | 2017-02-17 | 2022-10-18 | Koniku Inc. | Systems for detection |
WO2018180792A1 (ja) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | 富士フイルム株式会社 | 虫の検知方法、虫検知用ガスセンサー、虫検知用ガスセンサーアレイ、及び電機製品 |
EP3670656A4 (en) * | 2017-08-17 | 2021-10-13 | Komi Hakko Corporation | ODOR QUANTIFICATION PROCESS, CELLS USED IN THIS PROCESS AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF SUCH CELLS |
US11336285B2 (en) | 2018-08-10 | 2022-05-17 | Koniku Inc. | Stacked integrated platform architecture |
WO2020152940A1 (ja) | 2019-01-25 | 2020-07-30 | 浜松ホトニクス株式会社 | 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法 |
JP2020115807A (ja) * | 2019-01-25 | 2020-08-06 | 浜松ホトニクス株式会社 | 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法 |
CN113316644A (zh) * | 2019-01-25 | 2021-08-27 | 浜松光子学株式会社 | 选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法、及确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法 |
JP7209550B2 (ja) | 2019-01-25 | 2023-01-20 | 浜松ホトニクス株式会社 | 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法 |
WO2021045233A1 (ja) * | 2019-09-06 | 2021-03-11 | 国立大学法人東京大学 | 匂い検出キット、匂い検出キットの製造方法、及び匂い検出方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP5854686B2 (ja) | 2016-02-09 |
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