WO2020152940A1

WO2020152940A1 - 標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法

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Publication number: WO2020152940A1
Application number: PCT/JP2019/043560
Authority: WO
Inventors: 祐史木村; 紗弥香風見; 橋本　優; 伊藤　博康
Original assignee: 浜松ホトニクス株式会社
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2020-07-30
Also published as: EP3916104A4; CN113316644A; JP2020115807A; TW202040120A; US20220155297A1; EP3916104A1; JP7209550B2

Abstract

本発明に係る標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法は、（１ａ）標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程であって、上記細胞は、上記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、上記蛍光指示薬は、上記標的物質と上記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、（１ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（１ｃ）上記複数の細胞のうち、上位５０％以内の上記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える。本発明によれば、試料中の標的物質を高い感度で検出することができる。

Description

標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法

　本発明は、標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法に関する。

　従来、昆虫が匂いを識別する仕組みを利用して匂い物質を検出する方法が知られている。例えば、特許文献１には、昆虫の嗅覚受容体タンパク質及び蛍光タンパク質を共発現するスポドプテラ・フルギペルダ細胞に試料を接触させて、試料中の匂い物質を検出する方法が記載されている。かかる方法では、細胞チップを保持した容器に匂い物質を含む試料を接触させ、匂い物質が接触する前の容器の蛍光画像の平均輝度値と、匂い物質を接触した後の容器の蛍光画像の平均輝度値とを比較し、平均輝度値の増加率が所定の値以上であった場合に匂い物質を検出したと判定する。

特開２０１３－２７３７６号公報

　特許文献１に記載の方法では、検出感度が十分でない場合があった。そこで、本発明は、試料中の標的物質を高い感度で検出することを目的とする。

　本発明に係る標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法は、（１ａ）標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程であって、上記細胞は、上記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、上記蛍光指示薬は、上記標的物質と上記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、（１ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（１ｃ）上記複数の細胞のうち、上位５０％以内の上記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える。

　上記方法は、マイクロ流路デバイスを用いて実施することができる。マイクロ流路デバイスは、第一の流路と、上記第一の流路に隣接する第二の流路と、上記第一の流路と上記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、上記第一の流路側に上記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備える。上記工程１ａは、（Ａ１）上記第一の流路内の圧力が上記第二の流路内の圧力よりも高くなるように上記第一の流路に上記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、上記第一の流路側の開口部に上記細胞を捕捉する工程と、（Ａ２）上記第一の流路と上記第二の流路との圧力差を維持したまま、上記第一の流路又は上記第二の流路に標的物質を含む試料を導入し、上記捕捉された細胞に上記標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備えてよい。上記方法は、上記工程１ｃの後に、（１ｄ）上記第二の流路内の圧力が上記第一の流路内の圧力よりも高くなるように上記第二の流路に液体を導入し、上記捕捉された細胞を上記開口部から解放する工程と、（１ｅ）上記解放された細胞のうち上記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備えてよい。

　上記工程１ｃにおいて、上記複数の細胞のうち、上位３０％以内の上記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択してもよい。

　本発明に係る試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法は、（２ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、上記細胞は、上記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、上記蛍光指示薬は、上記標的物質と上記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、（２ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（２ｃ）異なる濃度の上記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程２ａ及び工程２ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、（２ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、（２ｅ）上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（２ｆ）上記細胞のうち、上記試料又はいずれかの上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位５０％以内であった任意の細胞を選択する工程と、（２ｇ）工程２ｅにおいて上記試料について算出された蛍光強度の上昇速度を、工程２ｂ及び工程２ｃにおいて上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程であって、上記比較される上昇速度は、工程２ｆにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である工程と、を備え、工程２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、及び２ｇはこの順に行われ、工程２ｆは、工程２ｂの後かつ工程２ｇの前に任意の段階で行われる。

　上記方法は、マイクロ流路デバイスを用いて実施することができる。マイクロ流路デバイスは、第一の流路と、上記第一の流路に隣接する第二の流路と、上記第一の流路と上記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、上記第一の流路側に上記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備える。上記方法は、上記工程２ａの前に、上記第一の流路内の圧力が上記第二の流路内の圧力よりも高くなるように上記第一の流路に上記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、上記第一の流路側の開口部に上記細胞を捕捉する工程を備えてもよい。上記工程２ａは、上記第一の流路と上記第二の流路との圧力差を維持したまま、上記第一の流路又は上記第二の流路に上記標準試料を導入し、上記捕捉された細胞に上記標準試料を接触させる工程を備えてもよい。上記工程２ｄは、上記第一の流路と上記第二の流路との圧力差を維持したまま、上記第一の流路又は上記第二の流路に上記試料を導入し、上記捕捉された細胞に上記試料を接触させる工程を備えてもよい。

　上記工程２ｆにおいて、上記細胞のうち、上記試料又はいずれかの上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位３０％以内であった任意の細胞を選択してもよい。

　上記いずれの方法においても、上記蛍光強度の上昇速度は、所定時間におけるＩｔの時間変化率であってよい。Ｉｔは、（Ｆｔ－Ｆ０）／Ｆ０である。Ｆ０は、上記試料又は上記標準試料を接触させる前の上記細胞の蛍光強度を表し、Ｆｔは、上記試料又は上記標準試料を接触させた後であって、かつ、上記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における上記細胞の蛍光強度を表す。上記所定時間は、上記試料又は上記標準試料を接触させた後であって、かつ、上記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間である。上記蛍光強度の上昇速度は、Ｉｔの時間変化率の最大値であってよい。

　本発明の他の側面に係る、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法は、（３ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、上記細胞は、上記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、上記蛍光指示薬は、上記標的物質と上記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、（３ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（３ｃ）異なる濃度の上記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程３ａ及び工程３ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、（３ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、（３ｅ）上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、（３ｆ）工程３ｅにおいて上記試料について算出された蛍光強度の上昇速度を、工程３ｂ及び工程３ｃにおいて上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程と、をこの順に備える。

　上記いずれの方法においても、上記標的物質は匂い物質であってよく、上記複数の細胞は、昆虫の嗅覚受容体及びカルシウム感受性蛍光タンパク質を有する昆虫細胞であってよい。上記いずれの方法においても、上記標的物質は、ボンビカール（以下、ＢＡＬと略す。）であってもよく、上記複数の細胞は、ＢｍＯＲ－３タンパク質及びＧＣａＭＰ６ｓタンパク質を有するＳｆ２１細胞であってもよい。

　本発明に係る方法により選択された細胞を用いることにより、試料中の標的物質を高い感度で検出することが可能となる。また、本発明に係る試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法によれば、標的物質の濃度が低くても、その濃度を決定することができる。

応答性の高い細胞の選択、及び、標的物質の濃度の決定に使用することのできるマイクロ流路デバイスの模式図である。応答性の高い細胞の選択、及び、標的物質の濃度の決定に使用することのできるマイクロ流路デバイスの模式図である。Ｉｔの経時変化を示すグラフである。蛍光強度の最大上昇速度の分布を示すヒストグラムである。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ３００００ｎＭ、３０００ｎＭ、３００ｎＭのＢＡＬ溶液を用いたときの結果である。図４の分布における、上位１００％、３０％、２５％、及び２０％以内の値の平均値を示すグラフである。

　本発明に係る標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法は、
　（１ａ）標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程と、
　（１ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
　（１ｃ）上記複数の細胞のうち、上位５０％以内の上記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える。

　本発明において使用される細胞は、標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞である。

　標的物質は、特に限定されず、ＢＡＬ、ボンビコール、１－オクテン－３－オール、ゲオスミン、フェネチルアルコール、メチルベンゾエート、エチルベンゾエート、ベンジルアルコール、メチルサリシレート、ベンズアルデヒド、ペンタナール、ヘキサナール、Ｅ２－ヘキサナール、２－ヘプタノン、６－メチル－５－へプテン－２－オン、２－メチルフェノール等の匂い物質であってよい。

　標的物質の受容体は、特に限定されず、例えば、上記の匂い物質の受容体であってよい。匂い物質の受容体は、例えば、カイコガ、キイロショウジョウバエ、ハマダラカ等の昆虫の嗅覚受容体であってよい。カイコガの嗅覚受容体としては、例えば、ＢＡＬの受容体であるＢｍＯＲ－３タンパク質、及び、ボンビコールの受容体であるＢｍＯＲ－１タンパク質が挙げられる。キイロショウジョウバエの嗅覚受容体としては、例えば、１－オクテン－３－オールの受容体であるＯｒ１３ａタンパク質、及び、ゲオスミンの受容体であるＯｒ５６ａタンパク質が挙げられる。

　蛍光指示薬は、標的物質と受容体との結合の結果蛍光を発する物質であれば特に限定されない。蛍光指示薬は、例えば、蛍光タンパク質又は蛍光色素であってよい。蛍光指示薬は、好ましくは遺伝的にコードされた蛍光タンパク質である。例えば、標的物質と受容体との結合が細胞内のイオン濃度の変化をもたらす場合、蛍光指示薬は、そのイオンに感受性の蛍光タンパク質又は蛍光色素であってよい。蛍光タンパク質の例は、カルシウム感受性蛍光タンパク質である、ＧＣａＭＰ３タンパク質、ＧＣａＭＰ６ｓタンパク質、及びＧＣａＭＰ７タンパク質である。蛍光色素の例は、Ｆｌｕｏ　３－ＡＭ、Ｒｈｏｄ　２－ＡＭ、Ｃａｌｂｒｙｔｅ（商標）　５２０、Ｆｌｕｏ　４－ＡＭ、Ｆｕｒａ　２－ＡＭ、Ｉｎｄｏ　１－ＡＭ、Ｃａｌｂｒｙｔｅ　５９０、Ｃａｌｂｒｙｔｅ　６３０等のカルシウム感受性蛍光色素である。

　細胞は、補助受容体をさらに含んでもよい。補助受容体の例としては、昆虫の嗅覚受容体の補助受容体であるＯｒｃｏタンパク質が挙げられる。

　細胞は、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞であってよい。スポドプテラ・フルギペルダ由来の細胞としては、例えば、Ｓｆ２１及びＳｆ９が挙げられる。

　工程１ａでは、標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる。細胞に試料を接触させることで、試料中の標的物質が受容体と結合し、その結果、蛍光指示薬が蛍光を発する。例えば、受容体がＢｍＯＲ－３タンパク質等のカルシウムイオンチャネルである場合、標的物質の受容体への結合は、カルシウムイオンの細胞内への流入を引き起こす。カルシウムイオンは細胞内に存在しているカルシウム感受性蛍光指示薬に結合し、蛍光指示薬は蛍光を発する。試料を細胞に接触し続けることで細胞内のカルシウム濃度が上昇し、細胞から発せられる蛍光の強度も上昇するが、カルシウムイオンの細胞内への取り込み速度は次第に低下していき、細胞内カルシウム濃度はプラトー（一定）に達し、そのため、蛍光強度もプラトーとなる。

　試料を細胞に接触させる方法は特に限定されず、試料が液体である場合には、例えば、細胞を試料に所定時間浸してもよいし、試料を所定の流速で流し、その流れの中に細胞を配置してもよい。試料が気体である場合には、例えば、試料を充満させた空間に細胞を配置してもよい。工程１ａにおける試料の濃度は、未知であっても既知であってもよい。

　工程１ｂでは、蛍光強度の上昇速度を細胞ごとに算出する。蛍光強度は、測定値そのもの（絶対値）であっても、試料を接触させる前の細胞の蛍光強度等に対する相対値であってもよい。蛍光強度の上昇速度は、所定時間における絶対又は相対的な蛍光強度の時間変化率であってよい。

　蛍光強度の上昇速度として所定時間における絶対的な蛍光強度の時間変化率を利用する場合、蛍光強度の上昇速度は、所定時間におけるＦｔの時間変化率ｄＦｔ／ｄｔを計算することにより求めることができる。ここで、Ｆｔは、試料を接触させた後であって、かつ、蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における細胞の蛍光強度（測定値そのもの）を表す。所定時間とは、試料を接触させた後であって、かつ、蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間を指す。ｄＦｔ／ｄｔは、試料を接触させてから経過した時間に対してＦｔをプロットして得られる曲線の傾きを算出することにより求めてもよい。蛍光強度の上昇速度として、ｄＦｔ／ｄｔの最大値を利用してもよい。

　一例として、試料を接触させてから時間ｔ１、ｔ２経過後の段階における細胞の蛍光強度をそれぞれＦｔ１、Ｆｔ２で表すと、蛍光強度の上昇速度は下式（１）を用いて計算することができる。
　蛍光強度の上昇速度＝（Ｆｔ２－Ｆｔ１）／（ｔ２－ｔ１）　・・・　（１）
ただし、試料を接触させてから時間ｔ１経過後の段階及び時間ｔ２経過後の段階は、いずれも蛍光強度がプラトーに達する前の段階であり、ｔ２＞ｔ１である。

　蛍光強度の上昇速度として所定時間における相対的な蛍光強度の時間変化率を利用する場合、蛍光強度の上昇速度は、所定時間におけるＦｔ／Ｆ０の時間変化率ｄ／ｄｔ（Ｆｔ／Ｆ０）計算することにより求めることができる。ここで、Ｆ０は、試料を接触させる前の細胞の蛍光強度（測定値そのもの）を表す。所定時間とは、試料を接触させた後であって、かつ、蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間を指す。一例として、蛍光強度の上昇速度は下式（２）を用いて計算することができる。
　蛍光強度の上昇速度＝（Ｆｔ２－Ｆｔ１）／Ｆ０／（ｔ２－ｔ１）　・・・　（２）

　あるいは、蛍光強度の上昇速度は、所定時間におけるＩｔの時間変化率ｄＩｔ／ｄｔを計算することにより求めることができる。ここで、Ｉｔは、（Ｆｔ－Ｆ０）／Ｆ０である。所定時間とは、試料を接触させた後であって、かつ、蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間を指す。ｄＩｔ／ｄｔは、試料を接触させてから経過した時間に対してＩｔをプロットして得られる曲線の傾きを算出することにより求めてもよい。蛍光強度の上昇速度として、ｄＩｔ／ｄｔの最大値を利用してもよい。一例として、蛍光強度の上昇速度は下式（３）を用いて計算することができる。式（３）を変形すると式（２）と同じ式が得られる。
　蛍光強度の上昇速度＝（Ｉｔ２－Ｉｔ１）／（ｔ２－ｔ１）　・・・　（３）

　工程１ｃでは、全細胞のうち、上位５０％以内の蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する。好ましくは、全細胞のうち、蛍光強度の上昇速度の最大値が、上位５０％、４０％、３０％、２５％、又は２０％以内である細胞を選択する。選択する細胞は、蛍光強度の上昇速度が上位５０％以内である細胞のうち、全ての細胞であってもよく、一部の細胞であってもよい。

　選択された細胞は、まず回収し、そして試料中の標的物質の検出に又はその濃度の決定に利用することができる。あるいは、選択された細胞は、回収せずにそのまま試料中の標的物質の検出に又はその濃度の決定に利用することができる。本発明に係る方法により選択された細胞は標的物質に対して高い応答性を示すため、本発明に係る細胞を用いることにより、試料中の標的物質を高い感度で検出することができる。

　選択及び回収された細胞を用いて試料中の標的物質を検出し又はその濃度を決定する方法は特に限定されず、公知の方法を使用することができる。例えば、回収された細胞を公知の方法により培養し、培養細胞に試料を接触させたときに発せられる蛍光を分析することにより、試料中の標的物質を検出し又はその濃度を決定することができる。ただし、選択された細胞が有する蛍光指示薬が遺伝的にコードされていない場合、蛍光色素等の蛍光指示薬が培養細胞内に存在している必要がある。標的物質の検出及びその濃度の決定には、蛍光強度の上昇速度を利用してもよいし、蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階又はプラトーに達した段階の蛍光強度を利用してもよい。

　選択された細胞を回収せずにそのまま試料中の標的物質の検出に利用することもできる。この場合、全細胞のうち少なくとも上記選択された細胞に標的物質を含む可能性のある試料を接触させて、上記選択された細胞から発せられる蛍光を分析することにより、試料中の標的物質の存在を検出することができる。

　選択された細胞を回収せずにそのまま試料中の標的物質の濃度の決定に利用することもできる。すなわち、本発明は、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
　（２ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程と、
　（２ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
　（２ｃ）異なる濃度の上記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程２ａ及び工程２ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
　（２ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、
　（２ｅ）上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
　（２ｆ）上記細胞のうち、上記試料又はいずれかの上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位５０％以内であった任意の細胞を選択する工程と、
　（２ｇ）工程２ｅにおいて上記試料について算出された蛍光強度の上昇速度を、工程２ｂ及び２ｃにおいて上記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程と、を備える方法も提供する。ただし、工程２ｇで比較される上昇速度は、工程２ｆにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である。また、工程２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、及び２ｇはこの順に行われ、工程２ｆは、工程２ｂの後かつ工程２ｇの前に任意の段階で行われる。

　工程２ａ～工程２ｃは、標準試料を用いたときの細胞の蛍光強度の上昇速度の測定に関する。工程２ａ及び工程２ｂの詳細は、工程１ａ及び工程１ｂについて説明したとおりである。ただし、工程２ａ及び工程２ｂでは、試料の代わりに既知濃度の標的物質を含む標準試料が使用される。工程２ｃでは、１以上の標準試料を用いて工程２ａ及び工程２ｂの組み合わせを繰り返すことにより、標的物質の濃度と各細胞の蛍光強度の上昇速度とを対応付ける。標的物質の濃度と各細胞の蛍光強度の上昇速度との関係を示す検量線を作成してもよい。用いる標準試料の数は特に限定されず、より多くの標準試料を用いることで、より正確な検量線を作成することができ、したがって、試料中の標的物質の濃度をより正確に決定することができる。

　工程２ｄ及び工程２ｅは、未知濃度の標的物質を含む試料を用いたときの細胞の蛍光強度の上昇速度の測定に関する。工程２ｄ及び工程２ｅの詳細は、工程１ａ及び工程１ｂについて説明したとおりである。ただし、工程２ｄ及び工程２ｅでは、未知濃度の標的物質を含む試料が使用される。

　工程２ｆは、細胞の選択に関する。工程２ｆの詳細は、工程１ｃについて説明したとおりである。ただし、工程２ｆでは、細胞の選択は、工程２ｂ、工程２ｃ、及び工程２ｅのいずれかにおいて得られた蛍光強度の上昇速度のデータに基づいて行う。いいかえれば、工程２ｆでは、全細胞のうち工程２ｂで算出された上昇速度が上位５０％以内であった細胞を選択してもよいし、全細胞のうち工程２ｃで算出された上昇速度が上位５０％以内であった細胞を選択してもよいし、全細胞のうち工程２ｅで算出された上昇速度が上位５０％以内であった細胞を選択してもよい。すなわち、本工程は、工程２ｂの後であれば、工程２ｃの前に行ってもよく、工程２ｄの前に行ってもよい。

　細胞の選択（工程２ｆ）を工程２ｂと工程２ｃの間で行う場合、工程２ｃ及び工程２ｅにおける蛍光強度の上昇速度の測定は、全ての細胞について行う必要はなく、少なくとも工程２ｆにおいて選択された細胞に対して行えば十分である。したがって、工程２ｃ及び工程２ｄにおいて、標準試料又は試料は、少なくとも工程２ｆにおいて選択された細胞に対して接触させれば十分である。同様に、細胞の選択（工程２ｆ）を工程２ｃと工程２ｄの間で行う場合、工程２ｅにおける蛍光強度の上昇速度の測定は、全ての細胞について行う必要はなく、少なくとも工程２ｆにおいて選択された細胞に対して行えば十分である。また、工程２ｄにおいて、試料は、少なくとも工程２ｆにおいて選択された細胞に対して接触させれば十分である。

　工程２ｇは、試料中の標的物質の濃度の決定に関する。本工程では、未知濃度の標的物質を含む試料について算出された蛍光強度の上昇速度の値（工程２ｅ）を、例えば検量線を用いることにより、標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度の値（工程２ｂ及び工程２ｃ）と比較して、試料中の標的物質の濃度を決定する。

　上記実施形態に係る試料中の標的物質の濃度を決定する方法によれば、標的物質に対して高い応答性を示す細胞の蛍光に基づいて濃度を決定するため、試料中の標的物質を高い感度で検出することができ、よって、標的物質の濃度が低くても、その濃度を決定することができる。また、上記実施形態に係る試料中の標的物質の濃度を決定する方法によれば、濃度を決定するための指標として蛍光強度の上昇速度を利用していることから、蛍光強度がプラトーに達する前に濃度を決定することが可能である。したがって、プラトーでの蛍光強度に基づいて濃度を決定する従来技術と比べて、より速く試料中の標的物質の濃度を決定することができる。

　なお、標的物質を高い感度で検出するという観点からは、蛍光強度の上昇速度が高い細胞を選択する工程２ｆが重要であるが、標的物質の濃度が検出限界よりも高ければ、高い感度が要求されない場合もある。そこで、本発明の他の側面は、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
　（３ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程と、
　（３ｂ）蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
　（３ｃ）異なる濃度の上記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程３ａ及び工程３ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
　（３ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を上記細胞に接触させる工程と、
　（３ｅ）上記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を上記細胞ごとに算出する工程と、
　（３ｆ）工程３ｅにおいて算出された試料の上昇速度を、工程３ｂ及び工程３ｃにおいて算出された標準試料の上昇速度と比較して、上記試料中の上記標的物質の濃度を算出する工程と、をこの順に備える方法を提供する。

　工程３ａ～３ｆの詳細は、工程２ａ～２ｅ及び２ｇについて説明したとおりである。ただし、工程３ｆで比較される上昇速度は、全ての細胞ついて算出された上昇速度であってよく、任意の一部の細胞について算出された上昇速度あってもよい。上記他の実施形態に係る試料中の標的物質の濃度を決定する方法によれば、濃度を決定するための指標として蛍光強度の上昇速度を利用していることから、蛍光強度がプラトーに達する前に濃度を決定することが可能である。したがって、プラトーでの蛍光強度に基づいて濃度を決定する従来技術と比べて、より速く試料中の標的物質の濃度を決定することができる。特に、試料中の標的物質の濃度が低い場合は蛍光強度がプラトーに達するまで長い時間がかかるため、プラトー達する前に濃度を決定することができる本方法が有用である。

　本発明に係る標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法、及び、試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法には、種々のデバイスを用いることができる。例えば、細胞を保持したフローセル内に標的物質を含む試料を導入して、細胞から発せられる蛍光を上述のとおり分析してもよい。あるいは、単一の細胞を捕捉可能な凹部を複数個備えるデバイスを用いてもよい。凹部に細胞を捕捉した後、凹部に標的物質を含む試料を導入して、細胞から発せられる蛍光を上述のとおり分析することができる。さらに、微細な流路を備えるマイクロデバイスを用いることもできる。

　図１にマイクロ流路デバイスの一例を示す。図１に示すマイクロ流路デバイス１０は、フォーク状の溝を一方の主面に有する基板２と、基板２の溝が形成された側の主面に積層されたカバーガラス１とを備える。基板２に設けられた溝は、流路３と、流路３の一方の端に設けられた３つの注入口４、５、及び６と、流路３のもう一方の端に設けられた注出口７と、を有し、フォーク状の形をしている。基板２は、特に限定されないが、例えば、シリコンゴム（例えば、ジメチルポリシロキサン）等の樹脂製であってよい。基板２が樹脂製である場合、流路３、注入口４、５、及び６、並びに注出口７は、フォトリソグラフィーにより容易に形成することができる。３つの注入口４、５、及び６には、細胞懸濁液又は溶液が充填されたシリンジ（図示せず）をそれぞれ接続してもよい。注入口４、５、及び６から流路３に導入された細胞懸濁液又は溶液は、注出口７からマイクロ流路デバイス１０の外に排出される。流路３の表面は、必要に応じて、ポリリジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リン脂質等の細胞接着性基材で修飾してもよい。

　マイクロ流路デバイス１０は、例えば次のようにして、標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法に使用することができる。まず、流路３の表面を細胞接着性基材で修飾する。注入口４、５、６に、それぞれシリンジＳ４、Ｓ５、Ｓ６を接続する。シリンジＳ４、Ｓ５、Ｓ６には、それぞれ細胞懸濁液、バッファー、標的物質を含む試料が充填されている。バッファーは、例えばリンガー溶液（４０ｍＭ　ＮａＣｌ，５．６ｍＭ　ＫＣｌ，４．５ｍＭ　ＣａＣｌ_２，１１．２６ｍＭ　ＭｇＣｌ_２，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，及び９．４ｍＭ　Ｄ－グルコース，ｐＨ７．２）であってよい。工程１ａに先立ち、細胞懸濁液をシリンジＳ４から流路３に導入する。流路３に導入された細胞は、細胞接着性基材の作用により流路３に接着する。細胞が接着した後、シリンジＳ４からの細胞懸濁液の導入を止める。バッファーをシリンジＳ５から流路３に導入し、流路３に接着しなかった細胞を洗い流す。シリンジＳ５からのバッファーの導入を止め、試料をシリンジＳ６から流路３に導入し、流路３に接着した細胞に接触させる（工程１ａ）。細胞から発せられる蛍光を分析して、上述の方法で応答性の高い細胞を選択する（工程１ｂ、１ｃ）。必要に応じて、上記選択された細胞をピペット等公知の手段により流路３から回収してもよい。マイクロ流路デバイス１０は、同様にして、試料中の標的物質の濃度を決定する方法にも使用することができる。

　あるいは、マイクロ流路デバイス１０は、例えば次のようにして、標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法に使用することもできる。まず、注入口４、５、６に、それぞれシリンジＳ４、Ｓ５、Ｓ６を接続する。シリンジＳ４及びＳ６には標的物質を含む試料が充填されており、シリンジＳ５には細胞懸濁液が充填されている。シリンジＳ４、Ｓ５、及びＳ６から、細胞懸濁液又は試料を流路３に同時に導入する。シリンジＳ４、Ｓ５、及びＳ６の圧力を調整することで、流路３内で、細胞懸濁液の層と、その層を挟む２つの試料の層と、からなる３層の層流を形成する。ここで、細胞懸濁液の層の幅を、細胞が層内で一列に整列するように調整することが好ましい。試料中の標的物質は層流内で拡散していき、流路３の下流では、拡散された標的物質が細胞懸濁液の層内で細胞と接触する（工程１ａ）。細胞から発せられる蛍光を分析して、上述の方法で応答性の高い細胞を選択する（工程１ｂ、１ｃ）。細胞は一列に整列したまま注出口７を介してマイクロ流路デバイス１０の外に排出されるため、必要に応じて、排出された細胞から上記選択された細胞のみを回収することができる。マイクロ流路デバイス１０は、同様にして、試料中の標的物質の濃度を決定する方法にも使用することができる。

　図２にマイクロ流路デバイスの他の例を示す。図２の（Ａ）に示すマイクロ流路デバイス４０は、流路２３と、流路２３に隣接する流路２４と、流路２３と流路２４とをつなぐ連絡部３０とを備える。流路２３、流路２４、及び連絡部３０は、いずれも基板２２に設けられた溝であり、基板２２の溝が形成された側の主面にはカバーガラス２１が積層されている。基板２２は、特に限定されないが、例えば、シリコンゴム（例えば、ジメチルポリシロキサン）等の樹脂製であってよい。基板２２が樹脂製である場合、流路２３、流路２４、及び連絡部３０は、フォトリソグラフィーにより容易に形成することができる。

　流路２３には液体の注入口２５及び２６、並びに注出口２８が設けられており、流路２４には液体の注入口２７及び注出口２９が設けられている。注入口２５には、細胞Ｃを含む懸濁液が注入される。残りの注入口には、試料、標準試料、バッファー等、他の溶液が注入される。注入口２５及び２６から流路２３に導入された細胞懸濁液又は溶液は、注出口２８からマイクロ流路デバイス４０の外に排出され、注入口２７から流路２４に導入された溶液は、注出口２９からマイクロ流路デバイス４０の外に排出される。懸濁液及び溶液は、例えばシリンジを用いて注入口に注入することができる。注入口は、使用する溶液の数だけあってもよいが、一つの流路に対して少なくとも１つの注入口があれば足りる。したがって、注入口２６はなくてもよいし、流路２４及び／又は２３に注入口を１つ以上追加してもよい。

　図２の（Ｂ）に連絡部３０の拡大図を示す。連絡部３０は、流路２３と流路２４とをつなぐ孔３２と、細胞Ｃを捕捉可能な開口部（開口端）３１と、を有する。ここで、細胞Ｃを捕捉可能とは、流路２３内の圧力が流路２４内の圧力よりも高い条件下において、流路２３内に存在する細胞Ｃを流路２３側の開口部３１に保持することができることを意味する。図２では、開口部３１がくぼみを形成しているが、開口部３１の形状は、細胞Ｃを捕捉可能であれば特に限定されない。連絡部３０は、細胞Ｃが通り抜けることができない形状である必要がある。したがって、孔３２の孔径は、細胞Ｃの直径よりも十分に小さいことが好ましい。例えば、細胞がＳｆ２１である場合、孔３２の孔径は、１ μｍ～１５ μｍであってよい。また、図２では、連絡部３０は孔３２を介して流路２３と流路２４とをつないでいるが、孔３２をスリットに置き換えてもよい。開口部３１は、細胞Ｃが存在する流路２３側に設けられてさえいればよく、流路２４側に開口部を設ける必要はない。

　次に、標的物質に対する応答性の高い細胞を、マイクロ流路デバイス４０を用いて選択する方法の例をいくつか説明する。

　マイクロ流路デバイス４０を用いる場合、上記工程１ａは、例えば、
　（Ａ１）流路２３内の圧力が流路２４内の圧力よりも高くなるように流路２３に複数の細胞Ｃを含む懸濁液を導入し、流路２３側の開口部３１に細胞Ｃを捕捉する工程と、
　（Ａ２）流路２３と流路２４との圧力差を維持したまま、流路２３に標的物質を含む試料を導入し、捕捉された細胞Ｃに標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備えてよい。

　工程Ａ１では、注入口２５を介して流路２３に細胞懸濁液を流すことができる。流路２３に細胞Ｃを含む懸濁液を流している間、流路２４には注入口２７を介してリンガー溶液等のバッファーを流すことができる。流路２３と流路２４との圧力差を生み出す方法は特に限定されない。例えば、流路２３と流路２４の形状が同一である場合、流路２３に細胞懸濁液を導入するシリンジの駆動圧力を、流路２４にバッファー導入するシリンジの駆動圧力より高くすることにより、流路２３内の圧力を流路２４内の圧力よりも高くすることができる。

　工程Ａ２では、細胞懸濁液の注入を止め、注入口２６を介して流路２３に試料を導入することができる。このとき、流路２４には引き続きバッファーを流していてもよい。流路２３と流路２４との圧力差は、シリンジの駆動圧力を調整することにより一定に保つことができる。開口部３１に捕捉された細胞Ｃに試料を接触させることにより発せられた蛍光は、工程１ｂにおいて上述のとおり分析され、続く工程１ｃで応答性の高い細胞が選択される。

　工程１ｃにおいて選択された細胞は、
　（１ｄ）流路２４内の圧力が流路２３内の圧力よりも高くなるように流路２４に液体を導入し、捕捉された細胞Ｃを開口部３１から解放する工程と、
　（１ｅ）解放された細胞Ｃのうち上記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備える方法により回収することができる。

　工程１ｄにおいて、流路２４に導入する液体は限定されず、例えば、バッファーであってよい。流路２３と流路２４との圧力差を逆転させる方法は特に限定されない。例えば、流路２３と流路２４の形状が同一である場合、流路２３に試料を導入するシリンジの駆動圧力を、流路２４にバッファー導入するシリンジの駆動圧力よりも低くすることにより、流路２４内の圧力を流路２３内の圧力よりも高くすることができる。圧力差を逆転させることにより解放された細胞Ｃは、注出口２８から回収することができる。

　図２に示すマイクロ流路デバイス４０では、流路２４に注入口は一つしか設けられていないが、流路２４にはもう一つ注入口（以下、注入口２７ｂと呼ぶ。）を追加してもよい。この場合、工程Ａ２では、試料を流路２３ではなく、注入口２７ｂを介して流路２４に導入することができる。この際、流路２３には、注入口２６を介してバッファーを導入することができる。工程１ｄでは、流路２３にバッファーを導入するシリンジの駆動圧力を、流路２４に試料を導入するシリンジの駆動圧力よりも低くすることにより、流路２４内の圧力を流路２３内の圧力よりも高くすることができる。

　上述の例では、使用する懸濁液及び溶液ごとに別々の注入口を設ける例を説明したが、懸濁液及び複数の溶液を単一の注入口から流路２３又は２４内に導入してもよい。

　マイクロ流路デバイス４０は、本発明に係る試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法にも使用することができる。マイクロ流路デバイス４０を用いる場合、上記工程２ａの前に、上記工程Ａ１と同様の工程により、流路２３側の開口部３１に細胞Ｃを捕捉する。また、工程２ａでは、上記工程Ａ２と同様の方法により捕捉された細胞Ｃに標準試料を接触させる。さらに、工程２ｄでは、上記工程Ａ２と同様の方法により、捕捉された細胞Ｃに未知濃度の標的物質を含む試料を接触させる。

　真空グリースを塗布した紙（２５ｍｍ×５ｍｍ）２枚をスライドガラス上に配置し、その上にカバーガラス（１８ｍｍ×１８ｍｍ）を重ねた。紙は、５ｍｍの間隔をあけて互いに平行になるように配置した。スライドガラスの表面は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を吸着させた後、細胞接着性基材であるＰＥＧリン脂質（ＢＡＭ）で修飾した。この装置をフローセルとして用いた。

　ＢｍＯＲ－３タンパク質と、ＧＣａＭＰ６ｓタンパク質と、Ｏｒｃｏタンパク質とを有するＳｆ２１細胞を培地に懸濁し、フローセルに導入した。細胞がスライドガラスの表面に接着した後、フローセルにバッファーを導入して、接着しなかった細胞とともに培地を洗い流した。バッファーとしては、リンガー溶液を用いた。

　フローセルを蛍光顕微鏡にセットし、１００個の細胞の蛍光を観察した。３０ｎＭのＢＡＬを含むバッファーをフローセルに導入し、細胞の蛍光像を数分間観察及び記録した。細胞ごとに、ＢＡＬ溶液を導入する直前の蛍光強度Ｆ０と、ＢＡＬ溶液を導入した後の蛍光強度Ｆｔとを蛍光画像から求め、下式で示されるＩｔを算出し、経時的に記録した。
　　Ｉｔ＝（Ｆｔ－Ｆ０）／Ｆ０×１００（％）
　３００ｎＭ、３０００ｎＭ、及び３００００ｎＭのＢＡＬ溶液を用いて同様の実験を行った。Ｉｔの経時変化を示すグラフを図３に示す。

　図３に示すＩｔの曲線に対して一定の時間幅で直線フィッティングを繰り返し、曲線の傾きの経時変化を求めた。曲線の傾きは蛍光強度の上昇速度を表す。傾きの最大値を細胞ごとに求め、図４に示す傾きの最大値のヒストグラムを作成した。図４の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ３００００ｎＭ、３０００ｎＭ、３００ｎＭのＢＡＬ溶液を用いたときの結果である。ヒストグラムから、上位１００％以内（すなわち、全細胞）、上位３０％、２５％、又は２０％以内の全値をＢＡＬ溶液の濃度ごとに選択し、それぞれの平均値を算出した。結果を図５に示す。

　１，２１・・・カバーガラス、２，２２・・・基板、３，２３，２４・・・流路、４，５，６，２５，２６，２７・・・注入口、７，２８，２９・・・注出口、１０，４０・・・マイクロ流路デバイス、３０・・・連絡部、３１・・・開口部、３２・・・孔、Ｃ・・・細胞。

Claims

　標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法であって、
　（１ａ）標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
　前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
　前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
　（１ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
　（１ｃ）前記複数の細胞のうち、上位５０％以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える、方法。
　第一の流路と、
　前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
　前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項１に記載の方法であって、
　前記工程１ａが、
　　（Ａ１）前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程と、
　　（Ａ２）前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に標的物質を含む試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備え、
　前記工程１ｃの後に、
　　（１ｄ）前記第二の流路内の圧力が前記第一の流路内の圧力よりも高くなるように前記第二の流路に液体を導入し、前記捕捉された細胞を前記開口部から解放する工程と、
　　（１ｅ）前記解放された細胞のうち前記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備える、請求項１に記載の方法。
　前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるＩｔの時間変化率であり、
　前記Ｉｔは、（Ｆｔ－Ｆ０）／Ｆ０であり、
　前記Ｆ０は、前記試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
　前記Ｆｔは、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
　前記所定時間は、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間である、請求項１又は２に記載の方法。
　前記工程１ｃにおいて、前記複数の細胞のうち、上位３０％以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
　（２ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
　前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
　前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
　（２ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
　（２ｃ）異なる濃度の前記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程２ａ及び工程２ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
　（２ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を前記細胞に接触させる工程と、
　（２ｅ）前記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
　（２ｆ）前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位５０％以内であった任意の細胞を選択する工程と、
　（２ｇ）工程２ｅにおいて前記試料について算出された蛍光強度の上昇速度を、工程２ｂ及び工程２ｃにおいて前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度と比較して、前記試料中の前記標的物質の濃度を算出する工程であって、前記比較される上昇速度は、工程２ｆにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である、工程と、を備え、
　工程２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、及び２ｇはこの順に行われ、
　工程２ｆは、工程２ｂの後かつ工程２ｇの前に任意の段階で行われる、方法。
　第一の流路と、
　前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
　前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項３に記載の方法であって、
　前記工程２ａの前に、前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程を備え、
　前記工程２ａが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記標準試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標準試料を接触させる工程を備え、
　前記工程２ｄが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記試料を接触させる工程を備える、請求項５に記載の方法。
　前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるＩｔの時間変化率であり、
　前記Ｉｔは、（Ｆｔ－Ｆ０）／Ｆ０であり、
　前記Ｆ０は、前記試料又は前記標準試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
　前記Ｆｔは、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
　前記所定時間は、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間である、請求項５又は６に記載の方法。
　前記工程２ｆにおいて、前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位３０％以内であった任意の細胞を選択する、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記蛍光強度の上昇速度が、Ｉｔの時間変化率の最大値である、請求項３又は７に記載の方法。
　試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
　（３ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
　前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
　前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
　（３ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
　（３ｃ）異なる濃度の前記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程３ａ及び工程３ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
　（３ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を前記細胞に接触させる工程と、
　（３ｅ）前記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
　（３ｆ）工程３ｅにおいて前記試料について算出された蛍光強度の上昇速度を、工程３ｂ及び工程３ｃにおいて前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度と比較して、前記試料中の前記標的物質の濃度を算出する工程と、をこの順に備える方法。
　前記標的物質が匂い物質であり、
　前記複数の細胞が、昆虫の嗅覚受容体及びカルシウム感受性蛍光タンパク質を有する昆虫細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記標的物質がボンビカールであり、
　前記複数の細胞が、ＢｍＯＲ－３タンパク質及びＧＣａＭＰ６ｓタンパク質を有するＳｆ２１細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。