TW202040120A - 選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法、及決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法包括如下步驟:(1a)使包含目標物質之樣品接觸複數個細胞,上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞,上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光;(1b)計算上述每個細胞之螢光強度之上升速度;(1c)選擇上述複數個細胞中表現出前50%以內之上述螢光強度之上升速度之任意細胞。根據本發明,能夠以高感度檢測樣品中之目標物質。
Description
本發明係關於一種選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法、及決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法。
先前,眾所周知有一種利用昆蟲識別氣味之結構檢測有氣味之物質之方法。例如,專利文獻1中記載有一種方法,其使樣品接觸共表現昆蟲之嗅覺受體蛋白質及螢光蛋白質之草地黏蟲細胞,而檢測樣品中之有氣味之物質。該方法中,使包含有氣味之物質之樣品接觸保存有細胞芯片之容器,比較有氣味之物質接觸之前之容器之螢光圖像之平均亮度值與有氣味之物質接觸之後之容器之螢光圖像之平均亮度值,於平均亮度值之增加率在特定之值以上之情形時,判定為已檢測出有氣味之物質。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:日本專利特開2013-27376號公報
[發明所欲解決之問題]
專利文獻1所記載之方法存在檢測靈敏度不足之情況。對此,本發明之目的在於以高感度檢測樣品中之目標物質。
[解決問題之技術手段]
本發明之選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法包括如下步驟:(1a)使包含目標物質之樣品接觸複數個細胞,上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞,上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光;(1b)計算上述每個細胞之螢光強度之上升速度;(1c)選擇上述複數個細胞中表現出前50%以內之上述螢光強度之上升速度的任意細胞。
上述方法可使用微流路器件實施。微流路器件具有:第一流路;第二流路,其與上述第一流路相鄰;及聯絡部,其係連接上述第一流路與上述第二流路者,且於上述第一流路側具有能夠捕捉上述細胞之開口部。上述步驟1a可包括如下步驟:(A1)為使上述第一流路內之壓力比上述第二流路內之壓力更高,而將包含上述複數個細胞之懸浮液導入上述第一流路,並於上述第一流路側之開口部捕捉上述細胞;(A2)維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將包含目標物質之樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使包含上述目標物質之樣品接觸上述被捕捉之細胞。上述方法中,於上述步驟1c之後,可包括如下步驟:(1d)為使上述第二流路內之壓力比上述第一流路內之壓力更高,而將液體導入上述第二流路,自上述開口部釋放上述被捕捉之細胞;(1e)回收上述被釋放之細胞中上述被選擇之任意細胞。
上述步驟1c中,可選擇上述複數個細胞之中表現出前30%以內之上述螢光強度之上升速度之任意細胞。
本發明之決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,包括如下步驟:(2a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞,上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞,上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光;(2b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度;(2c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟2a及步驟2b之組合,並就各標準樣品計算螢光強度之上升速度;(2d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞;(2e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後之螢光強度之上升速度;(2f)選擇上述細胞中之、就上述樣品或任一上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度在前50%以內之任意細胞;及(2g)比較步驟2e中就上述樣品所計算出之螢光強度之上升速度與步驟2b及步驟2c中就上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度,計算上述樣品中之上述目標物質之濃度,上述被比較之上升速度係就步驟2f中被選擇之細胞所計算出之上升速度;步驟2a、2b、2c、2d、2e及2g係按照該順序進行,步驟2f於步驟2b之後且步驟2g之前的任意階段進行。
上述方法可使用微流路器件實施。微流路器件具有:第一流路;第二流路,其與上述第一流路相鄰;及聯絡部,其係連接上述第一流路與上述第二流路者,且於上述第一流路側具有能夠捕捉上述細胞之開口部。上述方法可包括如下步驟:於上述步驟2a之前,為使上述第一流路內之壓力比上述第二流路內之壓力更高,而將包含上述複數個細胞之懸浮液導入上述第一流路,並於上述第一流路側之開口部捕捉上述細胞。上述步驟2a可包括如下步驟:維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將上述標準樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使上述標準樣品接觸上述被捕捉之細胞。上述步驟2d可包括如下步驟:維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將上述樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使上述樣品接觸上述被捕捉之細胞。
於上述步驟2f中,可選擇上述細胞中之、就上述樣品或任一上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度為前30%以內之任意細胞。
上述任一方法中,上述螢光強度之上升速度可為特定時間內It之時間變化率。It為(Ft-F0)/F0。F0表示上述樣品或上述標準樣品接觸之前之上述細胞之螢光強度,Ft表示上述樣品或上述標準樣品接觸後,且上述螢光強度達到平線區之前之任意階段中上述細胞之螢光強度。上述特定時間係上述樣品或上述標準樣品接觸後,且上述螢光強度達到平線區之前之任意兩個階段之間的時間。上述螢光強度之上升速度可為It之時間變化率之最大值。
本發明之其他態樣之決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,依序包括如下步驟:(3a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞,上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞,上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光;(3b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度;(3c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟3a及步驟3b之組合,就各標準樣品計算出其螢光強度之上升速度;(3d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞;(3e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後之螢光強度之上升速度;及(3f)比較步驟3e中就上述樣品所計算出之螢光強度之上升速度與步驟3b及步驟3c中就上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度,並計算上述樣品中之上述目標物質之濃度。
上述任一方法中,上述目標物質可為有氣味之物質,上述複數個細胞可為具有昆蟲之嗅覺受體及鈣敏感性螢光蛋白質之昆蟲細胞。上述任一方法中,上述目標物質可為蠶蛾醛(Bombykal,以下省略為BAL),上述複數個細胞可為具有BmOR-3蛋白質及GCaMP6s蛋白質之Sf21細胞。
[發明之效果]
藉由使用根據本發明之方法所選擇之細胞,能夠以高感度檢測樣品中之目標物質。又,根據本發明之決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,即便目標物質之濃度較低,亦能決定其濃度。
本發明之選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法包括如下步驟:
(1a)使包含目標物質之樣品接觸複數個細胞;
(1b)計算每個細胞之螢光強度之上升速度;及
(1c)選擇上述複數個細胞中表現出前50%以內之上述螢光強度之上升速度之任意細胞。
本發明中所使用之細胞為具有目標物質之受體與螢光指示劑之細胞。
目標物質並無特別限定,可為:BAL、蠶蛾醇、1-辛烯-3-醇、土腥素、苯乙醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苄醇、水楊酸甲酯、苯甲醛、戊醛、己醛、E2-己醛、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-甲基苯酚等有氣味之物質。
目標物質之受體並無特別限定,例如可為上述之有氣味之物質之受體。有氣味之物質之受體例如可為蠶蛾、黑腹果蠅、虐蚊等昆蟲之嗅覺受體。作為蠶蛾之嗅覺受體,例如可列舉作為BAL之受體之BmOR-3蛋白質、及作為蠶蛾醇之受體之BmOR-1蛋白質。作為黑腹果蠅之嗅覺受體,例如可列舉作為1-辛烯-3-醇之受體之Or13a蛋白質、及作為土腥素之受體之Or56a蛋白質。
螢光指示劑只要是發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光之物質則並無特別限定。螢光指示劑例如可為螢光蛋白質或螢光色素。螢光指示劑較佳為經遺傳性編碼之螢光蛋白質。例如,於目標物質與受體之結合引起細胞內之離子濃度之變化之情形時,螢光指示劑亦可為對該離子具有敏感性之螢光蛋白質或螢光色素。螢光蛋白質之例為屬於鈣敏感性螢光蛋白質之、GCaMP3蛋白質、GCaMP6s蛋白質、及GCaMP7蛋白質。螢光色素之例為Fluo 3-AM、Rhod 2-AM、Calbryte(商標) 520、Fluo 4-AM、Fura 2-AM、Indo 1-AM、Calbryte 590、Calbryte 630等鈣敏感性螢光色素。
細胞可進而包含輔助受體。作為輔助受體之例,可列舉作為昆蟲之嗅覺受體之輔助受體之Orco蛋白質。
細胞例如可為來自草地黏蟲之細胞。作為來自草地黏蟲之細胞,例如可列舉Sf21及Sf9。
步驟1a中使包含目標物質之樣品接觸複數個細胞。藉由使樣品接觸細胞,樣品中之目標物質與受體結合,其結果,螢光指示劑發出螢光。例如,於受體為BmOR-3蛋白質等鈣離子通道之情形時,其與目標物質之受體之結合引起鈣離子流入細胞內。鈣離子與存在於細胞內之鈣敏感性螢光指示劑結合,螢光指示劑發出螢光。藉由使樣品繼續接觸細胞,雖然細胞內之鈣濃度上升,且自細胞發出之螢光之強度亦上升,但是鈣離子滲入細胞內之速度逐漸降低,細胞內鈣濃度達到平線區(固定),因此,螢光強度亦成為平線區。
使樣品接觸細胞之方法並無特別限定,於樣品為液體之情形時,例如可將細胞浸泡於樣品特定時間,亦可使樣品以特定之流速流動,將細胞配置於該流體之中。於樣品為氣體之情形時,例如可將細胞配置於充滿樣品之空間。步驟1a中樣品之濃度可為未知亦可為已知。
步驟1b中計算每個細胞之螢光強度之上升速度。螢光強度可為測定值本身(絕對值),亦可為相對於樣品接觸之前之細胞之螢光強度等之相對值。螢光強度之上升速度可為特定時間內絕對或相對的螢光強度之時間變化率。
於利用特定時間內絕對的螢光強度之時間變化率作為螢光強度之上升速度之情形時,螢光強度之上升速度可藉由計算特定時間內Ft之時間變化率dFt/dt求出。其中,Ft表示使樣品接觸後,且螢光強度達到平線區之前之任意階段中細胞之螢光強度(測定值本身)。所謂特定時間是指,使樣品接觸後且螢光強度達到平線區之前之任意兩個階段之間的時間。dFt/dt可藉由計算對應於樣品接觸後所經過之時間繪製Ft所獲得之曲線之斜率而求出。作為螢光強度之上升速度,可利用dFt/dt之最大值。
作為一例,若將樣品接觸後經過時間t1、t2後之階段中細胞之螢光強度分別用Ft1、Ft2表示,則螢光強度之上升速度可使用下式(1)計算。
螢光強度之上升速度=(Ft2-Ft1)/(t2-t1)・・・(1)
其中,樣品接觸後經過時間t1後之階段及經過時間t2後之階段均為螢光強度達到平線區之前之階段,且t2>t1。
於利用特定時間內相對的螢光強度之時間變化率作為螢光強度之上升速度之情形時,螢光強度之上升速度可藉由計算特定時間內Ft/F0之時間變化率d/dt(Ft/F0)而求出。其中,F0表示樣品接觸之前之細胞之螢光強度(測定值本身)。所謂特定時間是指,樣品接觸後且螢光強度達到平線區之前之任意兩個階段之間的時間。作為一例,螢光強度之上升速度可使用下式(2)計算。
螢光強度之上升速度=(Ft2-Ft1)/F0/(t2-t1)・・・(2)
或者,螢光強度之上升速度可藉由特定時間內It之時間變化率dIt/dt求出。其中,It為(Ft-F0)/F0。所謂特定時間是指,樣品接觸後且螢光強度達到平線區前之任意兩個階段之間之時間。dIt/dt可藉由計算對應於樣品接觸後所經過之時間繪製It所獲得之曲線之斜率而求出。作為螢光強度之上升速度,可利用dIt/dt之最大值。作為一例,螢光強度之上升速度可使用下式(3)計算。若將式(3)變形則可得到與式(2)相同之式子。
螢光強度之上升速度=(It2-It1)/(t2-t1)・・・(3)
步驟1c中選擇全部細胞之中表現出前50%以內之螢光強度之上升速度之任意細胞。較佳為選擇全部細胞之中螢光強度之上升速度之最大值在前50%、40%、30%、25%、或20%以內之細胞。所選擇之細胞可為螢光強度之上升速度在前50%以內之全部細胞,亦可為部分螢光強度之上升速度在前50%以內之細胞。
首先回收被選擇之細胞,繼而可將其用於檢測樣品中之目標物質或決定其濃度。或者,可不回收被選擇之細胞而直接將其用於檢測樣品中之目標物質或決定其濃度。因藉由本發明之方法所選擇之細胞針對目標物質表現出高回應性,故而,藉由使用本發明之細胞,能夠以高感度檢測樣品中之目標物質。
使用經選擇及回收之細胞檢測樣品中之目標物質或決定其濃度之方法並無特別限定,可使用公知之方法。例如,使用公知之方法培養被回收之細胞,分析使樣品接觸培養細胞時所發出之螢光,藉此可檢測樣品中之目標物質或決定其濃度。但,於被選擇之細胞所包含之螢光指示劑未經遺傳性編碼之情形時,螢光色素等螢光指示劑必需存在於培養細胞內。為了檢測目標物質及決定其濃度,可利用螢光強度之上升速度,亦可利用於螢光強度達到平線區之前之任意階段或達到平線區後之階段之螢光強度。
亦可不回收被選擇之細胞而將其直接用於檢測樣品中之目標物質。於此情形時,使可能包含目標物質之樣品至少接觸全部細胞中上述被選擇之細胞,分析自上述被選擇之細胞所發出之螢光,藉此能夠檢測樣品中之目標物質之存在。
亦可不回收被選擇之細胞而直接將其用於決定樣品中之目標物質之濃度。即,本發明係一種決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,其亦提供一種包括如下步驟之方法:
(2a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞;
(2b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度;
(2c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟2a及步驟2b之組合,就各標準樣品計算出其螢光強度之上升速度;
(2d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞;
(2e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後的螢光強度之上升速度;
(2f)選擇上述細胞之中就上述樣品或任一上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度在前50%以內之任意細胞;及
(2g)比較步驟2e中就上述樣品所計算出之螢光強度之上升速度與步驟2b及步驟2c中就上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度,計算上述樣品中之上述目標物質之濃度。但,步驟2g中所比較之上升速度係就步驟2f中被選擇之細胞所計算出之上升速度。又,步驟2a、2b、2c、2d、2e、及2g係按照該順序進行,步驟2f於步驟2b之後且步驟2g之前之任意階段進行。
步驟2a~步驟2c係關於使用了標準樣品時之細胞之螢光強度之上升速度之測定。步驟2a及步驟2b之詳細情況如步驟1a及步驟1b之說明。但,步驟2a及步驟2b中使用包含已知濃度之目標物質之標準樣品而取代樣品。步驟2c中藉由使用1個以上之標準樣品重複步驟2a及步驟2b之組合,使目標物質之濃度與各細胞之螢光強度之上升速度建立對應關係。可製作表示目標物質之濃度與各細胞之螢光強度之上升速度之關係的校準曲線。所使用之標準樣品之數量並無特別限定,藉由使用更多標準樣品,能夠製作更加準確之校準曲線,因此,能夠更加準確地決定樣品中之目標物質之濃度。
步驟2d及步驟2e係關於使用包含未知濃度之目標物質之樣品時之細胞之螢光強度之上升速度之測定。步驟2d及步驟2e之詳細情況如步驟1a及步驟1b之說明。但,步驟2d及步驟2e中,使用包含未知濃度之目標物質之樣品。
步驟2f係關於細胞之選擇。步驟2f之詳細情況如步驟1c之說明。但,步驟2f中細胞之選擇係基於任一步驟2b、步驟2c、及步驟2e中所獲得之螢光強度之上升速度之資料而進行。換言之,步驟2f中可選擇全部細胞之中步驟2b所計算出之上升速度在前50%以內之細胞,亦可選擇全部細胞之中步驟2c所計算出之上升速度在前50%以內之細胞,亦可選擇全部細胞之中步驟2e所計算出之上升速度在前50%以內之細胞。即,本步驟只要是在步驟2b之後進行即可,可在步驟2c之前進行,亦可在步驟2d之前進行。
於在步驟2b與步驟2c之間進行細胞之選擇(步驟2f)之情形時,步驟2c及步驟2e中螢光強度之上升速度之測定無需對全部細胞進行,只要至少對步驟2f中被選擇之細胞進行便足夠。因此,步驟2c及步驟2d中,只要使標準樣品或樣品至少接觸步驟2f中被選擇之細胞便足夠。同樣地,於在步驟2c與步驟2d之間進行細胞之選擇(步驟2f)之情形時,步驟2e中螢光強度之上升速度之測定無需對全部細胞進行,只要至少對步驟2f中被選擇之細胞進行便足夠。又,步驟2d中,只要使樣品至少接觸步驟2f中被選擇之細胞便足夠。
步驟2g係關於樣品中之目標物質之濃度之決定。本步驟中,例如藉由使用校準曲線,比較就包含未知濃度之目標物質之樣品所計算出之螢光強度之上升速度之值(步驟2e)與就標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度之值(步驟2b及步驟2c),決定樣品中之目標物質之濃度。
因根據決定上述實施形態之樣品中之目標物質之濃度之方法,基於針對目標物質表現出高回應性之細胞之螢光而決定濃度,故能夠以高感度檢測樣品中之目標物質,因此,即便目標物質之濃度較低,亦能夠決定其濃度。又,根據上述實施形態之決定樣品中之目標物質之濃度之方法,將螢光強度之上升速度用作用以決定濃度之指標,故而能夠於螢光強度達到平線區之前決定濃度。因此,與基於在平線區之螢光強度而決定濃度之先前技術相比,能夠更加快速地決定樣品中之目標物質之濃度。
再者,就以高感度檢測目標物質之觀點而言,雖然選擇螢光強度之上升速度快之細胞之步驟2f重要,但是若目標物質之濃度比檢測限界更高,則亦存在不要求高感度之情況。對此,本發明之其他態樣係決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,提供一種依序包括如下步驟之方法:
(3a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞;
(3b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度;
(3c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟3a及步驟3b之組合,就各標準樣品計算螢光強度之上升速度;
(3d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞;
(3e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後之螢光強度之上升速度;及
(3f)比較步驟3e中所計算出之樣品之上升速度與步驟3b及步驟3c中所計算出之標準樣品之上升速度,並計算上述樣品中之上述目標物質之濃度。
步驟3a~3f之詳細情況如步驟2a~2e及2g之說明。但,步驟3f中所比較之上升速度可為就全部細胞所計算出之上升速度,亦可為就任意之一部分細胞所計算出之上升速度。根據決定上述其他實施形態之樣品中之目標物質之濃度之方法,因利用螢光強度之上升速度作為用以決定濃度之指標,故能夠在螢光強度達到平線區之前決定濃度。因此,與基於平線區內之螢光強度而決定濃度之先前技術相比,能夠更快速地決定樣品中之目標物質之濃度。尤其是,於樣品中之目標物質之濃度較低之情形時,因直到螢光強度達到平線區要花費較長時間,故能夠於達到平線區之前決定濃度之本方法有用。
本發明之選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法、及決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,可使用各種器件。例如,可將包含目標物質之樣品導入保存有細胞之流槽內,以如上方式分析自細胞所發出之螢光。或者,亦可使用具有複數個能夠捕捉單一細胞之凹部之器件。於凹部捕捉細胞後,將包含目標物質之樣品導入凹部,可以如上方式分析自細胞所發出之螢光。進而,亦可使用具有微細流路之微型器件。
圖1表示微流路器件之一例。圖1所示之微流路器件10具有:於一主面具有叉架狀之溝槽之基板2、及積層於基板2之溝槽形成之側之主面之覆蓋玻璃1。設置於基板2之溝槽為叉架狀,具有:流路3;3個注入口4、5、及6,其等設置於流路3之一端;及注出口7,其設置於流路3之另一端。基板2並無特別限定,例如可為矽橡膠(例如二甲基聚矽氧烷)等樹脂製。於基板2為樹脂製之情形時,流路3,注入口4、5、及6,及注出口7可藉由光微影法容易地形成。3個注入口4、5、及6可分別連接填充了細胞懸浮液或溶液之注射器(未圖示)。自注入口4、5、及6導入流路3之細胞懸浮液或溶液自注出口7排出至微流路器件10之外。流路3之表面視需要可使用聚離胺酸、聚乙二醇(PEG)磷脂質等細胞接著性基材修飾。
微流路器件10例如可以如下方式用於選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法。首先,使用細胞接著性基材修飾流路3之表面。注射器S4、S5、S6分別連接於注入口4、5、6。注射器S4、S5、S6中,分別填充有細胞懸浮液、緩衝液、包含目標物質之樣品。緩衝液例如可為林格氏液(40 mM NaCl、5.6 mM KCl、4.5 mM CaCl2
、11.26 mM MgCl2
、10 mM HEPES、及9.4 mM D-葡萄糖,pH7.2)。在步驟1a之前,將細胞懸浮液自注射器S4導入流路3。導入至流路3之細胞藉由細胞接著性基材之作用接著於流路3。細胞接著後,停止自注射器S4導入細胞懸浮液。將緩衝液自注射器S5導入流路3,沖洗未接著於流路3之細胞。停止自注射器S5導入緩衝液,將樣品自注射器S6導入流路3,使其與接著於流路3之細胞接觸(步驟1a)。分析自細胞所發出之螢光,使用上述方法選擇回應性高之細胞(步驟1b、1c)。可視需要藉由移液管等公知之方法自流路3回收上述被選擇之細胞。微流路器件10同樣亦可用於決定樣品中之目標物質之濃度之方法。
或者,微流路器件10亦可用於例如以如下方式選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法。首先,分別將注射器S4、S5、S6連接於注入口4、5、6。注射器S4及S6中填充有包含目標物質之樣品,注射器S5中填充有細胞懸浮液。自注射器S4、S5、及S6,同時將細胞懸浮液或樣品導入流路3。藉由調整注射器S4、S5、及S6之壓力,於流路3內形成3層之層流,該3層之層流包括細胞懸浮液之層及夾著該層之2層樣品層。其中,較佳為將細胞懸浮液之層之寬度調整為細胞於層內排列為一行。樣品中之目標物質於層流內擴散,在流路3之下游,經擴散之目標物質於細胞懸浮液之層內與細胞接觸(步驟1a)。分析自細胞所發出之螢光,使用上述方法選擇回應性高之細胞(步驟1b、1c)。因細胞保持排列為一行經由注出口7被排出至微流路器件10之外,故可視需要自所排出之細胞僅回收上述被選擇之細胞。微流路器件10同樣亦可用於決定樣品中之目標物質之濃度之方法。
圖2表示微流路器件之其他例。圖2之(A)所示之微流路器件40具有:流路23、與流路23相鄰之流路24、及連接流路23與流路24之聯絡部30。流路23、流路24、及聯絡部30均為設置於基板22之溝槽,於基板22之溝槽形成之側之主面積層有覆蓋玻璃21。基板22並無特別限定,例如可為矽橡膠(例如二甲基聚矽氧烷)等樹脂製。於基板22為樹脂製之情形時,流路23、流路24、及聯絡部30可藉由光微影法容易地形成。
於流路23設置有液體之注入口25及26、及注出口28,於流路24設置有液體之注入口27及注出口29。將包含細胞C之懸浮液注入至注入口25。將樣品、標準樣品、緩衝液等其他溶液注入其餘注入口中。自注入口25及26導入流路23之細胞懸浮液或溶液自注出口28被排出至微流路器件40之外,自注入口27導入流路24之溶液自注出口29被排出至微流路器件40之外。懸浮液及溶液例如可使用注射器注入至注入口。注入口之數量可與使用溶液之數量對應,只要保證一個流路至少有一個注入口即足夠。因此,可無注入口26,亦可於流路24及/或23追加1個以上之注入口。
圖2之(B)表示聯絡部30之放大圖。聯絡部30具有:連接流路23與流路24之孔32、及能夠捕捉細胞C之開口部(開口端)31。其中,所謂能夠捕捉細胞C是指,可於流路23內之壓力比流路24內之壓力更高之條件下,能夠將存在於流路23內之細胞C保存於流路23側之開口部31。圖2中雖然開口部31形成凹處,但是開口部31之形狀只要是能夠捕捉細胞C之形狀則並無特別限定。聯絡部30必需為細胞C不可穿過之形狀。因此,孔32之孔徑較佳為足夠小於細胞C之直徑。例如,於細胞為Sf21之情形時,孔32之孔徑可為1 μm~15 μm。又,雖然圖2中聯絡部30經由孔32將流路23與流路24相連接,但是可將孔32替換為狹縫。開口部31只要設置於存在細胞C之流路23側即可,無需於流路24側設置開口部。
繼而,對使用微流路器件40選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法的一些示例進行說明。
於使用微流路器件40之情形時,上述步驟1a例如可包括如下步驟:
(A1)為使流路23內之壓力比流路24內之壓力更高,而將包含複數個細胞C之懸浮液導入流路23,並於流路23側之開口部31處捕捉細胞C;
(A2)維持流路23與流路24之壓力差不變,將包含目標物質之樣品導入流路23,並使包含目標物質之樣品接觸被捕捉之細胞C。
步驟A1中可經由注入口25將細胞懸浮液流入流路23。於將包含細胞C之懸浮液流入流路23之期間,可經由注入口27將林格氏液等緩衝液流入流路24。使流路23與流路24之間產生壓力差之方法並無特別限定。例如,於流路23與流路24之形狀相同之情形時,藉由使將細胞懸浮液導入流路23之注射器之驅動壓力比將緩衝液導入流路24之注射器之驅動壓力更高,能夠使流路23內之壓力比流路24內之壓力更高。
步驟A2中可停止注入細胞懸浮液,經由注入口26將樣品導入流路23。此時,可繼續將緩衝液流入流路24。流路23與流路24之壓力差可藉由調整注射器之驅動壓力保持固定。藉由使樣品接觸被開口部31捕捉之細胞C所發出之螢光,於步驟1b經如上所述之分析,繼續於步驟1c選擇回應性高之細胞。
步驟1c中被選擇之細胞可藉由包括如下步驟之方法回收:
(1d)為使流路24內之壓力比流路23內之壓力更高,而將液體導入流路24,自開口部31釋放被捕捉之細胞C;
(1e)自被釋放之細胞C之中回收上述被選擇之任意細胞。
步驟1d中導入流路24之液並無限定,例如可為緩衝液。使流路23與流路24之壓力差反轉之方法並無特別限定。例如,於流路23與流路24之形狀相同之情形時,藉由使將樣品導入流路23之注射器之驅動壓力比將緩衝液導入流路24之注射器之驅動壓力低,能夠使流路24內之壓力比流路23內之壓力高。藉由使壓力差反轉釋放之細胞C可自注出口28回收。
圖2所示之微流路器件40中,雖然於流路24僅設置有一個注入口,但亦可於流路24再追加一個注入口(以下稱作注入口27b)。於此情形時,步驟A2中可不經由流路23而經由注入口27b將樣品導入流路24。此時,可經由注入口26將緩衝液導入流路23。步驟1d中藉由使將緩衝液導入流路23之注射器之驅動壓力比將樣品導入流路24之注射器之驅動壓力低,能夠使流路24內之壓力比流路23內之壓力高。
上述之例中,雖然對根據使用之各懸浮液及溶液而分別設置注入口之例進行了說明,但是亦可自單一之注入口將懸浮液及複數個溶液導入流路23或24內。
微流路器件40亦可用於本發明之決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法。於使用微流路器件40之情形時,在上述步驟2a之前,藉由與上述步驟A1相同之步驟,於流路23側之開口部31處捕捉細胞C。又,步驟2a中藉由與上述步驟A2相同之方法使標準樣品接觸被捕捉之細胞C。進而,步驟2d中藉由與上述步驟A2相同之方法,使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸被捕捉之細胞C。
[實施例]
將2張塗佈了真空潤滑脂之紙(25 mm×5 mm)配置於載玻片上,並在其上疊加覆蓋玻璃(18 mm×18 mm)。紙係以隔以5 mm之間隔相互平行之方式配置。載玻片之表面吸附牛血清白蛋白(BSA,Bovine Serum Albumin)後,藉由作為細胞接著性基材之PEG磷脂質(BAM)修飾。將該裝置用作流槽。
使包含BmOR-3蛋白質、GCaMP6s蛋白質、Orco蛋白質之Sf21細胞懸浮於培養基,並導入流槽。於細胞接著於載玻片之表面後,將緩衝液導入流槽,與未接著之細胞一同沖洗培養基。使用林格氏液作為緩衝液。
將流槽放置於螢光顯微鏡,觀察100個細胞之螢光。將包含30 nM之BAL之緩衝液導入流槽,觀察並記錄細胞之螢光像數分鐘。根據螢光圖像求出每個細胞之剛要導入BAL溶液之前之螢光強度F0、及導入BAL溶液之後之螢光強度Ft,計算下式所示之It,並經時性地進行記錄。
It=(Ft-F0)/F0×100(%)
使用300 nM、3000 nM、及30000 nM之BAL溶液進行了同樣之實驗。表示It之經時變化之曲線圖如圖3所示。
對圖3所示之It之曲線以固定之時間跨度重複直線擬合,求出曲線之斜率之經時變化。曲線之斜率表示螢光強度之上升速度。求出每個細胞之斜率之最大值,製作圖4所示之斜率之最大值之柱狀圖。圖4之(A)、(B)、(C)分別為使用30000 nM、3000 nM、300 nM之BAL溶液時之結果。根據柱狀圖,針對每個BAL溶液之濃度選擇前100%以內(即,全部細胞)、前30%、25%、或20%以內之全值,並計算各者之平均值。結果如圖5所示。
1:覆蓋玻璃
2:基板
3:流路
4:注入口
5:注入口
6:注入口
7:注出口
10:微流路器件
21:覆蓋玻璃
22:基板
23:流路
24:流路
25:注入口
26:注入口
27:注入口
28:注出口
29:注出口
30:聯絡部
31:開口部
32:孔
40:微流路器件
C:細胞
圖1係可用於選擇回應性高之細胞、及決定目標物質之濃度之微流路器件之模式圖。
圖2(A)、(B)係可用於選擇回應性高之細胞、及決定目標物質之濃度之微流路器件之模式圖。
圖3係表示It之經時變化之曲線圖。
圖4係表示螢光強度之最大上升速度之分佈之柱狀圖。(A)、(B)、(C)分別為使用了30000 nM、3000 nM、300 nM之BAL溶液時之結果。
圖5係表示圖4之分佈中之前100%、30%、25%、及20%以內之值的平均值之曲線圖。
Claims (12)
- 一種方法,其係選擇針對目標物質之回應性高之細胞之方法,包括如下步驟: (1a)使包含目標物質之樣品接觸複數個細胞, 上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞, 上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光; (1b)計算上述每個細胞之螢光強度之上升速度;及 (1c)選擇上述複數個細胞之中表現出前50%以內之上述螢光強度之上升速度之任意細胞。
- 如請求項1之方法,其係使用微流路器件實施之方法,該微流路器件具有: 第一流路; 第二流路,其與上述第一流路相鄰;及 聯絡部,其係連接上述第一流路與上述第二流路者,且於上述第一流路側具有能夠捕捉上述細胞之開口部; 上述步驟1a包括如下步驟: (A1)為使上述第一流路內之壓力比上述第二流路內之壓力更高,而將包含上述複數個細胞之懸浮液導入上述第一流路,並於上述第一流路側之開口部捕捉上述細胞; (A2)維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將包含目標物質之樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使包含上述目標物質之樣品接觸上述被捕捉之細胞; 上述步驟1c之後,具有如下步驟: (1d)為使上述第二流路內之壓力比上述第一流路內之壓力更高,而將液體導入上述第二流路,自上述開口部釋放上述被捕捉之細胞; (1e)回收上述被釋放之細胞中上述被選擇之任意細胞。
- 如請求項1或2之方法,其中上述螢光強度之上升速度係特定時間內It之時間變化率, 上述It為(Ft-F0)/F0, 上述F0表示使上述樣品接觸之前之上述細胞之螢光強度, 上述Ft表示使上述樣品接觸後且上述螢光強度達到平線區之前之任意階段中上述細胞之螢光強度, 上述特定時間係使上述樣品接觸後且上述螢光強度達到平線區之前之任意兩個階段之間之時間。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中於上述步驟1c中,選擇上述複數個細胞之中表現出前30%以內上述螢光強度之上升速度之任意細胞。
- 一種方法,其係決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,包括如下步驟: (2a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞, 上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞, 上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光; (2b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度; (2c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟2a及步驟2b之組合,就各標準樣品計算螢光強度之上升速度; (2d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞; (2e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後之螢光強度之上升速度; (2f)選擇上述細胞之中就上述樣品或任一上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度在前50%以內之任意細胞;及 (2g)比較步驟2e中就上述樣品所計算出之螢光強度之上升速度與步驟2b及步驟2c中就上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度,計算上述樣品中之上述目標物質之濃度,上述被比較之上升速度係就步驟2f中被選擇之細胞所計算出之上升速度; 步驟2a、2b、2c、2d、2e及2g係按照該順序進行, 步驟2f係於步驟2b之後且步驟2g之前之任意階段進行。
- 如請求項5之方法,其使用微流路器件實施,該微流路器件具有: 第一流路; 第二流路,其與上述第一流路相鄰;及 聯絡部,其係連接上述第一流路與上述第二流路者,且於上述第一流路側具有能夠捕捉上述細胞之開口部; 上述方法中,於上述步驟2a之前具有如下步驟:為使上述第一流路內之壓力比上述第二流路內之壓力更高,而將包含上述複數個細胞之懸浮液導入上述第一流路,並於上述第一流路側之開口部捕捉上述細胞; 上述步驟2a包括如下步驟:維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將上述標準樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使上述標準樣品接觸上述被捕捉之細胞; 上述步驟2d包括如下步驟:維持上述第一流路與上述第二流路之壓力差不變,將上述樣品導入上述第一流路或上述第二流路,使上述樣品接觸上述被捕捉之細胞。
- 如請求項5或6之方法,其中上述螢光強度之上升速度係特定時間內It之時間變化率, 上述It為(Ft-F0)/F0, 上述F0表示使上述樣品或上述標準樣品接觸之前之上述細胞之螢光強度, 上述Ft表示使上述樣品或上述標準樣品接觸後且於上述螢光強度達到平線區之前之任意階段中上述細胞之螢光強度, 上述特定時間係使上述樣品或上述標準樣品接觸後且上述螢光強度達到平線區之前之任意兩個階段之間之時間。
- 如請求項5至7中任一項之方法,其中上述步驟2f中,自上述細胞之中選擇就上述樣品或任一上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度在前30%以內之任意細胞。
- 如請求項3或7之方法,其中上述螢光強度之上升速度為It之時間變化率之最大值。
- 一種方法,其係決定樣品中未知濃度之目標物質之濃度之方法,其依序包括如下步驟: (3a)使包含已知濃度之目標物質之標準樣品接觸複數個細胞, 上述細胞係具有上述目標物質之受體與螢光指示劑之細胞, 上述螢光指示劑發出上述目標物質與上述受體結合所得之螢光; (3b)計算每個上述細胞之螢光強度之上升速度; (3c)使用1個以上包含不同濃度之上述目標物質之標準樣品,重複步驟3a及步驟3b之組合,就各標準樣品計算螢光強度之上升速度; (3d)使包含未知濃度之目標物質之樣品接觸上述細胞; (3e)計算每個上述細胞之使上述樣品接觸後之螢光強度之上升速度;及 (3f)比較步驟3e中就上述樣品所計算出之螢光強度之上升速度與步驟3b及步驟3c中就上述標準樣品所計算出之螢光強度之上升速度,並計算上述樣品中之上述目標物質之濃度。
- 如請求項1至10中任一項之方法,其中上述目標物質為有氣味之物質, 上述複數個細胞係具有昆蟲之嗅覺受體及鈣敏感性螢光蛋白質之昆蟲細胞。
- 如請求項1至11中任一項之方法,其中上述目標物質為蠶蛾醛, 上述複數個細胞係具有BmOR-3蛋白質及GCaMP6s蛋白質之Sf21細胞。
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