JP2002318188A - 液体中の粒子の体積の測定方法 - Google Patents
液体中の粒子の体積の測定方法Info
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
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-
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- G01N2015/1497—Particle shape
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 液中に懸濁された単体の赤血球または他の粒
子の体積を測定する方法を開示する。 【解決手段】 サンプルが、顕微鏡分析に適した光学キ
ュベット内に配置される。細胞内に漏入せず、細胞によ
り弱く吸収されるのみの波長で励起光を吸収し、蛍光性
光を放出することができる蛍光染料が加えられる。細胞
の体積は、（ｉ）単体の細胞を備える第１の領域、（i
i）該細胞に近い第２の領域、および（iii）既知の量だ
けキュベットの厚みを変えた後の第２の領域において測
定された蛍光強度を用いて測定される。
子の体積を測定する方法を開示する。 【解決手段】 サンプルが、顕微鏡分析に適した光学キ
ュベット内に配置される。細胞内に漏入せず、細胞によ
り弱く吸収されるのみの波長で励起光を吸収し、蛍光性
光を放出することができる蛍光染料が加えられる。細胞
の体積は、（ｉ）単体の細胞を備える第１の領域、（i
i）該細胞に近い第２の領域、および（iii）既知の量だ
けキュベットの厚みを変えた後の第２の領域において測
定された蛍光強度を用いて測定される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、定量的マイクロ分
光学、特に、単体赤血球の体積を測定する方法に関す
る。
光学、特に、単体赤血球の体積を測定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】単体赤血球の体積を測定し、この測定に
基づいて、平均細胞体積（ＭＣＶ）および赤血球分配幅
（ＲＤＷ）を計算することは臨床的に重要である。通
常、電気インピーダンス測定（Coulter Counter）に基
づく、または光散乱（フロー血球計算機）に基づくシス
テムが用いられている（例えば、フィラデルフィア、W.
B.Saunders CompanyのJ.B. Henry、"Clinical diagnosi
s and management by laboratory methods",１９９６
年、pp. 548 ff.または、D.H. Tycko, M.H. Metz, E.P.
Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scat
tering measurementof red blood cell volume and hem
oglobin concentration",応用光学２４（１９８５）、
１３５５−１３６５を見よ）。インピーダンスカウンタ
ーは、器械とサンプルパラメータの極めて注意深い調整
と制御を必要とする複雑で高価な器械である。フロー血
球計算機の大きく不利な点は、光散乱のパラメータが細
胞の体積のみならず細胞の形状にも依存するという事実
である。
基づいて、平均細胞体積（ＭＣＶ）および赤血球分配幅
（ＲＤＷ）を計算することは臨床的に重要である。通
常、電気インピーダンス測定（Coulter Counter）に基
づく、または光散乱（フロー血球計算機）に基づくシス
テムが用いられている（例えば、フィラデルフィア、W.
B.Saunders CompanyのJ.B. Henry、"Clinical diagnosi
s and management by laboratory methods",１９９６
年、pp. 548 ff.または、D.H. Tycko, M.H. Metz, E.P.
Epstein, A. Grinbaum, "Flow-cytometric light scat
tering measurementof red blood cell volume and hem
oglobin concentration",応用光学２４（１９８５）、
１３５５−１３６５を見よ）。インピーダンスカウンタ
ーは、器械とサンプルパラメータの極めて注意深い調整
と制御を必要とする複雑で高価な器械である。フロー血
球計算機の大きく不利な点は、光散乱のパラメータが細
胞の体積のみならず細胞の形状にも依存するという事実
である。
【０００３】１９８３年に、Gray, HoffmanおよびHanse
nが、フロー血球計算機において細胞の体積を測定する
新しい光学的方法を提案した（M.L. Gray, R.A. Hoffma
n, W.P. Hansen, "A new method for cell volume meas
urement based on volume exclusion of a fluorescent
dye", Cytometry 3 (１９８３)、４２８−４３２）。
この方法では、細胞膜を透通できない蛍光性染料内に細
胞が懸濁される。細胞懸濁液の細い流れが合焦レーザビ
ームにより励起されたときに発生される蛍光発光のレベ
ルは、細胞が照射領域に到達するまで一定に留まり、こ
れにより細胞の体積に直接に比例する蛍光発光強度にお
ける減少を生じさせる。フロー血球計算機では、単体細
胞がレーザ照射スポットを約１０μｓ内で通過してい
る。この短かいデータ獲得時間の故に、電子検出バンド
幅が比較的大きくならざるを得ず、結果的に、低ＳＮ比
および低い体積測定精度となっている。
nが、フロー血球計算機において細胞の体積を測定する
新しい光学的方法を提案した（M.L. Gray, R.A. Hoffma
n, W.P. Hansen, "A new method for cell volume meas
urement based on volume exclusion of a fluorescent
dye", Cytometry 3 (１９８３)、４２８−４３２）。
この方法では、細胞膜を透通できない蛍光性染料内に細
胞が懸濁される。細胞懸濁液の細い流れが合焦レーザビ
ームにより励起されたときに発生される蛍光発光のレベ
ルは、細胞が照射領域に到達するまで一定に留まり、こ
れにより細胞の体積に直接に比例する蛍光発光強度にお
ける減少を生じさせる。フロー血球計算機では、単体細
胞がレーザ照射スポットを約１０μｓ内で通過してい
る。この短かいデータ獲得時間の故に、電子検出バンド
幅が比較的大きくならざるを得ず、結果的に、低ＳＮ比
および低い体積測定精度となっている。
【０００４】利用可能なデータ獲得時間は、細胞を静止
サンプル内に懸濁し、デジタル画像形成蛍光顕微鏡法を
用いることにより著しく増大できる（P.L. Becker, F.
S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital
imaging fluorescence microscope", Biophysical Jou
rnal 49 （１９８６年）Ａ４６５を見よ）。デジタル蛍
光顕微鏡法のアプローチでは、細胞の体積を決定するた
めに較正手続が必要とされる。Recktenwaldと仲間達
は、較正が細胞と共に懸濁された光学的に透明で非蛍光
性のミクロスフェアにより行われる方法を紹介した（D.
Recktenwald, Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence
quantitation using degital microscopy", Journal P
hysical Chemistry 97 （１９９３年）、２８６８−２
８７０）。個々のスフェアの体積は、顕微鏡下でそれら
の突出領域を測定し、理想的な球形状を仮定してこの数
を体積に変換することにより決定される。放出している
蛍光から除かれている、スフェアの体積の結果としての
蛍光発光強度における減少が必要とされる較正パラメー
タとして用いられている。このアプローチの利点は、較
正している粒子がサンプル自体の中に配置されていると
いう事実によって与えられていることである。換言する
と、較正が全く同じサンプル容器で行われ、他の較正サ
ンプルが必要とされないことである。
サンプル内に懸濁し、デジタル画像形成蛍光顕微鏡法を
用いることにより著しく増大できる（P.L. Becker, F.
S. Fay, "Cell-volume measurement using the digital
imaging fluorescence microscope", Biophysical Jou
rnal 49 （１９８６年）Ａ４６５を見よ）。デジタル蛍
光顕微鏡法のアプローチでは、細胞の体積を決定するた
めに較正手続が必要とされる。Recktenwaldと仲間達
は、較正が細胞と共に懸濁された光学的に透明で非蛍光
性のミクロスフェアにより行われる方法を紹介した（D.
Recktenwald, Phi-Wilson, B. Verwer, "Fluorescence
quantitation using degital microscopy", Journal P
hysical Chemistry 97 （１９９３年）、２８６８−２
８７０）。個々のスフェアの体積は、顕微鏡下でそれら
の突出領域を測定し、理想的な球形状を仮定してこの数
を体積に変換することにより決定される。放出している
蛍光から除かれている、スフェアの体積の結果としての
蛍光発光強度における減少が必要とされる較正パラメー
タとして用いられている。このアプローチの利点は、較
正している粒子がサンプル自体の中に配置されていると
いう事実によって与えられていることである。換言する
と、較正が全く同じサンプル容器で行われ、他の較正サ
ンプルが必要とされないことである。
【０００５】細胞懸濁液中に較正スフェアを用いること
は問題がないわけではない。第一に、スフェアの導入は
仕事の流れの中で追加のステップに相当する。高い生産
性用にデザインされているシステムにおいては、この追
加のステップは不都合を意味する。第二に、Recktenwal
dと仲間達は、エラーを生じさせる、蛍光性染料分子が
スフェア表面に付着する傾向を観察していた。第三に、
もしも、スフェアの光学的屈折率が液体の屈折率にうま
く合わないと、測定されている蛍光発光強度において屈
折に基づく間違いの結果がスフェアの縁部において生じ
る。そして最後に、ミクロスフェアを用いることは、例
えば、数ミクロン以下のオーダーの薄いサンプル厚みが
必要とされた場合、問題となり得る。
は問題がないわけではない。第一に、スフェアの導入は
仕事の流れの中で追加のステップに相当する。高い生産
性用にデザインされているシステムにおいては、この追
加のステップは不都合を意味する。第二に、Recktenwal
dと仲間達は、エラーを生じさせる、蛍光性染料分子が
スフェア表面に付着する傾向を観察していた。第三に、
もしも、スフェアの光学的屈折率が液体の屈折率にうま
く合わないと、測定されている蛍光発光強度において屈
折に基づく間違いの結果がスフェアの縁部において生じ
る。そして最後に、ミクロスフェアを用いることは、例
えば、数ミクロン以下のオーダーの薄いサンプル厚みが
必要とされた場合、問題となり得る。
【０００６】先行技術における問題を克服するために、
異なる領域で異なる光路長を有する細胞懸濁液用のサン
プル容器をデザインすることが提唱された（K.W. Bernd
t, "Method for determining the volume of particles
suspended in liquids", P-3875、１９９７年）。好ま
しくは、容器の窓の一つに段状プロフィルが採用されて
いる。かかる段部のすぐ隣での、顕微鏡の光学的Ｚ軸に
対するサンプル容器の可能な傾きとは無関係な、光路長
における変化は周知である。周知の段部幅による強度の
変化が、体積を決定する手順を較正することを許容して
いる。このアプローチの不利な点は、段部には細胞が存
することが許されず、このことは、実施に際し常には保
証されないという事実により与えられる。また、容器の
窓の一つに、極めて精確な較正用段部が備えられたサン
プル容器を生産することは高価となろう。
異なる領域で異なる光路長を有する細胞懸濁液用のサン
プル容器をデザインすることが提唱された（K.W. Bernd
t, "Method for determining the volume of particles
suspended in liquids", P-3875、１９９７年）。好ま
しくは、容器の窓の一つに段状プロフィルが採用されて
いる。かかる段部のすぐ隣での、顕微鏡の光学的Ｚ軸に
対するサンプル容器の可能な傾きとは無関係な、光路長
における変化は周知である。周知の段部幅による強度の
変化が、体積を決定する手順を較正することを許容して
いる。このアプローチの不利な点は、段部には細胞が存
することが許されず、このことは、実施に際し常には保
証されないという事実により与えられる。また、容器の
窓の一つに、極めて精確な較正用段部が備えられたサン
プル容器を生産することは高価となろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、先行技
術における不利な点および問題の故に、液体中に懸濁さ
れた単体の赤血球の体積を測定する簡単且つ信頼性のあ
る方法に対する必要性が存する。
術における不利な点および問題の故に、液体中に懸濁さ
れた単体の赤血球の体積を測定する簡単且つ信頼性のあ
る方法に対する必要性が存する。
【０００８】本発明の目的は、液体中に懸濁された単体
の赤血球または他の粒子の体積を測定する方法を提供す
ることにある。
の赤血球または他の粒子の体積を測定する方法を提供す
ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、赤血球
の場合については、上記目的は、懸濁された赤血球を包
含する液体サンプルを少なくとも一つの透明な窓を有す
る光学キュベット内に配置し、該液体に、赤血球に実質
的に漏入しない蛍光性染料であって、赤血球により弱く
吸収されるのみの波長で励起光を吸収し、赤血球により
弱く吸収されるのみの波長で蛍光性光を放出することが
できる蛍光性染料を加えて均一に分配させ、サンプル
を、蛍光性染料により吸収されるが赤血球には弱く吸収
されるのみの光であるように選択された波長の光で照明
し、赤血球を包含しない領域において蛍光性光の強度を
測定し、キュベットの厚みを該領域において規定の量だ
け変え、そして該同じ領域において再出現する蛍光性光
の強度を再度測定し、赤血球が存在する領域において再
出現する蛍光性光の強度を測定し、該同じ赤血球に近い
領域から再出現する蛍光性光の強度を測定し、そして蛍
光性光強度値およびキュベットの厚みにおける既知の変
更値に基づいて赤血球の体積を計算する、ことにより達
成される。
の場合については、上記目的は、懸濁された赤血球を包
含する液体サンプルを少なくとも一つの透明な窓を有す
る光学キュベット内に配置し、該液体に、赤血球に実質
的に漏入しない蛍光性染料であって、赤血球により弱く
吸収されるのみの波長で励起光を吸収し、赤血球により
弱く吸収されるのみの波長で蛍光性光を放出することが
できる蛍光性染料を加えて均一に分配させ、サンプル
を、蛍光性染料により吸収されるが赤血球には弱く吸収
されるのみの光であるように選択された波長の光で照明
し、赤血球を包含しない領域において蛍光性光の強度を
測定し、キュベットの厚みを該領域において規定の量だ
け変え、そして該同じ領域において再出現する蛍光性光
の強度を再度測定し、赤血球が存在する領域において再
出現する蛍光性光の強度を測定し、該同じ赤血球に近い
領域から再出現する蛍光性光の強度を測定し、そして蛍
光性光強度値およびキュベットの厚みにおける既知の変
更値に基づいて赤血球の体積を計算する、ことにより達
成される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の方法によれば、懸濁され
た赤血球を包含する液体サンプルが、少なくとも一つの
透明な窓を有する光学キュベット内に置かれる。好まし
くは、キュベットは比較的薄く、蛍光顕微鏡のサンプル
ステージに位置されるのに適している。例えば、キュベ
ットは、２５ｍｍ×７５ｍｍの体積の共通の顕微鏡スラ
イド上にあるスペーサに２４ｍｍ×５０ｍｍの体積の可
撓性＃１カバースリップを置くことにより作られ得る。
スペーサの好ましい高さは、約２００μｍである。可撓
性カバースリップを押すことにより、キュベットの中央
領域の厚みの値が、１μｍ未満から２００μｍの間で得
られる。光学キュベットは、その内部空間に液体サンプ
ルを保持でき、蛍光発光の測定を許容する少なくとも一
つの透明窓を有している容器であればよい。二つの窓を
両側に有しているキュベットを用いることもまた本発明
の意図するところである。さらに、一側に一つの窓、他
側に鏡を備えた容器を用いることも本発明の意図すると
ころである。この場合、励起光は前記一つの透明窓を通
って入り、液体サンプルを二度横切り、そして蛍光性光
が同じ窓を通って出るであろう。この一つの窓が入口窓
および出口窓の両者として機能する。本発明は顕微鏡分
析用の容器に限定されるものではなく、顕微鏡以外の光
学系で調べられる、より大きなサイズの容器にも適用可
能である。
た赤血球を包含する液体サンプルが、少なくとも一つの
透明な窓を有する光学キュベット内に置かれる。好まし
くは、キュベットは比較的薄く、蛍光顕微鏡のサンプル
ステージに位置されるのに適している。例えば、キュベ
ットは、２５ｍｍ×７５ｍｍの体積の共通の顕微鏡スラ
イド上にあるスペーサに２４ｍｍ×５０ｍｍの体積の可
撓性＃１カバースリップを置くことにより作られ得る。
スペーサの好ましい高さは、約２００μｍである。可撓
性カバースリップを押すことにより、キュベットの中央
領域の厚みの値が、１μｍ未満から２００μｍの間で得
られる。光学キュベットは、その内部空間に液体サンプ
ルを保持でき、蛍光発光の測定を許容する少なくとも一
つの透明窓を有している容器であればよい。二つの窓を
両側に有しているキュベットを用いることもまた本発明
の意図するところである。さらに、一側に一つの窓、他
側に鏡を備えた容器を用いることも本発明の意図すると
ころである。この場合、励起光は前記一つの透明窓を通
って入り、液体サンプルを二度横切り、そして蛍光性光
が同じ窓を通って出るであろう。この一つの窓が入口窓
および出口窓の両者として機能する。本発明は顕微鏡分
析用の容器に限定されるものではなく、顕微鏡以外の光
学系で調べられる、より大きなサイズの容器にも適用可
能である。
【００１１】蛍光染料が加えられ、そして液体サンプル
内に均しく分配される。染料は、赤血球内に漏入しない
ものが選ばれる。また、それは励起光を吸収し、赤血球
内での吸収が弱いのみのスペクトル領域内で蛍光性光を
発すべきである。ヘモグロビンが赤血球における支配的
な吸収体であるので、励起波長は６００ｎｍより長くな
ければならない。一つの良好な染料候補はTO-PRO-3（例
えば、オレゴン州、EugeneのMolecular Probes, Inc.よ
り販売されている）であり、６４０ｎｍ近傍の波長範囲
内で励起され、６４０ｎｍより上の蛍光を発する。他の
可能な染料はTO-PRO-５（Molecular Probes, Inc.より
販売されている）であり、赤血球内に漏入せず、７５０
ｎｍ近傍で励起され、７５０ｎｍより上の蛍光を発す
る。本発明は上述の二つの染料に限定されないことは当
業者には明らかである。赤血球の測定のためのスペクト
ル条件を満たす他の多くの染料も利用可能であり、他の
粒子のためのスペクトル条件を満たす多くの染料でさえ
も利用可能である。もちろん、サンプルを容器の中に配
置する前に蛍光性染料を液体サンプル内に加え、均しく
分配することも本発明の意図するところである。
内に均しく分配される。染料は、赤血球内に漏入しない
ものが選ばれる。また、それは励起光を吸収し、赤血球
内での吸収が弱いのみのスペクトル領域内で蛍光性光を
発すべきである。ヘモグロビンが赤血球における支配的
な吸収体であるので、励起波長は６００ｎｍより長くな
ければならない。一つの良好な染料候補はTO-PRO-3（例
えば、オレゴン州、EugeneのMolecular Probes, Inc.よ
り販売されている）であり、６４０ｎｍ近傍の波長範囲
内で励起され、６４０ｎｍより上の蛍光を発する。他の
可能な染料はTO-PRO-５（Molecular Probes, Inc.より
販売されている）であり、赤血球内に漏入せず、７５０
ｎｍ近傍で励起され、７５０ｎｍより上の蛍光を発す
る。本発明は上述の二つの染料に限定されないことは当
業者には明らかである。赤血球の測定のためのスペクト
ル条件を満たす他の多くの染料も利用可能であり、他の
粒子のためのスペクトル条件を満たす多くの染料でさえ
も利用可能である。もちろん、サンプルを容器の中に配
置する前に蛍光性染料を液体サンプル内に加え、均しく
分配することも本発明の意図するところである。
【００１２】図１は、一つの可撓性窓（３）を有し、懸
濁された赤血球を含む液体サンプル（４）を包含する光
学キュベット（２０）を備えた測定装置を示す。キュベ
ットは、可撓性カバースリップ（３）を保持するスペー
サ（２，２’）を支持している共通の顕微鏡スライド
（１）を用いることによって作られている。血液の血漿
（４）のような液体内の赤血球の懸濁が、スライド
（１）およびカバースリップ（３）の間に包含されてい
る。光学キュベットは、交換可能な対物レンズ（７，
９，１０）を有する共通の蛍光顕微鏡（８）のＸＹＺ-
ステージ（５）上に位置されている。図２に示されるよ
うに、顕微鏡（８）にはＣＣＤカメラ（２１）が備えら
れ、ＣＣＤカメラ（２１）は、データを保管し、画像処
理手順を実行するコンピュータ（２２）に接続されてい
る。コンピュータ（２２）はまた、必要に応じキュベッ
ト（２０）を移動させるためにＸＹＺ-ステージ（５）
にも接続されている。
濁された赤血球を含む液体サンプル（４）を包含する光
学キュベット（２０）を備えた測定装置を示す。キュベ
ットは、可撓性カバースリップ（３）を保持するスペー
サ（２，２’）を支持している共通の顕微鏡スライド
（１）を用いることによって作られている。血液の血漿
（４）のような液体内の赤血球の懸濁が、スライド
（１）およびカバースリップ（３）の間に包含されてい
る。光学キュベットは、交換可能な対物レンズ（７，
９，１０）を有する共通の蛍光顕微鏡（８）のＸＹＺ-
ステージ（５）上に位置されている。図２に示されるよ
うに、顕微鏡（８）にはＣＣＤカメラ（２１）が備えら
れ、ＣＣＤカメラ（２１）は、データを保管し、画像処
理手順を実行するコンピュータ（２２）に接続されてい
る。コンピュータ（２２）はまた、必要に応じキュベッ
ト（２０）を移動させるためにＸＹＺ-ステージ（５）
にも接続されている。
【００１３】図３は、本発明による状況を説明するもの
で、ここでは、蛍光性染料を包含する液体サンプルが励
起光で照射され、蛍光性光子を再放出している。図３に
示されるように、赤血球内の光学的吸収は弱いので、赤
血球の「背後の」染料分子が励起され得、これらの分子
から放出された蛍光性光子がＣＣＤカメラに向う途中で
細胞を突き抜けることができる。
で、ここでは、蛍光性染料を包含する液体サンプルが励
起光で照射され、蛍光性光子を再放出している。図３に
示されるように、赤血球内の光学的吸収は弱いので、赤
血球の「背後の」染料分子が励起され得、これらの分子
から放出された蛍光性光子がＣＣＤカメラに向う途中で
細胞を突き抜けることができる。
【００１４】作動時には、可撓性窓（３）が対物レンズ
（７）に取付けられた固定プランジャ（６）に物理的に
接触するまで、キュベット（２０）がステージ（５）に
より上方に移動される。顕微鏡（８）の焦平面は、可撓
性窓（３）がプランジャ（６）に触れているなら、液体
サンプル（４）内に存するようにされている。必要であ
れば、赤血球を包含しないサンプル領域が視野内に入る
まで、キュベット（２０）はＸおよびＹ方向に移動され
る。もしも、サンプルが全血液であれば、赤血球を包含
しない領域を容易に利用可能とするために、２μｍから
３０μｍの範囲のキュベット厚さを用いるのが適切であ
る。希釈された血液サンプルに対しては、より厚いキュ
ベットが用いられ得る。
（７）に取付けられた固定プランジャ（６）に物理的に
接触するまで、キュベット（２０）がステージ（５）に
より上方に移動される。顕微鏡（８）の焦平面は、可撓
性窓（３）がプランジャ（６）に触れているなら、液体
サンプル（４）内に存するようにされている。必要であ
れば、赤血球を包含しないサンプル領域が視野内に入る
まで、キュベット（２０）はＸおよびＹ方向に移動され
る。もしも、サンプルが全血液であれば、赤血球を包含
しない領域を容易に利用可能とするために、２μｍから
３０μｍの範囲のキュベット厚さを用いるのが適切であ
る。希釈された血液サンプルに対しては、より厚いキュ
ベットが用いられ得る。
【００１５】一旦、赤血球を包含しない領域が見出され
ると、サンプルは適切な波長の励起光で蛍光顕微鏡内か
ら照射され、その領域における蛍光強度Ｉ1がＣＣＤカ
メラ（２１）により測定され、その結果がコンピュータ
（２２）に保管される。次のステップでは、キュベット
（２０）がステージ（５）により、小さく、しかし正確
に知られた距離Δｈだけさらに上方に移動される。キュ
ベット（２０）を固定プランジャ（６）に対して上方に
移動させると、Δｈと同じ量のキュベット内の光路長の
減少になる。キュベット（２０）が移動されたとき、同
じ領域における新たな蛍光強度Ｉ2が測定され、その結
果がコンピュータ（２２）に保管される。新たな蛍光強
度Ｉ2は最初の蛍光強度Ｉ1より小さい値を有する。何故
なら、より少量のサンプルが蛍光性光子を放出している
からである。これは、図４および図５に図説されてい
る。
ると、サンプルは適切な波長の励起光で蛍光顕微鏡内か
ら照射され、その領域における蛍光強度Ｉ1がＣＣＤカ
メラ（２１）により測定され、その結果がコンピュータ
（２２）に保管される。次のステップでは、キュベット
（２０）がステージ（５）により、小さく、しかし正確
に知られた距離Δｈだけさらに上方に移動される。キュ
ベット（２０）を固定プランジャ（６）に対して上方に
移動させると、Δｈと同じ量のキュベット内の光路長の
減少になる。キュベット（２０）が移動されたとき、同
じ領域における新たな蛍光強度Ｉ2が測定され、その結
果がコンピュータ（２２）に保管される。新たな蛍光強
度Ｉ2は最初の蛍光強度Ｉ1より小さい値を有する。何故
なら、より少量のサンプルが蛍光性光子を放出している
からである。これは、図４および図５に図説されてい
る。
【００１６】光路長における変化Δｈと共に二つの蛍光
強度値Ｉ1およびＩ2は、「蛍光における変化/光路長に
おける変化」の比を計算することにより、装置を較正す
るために用いられ得る。図５を参照して、この較正は以
下のように説明され得る。
強度値Ｉ1およびＩ2は、「蛍光における変化/光路長に
おける変化」の比を計算することにより、装置を較正す
るために用いられ得る。図５を参照して、この較正は以
下のように説明され得る。
【００１７】液体サンプルが励起光により均等に照射さ
れていると仮定すると、第１の蛍光強度Ｉ1は次式
（１）で与えられる。
れていると仮定すると、第１の蛍光強度Ｉ1は次式
（１）で与えられる。
【００１８】
【数１】
【００１９】ここで、量Ｋは、励起強度、蛍光量子収
量、発蛍光団濃度、発蛍光団吸収係数、スペクトル励起
および放出窓の伝達関数、顕微鏡の光学伝達関数、光検
知感度のようなパラメーターを含んでいる。Ｋは較正さ
れねばならない一つの量である。以下の議論のために、
我々はＫは定数であり、用いられているＸおよびＹ位置
とは無関係であると仮定できる。量ｈ1は、測定されて
いる領域におけるキュベット（２０）の光路長（すなわ
ち厚み）である。ＩAFは、キュベット材料からの可能な
自動蛍光性付加量である。
量、発蛍光団濃度、発蛍光団吸収係数、スペクトル励起
および放出窓の伝達関数、顕微鏡の光学伝達関数、光検
知感度のようなパラメーターを含んでいる。Ｋは較正さ
れねばならない一つの量である。以下の議論のために、
我々はＫは定数であり、用いられているＸおよびＹ位置
とは無関係であると仮定できる。量ｈ1は、測定されて
いる領域におけるキュベット（２０）の光路長（すなわ
ち厚み）である。ＩAFは、キュベット材料からの可能な
自動蛍光性付加量である。
【００２０】キュベットの厚さを、Δｈの量だけ変えた
後に測定される第２の蛍光強度Ｉ2は次式（２）で与え
られる。
後に測定される第２の蛍光強度Ｉ2は次式（２）で与え
られる。
【００２１】
【数２】
【００２２】式（１）から式（２）を減ずることによ
り、我々は、我々の較正量を表しているＫについての表
現を得る。
り、我々は、我々の較正量を表しているＫについての表
現を得る。
【００２３】
【数３】
【００２４】式（３）は、絶対的なキュベットの厚さｈ
1を知る必要がないこと、および自動蛍光性付加量ＩAF
は相殺されることを示している。
1を知る必要がないこと、および自動蛍光性付加量ＩAF
は相殺されることを示している。
【００２５】較正の正確さを強化するためには、図４に
示されるように、キュベットの厚みにおいて、一つ以上
の変化Δｈを採用することも可能である。図７は、ＣＣ
Ｄカメラのピクセル強度として表され、約１０μｍのキ
ュベットの厚みが０．２μｍ毎の１０ステップで約８μ
ｍまで減少された場合、再出現している蛍光強度の典型
的なプロットを示している。図７のプロットから、較正
値Ｋ=３９．９９３ｍ- 1が得られる。
示されるように、キュベットの厚みにおいて、一つ以上
の変化Δｈを採用することも可能である。図７は、ＣＣ
Ｄカメラのピクセル強度として表され、約１０μｍのキ
ュベットの厚みが０．２μｍ毎の１０ステップで約８μ
ｍまで減少された場合、再出現している蛍光強度の典型
的なプロットを示している。図７のプロットから、較正
値Ｋ=３９．９９３ｍ- 1が得られる。
【００２６】上に概略述べたような較正を実行した後、
本発明による方法では、単体の赤血球の体積が以下の方
法で測定される。
本発明による方法では、単体の赤血球の体積が以下の方
法で測定される。
【００２７】第１のステップにおいて、図６を参照する
に、赤血球が存在する領域において再出現している蛍光
強度Ｉ4が測定される。この瞬間のために、我々は、赤
血球が面積ＡRBCで高さｈRBCの円柱形状を有していると
仮定する。第２のステップにおいて、同じ赤血球の近く
の領域において再出現している蛍光強度Ｉ3が測定され
る。Ｉ4が次式で与えられ、
に、赤血球が存在する領域において再出現している蛍光
強度Ｉ4が測定される。この瞬間のために、我々は、赤
血球が面積ＡRBCで高さｈRBCの円柱形状を有していると
仮定する。第２のステップにおいて、同じ赤血球の近く
の領域において再出現している蛍光強度Ｉ3が測定され
る。Ｉ4が次式で与えられ、
【００２８】
【数４】
【００２９】そして、Ｉ3が次式で与えられることを考
慮して、
慮して、
【００３０】
【数５】
【００３１】我々は、次式を得、
【００３２】
【数６】
【００３３】これは、式（３）に示されたように、我々
の較正値Ｋを含んでいる。式（６）は次式の形式に書き
改められ、
の較正値Ｋを含んでいる。式（６）は次式の形式に書き
改められ、
【００３４】
【数７】
【００３５】これは、単体の円柱状赤血球の体積ＶRBC
のための表現を表している。
のための表現を表している。
【００３６】本発明による方法は、キュベットの厚みの
みならず、再出現する蛍光強度に関する異なる測定に基
づいているということが強調されるべきである。換言す
ると、キュベットの絶対的厚みを知る必要がないことで
ある。さらに、キュベットに導入される励起強度を知る
必要がないことである。細胞体積についての式（７）と
較正量Ｋについての式（３）とを組合せると、次式とな
る。
みならず、再出現する蛍光強度に関する異なる測定に基
づいているということが強調されるべきである。換言す
ると、キュベットの絶対的厚みを知る必要がないことで
ある。さらに、キュベットに導入される励起強度を知る
必要がないことである。細胞体積についての式（７）と
較正量Ｋについての式（３）とを組合せると、次式とな
る。
【００３７】
【数８】
【００３８】式（８）は、器械のパラメータにおける全
ての長期間のドリフトが相殺されることを示している。
これは、赤血球の体積ＶRBCが光電流の比から計算され
るという事実に帰している。換言すると、較正手順が測
定と時間的に近くで行われるならば、本発明による方法
は極めて頑健である。この条件は、較正手順は測定され
ている同じサンプルに対して行われるので、常に満たさ
れるであろう。
ての長期間のドリフトが相殺されることを示している。
これは、赤血球の体積ＶRBCが光電流の比から計算され
るという事実に帰している。換言すると、較正手順が測
定と時間的に近くで行われるならば、本発明による方法
は極めて頑健である。この条件は、較正手順は測定され
ている同じサンプルに対して行われるので、常に満たさ
れるであろう。
【００３９】今まで、赤血球は円柱形状を有していると
仮定されていた。赤血球の形状は不規則であり得、且
つ、キュベット内の細胞のＺ位置は、較正された細胞の
体積には影響しないということが示され得る。細胞の体
積ＶRBCは、次式によって空間に依存する細胞高さｈRBC
（ξ、η）に関係され、
仮定されていた。赤血球の形状は不規則であり得、且
つ、キュベット内の細胞のＺ位置は、較正された細胞の
体積には影響しないということが示され得る。細胞の体
積ＶRBCは、次式によって空間に依存する細胞高さｈRBC
（ξ、η）に関係され、
【００４０】
【数９】
【００４１】ここで、量ξおよびηは、赤血球内で独立
のＸおよびＹ変数を表す。式（８）および（９）を組合
せることにより、我々は次式を得る。
のＸおよびＹ変数を表す。式（８）および（９）を組合
せることにより、我々は次式を得る。
【００４２】
【数１０】
【００４３】式（１０）に示されている積分手順は、赤
血球によって占められている正に領域上は実行されな
い。替りに、細胞を含んでいる幾らか大きめの領域上で
実行されてもよい。細胞の外では、Ｉ4（ξ、η）はＩ3
と同じであり、よって、Ｉ3-Ｉ4（ξ、η）＝０とな
る。換言すると、細胞の周囲を越えるより大きな領域上
に積分を拡大しても、較正された細胞の体積に対する追
加の貢献とはならない。本発明のこの形態は、検査され
ている個々の細胞全てに対して単純な一寸法、一形状の
積分領域の使用を許容する。結果として、必要とされる
計算がより短時間内に実行され得ることになる。式（１
０）が意味するとき、細胞の近くの強度Ｉ3は一定であ
るということが仮定されていることに注意すべきであ
る。Ｉ4（ξ、η）は実際には単一のＣＣＤピクセルの
強度として測定されるが、Ｉ3は、ピクセル数により除
された、領域上の全てのピクセルの強度の合計として最
大の精度で測定され得る。換言すると、Ｉ3は、細胞の
近くの平均ピクセル強度である。本発明による単体赤血
球の体積を測定する方法は、全血液または希釈血液サン
プルにも適用され得る。本発明はまた、個々の粒子また
は細胞だけでなく赤血球の全クラスターまたは他の懸濁
液内の粒子にも適用できる。また、この方法を、ビード
または他の粒子または細胞、例えば、原核生物、細菌、
真核生物、哺乳綱、組織培養または人細胞のような液中
に懸濁された他の粒子に適用することも本発明の意図す
るところである。本発明はまた、他の懸濁液やサンプル
もしくはそれらの希釈液中の粒子や細胞にも適用され得
ることは当業者には明らかであり、かかる医学または生
物学的サンプルは、細菌培養や血液、尿、痰、唾液およ
びリンパ液のような他の体液を含む、組織培養または他
の培養内の細胞を含んでいる。
血球によって占められている正に領域上は実行されな
い。替りに、細胞を含んでいる幾らか大きめの領域上で
実行されてもよい。細胞の外では、Ｉ4（ξ、η）はＩ3
と同じであり、よって、Ｉ3-Ｉ4（ξ、η）＝０とな
る。換言すると、細胞の周囲を越えるより大きな領域上
に積分を拡大しても、較正された細胞の体積に対する追
加の貢献とはならない。本発明のこの形態は、検査され
ている個々の細胞全てに対して単純な一寸法、一形状の
積分領域の使用を許容する。結果として、必要とされる
計算がより短時間内に実行され得ることになる。式（１
０）が意味するとき、細胞の近くの強度Ｉ3は一定であ
るということが仮定されていることに注意すべきであ
る。Ｉ4（ξ、η）は実際には単一のＣＣＤピクセルの
強度として測定されるが、Ｉ3は、ピクセル数により除
された、領域上の全てのピクセルの強度の合計として最
大の精度で測定され得る。換言すると、Ｉ3は、細胞の
近くの平均ピクセル強度である。本発明による単体赤血
球の体積を測定する方法は、全血液または希釈血液サン
プルにも適用され得る。本発明はまた、個々の粒子また
は細胞だけでなく赤血球の全クラスターまたは他の懸濁
液内の粒子にも適用できる。また、この方法を、ビード
または他の粒子または細胞、例えば、原核生物、細菌、
真核生物、哺乳綱、組織培養または人細胞のような液中
に懸濁された他の粒子に適用することも本発明の意図す
るところである。本発明はまた、他の懸濁液やサンプル
もしくはそれらの希釈液中の粒子や細胞にも適用され得
ることは当業者には明らかであり、かかる医学または生
物学的サンプルは、細菌培養や血液、尿、痰、唾液およ
びリンパ液のような他の体液を含む、組織培養または他
の培養内の細胞を含んでいる。
【００４４】液体サンプルの光学的性質に依存して、本
方法はより高い厚みのキュベットにも適用され得る。可
撓性の窓を用いることは、キュベットの厚みの変更を達
成する唯一つの例である。硬い窓とゴムのような可撓性
材料から作られたスペーサを用いることも可能であろ
う。局部的なスペーサの替りに可撓性のキュベット壁を
利用することによるさらに他の実施形態も可能であろ
う。また、キュベット厚みの変更は、キュベットの主要
部を固定したまま、窓が動くように窓に正または負圧を
作用させることでも達成され得る。かかる正または負圧
は、圧力または真空の使用を含んでもよい。
方法はより高い厚みのキュベットにも適用され得る。可
撓性の窓を用いることは、キュベットの厚みの変更を達
成する唯一つの例である。硬い窓とゴムのような可撓性
材料から作られたスペーサを用いることも可能であろ
う。局部的なスペーサの替りに可撓性のキュベット壁を
利用することによるさらに他の実施形態も可能であろ
う。また、キュベット厚みの変更は、キュベットの主要
部を固定したまま、窓が動くように窓に正または負圧を
作用させることでも達成され得る。かかる正または負圧
は、圧力または真空の使用を含んでもよい。
【００４５】既に上述したように、本発明は光学顕微鏡
に限定されない。粒子を包含する領域および粒子を包含
しない領域における蛍光性光強度の測定を許容する全て
の画像形成システムが本発明を実施するのに適してい
る。画像形成システムはレンズを包含してもよいが、い
わゆる近接配置の光ファイバ要素を用いてもよい。この
場合、可干渉性の光ファイバ束がキュベット窓と画像形
成光検知器との間に配列される。最後に、キュベット窓
を横切る励起光のビームを走査し、キュベットの厚みを
変えつつ非画像形成光検知器で再出現された蛍光性光を
モニターすることもさらに本発明の意図内にある。
に限定されない。粒子を包含する領域および粒子を包含
しない領域における蛍光性光強度の測定を許容する全て
の画像形成システムが本発明を実施するのに適してい
る。画像形成システムはレンズを包含してもよいが、い
わゆる近接配置の光ファイバ要素を用いてもよい。この
場合、可干渉性の光ファイバ束がキュベット窓と画像形
成光検知器との間に配列される。最後に、キュベット窓
を横切る励起光のビームを走査し、キュベットの厚みを
変えつつ非画像形成光検知器で再出現された蛍光性光を
モニターすることもさらに本発明の意図内にある。
【００４６】較正のステップ、すなわち、式（３）によ
る量Ｋ「蛍光の変化/体積の変化」を測定するステップ
は、検査下にある粒子にごく接近して実行され得る。こ
の場合、図４を参照するに、単一の粒子の近隣における
蛍光強度を最初に測定するであろう。次のステップで、
光学キュベットのこの領域における厚みがΔｈの量だけ
変えられ、そして新たな蛍光強度が測定される。第３の
ステップで、粒子により占められている領域における蛍
光強度が測定される。最初の二つのステップは必要とさ
れる較正量Ｋを与え、第２および第３のステップは実際
の体積測定のために必要な２つの蛍光強度値を与える。
本発明によるこの第２の手順は、４つのステップに換え
て３つが必要とされるという利点を有する。本発明によ
る第１の手順は、増大された厚みのキュベット領域内で
の較正を許容し、増大された強度レベルの故に、より精
確な較正値を許容する。実際には、使用者が手近な優先
度に基づいて決定しなければならない。
る量Ｋ「蛍光の変化/体積の変化」を測定するステップ
は、検査下にある粒子にごく接近して実行され得る。こ
の場合、図４を参照するに、単一の粒子の近隣における
蛍光強度を最初に測定するであろう。次のステップで、
光学キュベットのこの領域における厚みがΔｈの量だけ
変えられ、そして新たな蛍光強度が測定される。第３の
ステップで、粒子により占められている領域における蛍
光強度が測定される。最初の二つのステップは必要とさ
れる較正量Ｋを与え、第２および第３のステップは実際
の体積測定のために必要な２つの蛍光強度値を与える。
本発明によるこの第２の手順は、４つのステップに換え
て３つが必要とされるという利点を有する。本発明によ
る第１の手順は、増大された厚みのキュベット領域内で
の較正を許容し、増大された強度レベルの故に、より精
確な較正値を許容する。実際には、使用者が手近な優先
度に基づいて決定しなければならない。
【００４７】本発明がいくつかの好ましい実施の形態に
関して説明されたが、当業者は本発明の範囲から逸脱す
ることなく本発明の種々の変更および改良がなされ得る
ことを理解するであろう。さらに、一つの実施形態の個
々の特徴は他の実施形態のものではないが、一つの実施
形態の個々の特徴は他の実施形態の一つ以上の特徴また
は複数の実施形態からの特徴と組合されてもよいことは
明かであろう。
関して説明されたが、当業者は本発明の範囲から逸脱す
ることなく本発明の種々の変更および改良がなされ得る
ことを理解するであろう。さらに、一つの実施形態の個
々の特徴は他の実施形態のものではないが、一つの実施
形態の個々の特徴は他の実施形態の一つ以上の特徴また
は複数の実施形態からの特徴と組合されてもよいことは
明かであろう。
【図１】一つの可撓性窓を有し、懸濁された赤血球を含
む液体サンプルを包含する光学キュベットを備える測定
装置を示す。
む液体サンプルを包含する光学キュベットを備える測定
装置を示す。
【図２】サンプル容器、ＸＹＺステージ、蛍光顕微鏡、
ＣＣＤカメラおよびコンピュータが完備した装置を示
す。
ＣＣＤカメラおよびコンピュータが完備した装置を示
す。
【図３】弱吸収赤血球を包含する領域と細胞を包含しな
い他の領域を備える光学キュベットを概略的に示す。矢
印は液状懸濁から再出現する蛍光性光子を示す。
い他の領域を備える光学キュベットを概略的に示す。矢
印は液状懸濁から再出現する蛍光性光子を示す。
【図４】可撓性のキュベット窓がΔｈの段幅で二度移動
されていることによる、弱吸収赤血球を包含する領域と
細胞を包含しない他の領域を備える光学キュベットを概
略的に示す。
されていることによる、弱吸収赤血球を包含する領域と
細胞を包含しない他の領域を備える光学キュベットを概
略的に示す。
【図５】較正手順を示し、ここで、赤血球を包含しない
領域におけるキュベットの厚みが規定された量Δｈだけ
変えられ、再出現している蛍光強度Ｉ1およびＩ2が厚み
を変える前後において測定される。この例では、キュベ
ットの厚みは減少されている。
領域におけるキュベットの厚みが規定された量Δｈだけ
変えられ、再出現している蛍光強度Ｉ1およびＩ2が厚み
を変える前後において測定される。この例では、キュベ
ットの厚みは減少されている。
【図６】測定手順を示し、ここで、再出現している蛍光
強度Ｉ3およびＩ4が赤血球が存在する領域および同じ細
胞に近い領域において測定される。図６において、我々
は、面積ＡRBCおよび高さｈRBCの円柱状細胞と仮定し
た。
強度Ｉ3およびＩ4が赤血球が存在する領域および同じ細
胞に近い領域において測定される。図６において、我々
は、面積ＡRBCおよび高さｈRBCの円柱状細胞と仮定し
た。
【図７】ＣＣＤカメラのピクセル強度として表され、約
１０μｍのキュベットの厚みが０．２μｍ毎の１０ステ
ップで約８μｍまで減少された場合、再出現している蛍
光強度の典型的なプロットを示す。
１０μｍのキュベットの厚みが０．２μｍ毎の１０ステ
ップで約８μｍまで減少された場合、再出現している蛍
光強度の典型的なプロットを示す。
１ 顕微鏡スライド ２、２’ スペーサ ３ カバースリップ（可撓性窓） ４ 液体サンプル ５ ＸＹＺ-ステージ ６ 固定プランジャ ７ 対物レンズ ８ 蛍光顕微鏡 ２０ 光学キュベット ２１ ＣＣＤカメラ ２２ コンピュータ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 クラウス ダブリュ．バーント アメリカ合衆国 21093 メリーランド州 ティモニウム ロックビュー テラス 305 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA01 EA01 FA01 GA03 GB02 GB21 HA01 HA05 KA02 KA05 LA03 NA01 NA13 2G045 AA02 BA13 BB25 CA02 FA11 GA07
Claims (10)
- 【請求項１】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液を少なくとも一つの透明な窓を有する
容器内に配置し、 （c）前記容器内の前記懸濁液に、前記粒子に実質的に
漏入しない蛍光性染料であって、前記粒子により弱く吸
収されるのみの波長で励起光を吸収し、前記粒子により
弱く吸収されるのみの波長で蛍光性光を放出することが
できる蛍光性染料を加え、 （d）前記懸濁液を、前記蛍光性染料により吸収される
が前記粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選
択された波長の光で照明し、 （e）前記懸濁液の第１の領域であって、粒子を包含し
ない第１の領域において前記懸濁液から再出現する蛍光
性光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記懸濁液
から再出現する蛍光性光の第２の強度を測定し、 （g）前記懸濁液の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記懸濁液から
再出現する蛍光性光の第３の強度を測定し、 （h）前記第２の領域の前記少なくとも一つの粒子に近
い前記懸濁液の第３の領域から再出現する蛍光性光の第
４の強度を測定し、そして （i）前記蛍光性光強度値および前記容器の厚みにおけ
る既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の
体積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液に、前記粒子に実質的に漏入しない蛍
光性染料であって、前記粒子により弱く吸収されるのみ
の波長で励起光を吸収し、前記粒子により弱く吸収され
るのみの波長で蛍光性光を放出することができる蛍光性
染料を加え、混合物を形成し、 （c）前記混合物を少なくとも一つの透明な窓を有する
容器内に配置し、 （d）前記混合物を、前記蛍光性染料により吸収される
が前記粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選
択された波長の光で照明し、 （e）前記混合物の第１の領域であって、粒子を包含し
ない第１の領域において前記混合物から再出現する蛍光
性光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記混合物
から再出現する蛍光性光の第２の強度を測定し、 （g）前記混合物の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記混合物から
再出現する蛍光性光の第３の強度を測定し、 （h）前記第２の領域の前記少なくとも一つの粒子に近
い前記混合物の第３の領域から再出現する蛍光性光の第
４の強度を測定し、そして （i）前記蛍光性光強度値および前記容器の厚みにおけ
る既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の
体積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３】 粒子は、人細胞または赤血球であること
を特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 液体は、体液、組織培養細胞または細菌
細胞を含む生物学的または医学的サンプルであることを
特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 容器は、光学キュベットであり、染料は
TO-PRO-3およびTO-PRO-5から成る群から選ばれたもので
あることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項６】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液を少なくとも一つの透明な窓を有する
容器内に配置し、 （c）前記容器内の前記懸濁液に、前記粒子に実質的に
漏入しない蛍光性染料であって、前記粒子により弱く吸
収されるのみの波長で励起光を吸収し、前記粒子により
弱く吸収されるのみの波長で蛍光性光を放出することが
できる蛍光性染料を加え、 （d）前記懸濁液を、前記蛍光性染料により吸収される
が前記粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選
択された波長の光で照明し、 （e）前記懸濁液の第１の領域であって、粒子の近くに
位置された第１の領域において前記懸濁液から再出現す
る蛍光性光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記懸濁液
から再出現する蛍光性光の第２の強度を測定し、 （g）前記懸濁液の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記懸濁液から
再出現する蛍光性光の第３の強度を測定し、そして （h） 前記蛍光性光強度値および前記容器の厚みにお
ける既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子
の体積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項７】 液体中の粒子の体積の測定方法であっ
て、 （a）液体中の粒子の懸濁を得、 （b）前記懸濁液に、前記粒子に実質的に漏入しない蛍
光性染料であって、前記粒子により弱く吸収されるのみ
の波長で励起光を吸収し、前記粒子により弱く吸収され
るのみの波長で蛍光性光を放出することができる蛍光性
染料を加え、混合物を形成し、 （c）前記混合物を少なくとも一つの透明な窓を有する
容器内に配置し、 （d）前記混合物を、前記染料により吸収されるが前記
粒子には弱く吸収されるのみの光であるように選択され
た波長の光で照明し、 （e）前記混合物の第１の領域であって、粒子の近くに
位置された第１の領域において前記混合物から再出現す
る蛍光性光の第１の強度を測定し、 （f）前記容器の厚みを前記第１の領域において既知の
量だけ変え、そして前記第１の領域において前記混合物
から再出現する蛍光性光の第２の強度を測定し、 （g）前記混合物の第２の領域であって、少なくとも一
つの粒子を包含する第２の領域において前記混合物から
再出現する蛍光性光の第３の強度を測定し、そして （h）前記蛍光性光強度値および前記容器の厚みにおけ
る既知の変更値に基づいて前記少なくとも一つの粒子の
体積を測定することを含むことを特徴とする方法。 - 【請求項８】 粒子は、人細胞または赤血球であること
を特徴とする請求項６または７に記載の方法。 - 【請求項９】 液体は、体液、組織培養細胞または細菌
細胞を含む生物学的または医学的サンプルであることを
特徴とする請求項６または７に記載の方法。 - 【請求項１０】 容器は、光学キュベットであり、染料
はTO-PRO-3およびTO-PRO-5から成る群から選ばれたもの
であることを特徴とする請求項６または７に記載の方
法。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2013157283A1 (ja) * | 2012-04-18 | 2013-10-24 | オリンパス株式会社 | 標的粒子の検出方法 |
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008523376A (ja) * | 2004-12-10 | 2008-07-03 | ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド | 生体の画像化の方法、ならびにそのための装置およびコンピュータソフトウェア |
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