DE69028370T2

DE69028370T2 - Hochempfindliche fluoreszierende einzelteilchen, gerät und verfahren zum nachweis einzelner moleküle

Info

Publication number: DE69028370T2
Application number: DE69028370T
Authority: DE
Inventors: Richard Mathies; Konan Peck; Lubert Stryer
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1989-05-26
Filing date: 1990-05-21
Publication date: 1997-03-13
Anticipated expiration: 2010-05-22
Also published as: DE69028370D1; EP0426829B1; WO1990014589A1; EP0426829A1; AU5677690A; EP0426829A4; AU624047B2; US4979824A; ATE142334T1; JPH04500274A

Description

Die vorliegende Erfindung wurde teilweise durch Mittel der National Science Foundation, des National Institute of Health und durch den Direktor des Office of Energy Research, Office of Health and Environmental Research, Physical and Technological Research Division, des U.S. Department of Energy gefördert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erfassen einzelner fluoreszierender Partikel bis auf die Ebene einzelner Moleküle und insbesondere auf eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Messen der Konzentration fluoreszierender Partikel oder Moleküle in einer fluiden Lösung oder zum Lokalisieren und/oder Zählen fluoreszierender Partikel oder Moleküle auf Oberflächen oder in Filmen.

Hintergrund der Erfindung

Es besteht ein Bedarf nach empfindlichen Vorrichtungen und Verfahren zum Erfassen einzelner Moleküle und Partikel. In der medizinischen und biologischen Forschung ist es besonders wichtig, daß man die Konzentration, Anzahl oder Position einzelner Partikel, wie zum Beispiel von Bakterien, Viren und DNA- Fragmenten messen kann, die intrinsisch fluoreszierend sind oder mit fluoreszierenden Markierungen oder Sonden gekennzeichnet werden können.
Bei der Suche nach erhöhter Empfindlichkeit verwendete Hirschfeld Evaneszenzwellenanregung zum Erfassen eines auf einem Objektträger adsorbierten, mit 80 Fluoreszinen markierten Antikörpermoleküls.¹ Unter Verwendung einer fließenden Probe erzielten Dovichi et al.² eine Erfassungsgrenze von 22.000 Rhodamin-6G-Molekülen in einer lntegrationszeit von 1s, und Nguyen et al.³ erweiterten diese Grenze auf 800 Moleküle bei hydrodynamisch fokussierten fließenden ¹ Hirschfeld, T. (1976) in Applled Optics 15, 2965-2966. ² Dovichi, N.J., Manin, J.C., Jett, J.H., Trkula, M. & Keller, R.A. (1984) in Anal. Chem 56, 348-354. ³ Nguyen, D., Keller, R. & Trkula, M. (1987) in J. Opt. Soc. Am. 4,138-143.
Materialien. Mathies und Stryer&sup4; wiesen auf die durch Photozerstörung gegebenen Einschränkungen hin und erfaßten drei Moleküle B-Phycoerythrin (PE) in einem Sondenvolumen von 10&supmin;¹² pL. Kürzlich haben Nguyen et al. Fluoreszenzbursts beim Durchfluß einer 10&supmin;¹² M-Lösung von PE durch einen fokussierten Laserstrahl beobachtet, und sie interpretierten diese Bursts so, daß sie auf den Durchgang einzelner Moleküle zurückzuführen seien&sup5;. Zum Erfassen von Fluoreszenzbursts einzelner Moleküle muß sichergegangen werden, daß die Wahrscheinlichkeit des gleichzeitigen Beobachtens von zwei Molekülen im Strahl vernachlässigbar gering ist. In der Verteilungsfunktion sollte sich die Wahrscheinlichkeit der Erfassung vor Nullzählungen aus der fluoreszierenden Probe während eines vorbestimmten Zeitintervalls von derjenigen des Lösungsmittels um weniger als 10% unterscheiden. Ein einfacher Test ist, daß die mittlere Zählungsquote in der Probe sich um weniger als 10% im Vergleich zur Gegenprobe erhöhen sollte. Bei den Experimenten von Nguyen et al. ist die wahrscheinlichste Zählungsquote bei PE doppelt so groß wie diejenige der Gegenprobe, und die Wahrscheinlichkeit für ein einzelnes Vorkommen (0,34) ergibt bei ihnen eine Wahrscheinlichkeit für ein doppeltes Vorkommen von 0,11. Das deutet darauf hin, daß Nguyen et al. Fluoreszenzbursts aufgrund des gleichzeitigen Vorhandenseins von zwei oder mehr Molekülen im abgebildeten Volumen und nicht der Präsenz einzelner Moleküle beobachteten.
Im US-Patent 4,778,593 wird die Unterscheidung winziger Partikel beschrieben, wie zum Beispiel biologischer Partikel oder organischer Polymere. Die Partikel sind in einer Flüssigkeit suspendiert, wobei einzelne Partikel im wesentlichen voneinander getrennt sind, während sie in einem Flüssigkeitsstrom fließen. Der Partikelstrom wird mit einem hochintensiven Lichtstrahl bestrahlt, und aus dem Strom bilden sich dann Tröpfchen, von denen jedes ein Partikel enthält. Die Partikel werden je nach der Veränderung der von den Partikeln über einen Zeitraum ausgestrahlten Lichtenergie unterschieden. Das heißt, jedes Partikel emittiert eine bestimmte zeitlang Licht, je nach seiner Größe und nach seinen Eigenschaften. Die Partikel werden durch Ablenken der Tröpfchen je nach der Veränderung der emittierten Energie sortiert. &sup4; Mathies, R.A. & Stiyer, L. (1986) in Fluorescence in the Bioiogicai Sciences, Taylor, D.L., Waggoner, A.S., Lanni, F. Murphy, R.F. & Birge, R. (Hrsg.) (Alan R. Liss, Inc., New York), 129-140 &sup5; Nguyen, D.C., Keller, R.A., Jett, J.H. & Martin, J.c. (1987) Anal. Chem. 59, 2158-61.
Im US-Patent 4,021,117 wird ein Verfahren zum Zählen und Analysieren von Impulsen beschrieben, die die Eigenschaften von Partikeln repräsentieren, die durch eine Erfassungsvorrichtung gelangen. Die Amplitude des jeweiligen Impulses wird erfaßt, der Bereich unter dem jeweiligen Impuls über einem Referenzniveau wird bestimmt, und ein Verhältnis der Amplitude zum gemessenen Bereich wird errechnet. Die Vorrichtung wird zum Vorsehen gegen den Durchgang von Vielfachpartikeln durch die Erfassungszone des Geräts verwendet.
Im Stand der Technik ist kein Verfahren und keine Vorrichtung vorgesehen die eine schnelle ultrasensible Erfassung und Zählung fluoreszierender Partikel bis zur Grenze einzelner Moleküle durchführen könnte, noch ist beim Stand der Technik ein Verfahren zum Bestimmen der optimalen Bedingungen zum Erzielen dieser hohen Erfassungssensibilität vorgesehen.

Aufgabe und Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur quantitativen Erfassung einzelner fluoreszierender Partikel in einer Lösung bis auf das Niveau einzelner Moleküle vorzusehen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zum Lokalisieren und Zählen fluoreszierender Partikel oder fluoreszierender Moleküle auf Substraten vorzusehen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und eine Verfahren zum Erfassen und Quantifizieren einzelner Partikel in einer Lösung oder auf einem Substrat in Echtzeit vorzusehen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur quantitativen Erfassung einzelner, intrinsisch fluoreszierender Partikel oder mit fluoreszierendem Material markierter Partikel vorzusehen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren vorzusehen, bei dem einzelne Partikel in einer fluiden Lösung mit einem Lichtstrahl beleuchtet werden und das von den Partikeln und dem Fluid emittierte Licht zur Erstellung einer Parikelzählung verarbeitet wird.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, eine Vorrichtung und ein Verfahren vorzusehen, bei dem ein fluoreszierende Partikel enthaltendes Fluid beleuchtet wird und Fluoreszenz-Photonenbursts von den Partikeln von Hintergrundphotonemission zur Erstellung einer Anzeige von Partikeln unterschieden werden.
Die obigen und weitere erfindungsgemäße Aufgaben werden durch eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erfassen fluoreszenter Partikel in einem Fluid, wie sie durch die Patentansprüche definiert sind, gelöst.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Die obigen und weitere erfindungsgemäße Aufgaben werden aus der folgenden Beschreibung anhand der Zeichnungen besser verständlich. Es zeigt:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Vorrichtung, bei der die Partikel in einem Fluidstrom vorliegen,
Fig. 2 ein Blockdiagramm der elektronischen Torschaltung von Fig. 1, wobei die Eingangs- und Ausgangssignale an verschiedenen Punkten in der Schaltung gezeigt werden,
Fig. 3 eine weitere Ausführungsform der Torschaltung von Fig. 1,
Fig. 4 noch eine weitere Ausführungsform der Torschaltung von Fig. 1,
Fig. 5 eine digitale Ausführungsform der Torschaltung,
Fig. 6 die Laserintensität und die Partikeldurchgangszeit bei optimalen Signal- zu-Rauschen-Bedingungen,
Fig. 7 des optimale Signal-zu-Rauschen-Verhältnis bei optimalen Laserintensitäten in Abhängigkeit von der Durchgangszeit,
Fig. 8 Ergebnisse des Betriebs der Vorrichtung von Fig. 1 in Graphform,
Fig. 9 ein Blockdiagramm einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform zum Zählen und Lokalisieren fluoreszenter Partikel oder Moleküle auf einem Substrat,
Fig. 10 eine schematische Darstellung noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform zum Zählen und Lokalisieren fluoreszierender Partikel oder Moleküle auf einem Substrat,
Fig. 11 eine schematische Darstellung einer weiteren erfindungsgemäßen Ausfüh rungsform zum Zählen und Lokalisieren fluoreszierender Partikel oder Moleküle auf einem Substrat.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsform(en)

Bei der Vorrichtung von Fig. 1 wird eine Laserstrahl 11 durch einen Laser 12 durch eine Polarisiereinrichtung 13 projiziert und durch eine Linse 14 auf den Fluidstrom fokussiert, wie durch den fokussierten Strahl 16 gezeigt. Der Strahl wird auf einen fließenden Probenfluidstrom 17, der in einer Kapillarröhre 18 fließt, fokussiert. Schematisch ist eine Flußsteuerungseinrichtung 19 gezeigt, die zum Steuern der Fließgeschwindigkeit des Stroms 17 dient. Die Laserpolarisierung ist durch die Polarisierungseinrichtung 13 zum Minimieren der Hintergrundstreuung in der Streuebene ausgerichtet. Der Laserstrahl beleuchtet den in der vergrößerten Darstellung 22 gezeigten Bereich 21. Eine Abbildung des beleuchteten Volumens wird durch die Objektivlinse 24 auf ein Raumfilter 23 abgebildet. Das Raumfilter 23 verkleinert den beleuchteten Bereich und das zu untersuchende Volumen auf das durch die Referenznummer 26 bezeichnete Volumen. Das Raumfilter definiert die Höhe und Breite des Probenvolumens. Ein Spektrumsfilter 28 filtert aus dem beleuchteten Volumen kommende gestreute Rayleigh- und Raman-Emission heraus. Die durch das Raum- und das Spektrumsfilter hindurchgelassene Energie wird durch eine Fokussierungslinse 28 auf einen Fotowandler 29, der eine Fotovervielfacherröhre oder ein anderer Fotowandler mit der erforderlichen Empfindlichkeit sein kann, fokussiert.
Wenn ein fluoreszierendes Partikel 31 durch den Laserstrahl fließt und von diesem bestrahlt wird, wird ein Photonenburst erzeugt. Dieser Photonenburst wird zusammen mit der Hintergrundemission von der Fotovervielfacherröhre erfaßt, die ein Ausgangssignal erzeugt. Dieses Ausgangssignal wird an eine elektronische Torschaltung 33 geleitet, die so konstruiert ist, daß sie Bursts einer bestimmten Amplitude und Dauer erkennen kann. Die interessierenden Bursts haben eine Dauer, die der Durchgangszeit durch das Volumen entspricht, und mindestens eine Mindestamplitude. Wenn ein solcher Burst erfaßt wird, wird das resultierende Signal an den Zähler 34 und an einen Computer 36 weitergeleitet, der die verarbeiteten, über vorbestimmte Zeiträume vorgenommenen Zählungen verarbeiten kann und eine Konzentrationsanzeige oder andere relevante Information liefert.
Bei Fig. 2 wird in Fig. 2A das Ausgangssignal von der Fotovervielfacherröhre gezeigt, das neben mehreren Photonenbursts, wobei die niedrigfrequente Hintergrundemission 38 Rayleigh- und Raman-Streuung darstellt und die hochfrequenten Bursts 39 ein durch das Probenvolumen gehendes Partikel darstellen, elektronisches Rauschen 40 aufweist. Das von der Fotovervielfacherröhre kommende Signal wird an eine Impulshöhenunterscheidungsschaltung 41 weitergeleitet, die Impulse vorbestimmter Amplituden hindurchläßt, und dann an einen Frequenz-Spannungs-Wandler 42, der die Frequenz der Impulse in eine Spannung 43 umwandelt. Danach wird die Spannung 43 an eine Impulshöhenunterscheidungsschaltung 44 geleitet, die zwei Ausgangsimpulse 46 und 47 erzeugt und niederfrequente Hintergrundemissionen herausfiltert. Ein Impulsbreiten-Spannungs-Wandler 48 empfängt die Impulse und erzeugt das mit 51, 52 in Fig. 2E gezeigte Ausgangssignal.
Eine Impulshöhenunterscheidungsschaltung 53 erfaßt die Impulse 51 und 52 und erzeugt einen Ausgangsimpuls 54, wenn der Impuls 52 eine vorbestimmte Amplitude übersteigt oder in einem durch die zwei punktierten Linien in Fig. 2E gezeigten Bereich liegt. Eine Fensterunterscheidungsschaltung kann zum Herausfiltern sehr langer, physikalisch nicht sinnvoller Impulse eingesetzt werden. Die Amplitude ist der Anzeiger für die Anwesenheit eines Partikels. Die Schaltung filtert hochfrequente, spitze, kurz andauernde elektronische Zacken 40, wie sie durch den Impuls 51 dargestellt sind, ebenso heraus wie niederfrequente Hintergrundemissionen 38.
Ein alternatives Erfassungsverfahren ist in Fig. 3 gezeigt, bei dem das Signal von der Fotovervielfacherröhre 29 an einen Strom-Spannungs-Wandler 52 weitergeleitet wird, der ein im wesentlichen dem in Fig. 2C gezeigten entsprechendes Signal erzeugt. Das Signal kann dann an die Implshöhenunterscheidungsschaltung 44 und die Impulsbreitenunterscheidungsschaltungen 48 zum Erzeugen eines die Anwesenheit von Partikeln anzeigenden Signals angelegt werden.
Fig. 4 ist eine verallgemeinertes Blockdiagramm der Verarbeitungsschaltung, die die oben beschriebene Impulshöhenunterscheidungsschaltung und Impulsbreitenunterscheidungsschaltung 48 aufweist.
In Fig. 5 ist eine digitale Schaltung zum Durchführen der Impulshöhen- und Impulsbreitenunterscheidung zum Erfassen gültiger Photonenbursts von fluoreszierenden Partikeln dargestellt. Das aus der Fotovervielfacherröhre kommende Ausgangssignal wird verstärkt 56 und an die Impulshöhenunterscheidungsschaltung 57 zum Erzeugen eines Signal des in Fig. 2B gezeigten Typs geleitet. Das aus der Impulshöhenunterscheidungsschaltung kommende Ausgangssignal wird an eine Zählerschaltung geleitet, die durch den ersten ankommenden Impuls ausgelöst wird. Der Impuls schließt auch ein Tor und startet eine veränderbare Verzögerungsschaltung 59, die auf die Durchgangszeit des Moleküls durch den Laserstrahl eingestellt wird. Der Zähler fährt mit der Zählung fort, bis die verstellbare Verzögerungsschaltung den Zähler 61 stoppt, den Zähler zurückstellt und das Tor öffnet, damit ein neuer Verzögerungszyklus anfangen kann. Eine Größenvergleichsschaltung 62 vergleicht die Zahl der Zählungen, die der Zähler während der Verzögerungszeit erzeugt, mit einem vorbestimmten Hintergrundwert, da die Fluoreszenzbursts von den Partikeln eine höhere Zählungsquote als die Hintergrundemission aufweisen. Wenn die Zahl einen vorbestimmten Hintergrundwert übersteigt, ist das ein Anzeichen dafür, daß ein Molekül durch den Strahl gelangte, und es erfolgt eine Zählung.
Bei der Erfassung einzelner Partikel oder Moleküle ist es wichtig, Bedingungen zu schaffen, die das Ereignis des einzelnen Partikels oder Moleküls so hell wie möglich im Vergleich zu den Fluktuationen der Hintergrundemission gestalten. In dieser Hinsicht muß der Laser eng fokussiert sein, und das Raumfilter muß ein Sondenvolumen definieren, das so klein ist, daß die Wahrscheinlichkeit mehrerer im Volumen vorhandener Moleküle oder Partikel vernachlässigbar gering ist. Die Laserenergie muß so gewählt werden, daß die hellste Fluoreszenz ohne eine übermäßige Hintergrundemission erzeugt wird.
Zum Erhalten der zum Erfassen einzelner Moleküle durch laserinduzierte Fluoreszenz benötigten Sensibilität müssen die einfallende Laser-Erregungsintensität und die Durchgangszeit der Moleküle durch den Laserstrahl gesteuert werden. Die hier erarbeitete Theorie und die entsprechenden Experimente haben ergeben, daß die Sättigung der Absorption des erregten Zustands und der Grundwert des photochemischen Photozerstörungsorts die Laserenergie und die Belichtungszeit (Durchgangszeit) beschränken, die das beste Signal-zu-Rauschen- Verhältnis ergeben. Zum Definieren der optimalen Bedingungen ist es sinnvoll, wenn zuerst einmal die relevanten Variablen definiert werden:
(1) Die zu beobachtende Fluoreszenzemissionszerfallsrate wird als kf (in Photon/s) definiert;
(2) die Erregungsrate der molekularen Absorption ist durch ka (in Photon/s) gegeben. Diese Rate hängt von der einfallenden Lichtintensität und vom optischen Absorptionsquerschnitt im Molekül ab.
ka = l a (1)
Hier ist a der Absorptionsquerschnitt (in cm²/Molekül), der mit dem herkömmlichen Molarextinktionskoeffizienten &epsi; (in l/(mol cm)) zusammenhängt durch:
a= 3,824 x 10&supmin;²¹&epsi; (2)
(3) die Durchgangszeit des Moleküls durch den Laserstrahl oder die Überstreichzeit des Strahls über das Molekül ist durch τt = w/v (in s) gegeben, wobei w die Breite des Laserstrahls ist und v die Geschwindigkeit.
(4) Die charakteristische Photozerstörungsrate kpd (in s&supmin;¹) definiert die Rate erster Ordnung, bei der die Moleküle durch Licht zerstört werden. Sie hängt mit dem Photozerstörungs-Quantenertrag Φpd zusammen durch
kpd = Φpd kf (3)
Die charakteristische Photozerstörungszeit τpd ist durch den Reziprokwert von kpd gegeben.
Die Gleichung (4) unten gibt die Fluoreszenz pro Molekül, geteilt durch die Wurzel des mittleren Hintergrundsignals pro Durchgangszeit an. Das ist ein Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, da ein Interesse an der Optimierung des Signals (Fluoreszenz pro Molekül) im Verhältnis zu den Fluktuationen des Hintergrunds besteht. Die Gleichung ist die folgende:
S/ B (kτ)-1/2 [1 - exp{-k τ/(k + 1 )}] (4) In dieser Gleichung ist die Variable k als ka/kf und τ als τt/τpd definiert. Die Optimierung des Experiments hängt also von dem Verhältnis der Erregungsrate zur Emissionsrate (ka/kf) und vom Verhältnis der Durchgangszeit zur Photozerstörungszeit (τt/τpd) ab. Eine zweidimensionale Darstellung von S/ B in Abhängigkeit von k und τ ist in Fig. 6 dargestellt. Dies ist eine grundlegende Funktion, die auf alle Fluorophore zutrifft.
Zum Optimieren der Bedingungen für ein bestimmtes Fluorophor ist es lediglich nötig, die charakteristische Fotozerstörungszeit und die beobachtete Fluoreszenzdauer zu wissen. Die Punkte in Fig. 6 geben die optimalen S/ B-Werte bei den optimalen Lichtintensitäten bei Durchgangszeiten τ von 0 bis drei an. Fig. 7 is eine Darstellung des optimalen S/ B in Abhängigkeit von der Durchgangszeit. Zum Durchführen eines Experiments wählt man lediglich die längste für das betreffende Experiment praktikable Durchgangszeit und wählt die Erregungsintensität, die bei dieser Durchgangszeit eine maximales S/ B ergibt.
Die Vorrichtung von Fig. 1 und 2 wurde zum Erfassen von Einzelmolekülfluoreszenz in einer subpicomolaren Lösung von Monomeren und Dimeren von B- Phycoerythrin (PE) verwendet. Der Argonlaser 12 lieferte einen Erregungsstrahl, der auf einen ein paar µm messenden Punkt in der Mitte eines in einer Kapillarröhre 18 fließenden Probenstroms 17 fokussiert wurde. Die Fließgeschwindigkeit wurde so gewählt, daß eine Durchgangszeit entstand, die ungefähr gleich der Photozerstörungszeit für PE war, und die Laserintensität wurde so gewählt, daß sie ein optimales S/ B ergab, wie in Fig. 6 und 7 angegeben. Die Fluoreszenzemission wurde durch eine Mikroskopobjektiv 24 gesammelt und auf ein Raumfilter 23 abgebildet. Das Raumfilter definierte das Sondenvolumen und filterte Streulicht und Fluoreszenz von den Wänden der Kapillarröhre heraus. Ein Fluoreszenzinterferenzfilter 27 wurde zum Herausfiltern von Rayleigh- und Raman-Streuung verwendet. Die Fluoreszenz wurde mit einer Fotovervielfacherröhre und einer Verstärkungs-/Unterscheidungsschaltung erfaßt. Der Fluoreszenzburstdetektor in Fig. 2 wurde dann zum Aufzeichnen der Anzahl von Ereignissen on-line und in Echtzeit verwendet.
Fig. 8 ist die Aufzeichnung der Anzahl von Einzelmolekülereignissen im Verhältnis zu der Aufzeichnung der Konzentration von PE-Monomeren und - Dimeren.
Die Regressionslinien dieser zwei Funktionen haben eine Steigung, die eins ziemlich nahe kommt, nämlich 1,05 für die Monomerdaten und 1,15 für die Dimerdaten. Die lineare Konzentrationsabhängigkeit beweist, daß es sich hier um Einzelmolekülereignisse handelt. Der dynamische Bereich wird durch die Abtastzeit bei niedrigen Konzentrationen und durch vielfaches Vorkommen bei hohen Konzentrationen begrenzt. Bei Werten über 10&supmin;¹² M bewegt sich der Durchschnittswert aufgrund der Fluoreszenz um das Probenvolumen herum nach oben. Diese Experimente wurden alle mit einer ausreichend geringen Konzentration durchgeführt, so daß die Wahrscheinlichkeit für ein Einzelvorkommen geringer als ungefähr 0,02 war. Dadurch wird weiterhin sichergestellt, daß es sich um Einzelmolekülereignisse handelt.
In Fig. 1 fließt die Fiuidlösung durch den beleuchteten Bereich, wobei Partikel einen Burst von Photonen emittieren, während sie im Volumen sind. Es ist offensichtlich, daß der beleuchtete Bereich über eine Oberfläche oder eine Folie auf einem Substrat zum Lokalisieren und Erfassen von Partikeln bewegt werden kann Der Endeffekt ist der gleiche, da die Partikel nur während der Durchgangszeit τ, während der sie beleuchtet sind, emittieren. Durch Bewegen des Lichtstrahls im Verhältnis zur Oberfläche oder durch Bewegen des Substrats zum Beispiel auf einem Objektträger oder dergleichen ist es möglich, den gesamten auf dem Substrat oder dem Objektträger liegenden Bereich zum Lokalisieren oder Zählen der Partikel zu bestreichen.
Mit Bezug auf Fig. 9 kann die Lösung auf einem Substrat oder einem Objektträger 67 als ein dicker Film 66, in Filterpapier oder in Gel getragen werden, das durch eine geeignete X-Y-Antriebseinrichtung wie zum Beispiel durch Zahnstangenantriebe, Schrittmotoren oder dergleichen bewegt werden. Licht von einer Lichtquelle 68, die ein Laser oder dergleichen sein kann, wird auf den Objektträger durch eine Linse 69 fokussiert. Das Licht gelangt durch einen Strahlteiler 71 und trifft auf die Probenlösung. Die von der Lösung emittierten Photonen werden durch den dichroitischen Strahlteiler an die Sammlungsoptik 72, das Raumfilter 73, das Spektrumsfilter 74 und den Detektor 76 reflektiert. Wie oben beschrieben, definiert das Raumfilter den Bereich, der betrachtet wird, und das Spektrumsfilter filtert gestreute Rayleigh- und Raman-Emissionen. Das Signal wird dann durch die Torschaltung 33 verarbeitet, durch den Zähler 34 gezählt und an den Computer 36, wie zuvor beschrieben, weitergeleitet. Dadurch wird hier ein Scanner für fluoreszierende einzelne Partikel zur Verwendung in Verbindung mit einem Objektträger oder dergleichen vorgesehen. Durch Steuern des X-Y-Antriebs kann der gesamte Film analysiert werden. Die Durchgangszeit τ der Partikel im beleuchteten Volumen wird durch die Bewegungsgeschwindigkeit der Objekttische bestimmt Der Bereich kann wie gewünscht abgetastet werden. Eine der oben beschriebenen elektronischen Verarbeitungsschaltungen kann zum Verarbeiten des Ausgangssignals des Detektors verwendet werden, wodurch ein Partikelidentifikationsausgangssignal erzeugt wird.
Fig. 10 zeigt eine weitere Vorrichtung zum Abtasten von Film 66 auf einem Substrat 67. Hier wird das Substrat nicht in einer Translationsbewegung bewegt, sondern das Substrat ist stationär, und der projizierte Strahl wird durch die Abtastbewegung eines Spiegels oder einer Baugruppe über die Probe geführt. In Fig. 10 projiziert eine Lichtquelle 78 einen Lichtstrahl 79, der durch den dichroitischen Strahlteiler 81 gelangt, durch die Abtastspiegelanordnung 82 abgelenkt und von der Abtastlinse 83 auf den Film 66 fokussiert wird. Die emittierte Photonenenergie wird von der Abtastlinse gesammelt, von der Abtastspiegel anordnung auf einen Strahlteiler gelenkt, wonach sie auf die Fokussierungs- und Sammlungsoptik 72 trifft, durch das Raumfilter 73, das Spektrumsfilter 74 gelangt und von einem Detektor 76 gesammelt wird. Das Ausgangssignal wird dann von der elektronischen Toreinrichtung 33, dem Zähler 34 analysiert und dann zum Computer 36 weitergeleitet. Der Abtastspiegel kann zwei Abtast-Galvanometerspiegel die durch an die Galvanometermotoren geleitete Signale zum Anstellen der Spiegel abgelenkt werden, verstellen. Ein Spiegel wird mit großer Geschwindigkeit in einer ersten Richtung zum Überstreichen der Probe bewegt, und ein zweiter Spiegel mit geringerer Geschwindigkeit zum Weiterbewegen der Abtastung erzeugt eine Rasterabtastung der durch die Linien 84 gezeigten Art. Alternativ kann der Strahl langsam in der x- Richtung durch einen Schrittmotor oder dergleichen bewegt werden. Wieder liefern mit dem Detektor zusammenhängende elektronische Ströme die notwendige Signalunterscheidung zum Identifizieren und Erfassen einzelner Partikel.
In Fig. 11 ist gezeigt, wie das Substrat 67 und der Film 66 auf einem Translationstisch des im Zusammenhang mit Fig. 9 beschriebenen Typs angeordnet sind. Eine Lichtquelle 86 liefert Energie an einen dichroitischen Strahlteiler 87 und die Energie wird durch die Linse 88 auf den Film 66 fokussiert. Die emittierte Energie wird durch die Linse 88 aufgenommen und durch den dichroitischen Strahlteiler 87 durch ein Spektrumsfilter 89, Fokussierlinse 91 und Raumfilter 92 zum Detektor 93 geleitet. Das vom Detektor kommende Ausgangssignal wird durch die elektronische Schaltung verarbeitet, die die elektronische Toreinrichtung 33, den Zähler 34 und den Computer 36 aufweist.
Es erweist sich, daß bei jedem der obigen Beispiele die Elektronik und die Ansteuerung darauf beruht, daß beim entweder durch Bewegung des Partikels oder durch Bewegen des beleuchteten Bereichs erfolgenden Durchgehen eines fluoreszenten Moleküls oder Partikels durch das beleuchtete Volumen, es über einen vorbestimmten Zeitraum beleuchtet wird und einen Photonenburst emittiert. Dieser Photonenburst kann von Hintergrundemission durch einen erfindungsgemäßen Einzelpartikelburstdetektor unterschieden werden, der nur anspricht, wenn die Photonenbursts die richtigen Amplitude und Dauer oder Breite haben.
Die Erfindung wurde zwar anhand einer bestimmten Ausführungsform beschrieben, doch soll die Beschreibung die Erfindung nur veranschaulichen und ist nicht als die Erfindung einschränkend zu verstehen. Verschiedene Modifikationen und Anwendungsweisen mögen dem Fachmann einfallen, ohne daß dadurch vom Umfang der Erfindung, wie er in den Patentansprüchen definiert ist, abgewichen wird.

Claims

1. Vorrichtung zum Erfassen einzelner fluoresziernder Partikel und/oder Moleküle in einem Fluid mit:

einer Einrichtung zum Beleuchten eines vorbestimmten Volumens des Fluids;

einer Einrichtung zum Durchbringen von Partikeln und/oder Molekülen durch das beleuchtete Volumen, wobei Bursts floureszierender Energie von den Partikeln und/oder auf die Beleuchtung ansprechenden Molekülen emittiert werden, während sie durch das Volumen hindurchgehen; und

einer Einrichtung zum Erfassen der Bursts fluoreszierender Energie und zum Erzeugen eines Ausgangssignals, dadurch gekennzeichnet, daß

eine Verarbeitungseinrichtung zum Empfangen des Ausgangssignals vorgesehen ist, wobei die Verarbeitungseinrichtung eine Einrichtung zum Erfassen der Amplitude und Dauer der Bursts und zum Unterscheiden der Bursts fluoreszierender Energie von den Partikeln und/oder Molekülen von Hintergrundenergie oder elektronischem Rauschen aufweist, wobei die Verarbeitungseinrichtung eine Anzeige der Erfassung eines durch das Volumen hindurchgehenden Partikels und/oder Moleküls erzeugt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zum Erfassen der Amplitude und Dauer der Bursts einen Frequenz-Spannungs-Wandler, ein analoges Signal, eine Impulshöhenunterscheidungseinrichtung zum Empfangen des Signals und zum Erzeugen von Ausgangsimpulsen mit einer Impulsbreite, die der Zeit entspricht, die das Signal einen vorbestimmten Wert überschreitet, und eine lmpulsbreitenunterscheidungeinrichtung, die ein Ausgangssignal erzeugt, wenn die Ausgangsimpulsbreite einen die Durchgangszeit des Partikels anzeigenden vorbestimmten Wert überschreitet, aufweist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, bei dem die Impulsbreitenunterscheidungseinrichtung einen Impulsbreiten-Spannungs-Wandler, der die Ausgangsimpulse empfängt und eine Ausgangsspannung erzeugt, die eine von der Impulsbreite abhängige Amplitude hat, und eine Impulshöhenunterscheidungseinrichtung zum Erfassen, wann die Ausgangsspannung eine vorbestimmte Amplitude überschreitet oder in einem vorbestimmten Fenster liegt, aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zum Erfassen der Amplitude und Dauer der Bursts einen Strom-Spannungs-Wandler zum Empfangen des Ausgangssignals der Erfassungeinrichtung und Erzeugen eines analogen Ausgangssignals, eine Impulshöhenunterscheidungseinrichtung zum Empfangen des analogen Signals und Erzeugen von Ausgangsimpulsen mit einer Impulsbreite, die der Zeit entspricht, die das Signal ein vorbestimmtes Volumen überschreitet, und eine Impulsbreitenunterscheidungseinrichtung, die ein Ausgangssignal erzeugt, wenn die Ausgangsimpulsbreite einen vorbestimmten Wert überschreitet oder in einem vorbestimmten Fenster oder Bereich liegt, der die Durchgangszeit eines Partikels durch das Volumen anzeigt, aufweist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zum Erfassen der Amplitude und Dauer der Bursts eine Einrichtung zum Zählen von über vorbestimmte Zeiträume emittierten Photonen und zum Erzeugen eines einen Partikel und/oder ein Molekül anzeigenden Ausgangssignals, wenn die Zählung einen vorbestimmten Wert überschreitet, aufweist.

6. Verfahren zum Erfassen einzelner fluoresziernder Partikel und/oder Moleküle in einem Fluid mit den folgenden Schritten:

Beleuchten eines vorbestimmten Volumens des Fluids,

Durchschicken von Partikeln und/oder Molekülen durch das beleuchtete Volumen, wodurch Bursts zu emittierender fluoreszierender Energie erzeugt werden, und

Erfassen der Energie und Erzeugen eines Ausgangssignals aus den durchgehenden Partikeln und/oder Molekülen, dadurch gekennzeichnet, daß das Signal in der folgenden Weise vearbeitet wird:

es werden Hintergrundenergie darstellende elektrische Signale gesperrt und

es wird ein Ausgangssignal erzeugt, wenn elektrische Signale eine Amplitude und Dauer haben, die der Durchgangszeit der Partikel und/oder Moleküle durch das Volumen entspricht, wodurch eine Anzeige der durch das Volumen hindurchgehenden Partikel und/oder Moleküle erstellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, mit dem folgenden Schritt:

Wählen der Beleuchtungsenergie und der Durchgangszeit der Partikel und/oder Moleküle durch das vorbestimte Volumen zum Herstellen des optimalen Verhältnisses von emittierter Energie von Partikeln und/oder Molekülen zur Hintergrundenergie oder Energiefluktuation.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Verfahrensschritte den folgenden Schritt enthalten: Verwenden der Fluoreszenzemissionsdauer und Fluoreszenzlichtzerstörungszeit von Fluorophoren als bestimmende Faktoren.