FI96638C - "Inner-filter"-korjaus fluorometripohjaisella monitoimintoisella laitteella - Google Patents

Description

96638

"INNER-FILTER"-KORJAUS FLUOROMETRIPOHJAISELLA MONITOI-MINTOISELLA LAITTEELLA

Keksintö koskee menetelmää nestenäytteen fluo-5 resenssin optisen vaimenemisen aiheuttaman intensiteetin pienemisen korjaamiseksi fluorometrisen kvantitatiivisen analyyysin yhteydessä, jossa menetelmässä nestenäyte sijoitetaan kyvettiin, kyvettiin suunnataan herätevalonsäde ja herätevalonsäteen nestenäytteessä 10 sen sisältämän aineen vuoksi synnyttämän fluoresoivan valon intensiteetti määritetään ja nestenäytteen sisältämän aineen konsentraatio määritetään intensiteetin perusteella. Edelleen keksintö koskee laitetta menetelmän suorittamiseksi.

15 Kun aineeseen kohdistetaan optista säteily- energiaa (yksinkertaisuuden vuoksi, käytetään tälle ekvivalenttia termiä 'valo'), osa valosta heijastuu, osa läpäisee näytteen ja osa valosta absorboituu näytteeseen.

20 Heijastunut valo muodostuu säännöllisestä - ja epäsäännöllisestä vuosta. Säännöllinen heijastus tapahtuu esimerkiksi järjestelmässä käytettävistä optisista komponenteista.

Läpäissyt valo on myöskin sekoitus säännölli-25 sistä - ja epäsäännöllisistä osuuksista. Edellinen . tarkoittaa sitä, ettei näytteen läpäissyt energia muuta suuntaa. Jälkimmäinen edustaa sironneen energian osuutta.

Valon absorptio näyttelee keskeistä osaa sekä 30 spektrofotometriassa että spektrofluorometriassa. Absorboituneen säteily-energian määrä on se osuus, joka : ei ole heijastunut, sironnut tai läpäissyt ainetta.

Materiaaliabsorptanssi α(λ)6 voidaan näinollen esittää seuraavasti: α(λ) = 1.0 - [τ(λ) + β(λ)], 35 2 96638 missä τ(λ) ja β(λ) edustavat vastaavasti näytteen koko-naisläpäisevyyttä ja kokonaisheijastuvuutta.

Fotometriset ominaisuudet eivät ole aineelle ominaiset. Monet riippumattomat tekijät, kuten säteilyn 5 spektri, polarisaatioaste, valon tulo- ja tarkaste-lusuunta, näytteen paksuus jne., vaikuttavat mitattavaan arvoon.

Fluorometriset ominaisuudet sen sijaan ovat aineelle tyypilliset. Vain osa aineista, jotka absor-10 hoivat energiaa, fluoresoivat.

Fluoresenssi on fotoluminesenssin alaluokka,-joka edelleen kuuluu luminesenssiin, tarkoittaen mitä hyvänsä valon emissiota, joka syntyy ei-termisestä atomien, molekyylien, polyeerien tai kiteiden ener-15 giatilojen virittymisestä.

Luminesenssi luokitellaan viritysmuodon perusteella. Tyypillisimpiä ovat biologisen prosessin seurauksena syntyvä bioluminesenssi tai kemiallisen prosessin seurauksena syntyvä kemiluminesenssi tai fotolu-20 minesenssi, joka voi olla seurauksena valon absorboituessa näytteeseen.

Fotoluminesenssissa erotetaan fluoresenssi ja fosforesenssi, sen mukaan tapahtuuko energiasiirtymä singletti- vai triplettitilojen välillä. Edellinen on 25 seurausta saman multipliteetin omaavan spin-tilan väli-: sestä energiansiirrosta. Jälkimmäinen aiheutuu spin- kielletyn eri multipliteetin omaavan tilan välisestä energiasiirtymästä tai, mikä on todennäköisempää, sisäisen konversion seurauksena. Useimmissa tapauksissa 30 molekyyli virittyy energia-absorption seurauksena perustilaltaan S0 singletti-tilalle sx. Todennäköisimmin virittyy molekyylit, joilla on lyhyin elinikä. Yleisesti ottaen fluoresenssin eliniät ovat selvästi lyhyemmät kuin fosforesenssin, joka toisaalta johtaa siihen, että 35 fluoresenssin intensiteetti on suurempi kuin fosforesenssin.

Valtaosa molekyyleistä palaa välittömästi !l ! Idit Hill ΙΉ'Ν» > · 1 3 96638 alimmalle energiatasolleen ei-säteilevän siirtymän kautta, joten tavallisesti havaitaan säteilevä siirtymä tiloilta Sx ja Τχ perustilalle. Koska osa energiasta muuttuu lämmöksi, emittoituva aallonpituus edustaa 5 pienempää energiaa kuin eksitoiva, tarkoittaen sitä, että emittoituvan valon aallonpituus on suurempi kuin eksitoivan valon aallonpituus.

Tyypillisesti fluoresenssi emittoituu isot-roppisesti, mahdollistaen sen mittaamisen eri suunnis-10 ta. Koska sen intensiteetti suhteessa sironneen valon osuuteen on usein selvästi pienempi, pyritään mittaus suorittamaan suuntaan, jossa sironneen valon osuus on vähäisin, ellei jotkin muut tekijät toisin edellytä ja sironnut valo voidaan vaimentaa optisin suotimin.

15 Perus-geometriat ovat kohtisuora mittaus, jossa eksitoivan ja emittoivan valon välinen kulma on 90°, säteen suuntainen mittaus, jossa fluoresenssi detektoidaan näyteen takaa ja pinnasta suoritettava mittaus, jossa sekä säteilytys että keruu tapahtuu 20 samalta puolelta näytettä.

Kohtisuoran geometrian etu on ilmeinen. Sironta 90-asteen suuntaan on vähäistä ja kyvetin vaikutus voidaan minimoida käyttäen hyvin fokusoitua eksitaatio-ja emissio-optiikkaa. 90-asteen istrumentteja käytetään 25 silloin, kun vaaditaan suurta herkkyyttä. Haittapuolena : on epälineaarisuus suurilla pitoisuuksilla, sillä näyte absorboi merkitävässä määrin sekä eksitoivaa- että emittoituvaa säteilyä, ennenkuin se saavuttaa detektorin. Tätä ns. 'inner-filter'-ilmiötä voidaan pienentää 30 käyttämällä pinnasta mittaavaa geometriaa.10

Vuonna 193713 Bowen ja Sawtell huomasivat pin-: nasta mittaavan geometrian arvon tutkiessaan läpinäky mättömiä ja voimakkaasti absorboivia näytteitä.

Bryant14 esitti pinnasta mittaavan geometrian 35 eksitaatio- ja emissiosäteilyn erottamisen käyttäen mikrokyvettiä.

Viimeisten vuosikymmenten aikana tietokoneista 4 96638 on tullut vakio-osa mittalaitteita. Ritter kuvasi mikrotietokoepohjäisen fluorometrin, joka on suunniteltu aallonpituus-korjausten ja kvantti-hyötysuhteen määrittämiseksi.15 Puyn ja Park raportoivat halvasta 5 mikroprosessoripohjäisestä nanosekunti-fluorometrista.16

Fluoresenssi-sammutuksella tarkoitetaan pros-sesia, joka vähentää aineen fluoresenssin intensiteettiä. Fluoresenssia voidaan lisätä kasvattamalla näytteen viskositeettia, johtuen vähentyneestä energian-10 siirrosta törmäysten muodossa. Päinvastainen tapahtuu kun lämpötilaa kasvatetaan; intensiteetti pienenee molekyylien lisääntyneiden törmäysten johdosta. Happi 02 on myös tunnetusti voimakas 'viritystilan valmentaja’. Fluoresenssin vähenemistä, kilpailevan vieraan aineen 15 vuoksi, edustaa 'törmäys- ja kompleksin muodostus vai-menemistä' ' Korkea fluorogeenipitoisuus voi aiheuttaa vaimenemista. Suuret optiset tiheydet tai aineen turbi-disuus voi johtaa fluoresenssi-intensiteetin pienenemiseen. Tämän tyyppisessä vaimenemisessa puhutaan kon-20 sentraatiosammutuksesta tai mieluummin optisesta sammu tuksesta .

Molekylaarisessa fluoresensispektrometriässä esiintyvistä absorptiovirheistä on kirjoitettu lukuisia artikkeleita.20'25 Termit kuten "inner-filter effect", 25 "pre-filter effect", post-filter effect", "self-absorp- : tion" ja "reabsorbtion" on käytetty kuvaamaan näitä « virheitä, jotka voidaan luokitella eksitoivan säteilyn absorptiona tai emittoituvan säteilyn absorptiona. Tarkkaan ottaen "pre-filter effect" aiheutuu eksitoivan 30 valon absorboitumisesta näyteeseen ja "post-filter effect" aiheutuu emittoituvan valon absorboitumisesta : näytteeseen. "Re-emission"-ilmiö voi tapahtua, jos eksiaatio- ja emissiokaistanleveydet ovat osittain päällekäin, jolloin emittoituva valo absorboituu näyt-35 teeseen aiheuttaen emissiota.

"inner-filter"-efekti ei ainoastaan aiheuta spektrin vääristymistä, vaan voi johtaa myös spatiaali- I itt t dii ii i : i al; . : 5 96638 sen intensiteettiprofiilin muuttumiseen. Tämä ulkoisen fluoresenssi-jakauman epäisotrooppisuus ovat keskeisiä tekijöitä valittaessa sopivaa mittausgeometriaa.

Koska valon absorboituminen on fotoluminesens-5 sin perusta, "inner-filter"-efektillä on tärkeä osuus fotoluminesenssi-spektrofotometriassa. Vaikka tutkijat, jotka käyttävätkin fluoresenssiin pohjautuvia menetelmiä ovatkin tavallisesti tietoisia tästä absorptio-ongelmasta, mutta yleisesti ottaen pitävät sitä merkityk-10 settömänä, olettavat sen olevan vakion näytteestä toiseen tai jättävät sen kokonaan huomioimatta. Perussääntönä on pitää fluorogeenin konsentraatio mahdollisimman pienenä, jotta eksitoivan valon absorptio olisi pientä; tämä ei kuitenkaan ole kattava ratkaisu "in-15 ner-filter"-efektin välttämiseksi. Oletetaampa tapaus, jossa fluoresoivan aineen pitoisuus on alun alkaen pieni, mutta näyte sisältää muita aineita, jotka absorboivat voimakkaasti. Laimentaminen ei tässä tapauksessa lisää määrityksen tarkkuutta.

20 Tämän lisäksi laimentaminen voi aiheuttaa muutoksia, koostumuksessa sitoutumisessa, liukenevuu-dessa ja liittymisasteesta kuten myös muita kemiallisia tapahtumia, jotka voivat vaikuttaa absorptio-fluoresenssi-prosessiin, ja näinmuodoin aiheuttaa suuria 25 virheitä mittauksiin. Toisaalta laimennusvirhe vaikut-: taa merkittävästi fluorometrisen määrityksen tulokseen, jos primääri-absorption muuttumisesta aiheutuvia fluo-resenssiarvoja ei korjata.

Mode ja Sisson27 muotoilivat analyyttisen lau-30 sekkeen kyvetistä riippuvien optisten tiheyksien eroil-le pinnasta mittaavalle geometrialle. Holland on joh-tanut eksitaatio-absorptiosta aiheutuvan korjauksen kohtisuoralle geometrialle. Vastaavan korjauksen fluo-resenssiemissiolle on esittänyt Christman29. Leese ja 35 Wehry ovat johtaneet fluoresenssi-vaimennuksen "inner— filter"-korjauksen sekä kohtisuoralle että pinnasta mittaavalle geometrialle.30 6 96638

Perussääntö, jonka perusteella "inner-fil-ter"-vaikutus voidaan evätä on "laimeat näytteet, joihin vähemmän kuin 2% eksitoivasta valosta absorboituu"23. Tällöin, mikäli näyte absorboi joko eksitoivaa 5 tai emittoituvaa valoa tai molempia selvästi, pitää "inner-filter"-korjaus suorittaa. Tämä on erityisen tärkeää etenkin kohtisuoraa - tai läpi mittaavaa geometriaa sovellettaessa, jossa suuri pitoisuus saattaa johtaa pieneen lukemaan ja näin harhauttaa tutkijaa.

10 Tavallinen tapa "Inner-Filter"-vaikutuksen korjaamiseksi perustuu spektrofotometriseen näytteen optisen tiheyden mittaamiseen niin eksitoivalle kuin emittoituvalle valolle. Tämä menettelytapa on alttiina seuraaville ongelmille; monet fluoresoivat näytteet 15 saattavat muuttaa spektristä käyttäytymistään ennenkuin fluoresenssi- ja absorbanssimittaukset on suoritettu; analysointiin tarvittava aika kasvaa lisääntyneiden mittausten johdosta; täytyy toki myös kiinnittää huomiota, että eksitaatio- ja emissiokaistanleveydet inst-20 rumenttien välillä vastaavat toisiaan. Jotta kahden eri laitteen väliset eroavaisuudet voitaisiin eliminoida, on kehitetty joitakin laitteita, joilla voidaan mitata sekä absorbanssi- että fluoresenssiarvoja.

Novakin esittämää tapaa käyttäen voidaan "in-25 ner-filter"-korjaus suorittaa yhdellä ja samalla lait teella.32 Tämän lisäksi, näytteen absorbanssia ei tar-! vitse mitata; spektrofluorometri on ainoa mittalaite, jota tarvitaan. Menetelmä on nimetty "cell-shift"-mene-telmäksi koska näytekyvettiä pitää siirtää, jotta eksi-30 taatio- ja emissiovalon efektiivistä vaikutusmatkaa voidaan muuttaa.

: Haittapuolena on vaatimus kyvetin siirtämisek si. Jotta voitaisiin suorittaa sekä "pre-filter"- että "post-filter"-korjaukset, tulee kyvettiä voida siirtää 35 kahteen suuntaan, joka näinmuodoin rajoittaa menetelmän käytettävyyttä. Sitä voidaan käyttää ainoastaan 'yksi-kyvettisessä' laitteessa, ei MTP-pohjäisessä järjestel- Ί m.t m. i ί 4 «I . i 7 96638 mässä.

Keksinnön tarkoituksena on tuoda esiin yksinkertainen menetelmä, joka mahdollistaa inner-filter vaimenemisen aiheuttaman epälineaarisuuden korjaamisen 5 tavalla, joka soveltuu mihin hyvänsä kyvettiratkaisuun mukaanlukien mikrotiitterikyvetistö. Menetelmän mukainen korjaus voidaan suorittaa pelkällä fluorometrilla eikä kyvettiä tarvitse siirtää. Menetelmä mahdollistaa myös nopean korjauksen. Menetelmä perustuu fluoresoi-10 van kohteen kuvan käsittelyyn. Prosessointitavan määrää geometria ja käytettyjen komponenttien luonne. Kun sopivan raon ja kuvan projektion välinen konvoluutio muodostetaan, voidaan optinen kokonaissammutus laskea ja korjata.

15 Keksinnölle tunnusomaisten seikkojen osalta viitataan patenttivaatimuksiin.

Jotta näihin erilaisiin "inner-filter"-kor-jausmenetelmiin voitaisiin referoida, tullaan tässä kirjoituksessa käyttämään muutamia lyhennöksiä. Ta-20 vanomaista keinoa, joka perustuu optisten tiheyksien määrittämiseen spektrofotometrisesti, kutsutaan "Photometric Inner-Filter Correction" ja lyhennetään PIFC.

"Cell Shift" (CS) ja "Image Convolution" (IC) korjaukset toteutetaan tavalla, jossa fuoresoivan näytteen 25 fluoresenssin spatiaaliriippuvuus mitataan; nämä luoki-; teilaan "Fluorometric Inner-Filter Correction" (FIFC) -menetelmiksi. CS ja IC-menetelmien välillä on merkittävä ero; edellisessä koko näytekyvettiä on siirrettävä, jotta korjaus voitaisiin laskea. Jälkimmäisessä 30 prossessointi kohdistuu muodostettavaan kuvaan. Jos käytetään matriisimaista detektoria, ei tarvita edes ; liikkuvia osia. Tässä tutkimuksessa käytettiin edullis ta ratkaisua. Liikkuva rako yhdistettynä valomonistin-putkeen mahdollistaa kuvan konvoluution muodostamisen, 35 josta korjaus voidaan laskea. Tästä menetelmästä käytetään nimitystä "Image Convolution Inner-Filter Correction" (ICIFC).

8 96638

Lineaarisen absorptiokertoimen αλ, Naperiaani-sen raolaarisen absorptiokertoimen 6ηλ ja molaarisen absorptiokertoimen e^välillä on seuraava yhteys 5 ax = e"; c= 2.30 e^c Läpäisyn optinen tiheys tai yksinkertaisesti absorbans-si määritellään seuraavasti: 10 Αλ = 1ος(1/τλ) = e^ch

Nefelometriassa ja turbidometriassa sironnassa ei tapahdu energian häviämistä (toisin kuin Raman-spektros-kopiassa), ainoastaan säteilyn suunta muuttuu. Sironta-15 jakauman muoto on monimutkaisella tavalla riippuvainen useista parametreista kuten partikkelien lukumäärästä, koosta, muodosta, suhteellisesta taitekertoimesta ja käytetyn valon aallonpituudesta. Tarkka teoreettinen analyysi on mahdollista suorittaa, vain jos kaikki 20 tekijät ovat tunnettuja. Käytännössä teoreettisen mallin käyttö ei tule kysymykseen, sen monimutkaisuuden vuoksi, Käytännössä monet nefelometriset ja turbidomet-riset menetelmät ovat vahvasti empiirisiä.

Kvantitatiivinen fluoresenssi-intensiteetin ja 25 konsentraation välinen suhde voidaan johtaa Beer'n ; laista. Geometrinen perusta vertikaaliselle fotomet- t rialle ja fluorometrialle muodostaa sylinterimäinen näytekyvetti, johon altapäin kohdistetaan kollimoitu valovuo.

30 Fluoresenssin ja konsentraation välinen line- aarisuusalue on useimmiten vähintään kaksi dekadia; jota kuitenkin rajoittaa fluoresenssin perustaso ja sammutus. Erityisesti pienin detektoitava aineen määrä on riippuvainen perustason suuruudesta, joka edelleen 35 on riippuvainen instrumentaalisista kuten myös näytteestä johtuvista tekijöistä. Suuret analyytin pitoisuudet ovat fysikaalisessa mielessä riippuvaisia käyte-

il ; &tf:t MU IMU

9 96638 tystä geometriasta.

Oletetaan, että sisäinen vuo on symmetrinen näytteen sisällä ja raon kuva on fokusoitu näytteeseen. Edelleen oletetaan, että emittoituva fluoresenssi on 5 isotrooppista; polarisaatiovaikutukset ovat mitättömät. Lopuksi oletamme, että näytteen pitoisuus on tasaisesti jakautunut, niin että c(z) on vakio.

Voimme todeta, että eksitoivan valon sisäinen vuo φ1χ(ζ)Δλχ etäisyydellä z kyvetin pohjasta on 10 φ1χ(ζ)Δλχ = φχ Δλχ Γχ βχρ(-βηλ c(z)dz) missä Δλχ on eksitoivan valon kaistanleveys, εηλ Naperi-aaninen vaimenemiskerroin, tx on kyvetin pohjan lä-15 päisevyys eksitoivalle valolle. Näinollen kyvetin ulkoinen fluoresenssivuo L on m LM = Cn(n,a)C2 dL,Mz)e-^2)

Jz\ 20 missä C (n,α) = τ cosa/[n(i ) (n2(λ )-sin2a)] 25 Näytteen "bispectral radiant convertance"19 flm( λχ) (=4nLn( λχ) / φΐχ(ζ)Δλχ) voidaan kirjoittaa muotoon 3 0 βη{λχ) = SmxO f " * e:: ^ bU)dz

Jz\ missä B ( ) = c C (n,a)e"y 35

Vertailtaessa takaa - ja pinnasta mittaavia geometrioita, oletettiin, että reunaehdot ovat samat.

10 96638 Näin ei kuitenkaan ole asian laita MTP-kyvetistössä, koska emittoituva vuo läpäisee pohjan pinnasta mittaa-vassa geometriassa, kun se sen sijaan läpäisee vapaan nestepinnan takaa-mittaavassa tapauksessa. Rajapinnan 5 korjauskerroin mielivaltaiselle tarkastelukulmalle γ(0<γ< 90°), muuttuu γ:η funktiona.

Johtaaksemme "bispectral convertance"-arvon pinnasta mittaavalle geometrialle oletamme, että detektori on fokusoitu näytteen sisälle. Ja tilavuuden pro-10 jektiota Ah, tarkastellaan suuntaan γ. Koska "self-absorption" vaikutusalue ja etäisyys tarkasteltavasta emittoivasta kohteesta muuttuu säteen leveyden funktiona, integroimme yli z- ja x-suuntien seuraavasti 15 i2 »nvi ( e-***» dz) * w 20

Sisempi integraali lasketaan suuntaan z, missä z on riippuvainen x:stä φ(χ) = -tan(90-a)x+C 25 missä 0 <a < 90°. Vakio C edustaa suorien φ(χ) ja z-ak-selin leikkauskohtaa, saaden arvot C1=d-Ah/2 ja C2=d+Ah/2 kun x=0, kuten voidaan nähdä kuvasta 2.

Emittoituvan valon vaikutusmatka b(z) on 30 z/cosa.

• fXl *nw a= sloI (| r“dz)dx

Jx I 35 missä K=en-en /cosa.

x n

Ulompi integrandi lasketaan x-akselia pitkin || 1 . Utit lii il iiid : 11 96638 välillä -u/2, u/2, missä u on eksitoivan valonsäteen

X 9 X r X

leveys näytteessä, johtaen lopulta kokonaisluminesens-sin lausekkeeseen --—-—

On oletettu, että eksitoiva säde on koherentti 10 ja säteen leveys on riippumaton z:sta. Todellisuudessa asian laita ei ole tarkkaan ottaen tällainen. Optisten komponenttien aiheuttama aberaatio ja dispersio vaikuttavat tähän idealistiseen olettamukseen.

Tässä tutkimuksessa esitetyllä laitteella 15 voidaan suorittaa fotometrinen "inner-filter"-korjaus (PIFC). Absorbanssi- ja fluoresenssilukemat voidaan mitata samanaikaisesti, käyttäen samaa eksitaatio-suo-dinta. "Post-Filter"-korjaus voidaan laskea, mutta näytteen emissiovalon absorbanssiarvo täytyy mitata 20 emissio-suodinta vastaavalla filtterillä.

Korjauskertoimella C tarkoitetaan arvoa, jolla mitattu fluoresenssilukema F pitää korjata, jotta saadaan fluoresenssin arvo F0, joka vastaa "inner-filter" -vapaata arvoa. Oletetaan, että FQ on konsentraation 25 lineaarinen funktio. Korjauskerroin, joka voidaan esit-tää matemaattisesti

c - F„/ F

30 on riippuvainen geometriasta ja käytetystä menetelmästä .

Kun näytekyvettiä eksitoidaan pohjan läpi, intensiteetti etäisyydellä z on 35 Lx(z) = Lx(0) 10'Ax

Jos emittoituvan fluoresenssin otaksutaan 12 96638 muuttuvan lineaarisesti L^(z) suhteen ja FQ riippuu vastaavasti La „ (0):sta, niin F0 voidaan arvioida lausekkeesta 5 F =BY Äh u

0 mx X

Korjauskerroin C saadaan laskettua lausekkeesta C=KÄh K u eKd* a x 10 sinh(KÄh/2) sinh(Kaux/2) missä K=2.3(A +A /cosö) ' x m K =Ktan(90°-a).

15 Koska dC/dd = C/k on verrannollinen βΜ:ββη, korjauskertoimen suhteellinen virhe kasvaa, mitä syvemmältä luotaus tehdään. Mitä suurempi on optinen tiheys, sitä suurempi on korjauksen suhteellinen virhe.

Vaikka tämä menetelmä on periaatteessa epä-20 herkkä sedimentaatiolle ja haihtumiselle, tutkija haluaa tuoda esiin, että käytännön työssä esiintyvät annos-teluvirheet ja vapaan nestepinnan kaarevoituminen voivat aiheuttaa merkittäviä absorbanssin lukemavirheitä.

Suuret määrät proteiineja tai detergenttejä voivat 25 lisätä pintajännitystä niin, että neste nousee kyvetin ·: seinämille.

Kun rakoa liikutetaan yli fluoresoivan kuvan, jakauman intensiteetti raon paikan funktiona esittää kuvan ja raon konvoluutiota. Kahden reaalisen funktion 30 φ(ί) ja Ψ(0 välinen konvoluutio, jolle käytämme lyhennettä φ(ζ) ♦ Ψ(ζ) on Ω(ί)=Φ(ί) ♦ T(C) 35 Funktio φ(ί) edustaa fluoresoivan objektin kuvaa ja funktio Ψ(ζ) vastaa emissiorakoa.

Koska fluoresoiva kohde rajoittuu kyvetin . . »H i *1*4 lii» 13 96638 pohjan ja ilman välisestä rajapinnasta nesteen ja ilman väliseen rajapintaan, käytämme rect-funktiota määrittelemään fluoresoivan kuvafunktion F(C) 5 F(C)=rect[(C-E/2)/E]4>(0

Parametri Σ edustaa fluoresoivan kohteen korkeus-projektiota ja näinollen määrittää <|>(C):n esiintymisalueen.

10 E=(ux+h tanajcosy missä h on fluoresoivan objektin korkeus ja ux eksi-toivan säteen leveys.

15 Raon tyyppi määrää funktion 7(C) muodon. Käy tetty rako oli suorakaiteen muotoinen, sijaiten kuvatasossa. Vastaavan rakofunktion määrää reet-funktio ?(£)=rect[ (i-£0)/wf] 20 missä on raon korkeus ζ-suuntaan. Käyttäen näitä riippuvuuksia, voimme kirjoittaa konvoluutio-integraalin seuraavaan muotoon.

25 Φ(ζ) ♦ Ψ(ζ) = j F{ti)rect [{ζ-ω)ΐΜ>ζ\άω

Kun raon korkeus tehdään hyvin pieneksi rect-funktio voidaan korvata toisella tunnetulla funk-30 tiolla, nimittäin delta-funktiolla. Käytämme laajalti käytössä olevaa symbolia 6(C) kuvaamaan tätä impulssi-* funktiota. Delta-funktion ja minkä hyvänsä toisen funk tion välinen konvoluutio antaa tämän toisen funktion. Näinollen, jos (ζ)~δ(ζ), niin 35 (5)φ = (5)9 ♦ 0)Φ 14 96638 Tämä on tärkeä tulos; jos voidaan tehdä hyvin pieneksi, konvoluutio lähestyy funktiota F(£), jolloin "inner-filter"-korjaus voidaan helposti extra-poloida.

5 Perustuen edellä sanottuun, emittoituva fluo resenssi jakauma φ(0 on muotoa F0exp(k£), missä FQ on 4 smh(Ä

Fo------ K Ka 10 Käytännössä onkin riittävää tarkastella tapausta, jossa Wj<<E ja ux on pieni. Tällaisen konvoluution tulos on esitetty kuvassa 5.

Konvoluution suurin arvo sattuu kohtaan wf/2.

15 Välillä w^/2<C<E-w^/2, konvoloidun kuvan vaimennuskerroin kc voidaan estimoida konvoluutiointegraalista, esimerkiksi piirtämällä se puolilogaritmiselle paperille ja laskemalla kulmakerroin.

Konvoluutiointegraali saadaan käytännössä 20 mitattua siirtämällä rakoa A£-askelin samalla mitaten emittoituva fluoresenssi. F(£):n arvo exponentiaalisel-la alueella ja välillä £ , £±+Aw voidaan laskea lausekkeesta 25 FAl=exp[k=(£itl " Zi)] • · joka on riippumaton Aw:stä. Tämä merkitsee, että va-kiovälein mitattujen lukemien suhteet ovat riippumattomia raon arvosta w^.

30 Jos askelväli Δ£ on sama kuin raon korkeus logaritmi FA, FA=FAl( A£=w^) on suoraan verrannollinen ‘ vakioon k ja raon korkeuteen w..

LN(FA)=Kwi 35 FQ:n suurin arvo voidaan laskea lausekkeesta :B Itt i Bill I 1 ! £t , .

(B-6.1S) 15 96638 ,, ΜΑΧ(Φ(ζ) ♦ Ψ(0)

Fo =--

Jrw c e-^άζ o

Konvoluution Ω(0 suurin arvo voidaan löytää 5 kokeellisten lukemien perusteella ekstrapoloimalla kohtaan w{/2. F0 voidaan sitten laskea lausekkeesta „ kcMAX(<tXQ ♦ WQ)

Fo =---- l-e·^ 10

Extrapoloinnin tarkkuus on riippumaton w^:stä, mutta jos rako tehdään hyvin pieneksi FQ lähestyy arvoa MAX(φ(C)♦¥(C)/ jolloin extrapoloiduksi arvoksi tulee F0.Tämä voidaan selittää matemaattisesti seuraavasti.

15 Kun f (C)=6(C)» konvoluutio Ω(0=Φ(0· ΜΑΧ(φ(ζ)^Ψ(ζ) on suurin φ(():η arvo eli ΜΑΧ(φ(£))» Koska φ(Ο=Γ0βχρ(-kc£), φ(ζ):η suurin arvo löytyy kohdasta ζ=0. φ(0 redusoituu vakioksi FQ. ΜΑΧ(φ(ζ)4Ψ(ζ) on näinollen FQ.

Kuvan vaimennuskertoimen k^(=kc) ja Naperi-20 aanisten vaimennuskertoimien e" (eksitoivalle valolle) ja e"m (emittoivalle valolle) pätee k, = (en +e"/cosa) /tana cosy ς ' x m 25 Tämä riippuvuus on keskeisessä roolissa. Koska vaimennuskerroin k^ sisältää molemmat sekä "pre-filter"-että "post-filter"-komponentit, on se optisen vaimennuksen kokonaismitta.

ICIFC:n korjauskerroin C = F0/Fh saa muodon 30 C = exp(kh)

Yhtä kaikki, ei ole mieltä käyttää kojausker-rointa C ICIFC:n yhteydessä, sillä menetelmä antaa 35 automaattisesti estimaatin "inner-filter"-vapaasta lukemasta.

Käytännön laitteessa ei ole tarkoituksenmu- 16 96638 kaista muuttaa eksitoivan valonsäteen kokoa, mutta emissio-raon säätäminen voi tulla kysymykseen. Konvo-loidun fluoresenssin suhde emissio-raon kokoon saadaan lausekkeesta 5 (B-620) F (Ahi) sinhi-Sfl) 10 Kuvafunktion φ(£) projektio detektointisuun- taan on esitetty kuvassa 6.

Kuvassa alue IV esittää osaa, jossa fluoresenssi on lähtöisin itse näytteestä. Se edustaa myös aluetta, jossa fluoresenssin muutos dF/dx on vakio x:n 15 tai ζ:η funktiona - mikäli "inner-filter"-vaikutus jätetään huomioimatta. Myös viimeisessä alueessa fluoresenssi on peräisin näytteestä, mutta intensiteetti pienenee x:n myötä.

Fluoresoivan näytteen kuvan korkeus Σ kuva-20 tasossa, riippuu yksikkösuurennoksessa kuvan korkeudesta h (näytetilavuudesta) ja eksitoivan säteen koosta ux. Näytteen fluoresenssi esiintyy alueilla II-V, mutta vain alueilla IV ja V se yksinään edustaa emittoituvaa valoa. Edelleen on selvää, että fluoresenssi on riippu-25 maton kohdasta x, alueella IV, mikäli optista sammutus-ta ei esiinny. Tästä osasta emittoituvaa fluoresenssia « käytetään nimitystä ’Constant Emission Region' ja lyhennetään CER. Vastaava mitattu "Vakioemissioalue" on aina pienempi kuin CER{, sillä v^sllä on aina äärellinen 30 koko. Konvoluutiofunktion Ω(ζ) CERf lyhennetään termillä CCERj. CER^rn ja CCERf:n välinen relaatio on seuraava CERf = CCERf +wf 35 CCERj pienenee eksitaatiosäteen ux ja emissio— raon kasvaessa, kuten voidaan todeta kuvasta 7.

Käytännössä kyvetin pohjan paksuuden tulee il 34« I MI ! i 17 96638 olla mahdollisimman pienen, jotta näytteen suhteellinen osuus fluoresoivasta kuvasta voidaan maksimoida.

Toisaalta, mikäli eksitoivan säteen koko u on hyvin pieni, CER^:n ja näytteen fluoresenssin välinen 5 suhde R kasvaa, kuten käy ilmi yhtälöstä R= (htana-ux) / (htancr-ux)

Jos säteestä tehdään hyvin kapea, voi esiintyä 10 ongelmia. Koska monet fluorogeenit voivat hajota, mikäli niihin kohdistetaan voimakas valo, tulisi välttää paikallisen intensiteetin kasvattamista. Jos intensiteetti pidetään vakiona, emittoituva fluoresenssi pienenee, johtaen pienempää S/N-suhteeseen. Säteen pienen-15 täminen heikentää myös säteen integroivaa vaikutusta.

Lienee selvää, että kohteen kuva, jopa idea-listisimmassakin tapauksessa, on melkoisen monimuotoinen funktio φ(ζ). Monimutkaisuus lisääntyy edelleen, kun otamme huomioon kuvan muodostuksen ja heijastuksen 20 aiheuttamat tekijät.

Näytekyvetin dimensiot näyttelevät melko tärkeää roolia, tämän tyyppisessä geometrisessa ratkaisussa, erityisesti heijastusten vuoksi.

Heijastuspeitto rajoittaa eksitoivan säteen 25 fokusointia lähelle heijastavaa kyvetin seinämää. Kyve-. tin pieni sisähalkaisija estää koko fluoresoivaa näyte- osaa näkymästä detektorille, mikäli eksitoiva säde kohdistetaan pohjan keskipisteen kautta.

"Sivuseinäsiirymän" arvo määrää heijastuspei-30 ton suuruuden. Mitä pienempi on Ay, sitä suurempi on Δχ. Δγ:η arvoa voidaan kasvattaa, tekemällä kyvetin seinämä paksummaksi. Jos ulkoseinä leviää alaspäin, Ay kasvaa edelleen, pienentäen RO:ta. Tehokkain keino estää heijastuksen pääsy detektorille on tehdä kyvetin 35 ulkoseinämä heijastamattomaksi, esimerkiksi maalaamalla se mustaksi.

Käytännössä suositeltavin eksitoivan säteen 18 96638 kyvetin läpäisemä kohta on pohjan keskikohta. Tämä mahdollistaa sekä absorbanssi- että fluoresenssiarvojen mittaamisen samanaikaisesti, tarvitsematta siirtää eksitaatiosädettä absorbanssi- ja fluoresenssimittaus-5 ten välillä.

Eräs rajoittava tekijä on kyvetin reuna, joka leikkaa projektoidun kuvan yläpäätä.

Mittalaite on suunniteltu osaksi järjestelmää, joka lisäksi sisältää annostelu, ravistus ja lämmitys-10 toiminnot. Toisaalta laite, jossa on melkkä mittausmo-duli tarjoaa potentiaalisen laiteratkaisun. Suunniteltu modulaarinen rakenne tukee molempia näistä pyrkimyksistä.

Prototyyppi-laite on suunniteltu ohjattavaksi 15 mikrolla nopeaa sarjaliikennekanavaa (erillinen mikron väylään sijoitettava kortti) hyödyntäen tai käyttäen RS-linjaa, joka takaa yhteensopivuuden eri mikro-valmistajien kesken.

Mikro liikennöinti pääprosessorin kanssa, joka 20 edelleen ohjaa alaprosessoreita. Mikrolla voidaan myös suoraan ohjata alaprosessoreita kuvan 8 esittämällä tavalla.

Kontrolleri on vastuussa mittaukseen liittyvistä toimenpiteistä. Näitä ovat mm. lampun, detekto-25 rin, eksitaatio- ja emissiomoottoreiden ohjaus. Emis-siorakoa ohjattiin prototyypissä manuaalisesti, tosin ‘ ‘ sitäkin tulisi ohjata kontrollerilla.

Monitoimintaisuuden ja ICIFCrn mahdollistaa optisen ytimen toteutustapa. Sen muodostaa mekaanis-op-30 tinen yksikkö, jossa sijaitsevat lamppu, suodinmonokro-maattorit ja detektorit. Ytimen suunnittelulla on kes-. keinen rooli. Jotta geometrisen lopputuloksen perusteet voitaisiin ymmärtää, lienee paikallaan selittää niitä lyhyesti.

35 Koska mitattavat näytteet voivat sisältää epäpuhtauksia, sammuttavia substraatteja ja jopa sirottavia pertikkeleita ja koska läpimittaavan geometrian

tl ' Irti nil I I I il : : I

19 96638 epälineaarisuus on tunnettu ongelma suurilla pitoisuuksilla/ olemme päätyneet käyttämään pinnasta mittaavaa tapaa.

Valo voidaan johtaa näytteen läpi, vapaan 5 nestepinnan kautta (ylhäältä), tai pohjan läpi (alhaalta) .

ICIFC:n kannalta katsoen, detektointi vapaan nestepinnan kautta ei onnistu. Tästä syystä eksitoiva valo tulee johtaa näytteen alta, kyvetin pohjan läpi.

10 Ja emittoituva valo pitää kerätä näytteen alta.

Jotta tällä geometrialla voitaisiin mitata absorbansseja on selvää, että valon säde täytyy johtaa kohtisuoraa kyvetin pohjan läpi.

Emittoituva valo voidaan kerätä näytteen alta 15 joko optista kuitua tai perinteistä linssisysteemiä käyttäen. Molemmat ratkaisut ovat mahdollisia. Vertailtaessa näiden keskinäistä monimutkaisuutta näyttää siltä, että perinteinen linssisysteemi on yksinkertaisempi ja halvempi. Tosin keskeistä on se, että ICIFC 20 vaatii hyvätasoisen kuvan, jota ei voida toteuttaa kuitukimpulla. Tästä syystä valittu ratkaisu pohjautuu diskreettien komponenttien kuten linssien, peilien ja rakojen käyttöön.

Jotta ICIFC voitaisiin suorittaa, täytyy fluo-25 resoivasta näytteestä muodostaa projektoitu kuva. Tämä edellyttää pienen kulman käyttöä eksitoivan ja tarkas- t telusuunnan välillä. Näinollen voimme määritellä "Eksitoiva valon säde tulee johtaa kohtisuoraan näytekyvetin pohjan läpi. Emittoituva valo kerätään näytteen alta, 30 pientä kulmaa käyttäen, pinnasta mittaavaa geometriaa noudattaen ja näytteen läpäissyt valo mitataan ylhäältäpäin".

«

Laite on suunniteltu siten, että tuotannollis-tettavuus kuten myös huollon helppous on huomioitu.

35 Modulaarinen rakenne tukee eri osien testaamista. Optisen ytimen periaatteellinen ratkaisu on esitetty kuvassa 8.

20 96638

Xenon salamalamppu sijaitsee vasemmalla kuvassa. Lampun rakoa (LS) seuraa suodinmonokromaattori eksitaatio-linsseineen, linssin aukko ja eksitaa-tiosuodin (XF). Säteenjakaja (BS) johtaa noin 4% valos-5 ta referenssidetektorille (RD). Suurin osa valosta ohjataan ylöspäin, kohtisuoraan kyvetin (C) pohjan läpi. Valo läpäisee näytteen ja mitataan valodetekto-rilla (PD); fotodiodi linsseineen.

Isotrooppisesti emittoitunut valo kerätään 10 pohjan läpi. Emissio-peili (M) heijastaa valon vaakasuunnassa emissio-suotimen läpi (MF). Emissio-linssi fokusoi fluoresoivan näyteosan kuvan emissio-raolle (ES), jota seuraa valomonistinputki (PMT).

Yleisesti ottaen täytyy kiinnittää huomiota 15 komponenttien järjestykseen ja niiden suhteelliseen etäisyyteen toisistaan.

Tavallisesti interferenssisuotimet sijoitetaan kahden tasokuperan linssin väliin niin että kuperat pinnat osoittavat toisiinsa, jotta valo läpäisisi kohe-20 rentisti suotimen; sekä läpäisy- että heijastusspektrit siirtyvät lyhyemmille aallonpituuksille, mikäli suotimia kallistetaan valon tulokulman poikkeuttamiseksi kohtisuorasta.

Laite käyttää kolmea detektoria. Referenssi-25 ja fotometrikanavat on toteutettu puolijohdediodeilla, mutta fluoresenssikanava käyttää valomonistinputkea : (PMT).

Koska Xenon salamavalolampun intensiteetti on korkea, puolijohdediodia voidaan käyttää fotometride-30 tektorina. Fotodiodin etu verrattuna valomonistimeen on sen laaja dynaaminen alue, pieni koko ja edullinen hinta. Prototyypissä käytettiin korkealaatuista foto-diodia.

Referenssikanavaan oli myös sijoitettu foto-35 diodi. Referenssikanavan fotodiodin laadun ei tarvitse olla niin korkea kuin fotometrikanavassa, mutta lineaarisuuden tulee olla hyvä. Käytetyssä yksikössä myös ia mi ail· i>tu 21 96638 referenssikanavassa oli identtinen fotodiodi.

Koska käytetyn fluorometrigeometrian emis-siosäteilyn keruutehokkuus on alhainen, ainoa mahdollinen komponentti käytettäväksi valoherkkänä detektorina 5 on valomonistinputki (PMT). PMT:ltä vaaditaan alhaista pimeävirtaa, laajaa dynaamista aluetta ja kohtuullista vahvistusta. Koska elektronikka suunniteltiin tukemaan fotonilaskentaa (PC) alhaisilla valomäärillä, valitun PMT:n tulisi olla myös tähän soveltuva. 1P21 PMT:tä 10 käytettiin prototyypissä sen edullisen hinnan ja hyvien DC ominaisuuksiensa vuoksi ja sopivuudesta fotonilas- . . 52-54 kentaan.

Fotoelektronien määrä fotokatodilta riippuu siitä, mihin valo osuu. Fotokatodin fotoelektronitasai-15 suus on tärkeä tekijä, joka vaikutta ICIFCrn hyvyyteen. "Side-on"-tyyppisten PMT:den tasaisuus on melko huono, joka tuleekin ottaa erikseen huomioon.

Jotta epätasaisuusvirhe, etenkin z-suuntaan, voitaisiin minimoida, kuva tulee kohdistaa mahdollisim-20 man tasaiselle fotokatodin herkkyysosalle. Kuvan tulee myös olla mahdollisimman pieni suhteessa PMT:n aktiivi-alueen kokoon.

Emissioraon takainen virtuaalinen kuva voidaan pienentää optisin keinoin. Kovera linssi, sylinteri-25 linssi tai mitä hyvänsä linssisysteemiä voidaan käyttää. Optista kuitua hyödyntävä homogenisaattori antaa kyllä dispersiottoman pisteen PMT:lie. Tällaisen ratkaisun haittapuolena on kuitenkin emissiokanavan kasvanut koko ja monimutkaisuus sekä lisääntyneet kustannuk-30 set. Valon määrä myös pienenee, ellei käytetä hyvänlaatuista peilipohjäistä ratkaisua.

.-· Toteutetussa prototyypissä PMT sijoitettiin aivan raon taakse. Mitään ylimääräisiä komponentteja ei käytetty.

35 Koska monet tekijät vaikuttavat kuvan laatuun ja paikkaan, kuten valon aallonpituus, emissio-raon koko, käytetty PMT, ja epätasaisuus suuntaan z tulee 22 96638 huomioida. Tyypillinen epätasaisuuden kalibrointikäyrä on esitetty kuvassa 10.

Kuvassa 10 esitetty tulos on saatu seuraavanlaisesta mittauksesta. Kun kuva oli säädetty detektorin 5 keskelle, detektorin spatiaalinen herkkyyys mitattiin. Näytteenä käytettiin fluorogeenia (fluoreseiini 5xl0~7 mg/ml) alhaisella pitoisuudella, jottei eksitoiva tai emittoiva valo absorboituisi näytteeseen merkittävässä määrin. Kyvetin muodosti 10 mm:n polystyreenisylinteri, 10 johon oli liimattu lasipohja, paksuudeltaan 1.0 mm. Sylinteri peitettiin mustalla tussilla, jotta heijastunut valo ei johtuisi mittauskanavaan. Fluoreseiinillä täytetty näytekyvetti asetettiin siten, että eksitoiva säde kohdistettiin 4 mm:n etäisyydelle sylinterin hei-15 jastavasta seinästä. Edelleen kyvetti asetettiin 2 mm alemmaksi kuin vastaava MTP-kyvetti, jotta voitiin varmistua siitä, että raon skannausalue sisälsi ainoastaan näytteestä emittoituvan fluoresenssin. Kokeellinen konvoluutio toteutettiin, säätämällä rakoa välillä 20 0.5-2.5 mm, 0.5 mm:n välein. Kokeessa muutettiin myös eksitoivan säteen fokuksen paikkaa, jotta voitiin varmistua sen vaikutuksesta emissio-raolle langenneeseen fluoresenssikuvaan.

PIFC korjaus voidaan tehdä käyttäen erillistä 25 fotometria absorbanssiarvojen mittaamiseksi sekä eksi-toivalle että emittoituvalle säteilylle, mikäli samanlaisia suotimia voidaan käyttää käytetyllä fluoromet-rilla ja fotometrillä. Lienee selvää, että PIFC:n suorittaminen kehitetyllä laitteella antaa edun, sillä 30 kaistanleveysvirheitä ei ole, koska samoja suotimia voidaan käyttää sekä eksitaatio- että emissiopuolella.

Jos korjaus tulee tehdä useille näytteille, ei erillis-ten laitteiden käyttö tule kysymykseen. Näinollen kehitetyn laitteen etu on ilmeinen.

35 PIFC:n kohdalla on syytä olla tietoisia tie tyistä virhetekijöistä. Absorbanssia mitattaessa eksi-toivalle valolle, vahvasti fluoresoiva näyte saattaa

> ' »tf.t *1« l i itf . . I

23 96638 emittoida siinä määrin, että tämä pienentää todellista absorbanssin arvoa. Myöskin valon sironta saattaa pienentää todellista arvoa. Eräs käytännön ongelma, joka esiintyy kaikissa vertikaalifotometriaa toteuttavissa 5 laitteissa, on annostelutarkkuudesta aiheutuva virhe, mikä merkittävästi vaikuttaa järjestelmän tarkkuuteen. Haihtuminen ja konsentraatiosta riippuva pintajännitys, erityisesti optisesti huonolaatuisella laitteella lisää kokeellista virhettä.

10 Nämä ongelmat voidaan välttää käyttämällä ICIFC-menetelmää. Tilavuuteen ja vapaaseen nestepintaan liittyvät vertikaalifotometrian ongelmat voidaan välttää jättämällä huomioimatta 'pintaa lähellä' olevien lukemien käyttö. Toisaalta myös ICIFC:lla saavutettava 15 läpimenoaika on selvästi parempi kuin PIFC:llä.

PIFC:n laskemiseksi pitää mitata absorbans-siarvot sekä eksitoivalle että emittoituvalle valolle. Välttääksemme vapaasta nestepinnasta aiheutuneiden heijastusten vaikutukset, näytekyvettiä tulee siirtää 20 fluoresenssi- ja absorbanssimittausten välillä, jos erikoiskyvettejä ei käytetä tai luotaussyvyyttä rajoiteta .

Käytännössä PIFC:n käyttö kehitetyllä laitteella edellyttää seuraavat vaiheet: 25 1 Valitaan eksitaatio- ja emissiosuotimet 2 Paikoitetaan kyvetti fluoresenssin lukemiseksi 3 Mitataan fluoresenssiarvot 4 Paikoitetaan kyvetti absorbanssin lukemiseksi 5 Mitataan absorbanssit 30 6 Vaihdetaan emissio-suodin eksitaatiokanavaan 7 Mitataan absorbanssit

Vastaava tapahtumaketju ICIFC:n määrittämiseksi on seuraava.

35 1 Valitaan eksitaatio- ja emissiosuotimet 2 Paikoitetaan kyvetti fluoresenssin lukemiseksi 3 Mitataan fluoresenssit raon paikan funktiona 24 96638

Raon skannaus voidaan tehdä niin nopeaksi, että ICIFCsn vaatima aika on selvästi lyhyempi kuin PIFC:n kohdalla. Jos dynaamisen alueen ei tarvitse olla kovin laaja, niin CCD-matriisia voidaan käyttää raon 5 sijasta, jolloin mittausaika on hyvin pieni.

Seuraavassa keksintöä selostetaan yksityiskohtaisesti viittaamalla oheiseen piirustuksiin, jossa kuva 1 esittää koordinaatit sylinterimäisessä kyvetistössä, jota eksitoidaan pohjan läpi suorakaiteen 10 muotoisella säteellä, detektointi suuntaan γ, kuva 2 esittää parametrit sylinterimäisessä kyvetistössä, jota eksitoidaan pohjan läpi suorakaiteen muotoisella säteellä, kuva 3a esittää "inner-filter"-korjauskertoi-15 men C z:n funktiona kuva 3b esittää h:n ja Γ:η välistä relaatiota, kuva 4 esittää ICIFCtn konvoluutiofunktiot, kun u =>, kuva 5 esittää normitettua konvoluutiota, 20 kuva 6 esittää fluoresoivan kohteen projek tiota detektointisuuntaan, kuva 7 esittää CCERS säteen leveyden ux funktiona emissio-raon eri arvoilla, kuva 8 esittää mittausjärjestelmän kaavioku- 25 vaa, kuva 9 esittää kaaviokuvan optisen ytimen komponenttien järjestyksestä, kuva 10 esittää normitetun PMT fotokatodin herkkyyttä eri emissiorakojen arvoilla, jolloin eksi-30 taatiosäteen fokusta on muunnettu säätämällä lamppu-linssi-etäisyyttä 10 mm:llä; arvojen 2 mm ja 12 mm välillä, kuva 11 esittää QS lineaarisuuden emissioraon arvolla 1,5 mm; log-log esitys fluoresenssista näytepi-35 toisuuden funktiona (μς/ml), kuva 12 esittää QS fluoresenssin näytepitoi-suuden logaritmin funktiona (pg/ml), eri emissioraon il . . »»-tun ι-ι-ι-η ;·; 25 96638 arvoilla; 2,5 mm - 0,5 mm, kuvassa ylimpänä ovat ICIFC ekstrapoloidut tulokset, kuva 13 esittää fluoresenssin pitoisuuden logaritmin funktiona (μπιο1/1), emissioraon arvolla 5 0,25 mm, kuvassa ylimmät pisteet edustavat ICIFC tulok sia, laskettuna eri emissioraon paikan 0,5-2,5 mm (ylhäältä alas) lukemien perusteella, kuva 14 esittää fluoresenssin pitoisuuden logaritmin funktiona (μιηοΐ/ΐ) emissioraon arvolla 0,5 10 mm, kuvassa ylimmät arvot edustavat ICIFC tuloksia, laskettuna eri emissioraon paikan 0,5-2,5 mm (ylhäältä alas) lukemien perusteella, kuva 15 esittää fluoreseiinin absorbanssit 492 nm aallonpituudella pitoisuuden funktiona, 15 kuva 16 esittää PIFC korjauskertoimen fluo- reseiinin konsentraation funktiona (μπιο1/1), eri luo-taussyvyyksillä; 0,17, 0,29, 0,43, 0,57 ja 0,72 cm, alhaalta ylös, kuva 17 esittää ICIFC korjauskertoimen fluo-20 reseiinin konsentraation funktiona (μπιοΐ/ΐ), eri luo-taussyvyyksillä 0,17, 0,29, 0,43, 0,57 ja 0,72 cm, alhaalta ylös, kuva 18 esittää PIFC ja ICIFC korjauskertoimi-en suhdetta, jossa parametreinä ovat näytepitoisuus 25 (μπιο1/1) ja luotaussyvyys d (cm), . kuva 19 esittää NADH fluoresenssin pitoisuuden (μιηοΐ/ΐ) funktiona, neljällä eri bilirubiinipitoisuu-della (0, 28/25, 99/25, 305/25 μιηοΐ/l, ylhäältä alas, jolloin kuvassa A emissioraon paikka oli 2,5 mm (= 7 mm 30 luotaussyvyys) ja kuvassa B emissioraon paikka oli 0,5 mm (= 2 mm luotaussyvyys) ja kuvassa C ICIFC korjattu tulos, kuva 20 esittää bilirubiininäytteiden absorbanssit kyvetin pohjan eri kohdista; pitoisuuksilla 0 35 μg/ml (alin) ja 305/25 μg/ml, abskissan dimensio on (mm), kuva 21 esittää veteen laimennetun PNP-liuok- 26 96638 sen absorbanssit pitoisuuden funktiona, log-log-kuvaa-jalla esitettynä.

ESIMERKKI 1 5

Detektioraja (LOD) tai pienin mitattava pitoisuus (MDC) tai paino (MDW) ja lineaarisuusalue mitattiin. LOD:n arvoksi saatiin 20 ppb. Kiniinisulfaatin (QS) lineaarisuusalueen alapäätä rajoittaa LOD ja ylä-10 päätä "pre-filter"-vaikutus. Kun ICIFC suoritetaan, lineaarisuusalueen yläpää nousee 1000 μg/ml:aan.

Herkkyys

Lampun intensiteetti tai pikemminkin eksitaa-15 tio-intesiteetti, emissio-apertuuri ja emissio-optiikka, detektorin herkkyys ja elektroniikan kohina osoittautuivat vaikuttavan eniten laitteen herkkyyteen.

Koska laitteelta ei tässä vaiheessa vaadittu suurta herkkyyttä, tutkija ei pyrkinytkään maksimoimaan tätä, 20 vaan saamaan käsityksen siitä, mikä on se taso, johon tämän tyyppisellä ratkaisulla voidaan päästä. Tässä mittauksessa käytettiin sellaisia asetuksia, joita käytettiin myös myöhemmissä mittauksissa.

Lampun raon korkeus ux oli 0.5 mm ja leveys uy 25 2 mm, johtaen matalaintensiteettiseen (mutta hyvän laatuiseen) eksitointiin. Emissioraon korkeus w oli 0.5

. ' X

mm ja w 5 mm. Tämä merkitsee sitä, että vain 1/6 koko fluoresoivasta näytteen kuvasta mitattiin samanaikaisesti. Mittauksen kokonaisintegrointiaika oli Is ASTM 30 standardien E578-83 ja E579-83 (hyväksytty 1988)45 mukaisesti. Emissio-raon paikka oli asetettu arvoon 1.5 mm, vastaten 0.4 cm:n luotaussyvyyttä. Eksitointi ta-pahtui käyttäen 325 nm:n suodinta. Kaistanleveys oli noin 40 nm. Emissiosuotimen aallonpituus oli 470 nm ja 35 FWHM 20 nm. Herkkyys mitattiin ASTM standardin E579-83 mukaisesti, jossa sama näytekyvetti täytettiin kymmenen kertaa tausta-liuoksella (H2S04) ja näytteellä (0.1 il M-* im me 27 96638 jug/ml QS, laimenettuna H2S04:ään). Rms-kohina laskettiin tuloksista ja LOD laskettiin seuraavasti LOD=0.1( S-B) '1*3*nns 5 missä S ja B ovat näyte- ja taustalukemien keskiarvot.

LODrksi saatiin 20 ppb tai 20 ng/ml (MDC).

Koska mittaus kohdistuu vain osaan näytettä, jota rajoittaa emissioraon koko ja paikka; MDW on näinollen 10 enemmän tai vähemmän riippuvainen raon sijainnista. Jos esimerkiksi näytetilavuus on 100 μΐ, rako asetetaan kohtaa 0.5 mm, joka johtaa MDW-arvoon 2 ng, johdettuna LOD-arvosta 20 ng/ml.

Kun verrataan tuloksia muilla laitteilla saa-15 tuihin tuloksiin, joille on määritelty herkkyys QS:lle349, voidaan todeta, että järjestelmän herkkyys ko. asetuksilla ei ole hyvä; noin kaksi dekadia alhaisempi kuin kaupallisilla 90°teen hila-laitteilla, kuten on otaksuttavissa. On syytä huomata, että herkkyyden mää-20 ritelmä eri valmistajien kesken ei välttämättä ole sama; MDC nimittäin usein määritellään pitoisuuden arvoksi, joka antaa signaali-kohinasuhteeksi yksi, joka näinollen johtaa korkeampaan herkkyyteen kuin tässä käytetty LOD.

25

Lineaarisuus

Lineaarisuus testattiin ASTM-standardin E 578-83 (uudelleen hyväksytty 1988)44 mukaan, joka kuvaa tavan lineaarisuuden määrittämiseksi fluoresenssia 30 mittaavalle laitteelle. Testi perustuu rikkihapolla (H2S04) laimennetun kiniini-sulfaatin (QS) käytölle.

" 0.1N:sta rikkihappoa käyttäen tehtiin laimennussarja ΙΟ3, 10z, 101, 10°, 10"1 ja 10~2mg/ml. Konsentraatiota 10"3 mg/ml ei käytetty, herkkyyden riittämättömyyden vuoksi.

35 Biohitin MTP strippejä käytettiin kyvetistöinä. Yhteen kyveteistä annosteltiin laimennin taustan mittaamiseksi. Näytetilavuutena käytettiin 300 μΐ.

28 96638

Eksitaatiosuotimen 320 nm FWHM oli 40 nm ja emissiosuotimen 470 nm FWHM oli 20 nm. Maksimi läpäisevyys oli 40% ja 70 % vastaavasti. Lampun rako oli 0.5 mm · 2 mm ja emissio-raon koko 0.5 mm · 5 mm. Jotta 5 ICIFC voitiin laskea, emissio-rakoa säädettiin asennosta 0.5 mm asentoon 2.5 mm, 0.5 mm:n välein.

Lineaarisuusalueen yläraja on kohta (pitoisuus), jossa käyrä poikkeaa enemmän kuin 5% suorasta, joka on vedetty kyrän keskiosan kautta. Lineaarisuus-10 alueen yläraja on riippuvainen emissio-raon paikasta; mitä syvemmältä luotaus tehdään, sitä matalampi arvo saadaan.

Kuva 11 esittää fluoresenssia näytepitoisuuden funktiona, emissio-raon paikan arvolla 1.5 mm. Lineaa-15 risuusalueen yläraja on "pre-filter"-vaikutuksen vuoksi noin 20 jug/ml käytetylle raon paikan arvolle.

Jotta todellinen arvio saadaan selville, suoritetaan ICIFC korjaus. Kuvassa 12 on esitetty tapaus, jossa ICIFC oli laskettu suurilla pitoisuuksilla.

20 ICIFC:n käyttö kasvattaa lineaarisuusalueen ylärajan arvoa huomattavasti. Mittaukset osoittivat, että ICIFC:n käytön johdosta QS:n lineaarisuusalueen ylärajan arvoksi saadaan jopa 1000 μg/ml.

Lineaarisuusalueen alaraja on kohta (pitoi-25 suus), jossa käyrän alapää poikkeaa, käyrän keskiosa perusteella vedetystä suorasta enemmän kuin suoran hajonnan kaksinkertainen arvo.

Lineaarisuusalueen alarajaa rajoittaa järjestelmän herkkyys. Alaraja on riippumaton raon paikan 30 asetuksesta ja sen arvoksi saatiin < 0.10 mg/ml.

On syytä muistuttaa, että herkkyyttä kuten '1 myös lineaarisuusaluetta voidaan kasvattaa muuttamalla laitteen asetuksia. Herkkyyttä voidaan lisätä kasvattamalla lampun virtaa ja lampun raon kokoa, emissio-raon 35 kokoa ja monokromaattorien apertuureja. Tärkeimmäksi herkkyyttä rajoittavaksi tekijäksi osoittautui kuitenkin huono elektroninen toteutus, joka tulisi korvata n mini! IMS.: 29 96638 laadukkaammalla ratkaisulla. Edelleen, jos PMT:tä käytetään pulssilaskurina (PC) DC-moodin sijasta, herkkyyttä voidaan edelleen lisätä. Mutta tällöin tulee myös vaihtaa käytetty valolähde.

5 Myöskin lineaarisuusalueen ylärajaa voidaan kasvattaa käyttämällä laadukkaampaa elektronista ratkaisua. Tarkalla emissio-raon ohjauksella sekä spatiaalisesta korjatulla detektorilla on myös merkittävä osuus ICIFC:n tarkkuuteen. Hyvin toteutettu ICIFC-poh-10 jäinen laite tarjonnee laajimman lineaarisuusalueen, mitä mikään kaupallisesti saatava MTP-pohjainen laite voi saavuttaa.

ESIKERKKI II 15 "Inner-filter"-vaikutusta tutkittiin käyttäen sekä 0.5 mm:n että 0.25 mm:n emissio-raon korkeutta w . Näytteistä mitattiin myös absorbanssit, jotta PIFC voitiin laskea ja verrata sitä ICIFC:iin.

20 0.25 mm:n ja 0.5 mm:n emissio-raoilla kerätty jen fluoresenssitasojen suhde oli 0.5. Se oli riippumaton luotaussyvyydestä. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa teoreettisten laskelmien kanssa, jotka on esitetty aiemmin.

25 Molempia sekä PIFC että ICIFC korjausmenetel miä voidaan käyttää, mutta PIFC:llä on taipumus ylikor-jata suurilla pitoisuuksilla; ICIFC on suositeltavampi.

Fluoresceinia käytettiin fluorogeenina. Valmistettiin seitsemän pitoisuutta; 5*10*, 3.33*101,

30 1.67· 101, 5*10°, 3.33*10°, 1.67*10° ja 5* 10'1 mol/1. 0.1N

NaOHtta käytettiin laimentimena. Kutakin pitoisuutta pipetoitiin 300 μΐ Biohitin MTP strippien kyvetteihin.

Fluoresceinin fluoresenssit mitattiin käyttäen 492 nm:n eksitaatio- ja 510 nm:n emissiosuotimia. Mo-35 lempien suodinten kaistanleveydet olivat 6-9 nm. Läpäisevyys >20% ja blokkaus 10"7.

Intensiteettejä pienennettiin käyttämällä 3 96638 30 mm:n eksitaatio- ja 5 mm:n emissio-apertuureja. Lampun rako oli 0.5 mm. ICIFC mittaukset tehtiin 0.25 mm:n ja 0.5 mm:n emissio-raoilla.

Eri näytepitoisuudet mitattiin 0.25 mm:n ja 5 0.5 mm:n emissio-rakoja wz käyttäen. Tulokset on esitet ty graafisesti kuvissa 13 ja 14. Optinen sammutus käy selvästi ilmi. Fluoresenssilukemat pienenevät huomattavasti, kun emissio-raon paikkaa muutetaan 0.5 mm:stä 2.5 mm:iin. ICIFC-ekstrapoloidut arvot on piirretty 10 molempiin kuviin. Kuten saatetaan todeta lineaarisuus-alueen ylärajaa voidaan selvästi kasvattaa.

Jotta PIFC voitaisiin laske, pitää eri näytteiden absorbanssiarvot mitata. Tulos on esitetty kuvassa 15.

15 Pohjautuen mitattuihin absorbansseihin, PIFC

laskettiin eri syvyyksille 0.17 cm, 0.29 cm, 0.43 cm, 0.57 cm ja 0.72 cm, vastaten emissio-raon paikkaa 0.5-2.5 mm. Korjauskerroin C on esitetty kuvassa 16. Vastaava korjauskerroin laskettuna ICIFC tuloksista on 20 esitetty kuvassa 17. Vertaamalla tuloksia voidaan todeta, että PIFC ylikorjaa saatuja lukemia suurilla pitoisuuksilla. Tämä käy selkeästi ilmi kuvasta 18, jossa PIFC-korjauksen suhde ICIFC-korjaukseen on esitetty 3D-kuvana.

25 Fotometrisen korjauksen ylikorjautumisen ovat huomanneet myös muut tutkijat, jotka ovat käyttäneet ‘ saman tyyppisiä korjaumenetelmiä.15,54 ESIMERKKI III 30

Keinotekoisella kokeella testattiin "inner-filter"-kor-jauksen soveltuvuutta NADH-bilirubiin-systeemissä. Koe osoitti että NADH:n fluoresenssia pinentää merkittävästi bilirubiinin "post-filter"-sammutus. Mutta näyttää 35 myös siltä, ettei kokonaissammutus johdu pelkästään optisesta sammutuksesta, vaan myös jostakin NADH:n ja muun vieraan aineen vuorovaikutuksesta bilirubiini— 11 |Qi a.l»i l i -i£i · ; ; 31 96638 näytteissä.

Optinen sammutus korjattiin ICIFC-menetelmäl-lä. PIFCiiä ei käytetty, koska bilirubiini aiheutti vapaan nestepinnan voimakkaan kaarevoitumisen, jolloin 5 absorbanssien tarkka määrittäminen on hankalaa.

Ihmisen verestä mitataan useita aineita spektroskooppisesta. Yleensä mittaukset tehdään kokoverestä erotetusta plasmasta. Tyypillinen fluorometrisissa mittauksissa käytetty fluorogeeni on NAD (Nicotinamide 10 Adenine Dinucleotide) tai pikemminkin sen hapettunut muoto NADH. NAD:n etuna on suuri NADH:n Stoken-siirty-mä; maksimi absorbanssi saavutetaan 340 nm:n kohdalla ja fluoresenssiemission huippu sattuu 460 nm:n aallonpituudelle.

15 Tunnettu NADH-bilirubin systeemin ongelma on bilirubiinin absorptiospektri; absorptiohuippu on 470 nm kohdalla, kaistanleveyden ollessa 80 nm. NADH:n emissiospektri sattuu lähes kokonaisuudessaan samalle alueelle kuin bilirubiinin absorptiospektri.

20 Valmistettiin joukko bilirubiini-näytteitä, joka vastasivat ihmisen plasmassa olevaa pi-toisuusaluetta (0, 28/25, 99/25, 305/25m mol/1). Nämä sekoitettiin kuuteen NADH-pitoisuuteen (0, 10, 20, 30, 40, 50 mmol/1). Mittauksissa käytettiin 300 μΐ näyte-25 määriä.

Laitteen asetukset olivat seuraavat. Säteen leveys oli 0.5 mm ja emissio-raon koko wz oli myöskin 0.5 mm. Koska laitteen herkkyys näillä asetuksilla on melko huono, Käytettiin laajakaistaisia eksitaatio- ja 30 emissio-suotimia. Eksitaatio-suotimen 325 nm kaistanleveys on 40 nm. Emissio-suotimen FWHM on 20 nm. Molempi-en suodinten blokkaus oli 10~4.

Tulokset on esitetty kuvassa 19, missä mitatut fluoresenssiarvot on esitetty NADH-pitoisuuden funktio-35 na 50 pmol/l:aan asti. Kun luodataan syvälle näytteeseen (19 A), bilirubiinin sammutus käy selvästi ilmi.

Kun tätä verrataan läheltä kyvetin pohjaa esittämään 32 96638 tapaukseen (19 B), suhteellinen lukemien välinen ero pienentyy. Tämä indikoi optisesta sammutuksesta. Viimeisessä kuvassa (19 C) ICIFC:iä sovellettiin korjaamaan bilirubiinin aiheuttamaa NADH fluoresenssin "in-5 ner-filter"-vaikutusta.

"inner-filter"-korjauksenkin jälkeen fluo-resenssilukemat pienenevät merkittävästi biliru-biinikonsentraation myötä. Tämä viittaa johonkin NADH:n ja muun aineen väliseen vuorovaikutukseen.

10 Mitatut absorbanssilukemat vaihtelivat näyt teestä toiseen melkoisesti. Syynä tähän on kaarevan nestepinnan aiheuttama valon taittuminen. Jo hyvin pieni bilirubiini-pitoisuus aiheutti nesteen nousemisen kyvetin seinämille; näytteen muodostaen tasokoveran 15 linssin.

Koska eksitoiva valonsäde oli hyvin kapea ja fokusoitu 2 mm:n päähän heijastavasta kyvetin seinämästä, jo pieni kyvettien välinen paikoituksen epätarkkuus, vaikutti absorbanssimittausten tarkkuuteen.

20 Kuvasta 20 voimme nähdä kuinka kovera vapaa nestepinta kasvattaa absorbanssiarvoja, kyvetin reunojen läheisyydessä. Bilirubiinin aiheuttama 'huippu' on niin voimakas, että paikannusvirhe ei saa olla suurempi kuin +/- 0.3 mm.

25 Tämän lisäksi optinen polku on lyhyempi kyve tin keskellä, johtaen pienempiin optisen tiheyden lukemiin, mikäli korjausta ei suoriteta

Yksinkertaisella kokeella testattiin fotometrin lineaarisuus. Testissä käytettiin ei -fluoresoivaa 30 ja ei-sirottavaa paranitrofenoli-seosta (PNP) laimennettuna tislatulla vedellä. Neljän dekadin laimennos-sarja mitattiin käyttäen 405 nm:n suodinta.

Lineaarisuuden todettiin kattavan koko mittausalueen.

ESIMERKKI IV

!l 18 1 l;m I I : 35 33 96638

Ei-fluoresoivasta ja ei-sirottavasta paranit-rofenoli-liuoksesta (PNP) laimennettiin tislatulla vedellä pitoisuusalue 5 pmol/l:sta 50 mmol/1. Kyvettinä käytettiin Biohitin MTP-strippejä.

5 Lampun rako oli 0.5 mm · 2 mm. 405 nm:n suo timen kasitanleveys oli 6-9 nm. Tämän suotimen blokkaus oli 10’7 ja läpäisevyys >20%.

Kuva 21 esittää absorbansseja PNP-pitoisuuden funktiona. Lineaarisuus kattaa koko testatun pitoisuus-10 alueen.

On kehitetty uusi optisen sammutuksen korjausmenetelmä. Teoreettinen perusta on luotu. Menetelmää on kokeiltu erityisellä monitoimintaisella fluorometripoh-jaisella järjestelmällä. Kokeelliset mittaukset ovat 15 hyvässä sopusoinnussa teoreettisten laskelmien kanssa.

Monitoimintoinen laite on prototyyppi/ joka on suunniteltu osaksi kliinisen kemian analysaattoria tai sellaisenaan toimivaksi MTP-lukulaitteeksi. Laitteisto käsittää kaksi perustoimintaa; fluorometrin ja fotomet-20 rin. Tämän lisäksi laite pystyy periaatteessa mittaamaan myös luminesenssia ja fosforesenssia. Fotometrillä voidaan mitata turbidisuutta ja emissio-kanavaa voidaan käyttää mittaamaan sirontaa 150° kulmaan. Molemmat on myös kokeellisesti testattu tällä laitteella.

25 Kun vertaillaan kehitettyä detektointigeomet- riaa tavanomaisiin MTP-pohjäisiin laitteisiin, joitakin selviä etuja voidaan poimia esille. Annostelutarkkuuden virhe ei pääse vaikuttamaan, sillä menetelmällä mitataan pitoisuutta, ei ainemäärää kyvetissä, kuten kau-30 pallisilla MTP-pohjaisilla laitteilla tehdään. Toiseksi, kyvetin pohjan fluoresenssi pystytään eliminoimaan, koska luotaus voidaan kohdistaa näytteen sisään; kyvetin pohjan fluoresenssi ei näy mitatussa lukemassa.

Koska kehitetyllä laitteella voitiin suorittaa 35 sekä PIFC että ICIFC, tutkijalla oli näinmuodoin mahdollisuus vertailla näiden korjausmenetelmien kelpoisuutta. Käytännön toteutettavuuden vuoksi ICIFC osoit- 34 96638 tautui ylivoimaiseksi verrattuna PIFC:hen. Nopeus ja helppokäyttöisyys ovat selkeitä etuja.

Tunnetun fotometrisen korjausmenetelmän lisäksi on kehitetty ns. "cell shift"-korjausmenetelmä (CSC) 5 optisen sammutuksen korjaamiseksi. Sen haittapuolena on hankala instrumentoitavuus. CSC-menetelmää voidaan käyttää vain yksikyvettisissä laitteissa, ei MTP-poh-jaisissa järjestelmissä. CSC-menetelmä edellyttää eksi-taatio- ja emissio-suodinten vaihtamista sekä näyteky-10 vetin siirtämistä kahdessa dimensiossa, jotta "inner--filter"-korjaus voitaisiin laskea. Kaikki tämä on monimutkaista verrattuna ICIFC-menetelmään.

ICIFC-menetelmää käyttämällä voidaan optinen sammutus korjata näytettä mitattaessa. Mpre-filter"- ja 15 "post-filter"-vaikutuksia ei tarvitse erikseen mitata.

Kyvettiä ei tarvitse myöskään siirtää. Tämän lisäksi ICIFC-menetelmää voidaan käyttää minkä hyvänsä tyyppisessä laitteessa mukaanlukien MTP-pohjaiset järjestelmät .

20 ICIFC:n käyttökelpoisuus osoittautui hyväksi myös sirontamittauksissa. Optinen sammutus voitiin havaita ja korjata. Tutkija ei ole tietoinen mistään julkaisusta, jossa sironnan aiheuttamaa vaimennusta olisi aiemmin mitattu.

. 25 Pääasiallinen tarkoitus kehittää MTP-pohjainen fluorometri/fotometri parantamaan fluorometrin lineaa-risuusaluetta johti uuden mielenkiintoisen monitoimin-taisen järjestelmän syntymiseen, jolla voidaan lisäksi elegantisti korjata optisen sammutuksen aiheuttama 30 virhe.

Il : »U I I MI I I i ei

Claims (10)

96638

1. Menetelmä nestenäytteen fluoresenssin optisen vaimenemisen aiheuttaman intensiteetin pienemisen 5 korjaamiseksi fluorometrisen kvantitatiivisen ana-lyyysin yhteydessä, jossa menetelmässä nestenäyte sijoitetaan kyvettiin, kyvettiin suunnataan herätevalon-säde ja herätevalonsäteen nestenäytteessä sen sisältämän aineen vuoksi synnyttämän fluoresoivan valon 10 intensiteetti määritetään ja nestenäytteen sisältämän aineen konsentraatio määritetään intensiteetin perusteella, tunnettu siitä, että herätevalonsäde johdetaan kyvetin pohjan läpi, näytteen alta ja heräte-valonsäteen nestenäytteessä synnyttämän fluoresoivan 15 nestenäytteen kuvan intensiteettijakauma määritetään ja optinen vaimennus määritetään mitatusta intensiteetti-jakaumasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että optinen vaimennus mitataan 20 nestenäytteen kuvan vinosta projektiosta kuvatasolla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herätevalonsäde suunnataan kohtisuoraan kyvetin pohjan lävitse ja että fluoresenssin mittaussuunnan keskiakseli ja heräteva- 25 lonsäteen keskiakseli muodostavat 10 - 40° kulman.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herätevalonsäde suunnataan kyvettiin kohtisuorassa sen pohjan lävitse alhaalta ylöspäin ja että fluoresenssi mitataan 30 kyvetin pohjan lävitse alhaalta ylöspäin.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herätevalonsäde on koherentti.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen 35 menetelmä, tunnettu siitä, että herätevalonsäde on poikkileikkaukseltaan suorakaiteen muotoinen, sivut suuruusluokkaa (0.5 - 15) x (1 - 4) mm, edulli- 96638 sesti noin 1 mm.

7. Laite nestenäytteen fluoresenssin optisen vaimenemisen aiheuttaman intensiteetin pienemisen korjaamiseksi fluorometrisen kvantitatiivisen analyyysin 5 yhteydessä, johon laitteeseen kuuluu nestenäytteellä täytettävä mittauskyvetti, herätevalolähde, optiikka herätevalonlähteen muodostaman valonsäteen suuntaamiseksi mittauskyvettiin, detektori nestenäytteen kyve-tissä muodostavan fluoresoivan valon intensiteetin 10 mittaamiseksi ja laskentalaite nestenäytteen sisältämän ja fluoresoivan valon muodostavan aineen konsentraation määrittämiseksi mitatun intensiteetin perusteella, tunnettu siitä, että laitteeseen kuuluu mittauslaite fluoresoivan valon intensiteettijakauman 15 määrittämiseksi ja että optiikka on järjestetty siten että herätevalonsäde johdetaan näytteen alta, kyvetin pohjan läpi.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen laite, tunnettu siitä, että herätevalonsäde on suun- 20 nattu kohtisuoraan kyvetin pohjan lävitse ja että mittauslaite on suunnattu mittaamaan fluoresoivan nestenäytteen kuva 10 - 40° kulmassa herätevalonsäteeseen nähden, edullisesti alhaalta päin kyvetin pohjan lävitse.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen laite, tunnettu siitä, että mittauslaitteeseen kuuluu rako ja fluoresenssivaloilmaisin, jolloin rako sijaitsee oleellisesti kuvatasossa, edullisesti kuvan etäisyydellä näytteestä, ja rako on liikutettavissa kuva-30 tasossa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen laite, tunnettu siitä, että rako ja fluoresenssivaloilmaisin ovat molemmat liikuteltavissa kuvatasossa. il : itt.i liiti l;li:U ; : 96638