CN109632753B - 一种便携式吸光度测量装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种便携式吸光度测量装置及其方法，包括暗盒，暗盒内设置有激发光源，在光源的发射路径上设置有三通道测量池，测量池的另一端设置有消光器；所述三通道测量池包括两个荧光测量池和中间的用于加装样本溶液的吸光度测量池，两荧光测量池在光源激发下的荧光图像由拍摄工具进行拍摄，拍摄的图像由控制器进行图像的亮度测量、非线性校正、吸光度与浓度计算的数据处理过程，通过吸光度测量池两侧的荧光测量池的图像亮度比，得到样本溶液的吸光度。

Description

一种便携式吸光度测量装置及其方法

技术领域

本公开涉及一种便携式吸光度测量装置及其方法。

背景技术

本部分的陈述仅仅是提供了与本公开相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

比色分析是一种常用的检测方法，广泛地应用于现场分析测定中，它通常利用自然光(如日光)为照明光源，采用目视法比较待测物本身或者与显色试剂反应后产物的颜色，对照标准浓度色阶，进行快速测定。由于受外界光源强度变化以及人眼对颜色的判别存在很大主观误差的限制，其测定结果通常是半定量的。采用单色光源替代自然光源，以光电池、光电管、光电倍增管等检测器测定光强度，所得装置称为光度计。当配备单色器将连续光源分解为一系列波长的单色光进行光度分析时，该类仪器即为分光光度计。显然，光度计特别是分光光度计，具有比目视比色更高的灵敏度和准确度，而且还能实现可见光区之外的紫外、近红外、红外光区的光度分析。

分光光度分析的基本定量依据为郎伯-比尔定律。当一束波长为λ，强度为I₀的单色光束平行通过厚度为b的均匀吸光层后，透射光的强度降低为I，透射率为T＝I/I₀，所对应的吸光度为A，它们之间的相关关系如下：

式中，ε为溶液中吸光物质在所用波长下的摩尔吸收系数，C为吸光物质的摩尔浓度。

测定溶液吸光度的实验中，通常需将待测溶液盛放在称之为比色皿的光学容器中，这样就不可避免地出现了溶剂对该单色光的吸收，以及比色皿池壁对光的反射，这些因素也将造成光强度的损失，如果不加以校正，则会造成吸光度测量值的系统偏高。为此，通常设置特定的参比溶液，并设定在参比溶液中T＝100％，即把参比溶液的吸光度设为零，以此为参照点，可测定仅由溶液中吸光物质所产生的吸光度。因此在分光光度仪器中，将式(1)中I₀设置为单色光通过参比溶液后的透射光强度，由此计算吸光度并用于计算待测物的浓度。

虽然分光光度计的原理均为郎伯-比尔定律，但不同厂家所设计的仪器结构各不相同，根据测量方式上可分为单通道、双通道、单通道双波长等。其中，采用单通道模式的分光光度计结构简单，由光源发出的复合光，经过单色器色散分离出所需波长的单色光，首先通过盛放参比溶液的比色皿，并用调零旋钮人工将透光率调为T＝100％，然后手动切换为放置样品溶液的比色皿，测定样品溶液中的透过率，并通过读数刻度盘或光电转换，求得吸光度值。由此可见，在测定吸光度时，必须保持光源强度稳定不变，这就对光源的稳定性提出了较高的要求，为此不仅需要高度稳定的电源电压，而且分光光度计也需要较长的预热时间，在测定过程中还需要不时用参比溶液重新调零。

在双通道分光光度计中，将由单色器输出的单色光，经复杂的光路裂分为两束强度相同的平行光，分别同时通过参比溶液、样品溶液，实时测定样品溶液与参比溶液的透射光强度的比值。虽然光强度变化也会导致两个通道的透射光强度的变化，但这种变化对两个通道的影响是同步等比的，因而不影响其强度的比值，故光强度在一定范围内变化，并不影响吸光度的测定值，从而提高了吸光度测定的准确度和测量速度，而且还能实现吸收光谱的快速扫描测定。不过与单通道分光光度计相比，双通道分光光度计结构更加复杂，价格大约增加10倍甚至更多，由于仪器结构更为复杂，体积更大，功耗更高，对环境条件要求更苛刻，通常仅限于在实验室中使用，难以满足现场快速检测的需要。因此研发一种便携式光度计对于现场快速检测是很必要的。

鉴于人眼对颜色的识别存在很大的主观偏差，而且对图像强度的记忆随时间推移而逐渐模糊，目视比色法的测定误差较大，仅为半定量水平。如果能借助于照相机拍摄有色溶液的图像，不仅能客观准确的记录色彩和亮度，后期还可用相关的图像分析软件测量其色阶、强度等，从而大幅度提高目视比色法的准确度。近年来，智能手机中的CPU的运算能力以及所配备的照相机的图像捕捉能力不断提高，其出色的图像采集和数据分析能力，催生了基于智能手机的分析检测装置，其中基于智能手机的比色分析方法已经有不少文献报道。例如，Campos等报道了如图1所示的用智能手机替代目视比色的方法(A.R.Campos etal.,J.Chem.Edu.,2016,93,318-321)，在室内稳定光源照射下，借助计算机进行图像灰度数据分析，提高了目视比色法的准确度。Rico-Yuste等也以智能手机改进了目视比色法的准确度，通过测定敏感膜色度变化(图2)，用于检验啤酒的新鲜度(Alberto Rico-Yuste,etal.，Anal.Chem.2016,88,3959-3966)。在吸光度测定方面，Hussain等利用智能手机的照明灯为光源，配合滤光片分光，借助于光导纤维的传输，使单色光通过比色池，用手机中的曝光量传感器测定光强度的变化(图3)，利用氟离子使锆的有色配合物褪色的原理，测定饮用水中的氟离子(I.Hussain,et al,Anal.Chem.,2017,89,767–775)，但该装置所测定的信号仅是透射光强度而非吸光度，且与氟离子之间呈非线性关系，另外，光源强度的变化直接反应为信号的变化，严重影响测定结果的准确度。

发明内容

本公开为了解决上述问题，提出了一种便携式吸光度测量装置及其方法，具有结构简单，成本低廉，体积小，功耗低，便于携带，适用于现场光度法检测的优点。

根据一些实施例，本公开采用如下技术方案：

一种便携式吸光度测量装置，包括暗盒，暗盒内设置有激发光源，在光源的发射路径上设置有三通道测量池，三通道测量池的另一端设置有消光器；

所述三通道测量池两端为荧光测量池，其中加入相同种类的荧光物质，中间池用于加装测量吸光度的样本溶液，两荧光池在光源的激发下的荧光图像由拍摄工具进行拍摄，拍摄的图像由控制器进行图像的亮度测量、非线性校正、吸光度与浓度计算的数据处理过程，通过对比吸光度测量池两侧的荧光测量池的图像，得到样本溶液的吸光度。

作为一种可实施的方案，所述激发光源由移动电源供电，且在激发光源前端设置有激发光源转盘，切换激发光源所发出的单色光束。

作为进一步的限定，所述三通道测量池的排列方向与光源的光束方向一致。

作为一种可实施的方案，所述拍摄工具为智能手机，所述控制器集成于智能手机上或使用智能手机的处理器。

作为进一步的限定，所述暗盒内壁上设置有消除反光机构。作为可实施的方案，贴无反光的防水黑纸。

作为进一步的限定，所述暗盒内设置有广角镜头，与拍摄工具的位置相对应。

基于上述装置的工作方法，包括以下步骤：

在荧光测量池内加入同样浓度的荧光物质，在吸光度测量池内加入待测样品，关闭暗盒，打开激发光源，激发光源发出单色光依次通过荧光测量池、吸光度测量池和另一荧光测量池，记录前后两荧光溶液的发光图像，利用前后两池荧光溶液的发光图像的亮度比，测定待测溶液的吸光度。

作为进一步的限定，荧光测量池的荧光强度与入射光线的强度成正比。

作为进一步的限定，测定待测溶液的吸光度具体包括以下步骤：

采用稀释法减小临近光源的荧光测量池内溶液的浓度，使两个荧光测量池的荧光强度值相等，完成参比调零；

完成参比调零后，将标准溶液加入到光度检测池中，关闭避光暗盒，测定待测物存在下两荧光图像亮度的比值，计算吸光度，获得吸光度与浓度之间的关系式，即标准曲线，并存储回归方程；

在与测定标准曲线相同的实验条件下，将样品溶液加入到光度检测池中，测量其吸光度，计算溶液中待测物的浓度。

与现有技术相比，本公开的有益效果为：

本公开提供的便携式吸光度测量装置，主要包括光源模块，三通道测量池、广角镜、智能手机以及图像处理软件组成，结构简单，操作方便。

使用固定波长的简易单色光源，与商用分光光度计相比，无需使用单色器、狭缝、斩光器、反射镜等光学器件，即可实现对特定波长吸光度的测定。

与目前已报道的基于智能手机的比色检测装置相比，本实施例实现了吸光度的准确测量，消除了光源强度波动对吸光度测定的影响。而且能实现紫外、可见、近红外光区的吸光度测定。

采用了矫正图像亮度与荧光强度之间非线性关系的算法，可进一步消除拍摄参数，如相机焦距、曝光时间，感光灵敏度等变化对吸光度测定值的影响。

测量装置体积小，功耗低，结构简单，便于拆卸，抗干扰能力强，适合野外现场分析。此外，该装置成本低廉，操作简便，可拓展功能强，也可用于边远欠发达地区的光度测定，以及实验教学、家庭保健测量等领域，具有良好的应用前景。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为Campos等所用的基于智能手机的比色法的原理图；

图2为Rico-Yuste等以智能手机测量敏感膜的颜色图；

图3为Hussain等设计的基于智能手机的比色装置的原理图；

图4为设计的便携式吸光度测定装置的实物照片；

图5为设计的便携式吸光度测定装置的原理图；

图6为实例中重铬酸钾的标准曲线及其与分光光度计测量结果的比较；

图7为实例中测定水样中溶解氧的标准曲线及其碳量子点溶液的荧光图像。

其中，(1)避光暗盒，(2)蓄电池，(3)电源开关，(4)单色激发光源，(5)光源切换装置，(6)三通道测量池，(7)消光器，(8)广角镜头，(9)智能手机。

具体实施方式：

下面结合附图与实施例对本公开作进一步说明。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

在本公开中，术语如“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“侧”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，只是为了便于叙述本公开各部件或元件结构关系而确定的关系词，并非特指本公开中任一部件或元件，不能理解为对本公开的限制。

本公开中，术语如“固接”、“相连”、“连接”等应做广义理解，表示可以是固定连接，也可以是一体地连接或可拆卸连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的相关科研或技术人员，可以根据具体情况确定上述术语在本公开中的具体含义，不能理解为对本公开的限制。

本实施例针对上述背景中所述的双光束分光光度计仪器功耗高，不适合野外现场分析，而适于现场分析的基于智能手机的比色装置，有些因使用复合光为光源而不能测定吸光度，标准曲线的线性度差不利于定量分析，而且都属于单通道测量模式，光源强度的变化直接造成测定结果的波动起伏等不足，提出一种新的吸光度简易测量方法，吸光度值不受光源强度、外界背景光变化的影响，大大提高了吸光度测定的准确度。本实施例所设计的吸光度测定装置，具有结构简单，成本低廉，体积小，功耗低，便于携带，适用于现场光度法检测的优势。

图4为本实施例所设计的便携式光度测量装置的实物，图5为原理示意图。整个装置放置在黑色避光暗盒(1)中，以消除外界背景光对吸光度测定的影响，同时，避光暗盒内壁进行消除反光处理，例如贴无反光的防水黑纸。激发光源(4)为激光笔或LED灯(λ＝365nm),由移动电源(2)供电，为满足更换吸收波长的需求，可配备三个单色光源，由激发光源转盘(5)与电源开关(3)控制。由激发光源所发出的单色光束，与三通道测量池(6)在同一直线上，最终由消光器(7)所吸收。在三通道连体测量池中，前后两端为荧光测量池(以下简称为荧光池)，其中加入相同种类的荧光物质，中间池为吸光度测量池(以下简称为比色池/比色皿)，加装测定吸光度的样品溶液。在激发光照射下，两个荧光池中的荧光物质所发出位于可见光区的荧光，由智能手机(9)所带的照相机拍摄测量，为改善使用长吸收光程比色皿时的拍摄效果，可在照相机前加装一个广角镜头(8)。图像拍摄后由智能手机中APP软件进行图像的亮度测量、非线性校正、吸光度与浓度计算等数据处理。

该装置的基本工作原理如下：

1)进行吸光度测定时，根据吸光物质的吸收光谱，选择合适的吸收波长，以此选定激发光源和荧光物质。由激光光源发出的单色光，首先通过左侧的荧光池，使其中的荧光物质发光，其荧光强度(F₀)与光源入射强度(I₀)成正比，该单色光穿过比色池时，待测组份发生光吸收，使其强度下降，然后到达右边的荧光池，使其中与左池同种荧光物质发光，其荧光强度(F)与比色池的出射光强度(I)成正比。对比色池而言，I₀和I对应于式(1)中入射光与透射光强度。当两荧光池中荧光物质及其浓度相同时，则有：F₀＝kI₀，F＝kI，其中k为与单色光波长、荧光物质种类、浓度、溶液条件有关的常数，由此可见，在所用实验条件下，溶液的吸光度可用下式计算：

如果光源强度发生变化，例如光源强度通常随使用时间延长而衰减，F₀和F同比例下降，其强度比可保持不变，这样吸光度测量值就不受光源强度波动的影响。

2)用智能手机中的照相机记录前后两荧光溶液的发光图像。在理想条件下，荧光图像的亮度与荧光强度成正比，因此可用前后两池荧光溶液的发光图像的亮度比(H₀/H)，测定待测溶液的吸光度，即：

因为两荧光测定池的图像在相同时刻记录在同一照片中，照相机所用的拍摄参数，如曝光时间、感光灵敏度、焦距等的变化，对于两个荧光池的图像亮度的影响是相同的，因此两发光图像的亮度比(H₀/H)将不受照相机所用的拍摄参数调整的影响，这是使用单通道的便携式光度计所不具备的优点。

此外,大多数荧光物质，特别是荧光量子点，可被紫外光激发而发射可见光区的荧光，因此可选用紫外激发光源，实现吸收光谱位于紫外区的无色物质的光度测定。如果采用具有上转换特性的荧光物质(荧光激发波长>荧光发射波长)，例如在近红外激发光的作用下发射位于可见光区的荧光，也可实现近红外吸收区的光度测定。

3)但在实际应用中，荧光图像的亮度与荧光强度之间仅在一定范围内成正比，其线性范围与感光所用的CCD的质量有关。出于成本控制的考虑，智能手机上相机所采用的CCD通常是廉价的工业级产品，其线性范围较窄，并在高曝光量时出现亮度饱和，此时图像亮度与荧光强度之间呈非线性关系，需进行非线性校正，本实施例提出采用下式计算吸光度，使标准曲线的线性范围更宽。

式中，h为所用拍摄条件下的背景亮度值，通常较小，可以忽略。255为图像分析软件中亮度的最大值。

进一步的，使用本实施例进行吸光度测定的具体步骤如下：

(1)将由对苯二胺制备的碳量子点溶液放入左右两边荧光比色皿中，将参比溶液放入中间的吸光度测量池中，然后将三通道测量池安放在比色皿架上。

(2)转动光源架选取所需要的激发光源，打开光源，并确保光束平行通过三通道测量池，必要时可微调该光源的位置。

(3)关闭避光暗盒，打开智能手机摄像头对检测区进行图像拍摄，为了降低荧光背景杂散光所引起的背景值(h)，通常使用较短的曝光时间和低的CCD感光灵敏度，并使右侧池中碳量子点溶液图像的平均亮度值在180±10。

(4)适当稀释左侧池中碳量子点溶液的浓度，使该溶液的荧光图像亮度与右侧池中碳量子点溶液图像的平均亮度值相近，最好相同。因为存在溶剂、碳量子点、测量池壁的光吸收损失，如果左右两池碳量子点的浓度相同，右池的荧光强度也将低于左池。在低浓度条件下，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，因此采用稀释法使左右两池的荧光强度值相近，从而吸光度近似等于零，完成吸光度测定中的参比调零。

碳量子点具有良好的抗光漂白性，当测量池、激发光源、溶剂确定以后，左右两池的碳量子点溶液可以多次使用。另外，如果不采取调整溶液中荧光物质浓度平衡两边的荧光强度，也可采用在右池后壁外加装反射镜，增强它的荧光亮度，调整好反射强度，可使用等浓度的荧光物质溶液获得相近的荧光强度。如果两边荧光强度不完全相同，参比的吸光度就不为零，标准曲线将不过原点，但在一定范围内不影响浓度测定。

(5)完成参比调零后，将标准溶液加入到光度检测池中，关闭避光暗盒，测定待测物存在下两荧光图像亮度的比值，按式(4)计算吸光度。先测定标准溶液的吸光度，获得吸光度与浓度之间的关系式，即标准曲线，并将回归方程存储于智能手机中。

(6)在与测定标准曲线相同的实验条件下，将样品溶液加入到光度检测池中，测量其吸光度，计算溶液中待测物的浓度，并在屏幕上显示。

在本实施例中，其具体使用步骤如下：

重铬酸钾标准曲线的测定

重铬酸钾标准溶液稳定性好，以此为标准测试所发明的便携式吸光度测量装置的分析性能，并将所测得的吸光度与商用双通道分光光度计(UV-1700，岛津)对照。重铬酸钾标准溶液在浓度较高时为橙色，其吸收峰在352nm，在可见光区也有吸收光谱。

1)本实例中，避光暗盒的尺寸为180×120×75mm，其材料为黑色塑料。采用发射波长为365nm的LED灯为光源，该波长接近重铬酸钾的吸收峰(352nm)，而且也能有效激发碳量子点使其发射560nm的荧光。激发光束平行通过三通道测量池时，重铬酸钾溶液产生光吸收使其强度下降，造成右侧荧光池中碳量子点的荧光强度降低，使用智能手机(荣耀7，华为)所配置的照相机拍摄两荧光池的荧光图像，并用所设计的APP进行图像亮度测定和吸光度计算。

2)重铬酸钾溶液的标准曲线：以去离子水配制一组不同浓度的重铬酸钾标准溶液，以去离子水为参比，用本实施例的吸光度装置测定其吸光度，所用三通道测量池中各通道的内池尺寸为长10mm×宽10mm×高45mm，对应的吸收光程为10mm。在所用实验条件下，重铬酸钾的标准曲线见图6，其吸光度的线性范围在0～1.2，覆盖分光光度法的常用吸光度取值区间0.2～0.8，此外，所测定的吸光度数值与商用双通道分光光度计的测量数据相吻合。所用双通道分光光度计UV-1700采用光电倍增管检测吸光度，其线性范围略宽，在0～1.4，此外，双通道分光光度计使用连续光源，采用单色器分光，可以在200～700nm范围内，任意选择吸收波长，比本实施例的便携式吸光度装置优越，但其价格约为本实施例的装置(不包括智能手机)成本价格的100倍。

水中溶解氧的测定

1)原理：水中溶解氧的测定，参照国家标准(GB 7489—87)。其原理是水样中加入硫酸锰和碱性碘化钾，水中溶解氧将低价锰氧化成高价锰，生成四价锰的氢氧化物棕色沉淀。加酸后，该氢氧化物沉淀溶解，其中的高价锰将碘化物氧化成I₂，根据O₂→2I₂的计量关系，计算溶解氧含量。

2)实验过程按照GB 7489—87所推荐的操作步骤，将蒸馏水中的溶解氧转化为I₃ ^-离子后，采用逐步稀释的办法，制备溶解氧标准系列的标准溶液。I₃ ^-离子具有与重铬酸钾标准溶液类似的吸收光谱，其吸收峰位于350nm。因为水样中溶解氧的浓度较高，例如在20℃时，O₂在水中的饱和溶解度为8.8mg/L。水样中溶解氧经化学反应转化为I₃ ^-后，样品溶液在紫外区的吸光度很高，需稀释10～20倍后才能准确测定吸光度，因此不选用位于紫外区的吸收峰进行测定，而根据可获得的激发光源，选用波长为450nm的激光笔为激发光源，测定I₃ ^-离子在450nm处的吸光度，相比采用365nm的吸收波长，在450nm处的吸光度值降低14倍，虽然方法的灵敏度下降，但对于实际样品中溶解氧的测定，却可以免除因吸光度超出分光光度法的吸光度适用范围(0.2～0.8)而需稀释的操作步骤，更有利于野外现场分析，当溶解氧浓度很低时，可以使用365nm或405nm的激发光源，提高灵敏度。图7为本实施例装置所测定的溶解氧的标准曲线，以及相对应的碳量子点溶液的荧光图像。由图可见，在所用实验条件下，右池的荧光图像亮度梯度明显，经亮度非线性矫正后，所得的标准曲线线性良好，而且吸光度的测定结果也与使用双波长分光光度计UV-1700所测定的结果相吻合。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

上述虽然结合附图对本公开的具体实施方式进行了描述，但并非对本公开保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本公开的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本公开的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种便携式吸光度测量装置，其特征是：包括暗盒，暗盒内设置有激发光源，在光源的发射路径上设置有三通道测量池，三通道测量池的另一端设置有消光器；

所述三通道测量池的排列方向与光源的光束方向一致，装置包括控制器，控制器利用两池中荧光溶液的发光图像的亮度比，测定待测溶液的吸光度；

所述三通道测量池包括两个荧光测量池和置于中间的用于加装样本溶液的吸光度测量池，两荧光测量池在光源的激发下的荧光图像由拍摄工具进行拍摄，拍摄的图像由控制器进行图像的亮度测量、非线性校正、吸光度与浓度计算的数据处理过程，通过对比吸光度测量池两侧的荧光测量池的图像，得到样本溶液的吸光度。

2.如权利要求1所述的一种便携式吸光度测量装置，其特征是：所述激发光源由移动电源供电，且在激发光源前端设置有激发光源转盘，切换激发光源所发出的单色光束。

3.如权利要求1所述的一种便携式吸光度测量装置，其特征是：两端为荧光测量池，其中加入相同种类的荧光物质，中间池为吸光度测量池，加装测定吸光度的样品溶液。

4.如权利要求1所述的一种便携式吸光度测量装置，其特征是：所述拍摄工具为智能手机，所述控制器集成于智能手机上或使用智能手机的处理器。

5.如权利要求1所述的一种便携式吸光度测量装置，其特征是：所述暗盒内壁上设置有消除反光机构。

6.如权利要求1所述的一种便携式吸光度测量装置，其特征是：所述暗盒内设置有广角镜头，与拍摄工具的位置相对应。

7.基于权利要求1-6中任一项所述的装置的工作方法，其特征是：包括以下步骤：

在两荧光测量池内加入适当浓度的同种荧光物质，在吸光度测量池内加入待测样品，关闭暗盒，打开激发光源，激发光源发出单色光依次通过荧光测量池、吸光度测量池和另一荧光测量池，记录前后两荧光池中溶液的发光图像，利用前后两池中荧光溶液的发光图像的亮度比，测定待测溶液的吸光度。

8.如权利要求7所述的工作方法，其特征是：荧光测量池的荧光强度与入射光线的强度成正比。

9.如权利要求7所述的工作方法，其特征是：测定待测溶液的吸光度具体包括以下步骤：

采用稀释法稀释临近光源的荧光测量池内的溶液，使两个荧光测量池的荧光强度值相等，完成参比调零；

完成参比调零后，将标准溶液加入到光度检测池中，关闭避光暗盒，测定待测物存在下两荧光图像亮度的比值，计算吸光度，获得吸光度与浓度之间的关系式，即标准曲线，并存储回归方程；

在与测定标准曲线相同的实验条件下，将样品溶液加入到光度检测池中，测量其吸光度，计算溶液中待测物的浓度。

Images