JPWO2009104718A1

JPWO2009104718A1 - レーザ走査顕微鏡

Info

Publication number: JPWO2009104718A1
Application number: JP2009554386A
Authority: JP
Inventors: 繁行眞野; 佐藤　浩一; 浩一佐藤; エリックマルティヌスマリーマンダース; アントニウスフーベロナルド
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-20
Publication date: 2011-06-23
Also published as: US20110036993A1; US8129697B2; EP2273301A1; EP2273301A4; WO2009104718A1

Abstract

本発明は、適切な蛍光画像を取得することができるレーザ走査顕微鏡に関する。蛍光検出ユニット２６は、レーザ光の照射により励起し、試料１２から発せられる、異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する。そして、クレム処理部２８は、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、レーザ光の照射を停止させる制御を、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素走査時間ごとに行う。

Description

本発明は、レーザ走査顕微鏡に関し、特に、適切な蛍光画像を取得することができるようにしたレーザ走査顕微鏡に関する。

従来、レーザ走査顕微鏡は、生体細胞などの試料にレーザ光を照射し、そのレーザ光を走査させることで、試料の蛍光物質が励起されて試料から発せられる蛍光による蛍光画像や、試料を透過する透過光による透過光画像などを取得する。

また、特許文献１には、レーザ光による試料の損傷（退色）を抑制するために、蛍光の受光量が所定の上限の閾値以上となる場合、および、蛍光の受光量が所定の下限の閾値以下となる場合に、レーザ光の照射を停止するように制御を行うレーザ走査顕微鏡が開示されている。

特表２００７−５００８８０号公報

しかしながら、上述のレーザ走査顕微鏡において、ある１波長のレーザ光から励起される複数の波長の蛍光による蛍光画像をそれぞれ取得するとき、レーザ光の照射が適切に制御されないと、適切な蛍光画像を取得することができないことがあった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、適切な蛍光画像を取得することができるようにするものである。

本発明のレーザ走査顕微鏡は、レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡であって、前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての前記複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に前記複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素走査時間ごとに行う照射制御手段とを備えたことを特徴とする。

本発明のレーザ走査顕微鏡においては、レーザ光の照射により励起し、試料から発せられる、異なる波長の複数の蛍光の光量が測定され、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、レーザ光の照射を停止させる制御が、画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素走査時間ごとに行われる。

本発明のレーザ走査顕微鏡によれば、適切な蛍光画像を取得することができる。

本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。クレム処理およびクレム外挿処理について説明する図である。クレム処理の設定に用いられるクレム設定画面の例を示す図である。下限閾値Ｖ_thLを算出する方法について説明する図である。上限閾値Ｖ_thHを算出する方法について説明する図である。レーザ光の照射制御について説明する図である。レーザ光の照射制御について説明する図である。１レーザ光により２つの波長の蛍光が発せられる場合における照射制御について説明する図である。１レーザ光により２つの波長の蛍光が発せられる場合における照射制御について説明する図である。

符号の説明

１１レーザ走査顕微鏡システム，１２試料，１３レーザ走査顕微鏡，１４パーソナルコンピュータ，１５表示装置，１６入力装置，１７アプリケーションソフトウェア，２１レーザ光源ユニット，２２レーザ走査部，２３ダイクロイックミラー，２４対物レンズ，２５ステージ，２６蛍光検出ユニット，２７透過光検出部，２８クレム処理部，２９画像取得部，３０ファイバー，３１ａ乃至３１ｃレーザ光源，３２ａ乃至３２ｃシャッタ，４１ＤＭ，４２ＢＡフィルタ，４３ＰＭＴ，５１クレム設定画面，５２切換ボタン，５３ダイナミックレンジボタン，５４ファイルボタン，５５設定シート，６１および６２入力ボックス，６３スクロールバー，６４および６５入力ボックス，６６スクロールバー，７１および７２入力ボックス，７３スクロールバー，７４および７５入力ボックス，７６スクロールバー，８１および８２切換ボタン，８３入力ボックス，９１および９２ＯＲゲート，９３ＡＮＤゲート，９４ＯＲゲート

発明を実施するための形態

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用したレーザ走査顕微鏡の一実施の形態の構成例を示すブロック図である。

図１において、レーザ走査顕微鏡システム１１は、試料１２に照射されるレーザ光による画像を取得するレーザ走査顕微鏡１３と、レーザ走査顕微鏡１３を制御するパーソナルコンピュータ１４とが接続されて構成される。

パーソナルコンピュータ１４には、CRT(Cathode Ray Tube)やLCD(Liquid Crystal Display)などからなる表示装置１５、および、マウスやキーボードからなる入力装置１６が接続されている。パーソナルコンピュータ１４は、内蔵するCPU（Central Processing Unit）がアプリケーションソフトウェア１７を実行することで、レーザ走査顕微鏡１３により取得された画像や、レーザ走査顕微鏡１３の設定値をユーザに入力させるためのGUIなどを表示装置１５に表示させたり、ユーザが入力装置１６を操作することにより入力される設定値に基づいて、レーザ走査顕微鏡１３を制御する。

レーザ走査顕微鏡１３では、レーザ光源ユニット２１からのレーザ光が試料１２に照射され、そのレーザ光により試料１２の蛍光物質が励起されて試料１２から発せられる蛍光による蛍光画像、および、試料１２を透過する透過光による透過光画像が取得される。

レーザ光源ユニット２１には、それぞれ異なる波長のレーザ光を発する３つのレーザ光源３１ａ乃至３１ｃ、および、レーザ光の照射をオン／オフするための３つのシャッタ３２ａ乃至３２ｃが設けられている。シャッタ３２ａ乃至３２ｃは、例えば、AOM(Acousto-Optic Modulator)やAOTF（Acousto-Optic Tunable Filter）などの高速シャッタ素子であり、後述するようにクレム処理部２８の制御に従って、レーザ光源３１ａ乃至３１ｃからのレーザ光による試料１２の照射を、それぞれオン／オフする。

レーザ光源ユニット２１から発せられるレーザ光（励起光）は、出力端がファイバコネクタ（図示せず）に接続された光ファイバ（図示せず）によりダイクロイックミラー２３に導入され、反射したレーザ光はレーザ走査部２２に導入される。

レーザ走査部２２は、例えば、レーザ光を反射するミラーと、ミラーを駆動する駆動機構とを有して構成されるガルバノスキャナであり、レーザ光源ユニット２１からのレーザ光を、試料１２のＸ−Ｙ平面（試料１２に照射されるレーザ光の光軸に対し直交する平面）で走査する。レーザ走査部２２により走査されるレーザ光は、対物レンズ２４により集光されて、ステージ２５上の試料１２に照射される。

レーザ光を照射することにより励起され試料１２から発せられた蛍光は、対物レンズ２４を透過してレーザ走査部２２に入射し、デスキャンされた後ダイクロイックミラー２３に入射する。ダイクロイックミラー２３は、蛍光を透過し、その蛍光は、ファイバー３０を介して、蛍光検出ユニット２６に入射される。

蛍光検出ユニット２６において、試料１２からの蛍光は、ＤＭ（Dichroic Mirror）４１ａに入射し、第１の波長領域の蛍光がＤＭ４１ａにより反射されて、ＢＡフィルタ（Barrier filter）４２ａにより、試料１２や光学系からの散乱光がフィルタリングされた後、ＰＭＴ（photo multiplier tube）４３ａに入射される。

また、ＤＭ４１ａを透過した蛍光は、ＤＭ４１ｂに入射し、第２の波長領域の蛍光がＤＭ４１ｂにより反射されて、ＢＡフィルタ４２ｂによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ４３ｂに入射される。また、ＤＭ４１ｂを透過した第３の波長領域の蛍光は、ＢＡフィルタ４２ｃによりフィルタリングされた後、ＰＭＴ４３ｃに入射される。

そして、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃは、それぞれ受光した蛍光を検出し、その光量に応じた電圧の電気信号（光電変換信号）をクレム処理部２８に供給する。なお、以下、適宜、ＰＭＴ４３ａ乃至４３ｃを、それぞれ区別する必要がない場合、ＰＭＴ４３と称する。

また、試料１２に照射されたレーザ光のうち、試料１２を透過した透過光は、透過光検出部２７に入射する。透過光検出部２７は、試料１２を透過した透過光の光量に応じた電圧の電気信号をクレム処理部２８に供給する。

クレム処理部２８は、ＰＭＴ４３からの電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット２１のシャッタ３２ａ乃至３２ｃの制御を、試料１２の画像の１画素ごとに１画素に相当する所定時間（１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素走査時間）内で行い、レーザ光の照射により試料１２が露光される露光時間を制御する処理（以下、適宜、クレム（CLEM：Controlled Light-Exposure Microscopy）処理と称する）を行う。

また、クレム処理部２８は、クレム処理を行うことにより、露光時間がレーザ光の走査速度に応じて設定される１画素分の露光時間より短い時間となったときに、ＰＭＴ４３または透過光検出部２７からの電気信号に対し、１画素分の露光時間の露光がなされていたときに得られるであろう電気信号を演算により外挿して出力する処理（以下、適宜、クレム外挿処理と称する）を行う。

レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム処理部２８がクレム処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ１４を操作することにより設定することができ、クレム処理を行うと設定されている場合、クレム処理部２８は、クレム処理を行うとともに、蛍光検出ユニット２６からの電気信号に対しクレム外挿処理を施して画像取得部２９に供給する。

また、レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム処理を行うと設定されているときに、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うか否かを、ユーザが、パーソナルコンピュータ１４を操作することにより設定することができる。そして、クレム処理部２８は、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行うと設定されている場合、透過光検出部２７からの電気信号を外挿して画像取得部２９に供給し、透過光検出部２７からの電気信号に対しクレム外挿処理を行わないと設定されている場合、透過光検出部２７からの電気信号を、そのまま画像取得部２９に供給する。

画像取得部２９は、クレム処理部２８から供給される電気信号を増幅してA/D(Analog/Digital)変換し、その電気信号から画像を組み立てる画像処理を行い、その画像処理により得られる画像データをパーソナルコンピュータ１４に供給する。即ち、画像取得部２９は、蛍光検出ユニット２６からの電気信号から蛍光画像データを取得し、透過光検出部２７からの電気信号から透過光画像データを取得する。

そして、レーザ走査顕微鏡システム１１では、蛍光画像データおよび透過光画像データに基づいて、それぞれの画像を個別に表示装置１５に表示したり、ユーザにより指定された画像を重ね合わせて、または分割して表示装置１５に表示したりすることができる。

次に、図２を参照して、クレム処理およびクレム外挿処理について説明する。

図２において、横軸は時刻を表し、ある１画素の露光が開始される時刻Ｔ_startから、レーザ光の走査速度に応じて設定される１画素あたりの露光時間Ｕ（１Pixel Dwell）が経過する時刻Ｔ_endまでの時刻が示されている。また、縦軸は、ＰＭＴ４３により計測される蛍光の受光量に応じてＰＭＴ４３から出力される電気信号の電圧の積算値（即ち、蛍光光量を積算した値）が示されている。

また、図２において、V_H'は、レーザ走査顕微鏡１３において、画像を取得するために必要十分な電圧値として予めユーザにより設定されたV_thHに基づいて算出される、画素の露光時間U経過時に計測されるであろう電圧値を示している。また、Ｖ_MINは、レーザ走査顕微鏡１３において、背景（バックグラウンド）と見なせるあるいは、注目に値しないほど低い信号として設定される下限の電圧値を示している。

クレム処理部２８には、ＰＭＴ４３が試料１２からの蛍光を受光し、その受光量に応じた電圧の電気信号がＰＭＴ４３から供給され、クレム処理部２８は、時刻Ｔ_startから電圧の積算を開始し、後述する方法により時刻Ｔ_endまで積算した積算値を算出して、１画素の画素値（蛍光の光量）として出力する。

ここで、クレム処理部２８は、１画素の露光時間Ｕの経過時に、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達することができないと判定した場合、および、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中で電圧Ｖ_thHに達したと判定した場合に、シャッタ３２を閉鎖して試料１２へのレーザ光の照射を停止させるように制御する。即ち、時間Ｕの経過時に、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達していなかった場合には、ＰＭＴ４３からの信号を十分に取得することができない画素であり、これ以上の電気信号の取得は不要である。また、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中で、電圧Ｖ_thHを超過する場合には、ＰＭＴ４３からの電気信号は十分に取得されており、これ以上の電気信号の取得は不要である。従って、この場合には、試料１２へのレーザ光の照射を停止させることにより、試料１２の劣化（退色）を抑制する。

例えば、クレム処理部２８は、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達するか否かを判定する時刻である下限値判定時刻Ｔ_thLにおける電圧Ｖ_nが、下限閾値Ｖ_thL（Ｖ_thL＝Ｖ_MIN×Ｔ_thL／Ｕ）未満であるか否かを判定し、下限値判定時刻Ｔ_thLにおける電圧Ｖ_nが、下限閾値Ｖ_thL未満であると判定した場合、シャッタ３２を閉鎖する。また、例えば、クレム処理部２８は、電圧が、所定の上限閾値Ｖ_thHを超えたときには、電圧が上限閾値Ｖ_thHを超えた時刻Ｔ_nを記憶し、シャッタ３２を閉鎖する。

このように、クレム処理部２８が、１画素ごとに、ＰＭＴ４３の受光量に応じた電気信号に基づいて、レーザ光源ユニット２１のシャッタ３２の開閉を制御する処理がクレム処理である。

そして、クレム処理部２８は、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないと判定し、シャッタ３２を閉鎖した場合に、シャッタ３２を閉鎖せずに時刻Ｔ_endまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、下限値判定時刻Ｔ_thLでの電圧Ｖ_nの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないときに外挿された電圧Ｖ_L’は、Ｖ_L’＝Ｖ_n×（Ｕ／Ｔ_thL）で求められる。

また、クレム処理部２８は、電圧が１画素の露光時間Uの時間の中で上限閾値V_thHに達したと判定し、シャッタ３２を閉鎖した場合に、シャッタ３２を閉鎖せずに時刻Ｔ_endまで露光を行ったとしたときに得られるであろう電圧を、上限閾値Ｖ_thHでの時刻Ｔ_nの直線外挿により求めることができる。即ち、電圧が上限閾値V_thHを越えたときに外挿された電圧Ｖ_H'は、Ｖ_H'＝Ｖ_thH×（Ｕ／Ｔ_n）で求められる。

このように、クレム処理部２８が、クレム処理によりシャッタ３２ａ乃至３２ｃが閉鎖されたときに、測定された電圧を外挿する処理がクレム外挿処理である。

次に、図３は、クレム処理の設定に用いられるクレム設定画面の例を示す図である。

例えば、図１のレーザ走査顕微鏡システム１１による試料１２の観察を開始する際に、ユーザが、クレム処理の設定を行うように入力装置１６を操作すると、パーソナルコンピュータ１４は、クレム設定画面５１を表示装置１５に表示させる。

クレム設定画面５１には、クレム処理のオン／オフを切り替える切換ボタン５２、レーザ走査顕微鏡１３により得られる画像のダイナミックレンジ（Dynamic Range）のノーマル（Normal）またはワイド（Wide）を選択するダイナミックレンジボタン５３、クレム処理の設定を記載したファイル（File）の読み出し（Load）または保存（Save）を指示するファイルボタン５４、および、各種の設定を行うための設定シート５５が表示される。

設定シート５５は、タブを選択することにより、その表示を切り替えることができ、図３においては、信号レベルを設定するシート（Signal Level）が表示されている。また、設定シート５５には、レーザ光源の種類やチャンネルなどを設定するシート（Channel & Laser）、および、制御通信用のポートを指定するシート（Port）がある。

例えば、レーザ走査顕微鏡１３では、レーザ光源ユニット２１のレーザ光源３１ａがチャンネル１（CH1）とされ、設定シート５５には、チャンネル１のレーザ光（Ar 488/514）により励起される励起光の下限閾値Ｖ_thLの設定に用いられる「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Lを入力する入力ボックス６１、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を入力する入力ボックス６２、および、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を指定するスクロールバー６３が表示されている。

入力ボックス６１、入力ボックス６２、およびスクロールバー６３は、それぞれ連動しており、例えば、ユーザが、入力ボックス６１に「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Lを入力すると、設定値Ｖ_Lから「目標とする下限の蛍光の光量」の割合が算出されて、入力ボックス６２およびスクロールバー６３に表示される。また、ユーザが、入力ボックス６２またはスクロールバー６３に、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合を設定すると、その割合から設定値Ｖ_Lが算出されて入力ボックス６１に表示される。

レーザ走査顕微鏡１３では、蛍光の光量（積算値）を、０から4095の間の値で設定することができ、図３においては、入力ボックス６１には、「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Lとして205が入力されており、設定値Ｖ_Lに応じて、入力ボックス６２には、「目標とする下限の蛍光の光量」の割合として５％が設定され、５％に応じた位置に、スクロールバー６３のスライダが設定されている。

また、設定シート５５には、チャンネル１のレーザ光（Ar 488/514）により励起される励起光の上限閾値Ｖ_thHの設定に用いられる「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Hを入力する入力ボックス６４、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合を入力する入力ボックス６５、および、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合を指定するスクロールバー６６が表示されている。

入力ボックス６４、入力ボックス６５、およびスクロールバー６６は、入力ボックス６１、入力ボックス６２、およびスクロールバー６３と同様に、それぞれ連動している。図３においては、入力ボックス６４には、「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Hとして1600が入力されており、設定値Ｖ_Hに応じて、入力ボックス６５には、「目標とする上限の蛍光の光量」の割合として４０％が設定され、４０％に応じた位置に、スクロールバー６６のスライダが設定されている。

また、チャンネル１のレーザ光に対する設定と同様に、チャンネル２（CH2）のレーザ光（GRN 543）に対する設定が、入力ボックス７１、入力ボックス７２、スクロールバー７３、入力ボックス７４、入力ボックス７５、またはスクロールバー７６を用いて行われる。

また、レーザ走査顕微鏡１３では、クレム処理において、下限閾値Ｖ_thLおよび上限閾値Ｖ_thHの両方を用いる他、下限閾値Ｖ_thLだけを用いた処理（即ち、上限閾値Ｖ_thHを超過してもシャッタ３２の制御を行わない処理）、または、上限閾値Ｖ_thHだけを用いた処理（即ち、下限閾値Ｖ_thL未満であってもシャッタ３２の制御を行わない処理）を行うことができる。設定シート５５には、下限閾値Ｖ_thLを用いた処理のオン／オフを切り替える切換ボタン８１、および、上限閾値Ｖ_thHを用いた処理のオン／オフを切り替える切換ボタン８２が表示される。ユーザは、切換ボタン８１および８２を操作することにより、それぞれの切り替えを設定することができる。

また、図２を参照して説明したように、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達するか否かを判定する時刻である下限値判定時刻Ｔ_thLを設定する設定値factorを入力するための入力ボックス８３が表示されている。設定値factorは、例えば、１画素の露光時間Ｕに対して、下限値判定時刻Ｔ_thLを減少させる割合より指定することができ、時刻Ｔ_startを100％とし時刻Ｔ_endを０％とした割合が入力される。例えば、図３においては、設定値factorとして、入力ボックス８３に８０％と入力されている。なお、露光時間Ｕは、例えば、8.16μ秒に設定される。

そして、パーソナルコンピュータ１４は、クレム設定画面５１の入力ボックス６１に入力された設定値Ｖ_L（または、入力ボックス６２またはスクロールバー６３により設定された割合から求められる設定値Ｖ_L）、および入力ボックス８３に入力された設定値factorに基づいて、チャンネル１のレーザ光に対する下限閾値Ｖ_thLを算出する。また、パーソナルコンピュータ１４は、クレム設定画面５１の入力ボックス６４に入力された設定値Ｖ_H（または、入力ボックス６５またはスクロールバー６６により設定された割合から求められる設定値Ｖ_H）に基づいて、チャンネル１のレーザ光に対する上限閾値Ｖ_thH（Ｖ_thH＝Ｖ_H×ａ（Ｕ））を算出する。

次に、図４および図５を参照して、下限閾値Ｖ_thLおよび上限閾値Ｖ_thHを算出する方法について説明する。図４および図５では、図２と同様に、横軸は時刻を表し、縦軸はＰＭＴ４３の受光量に応じた電気信号の電圧の積算値を表している。

例えば、パーソナルコンピュータ１４は、アプリケーションソフトウェア１７を実行し、図３の入力ボックス８３に入力されている設定値factorと、入力ボックス６１に入力されている「目標とする下限の蛍光の光量」（Intensity）の設定値Ｖ_Lとを用いて、下限閾値Ｖ_thLを、図４に示すように、Ｖ_thL＝Ｖ_L×ａ（Ｕ）×（100−factor）／100を演算することにより求める。

ここで、回路定数ａ（Ｕ）は、レーザ光の走査速度に応じて設定される１画素の露光時間Ｕや、クレム処理部２８での処理の速度などの各種のパラメータを考慮して求められる定数である。また、図４において、Ｖ_Lnは、「目標とする下限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Lを、クレム処理部２８において閾値として用いる際の電圧に換算した値（閾値電圧）である。

なお、下限値判定時刻Ｔ_thLにおける電圧Ｖ_nが、下限閾値Ｖ_thL以下であるとき、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいてレーザ光の照射が停止され、下限値判定時刻Ｔ_thLで電圧Ｖ_nを直線外挿することにより求められる出力電圧Ｖ_outnを、光の強度（Intensity）に換算した値Ｖ_outが出力される。

このように、ユーザは、クレム設定画面５１（図３）に設定値Ｖ_Lおよび設定値factorを入力するだけで、アプリケーションソフトウェア１７により下限閾値Ｖ_thLが算出されて、クレム処理部２８に設定される。また、設定値Ｖ_Lおよび設定値factorを変更した場合にも、アプリケーションソフトウェア１７が自動的に下限閾値Ｖ_thLを算出してクレム処理部２８の設定を変更する。なお、例えば、レーザ光の走査速度が変更されて、１画素の露光時間Ｕが変更された場合にも、アプリケーションソフトウェア１７は、その変更に応じた回路定数ａ（Ｕ）に基づいて自動的に下限閾値Ｖ_thLを算出し、クレム処理部２８
の設定を変更する。

また、パーソナルコンピュータ１４は、アプリケーションソフトウェア１７を実行し、図３の入力ボックス６４に入力されている「目標とする上限の蛍光の光量」（Intensity）の設定値Ｖ_Hを用いて、図５に示すように、上限閾値Ｖ_thHを、Ｖ_thH＝Ｖ_H×ａ（Ｕ）を演算することにより求める。また、図５において、Ｖ_Hnは、「目標とする上限の蛍光の光量」の設定値Ｖ_Hを、クレム処理部２８において閾値として用いる際の電圧に換算した値（閾値電圧）である。

なお、電圧が上限閾値Ｖ_thHとなる時刻Ｔ_nにおいてレーザ光の照射が停止され、時刻Ｔ_nで、上限閾値Ｖ_thHを直線外挿することにより求められる出力電圧Ｖ_outnを、光の強度（Intensity）に換算した値Ｖ_outが出力される。

このように、ユーザは、クレム設定画面５１（図３）に設定値Ｖ_Hを入力するだけで、アプリケーションソフトウェア１７により上限閾値Ｖ_thHが算出されて、クレム処理部２８に設定される。また、設定値Ｖ_Hを変更した場合にも、アプリケーションソフトウェア１７が自動的に上限閾値Ｖ_thHを算出してクレム処理部２８の設定を変更する。なお、例えば、レーザ光の走査速度が変更されて、１画素の露光時間Ｕが変更された場合にも、アプリケーションソフトウェア１７は、その変更に応じた回路定数ａ（Ｕ）に基づいて自動的に上限閾値Ｖ_thHを算出し、クレム処理部２８の設定を変更する。

以上のように、レーザ走査顕微鏡システム１１では、ユーザがクレム設定画面５１を利用して入力した設定値に基づいて、下限閾値Ｖ_thLおよび上限閾値Ｖ_thHを算出することができる。

また、ユーザがクレム設定画面５１を利用して設定値を変更すると、その変更に応じて下限閾値Ｖ_thLおよび上限閾値Ｖ_thHを自動的に算出し、クレム処理に適用することができる。例えば、ユーザは、表示される蛍光画像を見てクレム処理の効果を確認し、クレム設定画面５１に対する操作を行って（例えば、スクロールバー６３のスライダを動かして）設定値を変更することができ、その入力がリアルタイムに反映された画像が表示される。これにより、適切な蛍光画像を取得可能なクレム処理が行われるように、ユーザが、適宜、設定値を変更することで、試料１２の劣化を抑制するとともに、適切な蛍光画像を取得することができる。

即ち、従来のレーザ走査顕微鏡では、上限および下限の閾値の設定が適切に行われないと、レーザ光による試料の損傷の抑制を効果的に行うことができなかったり、適切な蛍光画像を取得することができないことがあったが、レーザ走査顕微鏡システム１１では、クレム設定画面５１を利用することで、下限閾値Ｖ_thLおよび上限閾値Ｖ_thHを適切に設定することができ、試料１２の劣化を抑制しながら適切な蛍光画像を取得することができる。

なお、例えば、クレム設定画面５１では、入力ボックス６１や６４で指定される値は、ユーザにとってわかりやすい輝度値（Intensity）であり、このような輝度値を指定することにより、ハードウェアであるレーザ走査顕微鏡１３の調整を行うことができる。また、このように輝度値の指定により取得することができる蛍光画像は、ユーザが取得したいと考えている蛍光画像、即ち、適切な蛍光画像である。

また、ユーザは、クレム設定画面５１の下限閾値Ｖ_thLを用いた処理のオン／オフを切り替える切換ボタン８１を操作することにより、クレム処理において下限閾値Ｖ_thLを用いないようにすることや、上限閾値Ｖ_thHを用いた処理のオン／オフを切り替える切換ボタン８２を操作することにより、クレム処理において上限閾値Ｖ_thHを用いないようにすることができる。例えば、クレム処理において下限閾値Ｖ_thLを用いないことで、蛍光画像のＳ／Ｎ比を向上させることができる。

即ち、下限閾値Ｖ_thL以下の電気信号でクレム外挿処理を行う場合には、ＰＭＴ４３からクレム処理部２８に実際に入力される入力信号は、下限閾値Ｖ_thLを時刻Ｔ_end（露光時間Ｕ）で除算した値でしかなく、例えば、下限閾値Ｖ_thLが最小電圧Ｖ_MINの２０％に設定されているとき、クレム外挿処理では、その入力信号（実際には、ＰＭＴ４３が受光した光量に応じた信号と、ノイズ成分とが加算された信号）を５倍に増幅する直線外挿が行われる。つまり、入力信号に含まれるノイズ成分は５倍になる。基本的に、ノイズ成分は、常に一定の割合で入力信号に含まれると考えられており、下限閾値Ｖ_thLのときのノイズ成分が20ｍＶであるとしたら、時刻Ｔ_endでのノイズ成分も20ｍＶである。従って、クレム処理において下限閾値Ｖ_thLを用いないことで、ノイズ成分が増幅されることを回避することができ、これにより、蛍光画像のＳ／Ｎ比を向上させることができる。

また、クレム処理において上限閾値Ｖ_thHを用いない場合には、入力信号の信号レベル自体が大きく、時刻Ｔ_nでの電圧値に対して処理が行われるため、Ｓ／Ｎ比を向上させる割合は、クレム処理において下限閾値Ｖ_thLを用いないときよりも低いが、同様に、蛍光画像のＳ／Ｎ比を向上させることができる。

このようにレーザ走査顕微鏡システム１１では、電圧が最小電圧Ｖ_MINまで到達しないと判定した場合、および、電圧が上限閾値V_thHを超過すると判定した場合に、シャッタ３２の閉鎖を指示する信号をシャッタ３２に供給し、試料１２へのレーザ光の照射を停止させる。ここで、レーザ走査顕微鏡システム１１では、試料１２に複数の異なる波長のレーザ光が照射され、それぞれのレーザ光により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット２６において検出されるため、レーザ光ごとに、試料１２への照射を制御する必要がある。

次に、図６および図７を参照して、レーザ光ごとの照射の制御について説明する。

図６には、レーザ走査顕微鏡システム１１を構成する各ブロックのうち、レーザ光ごとの照射の制御についての説明に必要なレーザ光源ユニット２１、ステージ２５、および蛍光検出ユニット２６が示されている。なお、図６のレーザ光源ユニット２１では、レーザ光源３１ａおよび３１ｂには、シャッタ３２ａおよび３２ｂがそれぞれ設けられているが、レーザ光源３１ｃには、シャッタが設けられていない構成となっている。

図６に示すように、レーザ光源３１ａから照射されたレーザ光（波長：488/514nm）は、シャッタ３２ａを介して、ステージ２５上の試料１２に照射され、そのレーザ光（励起光）により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット２６のＤＭ４１ａにより反射され、ＰＭＴ４３ａが、その蛍光を受光する。また、レーザ光源３１ｂから照射されたレーザ光（波長：543nm）は、シャッタ３２ｂを介して、ステージ２５上の試料１２に照射され、そのレーザ光（励起光）により励起された蛍光が、蛍光検出ユニット２６のＤＭ４１ａおよび４１ｂを透過し、ＰＭＴ４３ｂが、その蛍光を受光する。

クレム処理部２８（図１）は、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量に応じた電気信号に従って、シャッタ３２ａを制御し、ＰＭＴ４３ｂが受光した蛍光の受光量に応じた電気信号に従って、シャッタ３２ｂを制御する。

即ち、クレム処理部２８は、図７に示す論理回路に基づいて、シャッタ３２ａおよび３２ｂを制御する。

図７Ａに示すように、ＯＲゲート９１には、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて下限閾値Ｖ_thL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号Ｓ_1Lと、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが上限閾値Ｖ_thHを超えたと判定した結果、発生する検出信号Ｓ_1Hとが入力され、ＯＲゲート９１は、検出信号Ｓ_1Lと検出信号Ｓ_1Hとの論理和に基づいて、シャッタ３２ａの閉鎖を制御する制御信号ＳＣ₁を出力する。

例えば、検出信号Ｓ_1Lは、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて下限閾値Ｖ_thL未満であることを検出すると、レベルが０から１に遷移する。また、検出信号Ｓ_1Hは、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値Ｖ_thHを超えたことを検出すると、レベルが０から１に遷移する。

従って、図７Ｂに示すように、検出信号Ｓ_1Hより早く、検出信号Ｓ_1Lのレベルが、下限値判定時刻Ｔ_thLで０から１に遷移し、その結果、ＯＲゲート９１が出力する制御信号ＳＣ₁のレベルは、下限値判定時刻Ｔ_thLで０から１に遷移する。これにより、シャッタ３２ａが下限値判定時刻Ｔ_thLで閉鎖され、レーザ光源３１ａからのレーザ光の照射が停止される。

同様に、ＯＲゲート９２には、ＰＭＴ４３ｂが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて下限閾値Ｖ_thL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号Ｓ_2Lと、ＰＭＴ４３ｂが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが上限閾値Ｖ_thHを超えたと判定した結果、発生する検出信号Ｓ_2Hとが入力され、ＯＲゲート９２は、検出信号Ｓ_2Lと検出信号Ｓ_2Hとの論理和に基づいて、シャッタ３２ｂの閉鎖を制御する制御信号ＳＣ₂を出力する。

検出信号Ｓ_2Lおよび検出信号Ｓ_2Hは、検出信号Ｓ_1Lおよび検出信号Ｓ_1Hと同様に遷移し、図７Ｂに示すように、検出信号Ｓ_2Hのレベルが、下限値判定時刻Ｔ_thL以降の時刻Ｔ_nで０から１に遷移すると、ＯＲゲート９２が出力する制御信号ＳＣ₂のレベルは、時刻Ｔ_nで０から１に遷移する。これにより、シャッタ３２ｂが時刻Ｔ_nで閉鎖され、レーザ光源３１ｂからのレーザ光の照射が停止される。

ところで、試料１２によっては、ある１つの波長の励起光により、異なる複数の波長の蛍光を発するものがある。

次に、図８および図９を参照して、１レーザ光により２つの波長の蛍光が発せられる場合における照射の制御について説明する。

図８には、図６と同様に、レーザ走査顕微鏡システム１１のレーザ光源ユニット２１、ステージ２５、および蛍光検出ユニット２６が示されている。図８に示すように、レーザ光源３１ａから照射されたレーザ光により励起された試料１２からの蛍光のうち、１つの波長のものは、ＤＭ４１ａにより反射されてＰＭＴ４３ａが受光し、もう１つの波長のものは、ＤＭ４１ａおよび４１ｂを透過し、ＰＭＴ４３ｂが受光する。

そして、クレム処理部２８は、図９に示す論理回路に基づいて、シャッタ３２ａを制御する。

図９Ａに示すように、ＡＮＤゲート９３には、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて下限閾値Ｖ_thL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号Ｓ_1Lと、ＰＭＴ４３ｂが受光した蛍光の受光量を示す電圧Ｖ_nが、下限値判定時刻Ｔ_thLにおいて下限閾値Ｖ_thL未満であるか否かを検出した結果を示す検出信号Ｓ_2Lとが入力され、ＡＮＤゲート９３は、検出信号Ｓ_1Lと検出信号Ｓ_2Lとの論理積に基づいた出力信号をＯＲゲート９４に出力する。

ＯＲゲート９４には、ＡＮＤゲート９３からの出力信号と、ＰＭＴ４３ａが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値Ｖ_thHを超えたと判定した結果、発生する検出信号Ｓ_1Hと、ＰＭＴ４３ｂが受光した蛍光の受光量を示す電圧が上限閾値Ｖ_thHを超えたと判定した結果、発生する検出信号Ｓ_2Hとが入力され、ＯＲゲート９４は、ＡＮＤゲート９３からの出力信号、検出信号Ｓ_1H、および検出信号Ｓ_2Hの論理和に基づいて、シャッタ３２ａの閉鎖を制御する制御信号ＳＣ₁を出力する。

従って、図９Ｂに示すように、下限値判定時刻Ｔ_thLで検出信号Ｓ_1Lのレベルのみが１となる場合には、シャッタ３２ａの制御は行われない。検出信号Ｓ_1Hまたは検出信号Ｓ_2Hのどちらか（図９Ｂの例では検出信号Ｓ_1Hより早く検出信号Ｓ_2H）のレベルが１に遷移する時刻Ｔ_nで、ＯＲゲート９４が出力する制御信号ＳＣ₁のレベルが０から１に遷移し、これにより、シャッタ３２ａが時刻Ｔ_nで閉鎖され、レーザ光源３１ａからのレーザ光の照射が停止される。

また、図９Ｃに示すように、検出信号Ｓ_1H及び検出信号Ｓ_2Hのいずれよりも早く、検出信号Ｓ_1Lのレベルが下限値判定時刻Ｔ_thLで０から１に遷移し、且つ検出信号Ｓ_2Lのレベルが下限値判定時刻Ｔ_thLで０から１に遷移したので、ＯＲゲート９４が出力する制御信号ＳＣ₁のレベルは、下限値判定時刻Ｔ_thLで０から１に遷移する。これにより、シャッタ３２ａが下限値判定時刻Ｔ_thLで閉鎖され、レーザ光源３１ａからのレーザ光の照射が停止される。

このように、複数の異なる波長の蛍光の光量のいずれか１つが上限閾値V_thHを超過すると判定した場合、または、全てが最小電圧Ｖ_MIN未満となると判定される場合に、レーザ光の照射を停止させるような制御を行うことで、ある１つの波長の励起光により、異なる複数の波長の蛍光が発せられる場合でも、適切な蛍光画像を取得することができる。

また、本明細書において、システムとは、複数の装置により構成される装置全体を表すものである。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

Claims

レーザ光を試料に走査して画像を取得するレーザ走査顕微鏡において、
前記レーザ光の照射により励起し、前記試料から発せられる異なる波長の複数の蛍光の光量を測定する蛍光測定手段と、
前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間より短い下限値判定時刻における、全ての前記複数の蛍光の光量が下限閾値未満である場合、および前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間中に前記複数の蛍光の光量のいずれか一つが上限閾値超える場合の少なくとも一方に該当する場合に、前記レーザ光の照射を停止させる制御を、前記画像の１画素に対応する範囲を走査する時間である１画素走査時間ごとに行う照射制御手段と
を備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
前記蛍光測定手段は、前記異なる波長の複数の蛍光をそれぞれ受光し、光電変換する光電変換素子と、前記１画素に相当する１画素走査時間の間、時々刻々、蓄積される光電変換信号の積算値を、前記各蛍光の光量として測定する測定手段とから構成され、
前記照射制御手段は、前記積算値に基づき前記レーザ光の照射を停止させる制御を行う
ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記光電変換素子からの光電変換信号を１画素に相当する走査時間の間蓄積し、蓄積された光電変換信号に基づき、前記複数の蛍光に対応する前記試料の画像を生成する画像処理回路と、
前記積算値が前記下限値判定時刻において前記下限閾値未満である場合には、前記積算値に基づき、前記光電変換手段が前記１画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第一外挿値を外挿処理して算出し、また、同様に前記積算値が前記上限閾値を超えた場合には、前記積算値に基づき前記光電変換手段が前記１画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第二外挿値を外挿処理して算出する外挿処理手段と
をさらに備え、
前記画像処理回路は、前記第一外挿値あるいは前記第二外挿値に基づき、それぞれ前記蛍光に対応する前記画像を生成する
ことを特徴とする請求項２に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記照射制御手段は、前記下限閾値に基づく制御のオン／オフ、および、前記上限閾値に基づく制御のオン／オフをそれぞれ切り替えて制御を行う
ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記蛍光の光量が前記下限値判定時刻において前記下限閾値未満である場合には、前記蛍光の光量に基づき、前記蛍光測定手段が前記１画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第一外挿値を外挿処理して算出し、また、同様に前記蛍光の光量が前記上限閾値を超えた場合には、前記蛍光の光量に基づき前記蛍光測定手段が前記１画素走査時間の間に蓄積するであろう前記蛍光の光量を示す第二外挿値を外挿処理して算出する外挿処理手段と、
目標とする上限の前記蛍光の光量あるいは目標とする下限の前記蛍光の光量の少なくとも一方を入力する入力手段と
を備え、
前記外挿処理手段は、前記入力手段により前記上限の蛍光の光量あるいは前記下限の蛍光の光量の少なくとも一方が入力されると、前記下限閾値あるいは前記上限閾値の少なくとも一方を逆算し、設定する
ことを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記蛍光測定手段は、前記蛍光を受光し、光電変換する光電変換素子と、前記１画素に相当する１画素走査時間の間、時々刻々、蓄積される光電変換信号の積算値を、前記蛍光の光量として測定する測定手段とから構成され、
前記照射制御手段は、前記積算値に基づき前記レーザ光の照射を停止させる制御を行う
ことを特徴とする請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記照射制御手段は、前記積算値が前記下限値判定時刻における前記下限閾値以上であって前記１画素走査時間の間に前記上限閾値を超えない場合には前記１画素走査時間の間、前記レーザ光の照射を停止しないよう制御する
ことを特徴とする請求項６に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記入力手段は、前記下限値判定時刻を設定すること
を特徴とする請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡。
前記入力手段は、前記下限の蛍光の光量及び前記上限の蛍光の光量をそれぞれ入力する２つの第一及び第二入力手段から構成され、
前記入力手段により入力された前記下限の蛍光の光量、前記上限の蛍光の光量をそれぞれ変更する第一及び第二変更手段を備え、
前記外挿処理手段は、前記第一及び第二変更手段により変更された前記下限の蛍光の光量及び前記上限の蛍光の光量に基づき、前記下限閾値及び前記上限閾値を逆算し、設定すること
を特徴とする請求項５に記載のレーザ走査顕微鏡。