JP2012118364A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】光毒性の問題を解消しながら試料の明るい観察像を取得可能な共焦点顕微鏡を提供する。
【解決手段】光源からの照明光を制限する第１遮光部材１０と、第１遮光部材１０で制限された照明光を走査する走査ミラー１２と、走査ミラー１２で走査された照明光を試料２に集光する対物レンズ４と、試料２からの観察光を制限する第２遮光部材２０と、第２遮光部材２０で制限された観察光を検出する検出器２８ａ，２８ｂとを有しており、第１遮光部材１０は複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、第２遮光部材２０は第１遮光部材１０の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であることを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関する。

従来、試料面に照射したライン状の光を走査して観察を行う共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１を参照。）。

特開昭６３−３０６４１３号公報

しかしながら、上述のような従来の共焦点顕微鏡は、試料面に対して１本のライン状の光を照射して走査するため、このライン状の光が試料面に照射されている時間は非常に短く、試料の観察像が暗くなってしまう。このため、適切な明るさの観察像を取得するためには、ライン状の光を比較的高い強度で照射することが必要になり、この高い強度の光が試料に悪影響を及ぼしてしまう所謂光毒性の問題があった。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、光毒性の問題を解消しながら試料の明るい観察像を取得可能な共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために本発明は、
光源からの照明光を制限する第１遮光部材と、
前記第１遮光部材で制限された照明光を走査する走査ミラーと、
前記走査ミラーで走査された照明光を試料に集光する対物レンズと、
前記試料からの観察光を制限する第２遮光部材と、
前記第２遮光部材で制限された観察光を検出する検出器とを有しており、
前記第１遮光部材は、複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
前記第２遮光部材は、前記第１遮光部材の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であることを特徴とする共焦点顕微鏡を提供する。

本発明によれば、光毒性の問題を解消しながら試料の明るい観察像を取得可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。

本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を示す図である。 （ａ）は本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の光学系の構成を示す図であり、（ｂ）は照明側スリット部及び観察側スリット部に備えられたマルチスリットの一例を示すである。 本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の主要部分のブロック図である。 走査ミラーを三角波駆動によって動作させた場合の、試料の観察領域におけるスリット光の走査位置（縦軸）と時間（横軸）の関係を示すグラフと、試料の観察領域とスリット光の様子を示す図である。 本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡のマルチスリット選択ルーチンを示すフローチャートである。 走査ミラーを三角波駆動によって動作させた場合の、試料の観察領域におけるスリット光の走査位置（縦軸）と時間（横軸）の関係の変形例を示すグラフと、試料の観察領域とスリット光の様子の変形例を示す図である。

以下、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。
はじめに、本実施形態に係る共焦点顕微鏡の全体的な構成を説明する。
図１に示すように共焦点顕微鏡１は、試料２を載置するステージ３、対物レンズ４、及び顕微鏡本体５を有している。顕微鏡本体５の側面には、照明光を供給する光源６が備えられており、共焦点顕微鏡１の各部を制御するコンピュータ（ＰＣ）７が接続されている。

図２（ａ）に示すように顕微鏡本体５内の光路１００上には、光源６側から順に励起フィルタホイール８、照明側スリット部９、及び第１ダイクロイックミラー１１が備えられている。
第１ダイクロイックミラー１１の反射光路１０１上には走査ミラー１２が備えられており、さらに走査ミラー１２の表側反射面の反射光路１０２上にはレンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４が順に備えられている。また、走査ミラー１２から見て第１ダイクロイックミラー１１の透過光路１０３上には、レンズ１６、反射ミラー１７、観察側スリット部１９、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３が順に備えられている。
反射ミラー２３から見て走査ミラー１２の裏側反射面の反射光路１０４上には、蛍光フィルタホイール２４、ズームレンズ２５、及び第２ダイクロイックミラー２６が順に備えられている。そして、第２ダイクロイックミラー２６の透過光路１０５上には集光レンズ２７ａと検出器２８ａが順に備えられており、反射光路１０６上には集光レンズ２７ｂと検出器２８ｂが順に備えられている。

励起フィルタホイール８は、波長透過特性の異なる複数の励起フィルタを回転切り替え可能に保持するものであり、これにより光源６から発せられた照明光のうち、所望の波長の照明光を試料２に対して選択的に照射することができる。
蛍光フィルタホイール２４は、励起フィルタホイール８と同様に波長透過特性の異なる複数の蛍光フィルタを回転切り替え可能に保持するものであり、これにより試料２で生じた蛍光のうち、所望の波長の蛍光を選択的に観察することができる。
検出器２８ａ，２８ｂには、ＣＣＤカメラが用いられており、ＣＭＯＳカメラ等を用いることも可能である。

照明側スリット部９と観察側スリット部１９は、いずれも対物レンズ４の物体側の所定の位置に対して光学的に共役な位置に配置されている。
照明側スリット部９は、複数種類のマルチスリット１０を切替可能に保持する回転切替部材である。各マルチスリット１０は、図２（ｂ）にその一例を示すように複数の細長い長方形状のスリットが並んで形成された遮光部材であって、本実施形態ではマルチスリット幅Ｌの異なる３つのマルチスリット１０が照明側スリット部９に保持されている。ここで、マルチスリット幅Ｌとは、全てのスリット幅と全てのスリット間隔を合計した長さであって、スリット数、スリット幅、及びスリット間隔によって定められるものである。なお、本実施形態における３つのマルチスリット１０は、いずれもスリット間隔がスリット幅の２．５倍以上に設計されている。これにより、各スリットを通過したスリット光どうしの干渉を防止することができる。具体的には、図２（ｂ）に示したマルチスリットの一例は、黒塗り部分が各スリットを示しており、スリット数が１０、スリット長が５ｍｍ、スリット幅が１０μｍ、スリット間隔が９０μｍ、マルチスリット幅Ｌが８９０μｍである。
斯かる構成の照明側スリット部９には、図３に示すようにＰＣ７に備えられているＣＰＵ３０からの指示に基づいて照明側スリット部９を回転させるための駆動部３１が備えられており、これによって３つのマルチスリット１０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。

観察側スリット部１９は、上記照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット２０と同じ構成、即ち同じマルチスリット幅Ｌの３つのマルチスリット２０を切替可能に保持する回転切替部材である。この観察側スリット部１９には、図３に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて観察側スリット部１９を回転させるための駆動部３２が備えられており、これによって３つのマルチスリット２０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
なお、上記構成の照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と、観察側スリット部１９が保持する３つのマルチスリット２０は、観察に際して、同じマルチスリット幅Ｌのものどうしが光路中に配置して使用される。また、照明側スリット部９及び観察側スリット部１９のいずれにもスリットが設けられていない開口部を有していてもよい。
走査ミラー１２には、ガルバノミラーが用いられており、図３に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて走査ミラー１２の動作を制御するためのミラー制御部３３が備えられている。

以上の構成の下、光源６から射出された照明光は、所定波長の光（励起光）のみが励起フィルタホイール８の励起フィルタを透過し、照明側スリット部９のマルチスリット１０を通過することで複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、第１ダイクロイックミラー１１で反射され、さらに走査ミラー１２の表側反射面で反射され、レンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４を順に介してステージ３上の試料２に照射される。これにより励起された試料２から発せられた観察光（蛍光）は、再び対物レンズ４、反射ミラー１４、及びレンズ１３を順に介し、走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、第１ダイクロイックミラー１１を透過する。そしてこの観察光は、レンズ１６と反射ミラー１７を介して、観察側スリット部１９の位置に試料２に投影されたマルチスリット１０の像が形成される。その像を形成する光線がマルチスリット２０を通過することで試料２における観察側スリット部１９と共役な位置からの光線のみが取り出されて、複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３を順に経て走査ミラー１２の裏側反射面で反射され、さらに所定波長の光のみが蛍光フィルタホイール２４の蛍光フィルタを透過した後、ズームレンズ２５を介して第２ダイクロイックミラー２６に入射する。そして、第２ダイクロイックミラー２６を透過した光は、集光レンズ２７ａを介して検出器２８ａで検出され、第２ダイクロイックミラー２６で反射された光は、集光レンズ２７ｂを介して検出器２８ｂで検出される。
ここで、試料２に照射される複数のスリット光は、走査ミラー１２によって試料面上を一次元的に走査されるため、各検出器２８ａ，２８ｂでは試料２の観察領域全体にわたって観察光が検出されることとなる。これによりＰＣ７は、各検出器２８ａ，２８ｂから観察光の検出信号を取得し、これに基づいて試料２の二次元画像を生成してＰＣ７のモニタ７ａに表示させる。これにより使用者は、試料２の共焦点画像を観察することが可能となる。

以上のように本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、試料面に対して複数のスリット光を照射して走査する構成であるため、同じ領域を複数のスリット光が照明するので、スリット光が試料面に照射されている時間を従来の共焦点顕微鏡よりも長く確保することができ、強度の弱い光で照明していても、試料２からの光量の増加を図ることができる。このため、低い強度の照明光によって試料２の明るい共焦点画像を撮影することができる。したがって、従来の共焦点顕微鏡のように高い強度の照明光が試料に悪影響を及ぼしてしまうという光毒性の問題を解消することができる。また、従来の共焦点顕微鏡では走査ミラーを高い駆動周波数で動作させた際に暗くて観察できなかった試料の共焦点画像でも、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、照明光の光量の増加によって観察することが可能になり、即ち試料２の高速な現象を捉えることが可能になる。

次に、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１における走査ミラー１２の駆動方法について説明する。
走査ミラー１２の駆動方法として、三角波駆動やノコギリ波駆動等の複数の駆動方法が知られている。走査ミラー１２を三角波駆動して動作させる場合、図４（ａ）に示すようにグラフの直線部分では走査ミラー１２が一定速度で動作しており、その動作期間中、照明側スリット部９のマルチスリット１０によって形成された複数のスリット光（「照明側マルチスリット光」という）は試料面上の観察領域を一定速度で走査し、これと同時に、観察側スリット部１９のマルチスリット２０によって形成された複数のスリット光（「観察側マルチスリット光」という）は試料面と共役関係にある検出器２８ａ，２８ｂの検出面上を同じ一定速度で走査することになる。即ち、均一に蛍光を発する物体を試料２として観察する場合には、試料面の観察領域に均一な光強度の照明光が照射され、検出器２８ａ，２８ｂの検出面に均一な輝度の蛍光が投影されることになる。斯かる場合、図４（ａ）のグラフの非直線部分では、走査ミラー１２の動作速度が一定でないため、照明光の光強度がばらつき、検出器２８ａ，２８ｂに投影される蛍光の輝度がばらついてしまうことになる。このため、図４（ａ）のグラフの直線部分のみで試料２の照明と蛍光の検出を行い、グラフの非直線部分ではこれらを行わないようにする、即ちグラフの非直線部分を観察に寄与しない無効期間とすればよい。しかしながら斯かる無効期間は、走査ミラー１２の駆動周波数が大きくなるほど、即ち図４（ｂ）に示すように走査ミラー１２の動作速度が大きくなるほど長くなってしまう。

また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１では、スリット光の走査中、走査方向の反転時にはその都度、照明側マルチスリット光が共焦点顕微鏡１の視野から一旦外れる、そして観察側マルチスリットも光路から一旦外れる必要がある。したがって、これに要する時間（詳細には、照明側マルチスリット光が全て試料面の観察領域から外れてから、減速して停止し、走査方向が反転して加速し、再び観察領域に入り始めるまでの時間であって、「スリット光退避時間」という。）も、上記図４（ａ）のグラフの非直線部分と同様に観察に寄与しない期間と考える必要がある。なお、このスリット光退避時間は各マルチスリット１０，２０のマルチスリット幅Ｌや走査ミラー１２の駆動周波数が大きいほど長くなってしまう。

上記前提の下、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、走査ミラー１２を三角波駆動して動作させる際に、走査ミラー１２の駆動周波数に応じて適切なマルチスリット１０，２０を自動的に選択するための図５に示すマルチスリット選択ルーチンを実行可能に構成されている。
ここで、本実施形態において、図３に示すＰＣ７の記憶部３５には、走査ミラー１２の駆動周波数によって異なる無効期間の情報が駆動周波数毎に記憶されている。なお、記憶部３５には、照明側スリット部９が保持する各マルチスリット１０の走査ミラー１２の駆動周波数によって異なるスリット光退避時間の情報も駆動周波数毎に記憶されている。

図５に示すマルチスリット選択ルーチンは、使用者が本ルーチンの開始の指示をＰＣ７へ入力することで開始される。
ステップＳ１：ＰＣ７のＣＰＵ３０が、使用者によって走査ミラー１２の所望の駆動周波数がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。前記所望の駆動周波数がＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ２へ進み、そうでない場合は本ステップＳ１を再度実行する。
ステップＳ２：ＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた走査ミラー１２の所望の駆動周波数に対応する無効期間の情報を記憶部３５から読み出す。
ステップＳ３：ＣＰＵ３０が、ステップＳ２で得られた無効期間の情報に基づいて、走査ミラー１２を前記所望の駆動周波数で駆動させる際に使用するための適切なマルチスリットを、照明側スリット部９の３つのマルチスリット１０から選択する。具体的には、ＣＰＵ３０が３つのマルチスリット１０について、前記所望の駆動周波数に対応するスリット光退避時間の情報を記憶部３５から読み出す。そしてＣＰＵ３０が読み出した３つのスリット光退避時間を参照して、ステップＳ２で得られた無効期間よりもスリット光退避時間が小さいマルチスリット１０のうち、マルチスリット幅Ｌが最大のものを選択する。即ち、前記所望の駆動周波数に対応する無効期間中に、照明側マルチスリット光を全て試料面の観察領域から退避させることが可能で最大のマルチスリット幅Ｌを有するマルチスリット１０がＣＰＵ３０によって選択されることとなる。

ステップＳ４：ＣＰＵ３０の指示の下、駆動部３１が照明側スリット部９を回転させ、ステップＳ３で選択されたマルチスリット１０を光路中に配置する。またこれと同時に、ＣＰＵ３０の指示の下、駆動部３２が観察側スリット部１９を回転させ、マルチスリット１０と同じマルチスリット幅Ｌのマルチスリット２０を光路中に配置する。
ステップＳ５：ＣＰＵ３０の指示の下、ミラー制御部３３がステップＳ１で得られた所望の駆動周波数で走査ミラー１２を三角波駆動する。
ステップＳ６：ＣＰＵ３０が、使用者によって走査ミラー１２の駆動を終了する旨の指示がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。走査ミラー１２の駆動を終了する旨の指示がＰＣ７へ入力されている場合にはステップＳ７へ進み、そうでない場合には本ステップＳ６を再度実行する。
ステップＳ７：ＣＰＵ３０の指示の下、ミラー制御部３３が走査ミラー１２の駆動を終了して本ルーチンが終了する。

以上より、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上記マルチスリット選択ルーチンを実行することで、走査ミラー１２の駆動周波数に適した最も大きなマルチスリット幅Ｌのマルチスリット１０，２０を自動的に選択することができる。具体的には、走査ミラー１２の駆動周波数が大きい即ち無効期間が長い場合は、マルチスリット幅Ｌの大きな即ちスリット光退避時間の長いマルチスリット１０，２０を用いることができる。また、走査ミラー１２の駆動周波数が小さい即ち無効期間が短い場合は、マルチスリット幅Ｌの小さな即ちスリット光退避時間の短いマルチスリット１０，２０を用いることができる。言い換えれば、走査ミラー１２の駆動周波数に応じて異なる無効期間をスリット光退避時間に適切に充当することができる。したがって、照明側マルチスリット光を試料面上の観察領域に均一に入射させ、観察側マルチスリット光を検出器２８ａ，２８ｂの検出面に均一に入射させることができる。
なお、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１では、走査ミラー１２を三角波駆動する例を示しているが、駆動方法はこれに限られず、ノコギリ波駆動等とすることも勿論可能である。

また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１では、上記マルチスリット選択ルーチンにおいて、スリット光退避時間を、照明側マルチスリット光が試料面の観察領域から外れはじめてから、照明側マルチスリット光の全てが観察領域から外れるまでの時間と定義してもよい（図６を参照。）。これにより、走査ミラー１２の駆動周波数に対してより大きなマルチスリット幅Ｌのマルチスリット１０，２０を選択することが可能となり、照明光及び観察光の光量をより大きくすることができる。なお、斯かる場合には、照明側マルチスリット光が試料面の観察領域から外れる以前より走査ミラー１２を減速し、さらに照明側マルチスリット光が観察領域に入りはじめてから走査ミラー１２を加速しなければならない。このため、走査ミラー１２の減速及び加速が行われる観察領域の周辺部分からの観察光の検出信号には明るさのゲインを下げる補正を行うことが望ましい。

なお、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上記マルチスリット選択ルーチンに限られず、使用者が自ら照明側スリット部９の所望のマルチスリット１０を選択した際に、当該所望のマルチスリット１０に適した最大の駆動周波数で走査ミラー１２を駆動する構成とすることもできる。斯かる場合、記憶部３５は、照明側スリット部９の３つのマルチスリット１０のスリット光退避時間と一致する無効期間の情報と、当該無効期間に対応する走査ミラー１２の駆動周波数の情報を記憶していればよい。斯かる構成により、走査ミラー１２をマルチスリット１０，２０に合わせて最大の駆動周波数で駆動することが可能となるため、試料２に生じる高速な現象を捉えることが可能となる。

１ 共焦点顕微鏡
２ 試料
４ 対物レンズ
７ ＰＣ
９ 照明側スリット部
１０ マルチスリット
１２ 走査ミラー
１９ 観察側スリット部
２０ マルチスリット
２８ａ，２８ｂ 検出器
３０ ＣＰＵ
３５ 記憶部

Claims (6)

1. 光源からの照明光を制限する第１遮光部材と、
   前記第１遮光部材で制限された照明光を走査する走査ミラーと、
   前記走査ミラーで走査された照明光を試料に集光する対物レンズと、
   前記試料からの観察光を制限する第２遮光部材と、
   前記第２遮光部材で制限された観察光を検出する検出器とを有しており、
   前記第１遮光部材は、複数のスリットが並んで形成された遮光部材であり、
   前記第２遮光部材は、前記第１遮光部材の複数のスリットに対応する複数のスリットが並んで形成された遮光部材であることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記第１遮光部材の複数のスリット及び前記第２遮光部材の複数のスリットは、スリット間隔がスリット幅の２．５倍以上であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. スリット数、スリット幅、及びスリット間隔の少なくとも１つが異なる複数の前記第１遮光部材を切替可能に保持する第１切替部材と、
   前記複数の第１遮光部材に対応する複数の前記第２遮光部材を切替可能に保持する第２切替部材とを有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記走査ミラーの駆動周波数に応じて、観察に使用する前記第１遮光部材及び前記第２遮光部材を選択する制御部を有することを特徴とする請求項３に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記走査ミラーの駆動周波数毎に前記走査ミラーの動作速度が変化する期間の情報を記憶した記憶部を有し、
   前記制御部は、前記走査ミラーの駆動周波数に対応する前記期間の情報を前記記憶部から取得し、前記試料を走査する照明光を前記期間中に前記試料の観察領域から退避可能に制限する前記第１遮光部材を選択することを特徴とする請求項４に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記複数の第１遮光部材毎に前記走査ミラーの最大駆動周波数の情報を記憶した記憶部と、
   使用者が選択した前記第１遮光部材に対応する前記最大駆動周波数を前記記憶部から取得し、該最大駆動周波数で前記走査ミラーを駆動する制御部とを有することを特徴とする請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。