JPH09304701A - 共焦点レーザ走査顕微鏡 - Google Patents
共焦点レーザ走査顕微鏡Info
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- JPH09304701A JPH09304701A JP8143717A JP14371796A JPH09304701A JP H09304701 A JPH09304701 A JP H09304701A JP 8143717 A JP8143717 A JP 8143717A JP 14371796 A JP14371796 A JP 14371796A JP H09304701 A JPH09304701 A JP H09304701A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 定量性のある調整を簡単に行うことができ、
また調整の際、試料にダメージを与えないですむ共焦点
レーザ走査顕微鏡を提供する。 【解決手段】 励起レーザ光を発して試料４６を照射す
るアルゴンレーザ光源１１と、励起レーザ光と試料４６
から発せられる蛍光とを分離させる第１ダイクロイック
ミラー２０と、励起レーザ光を２次元走査するスキャニ
ングユニット３０と、スキャニングユニット３０と試料
４６との間に配置された対物レンズ４４と、第１ダイク
ロイックミラー２０によって分離された蛍光を集光させ
るための集光レンズ３と、集光レンズ３の焦点面に設け
られたピンホール４ａと、ピンホール４ａを通過した蛍
光を検出する蛍光検出部とを備えた共焦点レーザ走査顕
微鏡１において、対物レンズ４４の焦点面と共役な１次
像面４７に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラス４２を
抜き差し自在に設ける。
また調整の際、試料にダメージを与えないですむ共焦点
レーザ走査顕微鏡を提供する。 【解決手段】 励起レーザ光を発して試料４６を照射す
るアルゴンレーザ光源１１と、励起レーザ光と試料４６
から発せられる蛍光とを分離させる第１ダイクロイック
ミラー２０と、励起レーザ光を２次元走査するスキャニ
ングユニット３０と、スキャニングユニット３０と試料
４６との間に配置された対物レンズ４４と、第１ダイク
ロイックミラー２０によって分離された蛍光を集光させ
るための集光レンズ３と、集光レンズ３の焦点面に設け
られたピンホール４ａと、ピンホール４ａを通過した蛍
光を検出する蛍光検出部とを備えた共焦点レーザ走査顕
微鏡１において、対物レンズ４４の焦点面と共役な１次
像面４７に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラス４２を
抜き差し自在に設ける。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明はコンフォーカルピ
ンホールを用いた共焦点レーザ走査顕微鏡に関する。
ンホールを用いた共焦点レーザ走査顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】共焦点レーザ走査顕微鏡は、励起レーザ
光を発して試料に照射する光源と、励起レーザ光と試料
から発せられる蛍光とを分離する光分離手段と、励起レ
ーザ光を２次元走査する走査手段と、走査手段と試料と
の間に配置された対物レンズと、光分離手段によって分
離された蛍光を集光させるための集光レンズと、集光レ
ンズの焦点面に設けられたピンホールと、ピンホールを
通過した蛍光を検出する検出手段とを備える。
光を発して試料に照射する光源と、励起レーザ光と試料
から発せられる蛍光とを分離する光分離手段と、励起レ
ーザ光を２次元走査する走査手段と、走査手段と試料と
の間に配置された対物レンズと、光分離手段によって分
離された蛍光を集光させるための集光レンズと、集光レ
ンズの焦点面に設けられたピンホールと、ピンホールを
通過した蛍光を検出する検出手段とを備える。
【０００３】レーザ光源から射出された励起レーザ光
は、ダイクロイックミラーによって反射された後、走査
ミラーによって２次元的に振られ、対物レンズによって
試料（例えば蛍光試薬が注入された生体細胞）面に集光
される。励起レーザ光の照射によって試料から発生した
蛍光は励起レーザ光とともに対物レンズから走査ミラー
へと光路を逆行し、ダイクロイックミラーで励起レーザ
光と分離される。ダイクロイックミラーを透過した蛍光
は、集光レンズにより蛍光光路中に配置したピンホール
に集光される。このとき、試料の結像部で発した蛍光の
みがピンホールを通過し、蛍光検出器で受光されて電気
信号に変換され、画像化される。
は、ダイクロイックミラーによって反射された後、走査
ミラーによって２次元的に振られ、対物レンズによって
試料（例えば蛍光試薬が注入された生体細胞）面に集光
される。励起レーザ光の照射によって試料から発生した
蛍光は励起レーザ光とともに対物レンズから走査ミラー
へと光路を逆行し、ダイクロイックミラーで励起レーザ
光と分離される。ダイクロイックミラーを透過した蛍光
は、集光レンズにより蛍光光路中に配置したピンホール
に集光される。このとき、試料の結像部で発した蛍光の
みがピンホールを通過し、蛍光検出器で受光されて電気
信号に変換され、画像化される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ダイクロイ
ックミラーは使用される励起光の波長に応じて切り換え
たり、交換したりして使用される。しかし、ピンホール
は極めて小さい（数十ミクロン程度）ので、光軸とピン
ホールとの位置がずれると画面が暗くなったり見えなく
なったりしてしまう。
ックミラーは使用される励起光の波長に応じて切り換え
たり、交換したりして使用される。しかし、ピンホール
は極めて小さい（数十ミクロン程度）ので、光軸とピン
ホールとの位置がずれると画面が暗くなったり見えなく
なったりしてしまう。
【０００５】これは、ダイクロイックミラーを切り換え
る度に、ダイクロイックミラーを切り換えるためのスラ
イダーや回転機構の切換位置がずれたり、ダイクロイッ
クミラーの交換時に装着位置がずれたりして蛍光がピン
ホールから外れたり、けられ（一部が遮光されること）
たりするからである。
る度に、ダイクロイックミラーを切り換えるためのスラ
イダーや回転機構の切換位置がずれたり、ダイクロイッ
クミラーの交換時に装着位置がずれたりして蛍光がピン
ホールから外れたり、けられ（一部が遮光されること）
たりするからである。
【０００６】そこで、ダイクロイックミラーを切り換え
る度に集光レンズの光軸やピンホールの位置が調整され
る。
る度に集光レンズの光軸やピンホールの位置が調整され
る。
【０００７】すなわち、ダイクロイックミラーを切り換
える度に、試料に実際に励起光を照射し、モニタ画面上
の蛍光像を見ながら輝度値が大きくなる（画像が明るく
なる）ように、集光レンズの光軸やピンホールに位置を
動かして調整する。
える度に、試料に実際に励起光を照射し、モニタ画面上
の蛍光像を見ながら輝度値が大きくなる（画像が明るく
なる）ように、集光レンズの光軸やピンホールに位置を
動かして調整する。
【０００８】しかし、実際の試料には蛍光を発し易い部
分と蛍光を発し難い部分があるため、最大の輝度値であ
る位置に合わせたつもりでも実際には最大の輝度値でな
い位置に合わせてしまう場合が生じ、調整は感覚に依存
する定量性のないものとなってしまうという問題があっ
た。
分と蛍光を発し難い部分があるため、最大の輝度値であ
る位置に合わせたつもりでも実際には最大の輝度値でな
い位置に合わせてしまう場合が生じ、調整は感覚に依存
する定量性のないものとなってしまうという問題があっ
た。
【０００９】また、調整時に試料に対して必要以上に励
起光を照射していまうため、試料に退色等のダメージを
与えてしまうという問題があった。
起光を照射していまうため、試料に退色等のダメージを
与えてしまうという問題があった。
【００１０】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は定量性のある調整を簡単に行うこ
とができ、また調整の際、試料にダメージを与えないで
すむ共焦点レーザ走査顕微鏡を提供することである。
たもので、その課題は定量性のある調整を簡単に行うこ
とができ、また調整の際、試料にダメージを与えないで
すむ共焦点レーザ走査顕微鏡を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡は、励
起レーザ光を発して試料に照射する光源と、前記励起レ
ーザ光と試料から発せられる蛍光とを分離する光分離手
段と、前記励起レーザ光を２次元走査する走査手段と、
前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズ
と、前記光分離手段によって分離された蛍光を集光させ
るための集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に設け
られたピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を
検出する検出手段とを備えることを特徴とする。
め請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡は、励
起レーザ光を発して試料に照射する光源と、前記励起レ
ーザ光と試料から発せられる蛍光とを分離する光分離手
段と、前記励起レーザ光を２次元走査する走査手段と、
前記走査手段と前記試料との間に配置された対物レンズ
と、前記光分離手段によって分離された蛍光を集光させ
るための集光レンズと、前記集光レンズの焦点面に設け
られたピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を
検出する検出手段とを備えることを特徴とする。
【００１２】対物レンズの焦点面と共役な１次像面に標
準蛍光サンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設
けたので、試料面に照射したのと同等の、集光レンズの
光軸やピンホールの位置の調整を行うことができ、試料
にダメージを与えることがなくなる。また蛍光ガラスは
均一な蛍光を発するので、輝度値を用いた定量的な調整
を行うことができる。
準蛍光サンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設
けたので、試料面に照射したのと同等の、集光レンズの
光軸やピンホールの位置の調整を行うことができ、試料
にダメージを与えることがなくなる。また蛍光ガラスは
均一な蛍光を発するので、輝度値を用いた定量的な調整
を行うことができる。
【００１３】請求項２記載の発明の共焦点レーザ走査顕
微鏡は、請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡
において、前記蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５
１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付
近で蛍光強度が強くなるものであることを特徴とする。
微鏡は、請求項１記載の発明の共焦点レーザ走査顕微鏡
において、前記蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５
１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付
近で蛍光強度が強くなるものであることを特徴とする。
【００１４】蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１
ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近
で蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍
光を観察することで安定した調整を行うことができる。
ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近
で蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍
光を観察することで安定した調整を行うことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。
面に基づいて説明する。
【００１６】図１はこの発明の第１の実施形態に係る共
焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【００１７】共焦点レーザ走査顕微鏡１は、照明光学系
１０と、第１ダイクロイックミラー（光分離手段）２０
と、スキャニングユニット（走査手段）３０と、リレー
光学系４０と、バリアフィルタ２と、集光レンズ３と、
ピンホール４ａが形成されたピンホールプレート４と、
蛍光検出部（検出手段）５０と、蛍光画像システム６０
とを備える。
１０と、第１ダイクロイックミラー（光分離手段）２０
と、スキャニングユニット（走査手段）３０と、リレー
光学系４０と、バリアフィルタ２と、集光レンズ３と、
ピンホール４ａが形成されたピンホールプレート４と、
蛍光検出部（検出手段）５０と、蛍光画像システム６０
とを備える。
【００１８】照明光学系１０は、アルゴンレーザ光源
（波長λ：３５１ｎｍ及び４８８ｎｍ）１１と、３５１
ｎｍの波長を通す励起フィルタ１２（ＥＸフィルタ）
と、全反射ミラー１３と、励起光の透過率を調整する減
光フィルタ（ＮＤフィルタ）１４と、ビームエクスパン
ダ１５とから構成される。なお、第１ダイクロイックミ
ラー２０を切換えるための機構は、例えばアリ溝又はボ
ールレース等のスライダを用いることができるるが、そ
の図示は省略されている。
（波長λ：３５１ｎｍ及び４８８ｎｍ）１１と、３５１
ｎｍの波長を通す励起フィルタ１２（ＥＸフィルタ）
と、全反射ミラー１３と、励起光の透過率を調整する減
光フィルタ（ＮＤフィルタ）１４と、ビームエクスパン
ダ１５とから構成される。なお、第１ダイクロイックミ
ラー２０を切換えるための機構は、例えばアリ溝又はボ
ールレース等のスライダを用いることができるるが、そ
の図示は省略されている。
【００１９】第１ダイクロイックミラー２０はレーザ光
と蛍光を分離させるものであって、ここでは３８０ｎｍ
以下の波長の光を反射させるものを用いる。
と蛍光を分離させるものであって、ここでは３８０ｎｍ
以下の波長の光を反射させるものを用いる。
【００２０】スキャニングユニット３０は、水平スキャ
ナ３１及び垂直スキャナ３２から構成される。水平スキ
ャナ３１及び垂直スキャナ３２としては、ガルバノスキ
ャナやレゾナントスキャナを用いる。
ナ３１及び垂直スキャナ３２から構成される。水平スキ
ャナ３１及び垂直スキャナ３２としては、ガルバノスキ
ャナやレゾナントスキャナを用いる。
【００２１】リレー光学系４０は、集光レンズ４１と、
蛍光ガラス４２と、全反射ミラー４３と、対物レンズ４
４とから構成される。蛍光ガラス４２は、対物レンズ４
４の焦点面（ステージ４５上に載置された試料４６の任
意のスライス面）と共役な１次像面４７に標準蛍光サン
プルとして抜き差し自在に設けられている。
蛍光ガラス４２と、全反射ミラー４３と、対物レンズ４
４とから構成される。蛍光ガラス４２は、対物レンズ４
４の焦点面（ステージ４５上に載置された試料４６の任
意のスライス面）と共役な１次像面４７に標準蛍光サン
プルとして抜き差し自在に設けられている。
【００２２】バリアフィルタ２は、３９０ｎｍ以上の波
長の光を透過する。
長の光を透過する。
【００２３】集光レンズ３は試料面４５で発生した蛍光
を対物レンズ４４の焦点面と共役な位置に設けられたピ
ンホール４ａに集光させる。
を対物レンズ４４の焦点面と共役な位置に設けられたピ
ンホール４ａに集光させる。
【００２４】蛍光検出部５０は、４４０ｎｍ以上の波長
の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５１と、４
００〜４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッション（Ｅ
ｍ）フィルタ５２と、蛍光検出器５３と、４４０ｎｍ以
上の波長の蛍光を通すエミッション（Ｅｍ）フィルタ５
４と、蛍光検出器５５とから構成される。蛍光検出器５
３，５５は、１つの励磁光で２つの波長の光を観察で
き、それぞれピンホール４ａを通過した蛍光を検出して
電気信号に変換し出力する。
の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５１と、４
００〜４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッション（Ｅ
ｍ）フィルタ５２と、蛍光検出器５３と、４４０ｎｍ以
上の波長の蛍光を通すエミッション（Ｅｍ）フィルタ５
４と、蛍光検出器５５とから構成される。蛍光検出器５
３，５５は、１つの励磁光で２つの波長の光を観察で
き、それぞれピンホール４ａを通過した蛍光を検出して
電気信号に変換し出力する。
【００２５】蛍光画像システム６０は、アンプ６１、Ａ
／Ｄコンバータ６２、モニタ６３、メモリ６４、ＣＰＵ
６５から構成される。
／Ｄコンバータ６２、モニタ６３、メモリ６４、ＣＰＵ
６５から構成される。
【００２６】次に集光レンズ３又はピンホールプレート
４を動かす調整時の動作を図１を参照して説明する。
４を動かす調整時の動作を図１を参照して説明する。
【００２７】第１ダイクロイックミラー２０が切り換え
られたとき、蛍光ガラス４２を一次像面４７に挿入す
る。
られたとき、蛍光ガラス４２を一次像面４７に挿入す
る。
【００２８】アルゴンレーザ光源１１から射出されたレ
ーザ光は、励起フィルタ１２を透過し、全反射ミラー１
３で反射され、減光フィルタ１４で調光された後、ビー
ムエクスパンダ１５で対物レンズ４４の瞳面を満たせる
大きさに拡大される。
ーザ光は、励起フィルタ１２を透過し、全反射ミラー１
３で反射され、減光フィルタ１４で調光された後、ビー
ムエクスパンダ１５で対物レンズ４４の瞳面を満たせる
大きさに拡大される。
【００２９】このレーザ光は、第１ダイクロイックミラ
ー２０によって反射された後、スキャニングユニット３
０でスキャニングされ、集光レンズ４１によって１次像
面４７に挿入された蛍光ガラス４２上に集光する（レー
ザ光は、この際も２次元的に振られている）。
ー２０によって反射された後、スキャニングユニット３
０でスキャニングされ、集光レンズ４１によって１次像
面４７に挿入された蛍光ガラス４２上に集光する（レー
ザ光は、この際も２次元的に振られている）。
【００３０】蛍光ガラス４２は、レーザ光の照射によっ
て５４２ｎｍ程度の波長の蛍光（緑色）を発生する。こ
の蛍光は集光レンズ４１からスキャニングユニット３０
へと光路を逆行する。スキャニングユニット３０では、
通常の観察時と同様にデスキャニングされる。
て５４２ｎｍ程度の波長の蛍光（緑色）を発生する。こ
の蛍光は集光レンズ４１からスキャニングユニット３０
へと光路を逆行する。スキャニングユニット３０では、
通常の観察時と同様にデスキャニングされる。
【００３１】第１ダイクロイックミラー２０を通過した
蛍光は、バリアフィルタ２を通った後集光レンズ３で集
光される。
蛍光は、バリアフィルタ２を通った後集光レンズ３で集
光される。
【００３２】ピンホール４ａを通過した蛍光は、光蛍光
検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅さ
れた後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階の
デジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタ
ルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路
により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナ
ログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力
される。
検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅さ
れた後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階の
デジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタ
ルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路
により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナ
ログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力
される。
【００３３】その際、例えばモニタ６３の画面をズーム
画面表示や静止画面表示としておき、画面の中心（スキ
ャン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、
集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート４の位置を
調整し、蛍光の光軸とピンホールの中心を一致させる。
画面表示や静止画面表示としておき、画面の中心（スキ
ャン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、
集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート４の位置を
調整し、蛍光の光軸とピンホールの中心を一致させる。
【００３４】この第１実施形態によれば、試料面に照射
したのと同等の調整を試料にダメージを与えることなく
行える。また均一な蛍光を発する蛍光ガラスを用いるの
で、輝度値の定量的な調整を行うことができる。
したのと同等の調整を試料にダメージを与えることなく
行える。また均一な蛍光を発する蛍光ガラスを用いるの
で、輝度値の定量的な調整を行うことができる。
【００３５】図２はこの発明の第２の実施形態に係る共
焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図であり、図１と
同一部材には同一符号を付して説明を省略する。
焦点レーザ走査顕微鏡のブロック構成図であり、図１と
同一部材には同一符号を付して説明を省略する。
【００３６】この第２の実施形態においては、ＣＰＵ６
５によって駆動が制御される第１の駆動回路７０と、第
２の駆動回路８０とを設けたことが第１の実施形態の構
成と相違する。
５によって駆動が制御される第１の駆動回路７０と、第
２の駆動回路８０とを設けたことが第１の実施形態の構
成と相違する。
【００３７】第１の駆動回路７０は蛍光ガラス４２を１
次像面４７に挿入させるためのものであり、第２の駆動
回路８０は集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート
４の位置を移動させるためのものである。
次像面４７に挿入させるためのものであり、第２の駆動
回路８０は集光レンズ３の光軸又はピンホールプレート
４の位置を移動させるためのものである。
【００３８】次に集光レンズ３又はピンホールプレート
４を動かす調整時の動作を図２を参照して説明する。
４を動かす調整時の動作を図２を参照して説明する。
【００３９】第１ダイクロイックミラー２０が切り換え
られたことを示す信号２０ａを入力したとき、ＣＰＵ６
５は制御信号６５ａを駆動回路７０へ出力し、蛍光ガラ
ス４２を一次像面４７に挿入する。
られたことを示す信号２０ａを入力したとき、ＣＰＵ６
５は制御信号６５ａを駆動回路７０へ出力し、蛍光ガラ
ス４２を一次像面４７に挿入する。
【００４０】アルゴンレーザ光源１１から射出されたレ
ーザ光は、第１実施形態の場合と同じ光路を通ってピン
ホール４ａに達する。
ーザ光は、第１実施形態の場合と同じ光路を通ってピン
ホール４ａに達する。
【００４１】ピンホール４ａを通過した蛍光は、光蛍光
検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅さ
れた後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階の
デジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタ
ルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路
により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナ
ログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力
される。
検出器５３で電気信号に変換され、アンプ６１で増幅さ
れた後、Ａ／Ｄコンバータ６２で、例えば２５６段階の
デジタル信号に変換される。このデジタル信号はデジタ
ルメモリ６４に記憶され、ＣＰＵ６５の制御や演算回路
により輝度信号を分離する処理等を行った後、再びアナ
ログ信号に戻してモニタ６３にデジタル画像として出力
される。
【００４２】その際、モニタ６３の画面の中心（スキャ
ン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、Ｃ
ＰＵ６５は所定のプログラムに基づいて駆動回路８０へ
制御信号６５ｂを出力し、集光レンズ３の光軸又はピン
ホールプレート４の位置を動かして、蛍光の光軸とピン
ホールの中心を一致させる。
ン中心）又は中心付近の輝度値が最大となるように、Ｃ
ＰＵ６５は所定のプログラムに基づいて駆動回路８０へ
制御信号６５ｂを出力し、集光レンズ３の光軸又はピン
ホールプレート４の位置を動かして、蛍光の光軸とピン
ホールの中心を一致させる。
【００４３】このＣＰＵ６５による制御を同じプログラ
ムで処理すれば、同じデジタル画像に対して処理結果は
常に同一となるので、画像再現性が極めてよい調整を行
うことができる。
ムで処理すれば、同じデジタル画像に対して処理結果は
常に同一となるので、画像再現性が極めてよい調整を行
うことができる。
【００４４】この第２実施形態によれば、第１実施形態
と同様の調整をより確実かつ迅速に行うことができる。
と同様の調整をより確実かつ迅速に行うことができる。
【００４５】なお、３５１ｎｍの波長を通す励起フィル
タ１２、３８０ｎｍ以下の波長の光を反射させる第１ダ
イクロイックミラー２０、３９０ｎｍ以上の波長の光を
透過するバリアフィルタ２、４４０ｎｍ以上の波長の蛍
光を透過する第２ダイクロイックミラー５１、４００〜
４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５
２及び４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を通すエミッション
フィルタ５４を用いる代わりに、４８８ｎｍの波長を通
す励起フィルタ１２、５１０ｎｍ以下の波長の光を反射
させる第１ダイクロイックミラー２０、５１５ｎｍ以上
の波長の光を透過するバリアフィルタ２、６２５ｎｍ以
上の波長の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５
１、５００〜６２５ｎｍの波長の蛍光を通すエミッショ
ンフィルタ５２及び６３０ｎｍ以上の波長の蛍光を通す
エミッションフィルタ５４を用いたときでも、上記各実
施形態と同様に調整を行うことができる。
タ１２、３８０ｎｍ以下の波長の光を反射させる第１ダ
イクロイックミラー２０、３９０ｎｍ以上の波長の光を
透過するバリアフィルタ２、４４０ｎｍ以上の波長の蛍
光を透過する第２ダイクロイックミラー５１、４００〜
４４０ｎｍの波長の蛍光を通すエミッションフィルタ５
２及び４４０ｎｍ以上の波長の蛍光を通すエミッション
フィルタ５４を用いる代わりに、４８８ｎｍの波長を通
す励起フィルタ１２、５１０ｎｍ以下の波長の光を反射
させる第１ダイクロイックミラー２０、５１５ｎｍ以上
の波長の光を透過するバリアフィルタ２、６２５ｎｍ以
上の波長の蛍光を透過する第２ダイクロイックミラー５
１、５００〜６２５ｎｍの波長の蛍光を通すエミッショ
ンフィルタ５２及び６３０ｎｍ以上の波長の蛍光を通す
エミッションフィルタ５４を用いたときでも、上記各実
施形態と同様に調整を行うことができる。
【００４６】また、上記各実施形態においては、ピンホ
ール４ａをピンホールプレート４に形成するようにした
が、シングルモードの光ファイバ等の端面を用いるよう
にしてもよい。
ール４ａをピンホールプレート４に形成するようにした
が、シングルモードの光ファイバ等の端面を用いるよう
にしてもよい。
【００４７】図３は蛍光ガラスの蛍光スペクトル図であ
り、横軸は蛍光波長λ（単位：ｎｍ）、縦軸は蛍光強度
Ｉである。
り、横軸は蛍光波長λ（単位：ｎｍ）、縦軸は蛍光強度
Ｉである。
【００４８】この図から３５１ｎｍ及び４８８ｎｍの波
長のレーザ光を蛍光ガラスに照射したとき、５４２ｎｍ
付近で蛍光強度が最大となることがわかる。したがっ
て、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光を観察することで集光
レンズの光軸やピンホールの位置の調整を行えば、安定
した調整を行えることがわかる。ることがわかる。
長のレーザ光を蛍光ガラスに照射したとき、５４２ｎｍ
付近で蛍光強度が最大となることがわかる。したがっ
て、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光を観察することで集光
レンズの光軸やピンホールの位置の調整を行えば、安定
した調整を行えることがわかる。ることがわかる。
【００４９】
【発明の効果】以上に説明したように請求項１に記載の
発明の共焦点走査顕微鏡によれば、対物レンズの焦点面
と共役な１次像面に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラ
スを抜き差し自在に設けたので、試料面に照射したのと
同等の、集光レンズの光軸やピンホールの位置の調整を
行うことができ、試料にダメージを与えることがなくな
る。また蛍光ガラスは均一な蛍光を発するので、輝度値
を用いた定量的な調整を行うことができる。そのため、
調整後においては再現性の画像を取得することが可能と
なる。
発明の共焦点走査顕微鏡によれば、対物レンズの焦点面
と共役な１次像面に標準蛍光サンプルとしての蛍光ガラ
スを抜き差し自在に設けたので、試料面に照射したのと
同等の、集光レンズの光軸やピンホールの位置の調整を
行うことができ、試料にダメージを与えることがなくな
る。また蛍光ガラスは均一な蛍光を発するので、輝度値
を用いた定量的な調整を行うことができる。そのため、
調整後においては再現性の画像を取得することが可能と
なる。
【００５０】請求項２に記載の発明の共焦点走査顕微鏡
によれば、蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎ
ｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で
蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光
を観察することで安定した調整を行うことができる。
によれば、蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが３５１ｎ
ｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎｍ付近で
蛍光強度が強くなるので、波長が５４２ｎｍ付近の蛍光
を観察することで安定した調整を行うことができる。
【図１】図１はこの発明の第１の実施形態に係る共焦点
レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【図２】図２はこの発明の第２の実施形態に係る共焦点
レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
レーザ走査顕微鏡のブロック構成図である。
【図３】図３は蛍光ガラスの蛍光スペクトル図である。
１ 共焦点レーザ走査顕微鏡 ３ 集光レンズ ４ａ ピンホール １１ アルゴンレーザ光源 ２０ ダイクロイックミラー（光分離手段） ３０ スキャニングユニット（走査手段） ４６ 試料 ４７ １次像面 ５０ 蛍光検出部（検出手段）
Claims (2)
- 【請求項１】 励起レーザ光を発して試料に照射する光
源と、前記励起レーザ光と試料から発せられる蛍光とを
分離する光分離手段と、前記励起レーザ光を２次元走査
する走査手段と、前記走査手段と前記試料との間に配置
された対物レンズと、前記光分離手段によって分離され
た蛍光を集光させるための集光レンズと、前記集光レン
ズの焦点面に設けられたピンホールと、前記ピンホール
を通過した蛍光を検出する検出手段とを備えた共焦点レ
ーザ走査顕微鏡において、 前記対物レンズの焦点面と共役な１次像面に標準蛍光サ
ンプルとしての蛍光ガラスを抜き差し自在に設けること
を特徴とする共焦点レーザ走査顕微鏡。 - 【請求項２】 前記蛍光ガラスは、レーザ光の波長λが
３５１ｎｍ及び４８８ｎｍのとき、蛍光波長が５４２ｎ
ｍ付近で蛍光強度が強くなるものであることを特徴とす
る請求項１記載の共焦点レーザ走査顕微鏡。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP14371796A JP3814869B2 (ja) | 1996-05-14 | 1996-05-14 | 共焦点レーザ走査顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14371796A JP3814869B2 (ja) | 1996-05-14 | 1996-05-14 | 共焦点レーザ走査顕微鏡 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09304701A true JPH09304701A (ja) | 1997-11-28 |
| JP3814869B2 JP3814869B2 (ja) | 2006-08-30 |
Family
ID=15345356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14371796A Expired - Fee Related JP3814869B2 (ja) | 1996-05-14 | 1996-05-14 | 共焦点レーザ走査顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3814869B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001027680A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Nikon Corporation | Microscope laser et instrument optique a balayage laser confocal |
| JP2002221663A (ja) * | 2001-01-29 | 2002-08-09 | Nikon Corp | 走査型共焦点顕微鏡 |
| EP1333102A2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Calibrating array scanners |
| WO2013036049A2 (ko) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | 서울대학교산학협력단 | 공초점 형광 현미경 |
| CN103940796A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-23 | 浙江大学 | 新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统 |
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| JPWO2022065459A1 (ja) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | ||
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| US20230332090A1 (en) | 2020-09-24 | 2023-10-19 | Nikon Corporation | Method of manipulating organism and device for manipulating organism |
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-
1996
- 1996-05-14 JP JP14371796A patent/JP3814869B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2001027680A1 (fr) * | 1999-10-12 | 2001-04-19 | Nikon Corporation | Microscope laser et instrument optique a balayage laser confocal |
| US6621628B1 (en) | 1999-10-12 | 2003-09-16 | Nikon Corporation | Laser microscope and confocal laser scanning microscope |
| JP2002221663A (ja) * | 2001-01-29 | 2002-08-09 | Nikon Corp | 走査型共焦点顕微鏡 |
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| EP1333102A3 (en) * | 2002-01-31 | 2004-01-02 | Agilent Technologies, Inc. | Calibrating array scanners |
| US7205154B2 (en) | 2002-01-31 | 2007-04-17 | Agilent Technologies, Inc. | Calibrating array scanners |
| WO2013036049A2 (ko) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | 서울대학교산학협력단 | 공초점 형광 현미경 |
| WO2013036049A3 (ko) * | 2011-09-06 | 2013-05-02 | 서울대학교산학협력단 | 공초점 형광 현미경 |
| KR101393514B1 (ko) * | 2011-09-06 | 2014-05-13 | 서울대학교산학협력단 | 고감도 실시간 공초점 형광 현미경 |
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| CN103940796A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-23 | 浙江大学 | 新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统 |
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| Publication number | Publication date |
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| JP3814869B2 (ja) | 2006-08-30 |
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