JPWO2008155883A1 - 共焦点顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、各ラウンドのフレームスキャンの回数が１であったとしても物体の光軸方向の状態変化を検知することを目的とする。そのために本発明の共焦点顕微鏡装置は、光源（１１）と、前記光源からの光を試料（１０）に集光するとともに走査する照明光学系（１２，１５，１６１，１６）と、前記試料からの光を集光する集光光学系（１６，１６１，１８）と、前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段（１９，２０ｓ，２０ｍ）と、前記検出手段から出力される前記集光点の近傍からの光の信号（Ｉｓ）と前記周辺からの光の信号（Ｉｍ）とを演算処理して前記試料の画像を生成する画像生成手段とを備えた共焦点顕微鏡装置であって、前記画像生成手段は、前記照明光学系の前記試料への光軸方向の集光位置を変えないで前記試料の所望領域を包含するように複数回走査することにより生成した複数の画像のそれぞれについて、前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との差異を算出する。

Description

本発明は、共焦点顕微鏡装置に関する。

生体標本の時間変化を観察する場合、共焦点顕微鏡タイムラプス撮影が有効である。特に生体標本の三次元的な変化や移動を捕らえる場合には、タイムラプス撮影の各ラウンドでＺ−スタック撮影を行うことになる。

但し、Ｚ−スタック撮影ではステージを光軸方向（Ｚ方向）に変位させながらスキャンを繰り返すので、複数枚の画像フレーム取得の間にタイムラグが生じる、スキャンを繰り返す分だけ生体細胞に加わるダメージが大きい、ステージの振動等により画質が低下するなどの問題がある。

その一方で、特許文献１には試料中の観察層からの射出光が示す画像と、その両側の層からの射出光が示す画像とを１回のスキャンで取得する共焦点顕微鏡が開示されている。このように１回のスキャンで多くの情報を取得できる共焦点顕微鏡は、上記問題の改善に有効と考えられる。
国際公開第２００７／１０１６９７号パンフレット

しかしながら、その共焦点顕微鏡をそのまま使用しただけでは生物標本のＺ方向に沿った変化又は移動は捕らえられないので、上記問題が解決されない。

そこで本発明は、各ラウンドのフレームスキャンの回数が１であったとしても物体の光軸方向の状態変化を検知することのできる共焦点顕微鏡装置を提供することを目的とする。

本発明の共焦点顕微鏡装置は、光源と、前記光源からの光を試料に集光するとともに走査する照明光学系と、前記試料からの光を集光する集光光学系と、前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段と、前記検出手段から出力される前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を生成する画像生成手段とを備えた共焦点顕微鏡装置であって、前記画像生成手段は、前記照明光学系の前記試料への光軸方向の集光位置を変えないで前記試料の所望領域を包含するように複数回走査することにより生成した複数の画像のそれぞれについて、前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との差異を算出することを特徴とする。

なお、前記画像生成手段は、前記差異を前記画像にそれぞれ反映させてもよい。

また、前記差異を前記画像にそれぞれ反映させることは、前記差異を可視化するためのカラー画像表示により行ってもよい。

また、前記画像生成手段は、前記差異の前記複数の画像間における変化量を算出してもよい。

また、前記差異は、前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との比であってもよい。

また、前記差異は、前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との差であってもよい。

また、前記画像生成手段は、算出した前記差異を記憶する記憶手段を有してもよい。

また、前記記憶手段は、前記差異を前記画像に対応付けて記憶してもよい。

本発明によれば、各ラウンドのフレームスキャンの回数が１であったとしても物体の光軸方向の状態変化を検知することができる。

共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。 光分離部材１９を説明する図である。 集光レンズ１８の焦点面上の領域を説明する図である。 試料１０の観察層と、その両側の層とを説明する図である。 共焦点顕微鏡装置の制御系の構成図である。 蛍光信号ＩｓのＺ方向の感度特性を示す図である。 比信号Ｉｓ／ＩｍのＺ方向の感度特性を示す図である。 第１実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。 ルックアップテーブルを説明する図である。 色相信号Ｉ’と、試料１０中の光軸方向の位置（Ｚ位置）との関係を示す図である。 （Ａ）は、モニタ２３に表示されるカラー画像を説明する図であり、（Ｂ）は、カラー画像から推測される、物体のＺ方向の変位の様子を可視化した図である。 第２実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。

［第１実施形態］
本発明の共焦点顕微鏡装置の第１実施形態を説明する。

図１は、共焦点顕微鏡装置の光学系の構成図である。図１に示すとおり、共焦点顕微鏡装置には、レーザユニット１１、光ファイバ７、コリメートレンズ１２、フィルタ１３、ダイクロイックミラー１４、ガルバノスキャナ１５、リレーレンズ１６１、対物レンズ１６、試料１０、フィルタ１７、集光レンズ１８、光分離部材１９、光ファイバ１９ｓ、光ファイバ１９ｍ、光検出器２０ｓ、光検出器２０ｍなどが配置される。

試料１０は、生体細胞を培養した培養標本であり、その生体細胞は所定の蛍光物質により予め染色されている。試料１０の光軸方向の位置は、観察対象物（生体細胞又はオルガネラ）が対物レンズ１６の焦点面に存在するよう不図示の顕微鏡の上下動機構によって予め調整されている。以下、対物レンズ１６の光軸方向をＺ方向とし、試料１０のうち対物レンズ１６の焦点深度内に存在する層を「観察層」という。

レーザユニット１１は、前記所定の蛍光物質の励起波長と同じ波長のレーザ光を出射する。レーザユニット１１から射出したレーザ光は、光ファイバ７の内部を伝搬してからコリメートレンズ１２において平行光束化された後、フィルタ１３を介してダイクロイックミラー１４へ入射する。そのレーザ光はダイクロイックミラー１４を通過し、ガルバノスキャナ１５の２つのミラーで順に反射した後、リレーレンズ１６１及び対物レンズ１６を通り、試料１０の観察層の１箇所で集光し、広がる。レーザ光が照射された領域、即ち集光点及びその前後では蛍光物質が励起され、蛍光を発する。

発生した蛍光は、その集光点に向かったレーザ光と同じ光路を逆に辿りながら、対物レンズ１６、リレーレンズ１６１、ガルバノスキャナ１５を通り、ダイクロイックミラー１４へ向かう。その蛍光はダイクロイックミラー１４で反射し、フィルタ１７を介して集光レンズ１８へ入射する。その蛍光は、集光レンズ１８によって集光されつつ光分離部材１９へ入射し、２つの蛍光Ｌｓ，Ｌｍに分離される。この光分離部材１９の詳細は後述する。

光分離部材１９において分離された一方の蛍光Ｌｓは、光ファイバ１９ｓの内部を伝搬してから光検出器２０ｓへ入射し、蛍光信号Ｉｓに変換される。光分離部材１９において分離された他方の蛍光Ｌｍは、光ファイバ１９ｍの内部を伝搬してから光検出器２０ｍへ入射し、蛍光信号Ｉｍに変換される。

したがって、以上の共焦点顕微鏡装置は、レーザユニット１１と、ガルバノスキャナ１５と、光検出器２０ｓと、光検出器２０ｍとを同期駆動することにより、試料１０をレーザ光でスキャンしながら２種類の蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを並列的に取得することができる。以下、主スキャンの方向をＸ方向とし、副スキャンの方向をＹ方向とする。

図２は、光分離部材１９を説明する図である。図２に示すとおり光分離部材１９の全体は、入射する蛍光に対し透明な部材であり、その部材上に光分離面１９ｓと光分離面１９ｍと反射面１９Ａとが形成されている。

光分離面１９ｓは、微小円形の透過面（ピンホール）１９ｓ’と、そのピンホール１９ｓ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｓ”とからなり、光分離面１９ｍは、円形の透過面１９ｍ’と、その透過面１９ｍ’の周辺領域をカバーする反射面１９ｍ”とからなる。このうち、ピンホール１９ｓ’の径ｒｓは前述した集光点の径に対応しており、透過面１９ｍ’の径ｒｍは、ピンホール１９ｓ’の径ｒｓよりも大きく、例えばｒｍ＝２×ｒｓである。

集光レンズ１８から光分離部材１９へ入射した蛍光は、光分離面１９ｓへ入射し、ピンホール１９ｓ’を透過する蛍光と、反射面１９ｓ”を反射する蛍光とに分離される。このうち反射面１９ｓ”を反射した蛍光は、反射面１９Ａへ向かい、その反射面１９Ａを反射した後に光分離面１９ｍへ入射し、透過面１９ｍ’を透過する蛍光と、反射面１９ｍ”を反射する蛍光とに分離される。このうち、ピンホール１９ｓ’を透過した蛍光が前述した蛍光Ｌｓであり、透過面１９ｍ’を透過した蛍光が前述した蛍光Ｌｍである。

ここでピンホール１９ｓ’の配置箇所とピンホール１９ｍ’の配置箇所とは、集光レンズ１８の焦点深度に比べて光路長差が十分短いので、同一焦点面とみなすことができる。

図３に示すとおり、集光レンズ１８の焦点面上の領域を考えると、蛍光Ｌｓは、集光レンズ１８の焦点面中央の円形領域Ａｓに向かう蛍光に相当し、蛍光Ｌｍは、その円形領域Ａｓの外側のリング領域Ａｍに向かう蛍光に相当する（円形領域Ａｓの径が前述したｒｓに相当し、リング領域Ａｍの外径が前述したｒｍに相当する。）。

これら各蛍光の射出元を示すと、円形領域Ａｓに向かう蛍光Ｌｓの射出元は、図４に示すとおり試料１０の観察層１０ｓであり、リング領域Ａｍに入射する蛍光Ｌｍの射出元は、観察層１０ｓの両側の層１０ｍである。したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置では、観察層１０ｓからの蛍光Ｌｓと、その両側の層１０ｍからの蛍光Ｌｍとが並列的かつ個別に検出される。

なお、光分離部材１９を省略し、蛍光Ｌｓの強度と蛍光Ｌｍの強度とを個別に検出可能な光検出器を光分離部材１９の配置箇所へ配置してもよい。このような光検出器の受光面は、円形領域Ａｓと同形状の受光領域と、リング領域Ａｍと同形状の受光領域とを有する。

図５は、共焦点顕微鏡装置の制御系の構成図である。図５に示すとおり、共焦点顕微鏡には、コントローラ２１と、コンピュータ２２と、モニタ２３と、入力器２４とが備えられる。

コントローラ２１には、２つの電流／電圧変換器２１１ｓ，２１１ｍと、２つのＡ／Ｄ変換器２１２ｓ，２１２ｍと、制御回路２１０とが備えられる。コンピュータ２２には、ＣＰＵ２２１と、２つのフレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍと、ＲＡＭ２２２と、ハードディスクドライブ２２３と、表示用メモリ２２４と、インタフェース２２５とが備えられる。

光検出器２０ｓから出力される蛍光信号Ｉｓは、電流／電圧変換器２１１ｓを通り電圧信号に変換される。その電流／電圧変換器２１１ｓから出力される蛍光信号Ｉｓは、Ａ／Ｄ変換器２１２ｓを通りディジタル信号に変換される。そのＡ／Ｄ変換器２１２ｓから出力される蛍光信号Ｉｓはフレームメモリ２２０ｓへ入力される。

光検出器２０ｍから出力される蛍光信号Ｉｍは、電流／電圧変換器２１１ｍを通り電圧信号に変換される。その電流／電圧変換器２１１ｍから出力される蛍光信号Ｉｍは、Ａ／Ｄ変換器２１２ｍを通りディジタル信号に変換される。そのＡ／Ｄ変換器２１２ｍから出力される蛍光信号Ｉｍはフレームメモリ２２０ｍへ入力される。

制御回路２１０は、ＣＰＵ２２１からのスキャン指示に応じて、前述したレーザユニット１１、ガルバノスキャナ１５、光検出器２０ｓ、光検出器２０ｍを同期制御してスキャンを行う。そのスキャンにより、フレームメモリ２２０ｓには１フレーム分の蛍光信号Ｉｓが、フレームメモリ２２０ｍに１フレーム分の蛍光信号Ｉｍがそれぞれ並列的に蓄積される。スキャンが終了すると、制御回路２１０はＣＰＵ２２１へ終了信号を与える
スキャンによってフレームメモリ２２０ｓに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｓは、試料１０の観察層１０ｓ（図４参照）の画像を示し、スキャンによってフレームメモリ２２０ｍに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｍは、観察層の両側の層１０ｍ（図４参照）の画像を示す。

コンピュータ２２のハードディスクドライブ２２３には予め観察用のプログラムが格納されており、ＣＰＵ２２１はその観察用のプログラムをＲＡＭ２２２上へ読み出し、そのプログラムを実行する。その際、ＣＰＵ２２１は必要に応じて、入力器２４及びインタフェース２２５を介してユーザの指示を認識したり、制御回路２１０へスキャン指示を与えたりする。

なお、ユーザがＣＰＵ２２１へ指定できる情報には、観察期間、スキャン頻度（インターバル）、観察開始指示などがある。例えば、インターバルが１ｓｅｃ，観察期間が１０ｓｅｃと指定された場合、スキャン回数は１０となる。

また、ＣＰＵ２２１は、スキャン時にフレームメモリ２２０ｓに蓄積される１フレーム分の蛍光信号Ｉｓを読み出し、それを表示用メモリ２２４の所定領域へ書き込むことにより、モニタ２３に対し観察層１０ｓの画像を表示することができる。また、ＣＰＵ２２１は、スキャン時にフレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蓄積される蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを読み出し、両者の和からなる和信号（Ｉｓ＋Ｉｍ）を生成し、それを表示用メモリ２２４の所定領域へ書き込むことにより、モニタ２３に対し、観察層１０ｓと両側の層１０ｍとの双方からなる全体層の画像を表示することができる。すなわち、ＣＰＵ２２１は、蛍光信号Ｉｓが示すセクショニング幅の狭い画像と、和信号（Ｉｓ＋Ｉｍ）が示すセクショニング幅の狭い画像とを表示することができる。

また、ここでは詳しく説明しないが、ＣＰＵ２２１は、重み付け和からなる和信号（Ｉｓ＋αＩｍ）が示す画像を表示し、かつその係数αを−１〜＋１の間で滑らかに変化させることにより、セクショニング幅を滑らかに変化させることもできる。

また、ＣＰＵ２２１は、スキャンで取得された画像をハードディスクドライブ２２３へ保存することもできる。この際、蛍光信号Ｉｓが示す画像と、蛍光信号Ｉｍが示す画像とは個別に保存されることが望ましい。個別に保存しておけば、セクショニング幅の異なる様々な画像を任意のタイミングで任意の回数だけ生成することができるからである。

ここで、蛍光信号Ｉｓのレベルと、試料１０中のＺ位置との関係（感度特性）を示すと、図６の太曲線のようになる。蛍光信号Ｉｓは、観察層（Ｚ＝−０．３〜＋０．３）から射出された蛍光の信号を多く含んでいることが分かる。なお、図６の横軸においてＺ＝０が対物レンズ１６の焦点面を示している（他の図も同様）。

また、蛍光信号Ｉｍのレベルと、試料１０中のＺ位置との関係（感度特性）を示すと、図６の細曲線のようになる。蛍光信号Ｉｍは、観察層の両側の層（Ｚ＝−０．５の近傍、及びＺ＝＋０．５の近傍）から射出された蛍光の信号を多く含んでいることが分かる。

さらに、蛍光信号Ｉｓと蛍光信号Ｉｍとの比信号Ｉｓ／Ｉｍを考える。比信号Ｉｓ／Ｉｍの値は、試料１０中のＺ位置によって異なり、図７の曲線のようになる。従って、比信号Ｉｓ／Ｉｍの値は、観察層（Ｚ＝−０．３〜＋０．３）内であっても蛍光を射出する位置が僅かでも異なると、位置に応じて異なる。また、比信号Ｉｓ／Ｉｍの値は、観察層近傍での位置の変化には敏感に反応するが、観察層から外れた面での位置の変化には殆ど反応しない。本実施形態のＣＰＵ２２１は、この現象を利用する。

図８は、ＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。

ステップＳ１１：ＣＰＵ２２１は、ユーザから観察開始指示が入力されたか否かを判別する。入力された場合にはステップＳ１２へ進む。

ステップＳ１２：ＣＰＵ２２１は、フレーム番号ｎを初期値「１」に設定する。

ステップＳ１３：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０へスキャン指示を与える。これによって第ｎフレームのスキャンが開始され、フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍがそれぞれ蓄積され始める。

ステップＳ１４：ＣＰＵ２２１は、フレームメモリ２２０ｓ，２２０ｍに蓄積される蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍを読み出す。本ステップでは、蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍが１ラインだけ読み出されるものとする。

ステップＳ１５：ＣＰＵ２２１は、読み出された１ライン分の蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍから、１ライン分の比信号Ｉを生成する。各画素の比信号Ｉは、その画素と共通の画素番号を持つ蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍにより、Ｉ＝Ｉｓ／Ｉｍで表される。

ステップＳ１６：ＣＰＵ２２１は、生成した１ライン分の比信号Ｉの各々を色相信号Ｉ’＝（Ｃｂ，Ｃｒ）へと変換する。このとき、例えば、図９に示すような入出力特性のルックアップテーブルが使用される。このルックアップテーブルによると、値の大きな比信号Ｉほど赤に近い色の色相信号Ｉ’に変換され、値の小さな比信号Ｉほど青に近い色の色相信号Ｉ’へと変換される。

この場合、色相信号Ｉ’と、試料１０中のＺ位置との関係は、図１０に示すとおりになる。すなわち、色相信号Ｉ’は、観察層の中で焦点面に近い面からの蛍光を赤に近い色で表し、観察層の中で焦点面から離れた面からの蛍光を青に近い色で表し、観察層から外れた面からの蛍光を青色で表す。

ステップＳ１７：ＣＰＵ２２１は、１ライン分の色相信号Ｉ’と、１ライン分の蛍光信号Ｉｓとに基づき、１ライン分の色信号Ｉ”＝（Ｙ，Ｃｂ，Ｃｒ）を生成する。各画素の色信号Ｉ”のＣｂ成分及びＣｒ成分には、その画素と共通の画素番号を持つ色相信号Ｉ’のＣｂ成分及びＣｒ成分の値が付与され、各画素の色信号Ｉ”のＹ成分には、その画素と共通の画素番号を持つ蛍光信号Ｉｓの値が付与される。

ステップＳ１８：ＣＰＵ２２１は、１ライン分の色信号Ｉ”を、表示用メモリ２２４の第ｎ領域のうち、そのラインに対応するアドレスに書き込む。第ｎ領域とは、第ｎフレームのスキャンで取得された画像に割り当てられた領域のことである。

ステップＳ１９：ＣＰＵ２２１は、制御回路２１０からの終了信号の有無により、第ｎフレームのスキャンが終了したか否かを判別する。終了していない場合はステップＳ１４へ戻って次のラインに関する処理を開始し、終了した場合はステップＳ２０へ進む。

ステップＳ２０：ＣＰＵ２２１は、ユーザの指定した観察期間が終了したか否かを判別し、終了していない場合はステップＳ２１へ進み、終了した場合はフローを終了する。

ステップＳ２１：ＣＰＵ２２１はフレーム番号ｎをインクリメントすると共に、前回のスキャン開始タイミングからユーザの指定したインターバル期間が確保されるまで待機する。その後、ステップＳ１３へ戻り次のフレームに関する処理を開始する。

以上のＣＰＵ２２１の動作によると、モニタ２３には、例えば図１１（Ａ）に示すとおり、色信号Ｉ”が示す複数のカラー画像がフレーム順に表示される。

表示されたカラー画像のパターンは、観察層に存在する物体のＸＹ方向の分布を表している。また、そのカラー画像の明るさは、観察層に存在する物体の蛍光強度（Ｉ”のＹ成分）を表している。そして、そのカラー画像の色相は、観察層に存在する物体の焦点面からの距離（Ｉ”のＣｂ成分及びＣｒ成分）を表している。

例えば、図１１（Ａ）において、カラー画像内の左側に位置する物体の色相に着目すると、その物体の色相は赤のまま不変なので、ユーザは、その物体が観察層の焦点面近傍に位置したままＺ方向に変位しなかったと推測すればよい。

また、図１１（Ａ）において、カラー画像内の中央に位置する物体の色相に着目すると、その物体の色相は、観察期間中に「赤→赤→赤→緑→青」の順に変化しているので、ユーザは、その物体が観察期間の最初は観察層の焦点面近傍に位置していたものの第４フレームの前後で焦点面から遠ざかる方向へ変位し、さらに第５フレームの前後で観察層から外れたと推測すればよい。

また、図１１（Ａ）において、カラー画像内の右側に位置する物体の色相に着目すると、その物体の色相は「赤→赤→赤→青→青」の順に変化しているので、ユーザは、その物体が観察期間の最初は観察層の焦点面近傍に位置していたものの第４フレームの前後で観察層から外れたと推測すればよい。

また、図１１（Ａ）において、カラー画像内の各物体の明るさに着目すると、その物体の明るさは観察期間中に「明→暗→暗→暗→暗」の順に変化しているので、ユーザは、各物体の蛍光強度が第２フレームの前後で低下したと推測すればよい。各物体は第２フレーム前後で観察層からＺ方向に変位していないので、この現象は、蛍光物質の「退色」と呼ばれる現象である。

このようにして推測された物体のＺ方向の変位の様子を可視化すると、図１１（Ｂ）のとおりになる。但し、変位の方向が上方向であったのか（点線部）、それとも下方向であったのか（実線部）については未知である。よって、方向については、ユーザが別の情報から推測することになる。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、Ｚ−スタック撮影を行わないにも拘わらず、物体のＺ方向の動きの有無を検出することができる。しかも、図１０に示すとおり、色相信号Ｉ’は物体の観察層内（すなわち対物レンズの焦点深度内）の微少な変位に感応するので、共焦点顕微鏡装置が検出できるのは、極めて微少な動きである。

また、色相信号Ｉ’は、物体の焦点面からの変位量によって異なる色相を示すので、ユーザは、モニタ２３に表示されたカラー画像の色相によって、物体の焦点面からの変位量を知ることができる。

なお、本実施形態のＣＰＵ２２１は、色相信号Ｉ’を生成するに当たり比信号Ｉ＝Ｉｓ／Ｉｍを使用したが、差信号Ｉ＝Ｉｓ−Ｉｍを使用してもよい。要するに、蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍの差異を示す信号を使用すれば、上述した効果と略同じ効果を得ることができる。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、カラー画像の生成及び表示を観察期間中にリアルタイムで行ったが、カラー画像の生成及び表示を観察期間の終了後に行ってもよい。或いは、その表示のみを観察期間の終了後に行ってもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、生成されたカラー画像をユーザからの保存指示などに応じてハードディスクドライブ２２３へ保存してもよい。その際には、色信号Ｉ”が示すカラー画像と、蛍光信号Ｉｓが示すモノクロ画像と、蛍光信号Ｉｍが示すモノクロ画像とがフレーム毎に対応づけられることが望ましい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、各フレームのカラー画像をフレーム順に連結して動画像を作成してもよい。

また、本実施形態のＣＰＵ２２１は、物体の焦点面からの変位量を、物体の蛍光強度とと共に、１枚の画像の成分（色相成分及び輝度成分）に反映させたが、物体の焦点面からの変位量を示す画像を、物体の蛍光強度を示す画像とは別に生成してもよい。

［第２実施形態］
本発明の共焦点顕微鏡の第２実施形態を説明する。ここでは、第１実施形態との相違点のみ説明する。相違点は、ＣＰＵ２２１の動作にある。

図１２は、本実施形態のＣＰＵ２２１の動作フローチャートである。図８に示したフローチャートとの相違点は、ステップＳ１５，Ｓ１６，Ｓ１７に代えてステップＳ２５が実行される点にある。以下、ステップＳ２５を説明する。

ステップ２５：ＣＰＵ２２１は、１ライン分の蛍光信号Ｉｓ，Ｉｍに基づき、１ライン分の色信号Ｉ”＝（Ｒ，Ｂ）を生成する。この色信号Ｉ”は、Ｒ色成分及びＢ色成分のみからなる２色カラーの色信号である。各画素の色信号Ｉ”のＲ色成分には、その画素と共通の画素番号を持つ蛍光信号Ｉｓの値が付与され、各画素の色信号Ｉ”のＢ色成分には、その画素と共通の画素番号を持つ蛍光信号Ｉｍの値が付与される。

この場合、モニタ２３に表示されるカラー画像は２色カラーとなるが、そのカラー画像上に存在する物体の明るさは、その物体の蛍光強度を表し、そのカラー画像上に存在する物体の色相は、その物体の焦点面からの距離を表すことになる。本実施形態の共焦点顕微鏡装置のユーザは、カラー画像上で物体の色相が赤色に近かった場合にはその物体が焦点面近くに位置しており、カラー画像上で物体の色相が青色に近かった場合にはその物体が焦点面から離れていると推測すればよい。

したがって、本実施形態の共焦点顕微鏡装置は、カラー画像の生成を簡単な演算により行いながらも、第１実施形態の共焦点顕微鏡装置と近い効果を得ることができる。

Claims (8)

1. 光源と、
   前記光源からの光を試料に集光するとともに走査する照明光学系と、
   前記試料からの光を集光する集光光学系と、
   前記集光光学系の集光位置に配置され、入射する光を少なくとも前記試料の前記集光点の近傍からの光と、その周辺からの光とに分離し、それぞれ検出する検出手段と、
   前記検出手段から出力される前記集光点の近傍からの光の信号と前記周辺からの光の信号とを演算処理して前記試料の画像を生成する画像生成手段と
   を備えた共焦点顕微鏡装置であって、
   前記画像生成手段は、
   前記照明光学系の前記試料への光軸方向の集光位置を変えないで前記試料の所望領域を包含するように複数回走査することにより生成した複数の画像のそれぞれについて、前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との差異を算出する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記差異を前記画像にそれぞれ反映させる
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記差異を前記画像にそれぞれ反映させることは、前記差異を可視化するためのカラー画像表示により行う
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
4. 請求項１に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   前記差異の前記複数の画像間における変化量を算出する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
5. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記差異は、
   前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との比である
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
6. 請求項１〜請求項４の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記差異は、
   前記近傍からの光の信号強度と前記周辺からの光の信号強度との差である
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
7. 請求項１〜請求項６の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記画像生成手段は、
   算出した前記差異を記憶する記憶手段を有する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
8. 請求項７に記載の共焦点顕微鏡装置において、
   前記記憶手段は、
   前記差異を前記画像に対応付けて記憶する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
   

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