JP7369801B2 - 顕微鏡システム、設定探索方法、及び、プログラム - Google Patents

Description

本開示は、顕微鏡システム、球面収差が補正される設定を探索する設定探索方法、及び、プログラムに関する。

従来から、顕微鏡システムの補正環は、カバーガラスの厚さに起因する球面収差を補正する手段として用いられている。サンプル（例えば、生体試料）の深部を観察する手法が開発された近年では、補正環は、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を補正する目的にも使用されている。このような技術は、例えば、特許文献１から特許文献３に記載されている。

また、サンプル内部で発生する球面収差量は、サンプルの屈折率分布に依存する。このため、球面収差が補正される補正環の位置を知ることができれば、サンプルの屈折率を逆算することが可能である。このような技術は、例えば、特許文献２、特許文献３に記載されている。

球面収差が補正されているか否かの判定は、特許文献１から特許文献３に記載されるように、画像のコントラストを評価した評価値（以降、コントラスト値と記す）に基づいて行うことができる。これは、球面収差が補正された状態では、球面収差が補正されていない状態に比べて、コントラストの高い画像が得られるためである。

特開２０１４－１６０２１３号公報 特開２０１７－０２６６６４号公報 特開２０１７－０２６６６５号公報

ところで、球面収差が補正されているか否かを正確に判定するためには、Ｓ／Ｎ比が高い画像を用いてコントラスト値を算出することが望ましい。Ｓ／Ｎ比が低い画像では、球面収差量とは無関係なノイズの影響が相対的に大きくなり、球面収差に起因するコントラストの変化を正確に把握することが難しいからである。Ｓ／Ｎ比が高い画像は、例えば、照明光の強度を強くして、画像のシグナル成分をノイズ成分に対して大きくすることによって取得可能である。

しかしながら、照明光の強度が強くなりすぎると、画像に含まれる飽和画素の割合が増加してしまう。コントラスト値は、飽和画素の割合が増加すると、実際よりも低く算出されてしまうことがあり、その結果、不正確な位置を球面収差が補正される補正環の位置として認識してしまうことがある。また、球面収差が補正される補正環の最適位置が決まっていない状態で照明光の強度を調整しても、補正環調整を行う過程で補正環の設定を変更することによって、さらに明るさが変化してしまい、その結果、飽和画素の割合が増加してしまうことがある。つまり、補正環調整を開始する前に照明光の強度を適正に調整した場合であっても、同様の問題は生じ得る。

以上では、補正環を例に説明したが、補正環に限らず、球面収差を補正する補正装置であれば、同様の技術的な課題が生じ得る。

以上のような実情を踏まえ、本開示の一つの目的は、飽和画素が生じた場合であっても球面収差が補正される設定を精度良く特定する技術を提供することである。

本発明の一態様に係る顕微鏡システムは、球面収差補正装置を有し、前記球面収差補正装置の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得する顕微鏡装置と、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する演算装置と、を備え、前記演算装置は、前記複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像データに対 して共通して定義された第１の位置として特定し、前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数のコントラスト値の各々を算出する。

本発明の一実施形態に係る設定探索方法は、球面収差が補正される設定を探索する設定探索方法であって、球面収差補正装置の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得し、前記複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像デー タに対して共通して定義された第１の位置として特定し、前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する。

本発明の一実施形態に係るプログラムは、コンピュータに、球面収差補正装置の設定が異なる状態で取得した複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像データに対して共通して定義 された第１の位置として特定し、前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する、処理を実行させる。

本開示によれば、飽和画素が生じた場合であっても球面収差が補正される設定を精度良く特定することができる。

第１の実施形態に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。 図１に示す演算装置の構成を例示した図である。 図１に示す顕微鏡装置の構成を例示した図である。 第１の実施形態に係る補正環設定処理のフローチャートである。 飽和画素位置特定処理のフローチャートである。 コントラスト算出処理のフローチャートである。 従来のコントラスト値の算出方法を説明するための図である。 第１の実施形態におけるコントラスト値の算出方法の一例を説明するための図である。 第１の実施形態におけるコントラスト値の算出方法の別の例を説明するための図である。 第２の実施形態に係る補正環設定処理のフローチャートである。 図１０に示す補正環設定処理の変形例のフローチャートである。 第３の実施形態に係る関係算出処理のフローチャートである。 補正環の設定と観察深さの関係の算出方法の一例を説明するための図である。 第３の実施形態に係るＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影処理のフローチャートである。 第４の実施形態に係る屈折率表示処理のフローチャートである。 屈折率の表示方法の一例を説明するための図である。 屈折率の表示方法の一例を説明するための別の図である。 コントラスト値の算出方法の更に別の例を説明するための図である。

［第１の実施形態］
図１は、本実施形態に係る顕微鏡システム１の構成を例示した図である。図２は、図１に示す演算装置２０の構成を例示した図である。図３は、図１に示す顕微鏡１００の構成を例示した図である。

図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡１００と、顕微鏡制御装置１０と、演算装置２０と、表示装置３０と、演算装置２０への指示を入力するための複数の入力装置（キーボード４０、補正環操作装置５０、焦準操作装置６０）を備えている。なお、以降では、顕微鏡１００と顕微鏡制御装置１０を顕微鏡装置と総称する。

顕微鏡制御装置１０は、演算装置２０からの指示に従って顕微鏡１００の動作を制御する装置であり、顕微鏡１００の各種電動部の動作を制御する制御信号を生成する。また、顕微鏡１００からの信号に基づいて画像データを生成する。顕微鏡制御装置１０は、光源の出力を制御する光源制御装置１１と、ズーム倍率を制御するズーム制御装置１２と、観察対象面の光軸方向の位置（以降、単に、観察対象面の位置と記す）を制御する焦準制御装置１３と、補正環１１１の設定を制御する補正環制御装置１４と、を備えている。なお、補正環１１１は、球面収差を補正する球面収差補正装置の一例であり、補正環制御装置１４は、補正制御装置の一例である。補正環１１１の設定は、例えば、基準位置に対する補正環１１１の回転角度（以降、単に、補正環１１１の角度と記す）のことである。

演算装置２０は、各種の演算処理を行うコンピュータであり、例えば、図２に示すように、プロセッサ２１、メモリ２２、入力Ｉ／Ｆ装置２３、出力Ｉ／Ｆ装置２４、可搬記録媒体２６が挿入される可搬記録媒体駆動装置２５を備え、これらがバス２７によって相互に接続されている。なお、図２は、演算装置２０の構成の一例であり、演算装置２０はこの構成に限定されるものではない。

プロセッサ２１は、１つ以上のプロセッサを含んでいる。１つ以上のプロセッサは、例えば、中央処理装置（ＣＰＵ：Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＤＳＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）などを含んでもよい。また、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ－Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｇａｔｅ Ａｒｒａｙ）などを含んでもよい。プロセッサ２１は、例えば、所定のソフトウェアプログラムを実行して演算処理を行ってもよい。

メモリ２２は、プロセッサ２１が実行するソフトウェアプログラムを格納した、非一時的なコンピュータ可読媒体を含んでいる。メモリ２２は、例えば、１つ又は複数の任意の半導体メモリを含んでもよく、さらに、１つ又は複数のその他の記憶装置を含んでもよい。半導体メモリは、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などの揮発性メモリ、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、プログラマブルＲＯＭ、フラッシュメモリなどの不揮発性メモリを含んでいる。ＲＡＭには、例えば、ＤＲＡＭ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＳＲＡＭ（Ｓｔａｔｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などが含まれてもよい。その他の記憶装置には、例えば磁気ディスクを含む磁気記憶装置、例えば光ディスクを含む光学記憶装置などが含まれてもよい。

入力Ｉ／Ｆ装置２３は、キーボード４０、補正環操作装置５０、焦準操作装置６０、及び表示装置３０からの信号を受信する。また、入力Ｉ／Ｆ装置２３は、顕微鏡１００からの信号も受信する。出力Ｉ／Ｆ装置２４は、表示装置３０及び顕微鏡制御装置１０へ信号を出力する。可搬記録媒体駆動装置２５は、可搬記録媒体２６を収容するものである。

演算装置２０は、メモリ２２または可搬記録媒体２６に格納されているプログラムをプロセッサ２１がメモリ２２に読み出して実行することで、様々な手段として動作する。演算装置２０は、例えば、画像データのコントラスト値を算出する手段（コントラスト算出手段）、球面収差が補正される補正環１１１の設定を算出する手段（目標値算出手段）、サンプルＳの屈折率を算出する手段（屈折率算出手段）、及び、表示装置３０を制御する手段（表示制御手段）として動作する。

表示装置３０は、例えば、液晶ディスプレイ装置、有機ＥＬディスプレイ装置、ＣＲＴディスプレイ装置などである。なお、表示装置３０は、タッチパネルセンサを備えてもよく、その場合、入力装置としても機能する。

補正環操作装置５０は、補正環１１１の設定を指示するための入力手段である。利用者が補正環操作装置５０で補正環１１１の設定を指示すると、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定を指示された設定に変更する。

焦準操作装置６０は、観察対象面の位置（即ち、観察深さ）の変更を指示するための入力手段である。利用者が焦準操作装置６０を用いて観察対象面の位置の変更を指示すると、焦準制御装置１３は、焦準装置１０９を光軸方向に移動させて観察対象面の位置を変更する。

顕微鏡１００は、例えば、２光子励起顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料であるが、生体試料に限らない。顕微鏡１００は、図３に示すように、照明光路上に、レーザー１０１と、走査ユニット１０２と、瞳投影光学系１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、対物レンズ１１０とを備えている。

レーザー１０１は、例えば、超短パルスレーザーであり、近赤外域のレーザー光を発振する。レーザー１０１の出力は、光源制御装置１１によって制御される。即ち、光源制御装置１１は、サンプルに照射するレーザー光の出力を制御するレーザー制御装置である。

走査ユニット１０２は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナとレゾナントスキャナを含んでいる。走査ユニット１０２の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット１０２の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。

瞳投影光学系１０３は、走査ユニット１０２の像を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。ダイクロイックミラー１０５は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によってレーザー光と蛍光を分離する。

対物レンズ１１０は、補正環１１１を備えた乾燥系又は液浸系の対物レンズであり、焦準装置１０９に装着されている。焦準装置１０９は、対物レンズ１１０を対物レンズ１１０の光軸方向に移動させる手段であり、焦準装置１０９の移動（即ち、対物レンズ１１０の移動）は、焦準制御装置１３によって制御される。

補正環１１１は、その設定に応じて対物レンズ１１０を構成するレンズの一部を光軸方向に動かして、球面収差を補正する補正装置である。補正環１１１の設定は、補正環制御装置１４（補正装置制御装置）によって変更される。なお、補正環１１１の設定は、補正環１１１を直接操作することで、手動で変更することもできる。

顕微鏡１００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー１０５の反射光路）上に、瞳投影光学系１０６と、光検出器１０７とを備えている。光検出器１０７から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０８に出力される。

瞳投影光学系１０６は、対物レンズ１１０の瞳の像を光検出器１０７に投影する光学系である。光検出器１０７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器１０８は、光検出器１０７からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、顕微鏡制御装置１０に出力する。光検出器１０７の感度は、図示しない検出感度制御装置によって制御される。なお、検出感度制御は、例えば、光検出器１０７に印加する印加電圧の調整、光検出器１０７から出力されるアナログ信号の増幅率調整、デジタル信号の段階での増幅率調整のいずれか、または、それらの組合せにより行われる。

以上のように構成された顕微鏡システム１では、顕微鏡１００は、走査ユニット１０２を用いてレーザー光で対物レンズ１１０の光軸と直交する方向にサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器１０７で検出する。顕微鏡制御装置１０は、走査ユニット１０２の走査タイミングに合わせてＡ／Ｄ変換器１０８でサンプリングされたアナログ信号に基づいて、画像データを生成し、演算装置２０へ出力する。即ち、画像データは、顕微鏡１００と顕微鏡制御装置１０を含む顕微鏡装置によって取得される。

図４は、第１の実施形態に係る補正環設定処理のフローチャートである。図５は、飽和画素位置特定処理のフローチャートである。図６は、コントラスト算出処理のフローチャートである。以下、図４から図６を参照しながら、観察対象面において生じる球面収差を補正するために、顕微鏡システム１で行われる補正環設定処理について説明する。なお、図４に示す補正環設定処理は、球面収差が補正される設定を探索する設定探索方法の一例であり、例えば、利用者が焦準操作装置６０を操作して観察対象面の位置を指定することによって開始される。

まず最初に、顕微鏡システム１は、サンプルＳ内のコントラスト評価の対象とすべき範囲（以降、注目領域と記す）の指定を受け付ける（ステップＳ１）。観察者による注目領域の指定は、例えば、観察者が表示装置３０に表示されたサンプルＳのライブ画像を見ながら、より良好に観察すべき部分（例えば、サンプルＳ内の特徴的な形状を有する部分）が含まれるようにキーボード４０などの入力装置を用いることによって行なわれる。なお、画像全体でコントラストを評価する場合には、ステップＳ１は省略してもよい。

次に、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定を初期設定に変更する（ステップＳ２）。ここでは、演算装置２０は、補正環制御装置１４を制御して、補正環１１１の角度を、例えば、可動範囲の一端の角度に設定する。

その後、顕微鏡システム１は、画像データを取得し（ステップＳ３）、予め決められた全ての補正環１１１の設定で画像データが取得されたか否かを判定する（ステップＳ４）。全ての補正環１１１の設定で画像データが取得されていないと判定すると（ステップＳ４ＮＯ）、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定を変更し（ステップＳ５）、ステップＳ３に戻って再び画像データを取得する。これにより、顕微鏡システム１は、予め決められた全ての補正環１１１の設定で画像データが取得されるまで（ステップＳ４ＹＥＳ）、画像データの取得（ステップＳ３）と補正環１１１の設定変更（ステップＳ５）を繰り返す。ここでは、演算装置２０は、補正環制御装置１４を制御して、補正環１１１の角度を、可動範囲の一端である初期位置から所定角度ずつ動かすことで、可動範囲の他端まで動かす。補正環制御装置１４のこのような一連の制御動作中に、顕微鏡制御装置１０が補正環１１１の各角度で画像データを取得して演算装置２０へ出力することで、演算装置２０は、同一の観察対象面に対して、複数の画像データを取得する。即ち、ステップＳ３からステップＳ５では、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得し、演算装置２０へ出力する。なお、演算装置２０は、顕微鏡装置から取得した複数の画像データを、メモリ２２へ格納する。

複数の画像データを取得すると、顕微鏡システム１は、画像データに含まれる飽和画素の位置を特定する（ステップＳ６）。ここでは、演算装置２０は、例えば、図５に示す飽和画素位置特定処理を開始し、複数の画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置を第１の位置として特定する。

具体的には、演算装置２０は、メモリ２２に格納された複数の画像データから１つの画像データを読み出して（ステップＳ１１）、読み出した画像データに画素値が飽和した画素データが含まれているか否かを判定する（ステップＳ１２）。そして、画素値が飽和した画素データが含まれている場合には、その画素データの画素（以降、飽和画素と記す）の位置を第１の位置として記憶する（ステップＳ１３）。演算装置２０は、ステップＳ１１からステップＳ１３の処理を、メモリ２２に格納された複数の画像データの全てに対して行い（ステップＳ１４ＹＥＳ）、図５に示す飽和画素位置特定処理を終了する。

飽和画素位置特定処理が終了すると、顕微鏡システム１は、複数の画像データの各々のコントラスト値を算出する（ステップＳ７）。ここでは、演算装置２０は、例えば、図６に示すコントラスト算出処理を開始し、複数の画像データから複数のコントラスト値を算出する。

具体的には、演算装置２０は、飽和画素の位置である第１の位置をメモリ２２から読み出す（ステップＳ２１）。さらに、演算装置２０は、メモリ２２に格納された複数の画像データから１つの画像データを読み出して（ステップＳ２２）、読み出した画像データのコントラスト値を、画像データと第１の位置とを用いて算出する（ステップＳ２３）。なお、コントラスト値の算出方法の詳細については後述する。演算装置２０は、ステップＳ２２及びステップＳ２３の処理を、メモリ２２に格納された複数の画像データの全てに対して行い（ステップＳ２４ＹＥＳ）、図６に示すコントラスト算出処理を終了する。

コントラスト算出処理が終了し、複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値が算出されると、顕微鏡システム１は、球面収差が補正される設定を目標設定として特定する（ステップＳ８）。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ７で算出した複数のコントラスト値に基づいて、球面収差が補正される補正環１１１の設定、つまり、補正環１１１の角度、を特定する。より具体的には、演算装置２０は、例えば、複数のコントラスト値のうちの最大のコントラスト値を特定し、その最大のコントラスト値を有する画像データを取得したときの補正環１１１の角度を目標設定として特定してもよい。また、複数のコントラスト値とそれらに対応する補正環１１１の角度との組み合わせからコントラスト値が最大になる補正環１１１の角度を推定して、推定した角度を目標設定として特定してもよい。

最後に、顕微鏡システム１は、目標設定に補正環１１１の設定を変更し（ステップＳ９）、補正環設定処理を終了する。ここでは、補正環制御装置１４は、演算装置２０の指示に従って、ステップＳ８で特定された設定に、補正環１１１の設定を変更する。これにより、球面収差が補正されるため、良好な画質でサンプルＳを観察することができる。

図７は、従来のコントラスト値の算出方法を説明するための図である。図８は、本実施形態におけるコントラスト値の算出方法の一例を説明するための図である。以下、図７及び図８を参照しながら、顕微鏡システム１が行うコントラスト算出方法について、従来のコントラスト算出方法と異なる点を中心に説明する。

画像のコントラストを評価する評価式の一つに、画素間での画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式が知られている。具体的な評価式としては、例えば、ｘ方向にｎ画素分ずれた位置にある２つの画素の画素値の差分の２乗を、画像データ全体で積算してコントラスト値を算出する下式が知られている。下式は、Ｊ．Ｆ．Ｂｒｅｎｎｅｒらによって提案された評価式であり、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔと呼ばれている。

ここで、Ｆ_{Ｂｒｅｎｎｅｒ}はコントラスト値であり、ｘは画像を構成する画素の列を特定する変数であり、ｙは画像を構成する画素の行を特定する変数である。Ｗは画像を構成する画素のｘ方向の画素数（即ち、列数）であり、Ｈは画像を構成する画素のｙ方向の画素数（即ち、行数）である。ｆは特定された画素に対応する画素データの画素値である。ｎはシフト量であり、画素値の差分が算出される画素間の間隔を示す整数（例えば、２など）である。

Ｂｒｅｎｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔのような、画素間での画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式は、画像データに含まれる最大画素値と最小画素値から画像のコントラストを評価する評価式よりも、画像に生じるコントラスト変化を詳細に捉えることができる。このため、球面収差の補正状態の評価に好適である。

その一方で、Ｓ／Ｎ比を稼ぐために照明強度が強い状態で画像を取得した場合、図７に示すように、球面収差が補正されて画像が明るくなるにつれて飽和画素の画素数が増加することがあり、Ｂｒｅｎｎｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔを用いた従来のコントラスト算出方法では、目標設定を誤ってしまうことがある。これは、飽和画素の数が増加すると、例えば、飽和画素間での画素値の差分が０になるなど、飽和画素を含む画素間での画素値の差分が実際よりも小さく見積もられてしまい、その結果として、算出されるコントラスト値が実際のコントラスト値に対して下振れしてしまうからである。

図７には、補正環１１１の角度θが０°、１０°、２０°の状態で取得した画像データに含まれる画素データが模式的に描かれている。なお、図７では、説明を簡略化するため、１行６列に並んだ画素からなる画像が描かれているが、画像を構成する画素の行数及び列数はこの例に限らない。この例では、画像データ間で画素データを比較すると、角度θを大きくするにつれて画素値が増加する傾向を確認することができるため、角度θが２０°のときに最も球面収差が補正された状態にあると考えられる。しかしながら、算出されたコントラスト値としては、角度θ＝２０°のときよりも角度θ＝１０°のときの方が大きな値となるため、演算装置２０は、角度θ＝１０°を目標設定として誤認してしまう。

このように、球面収差の変動に伴うコントラストの変化を精度よく検出するために明るさを調整してＳ／Ｎ比を高めると、従来の算出方法では、却って目標設定を誤ってしまうことが起こり得る。

そこで、本願では、画像データに含まれる画素データの一部を除外して画像を比較したとしても、画像間の明るさの関係に大きな影響はないという点に着目して、上記の課題を解決する技術を提案する。

具体的には、演算装置２０は、図６のステップＳ２３において、ステップＳ２２で読み出した画像データに含まれる第１の位置の画素データを、その読み出した画像データのコントラスト値を算出する計算から除外する。即ち、画像データに含まれる第１の位置の画素データを除いて、画像データのコントラスト値を算出する。より具体的には、図８に示すように、複数の画像データの各々のコントラスト値を算出する場合に、複数の画像データの少なくとも一つで画素値が飽和している画素データの位置（第１の位置）を特定し、その第１の位置に対応する画素データについては、その対応する画素データの画素値が飽和しているか否かにかかわらず、各画像データのコントラスト値の計算から除外する。なお、画素間での画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いる点については、顕微鏡システム１が行うコントラスト算出方法は、従来のコントラスト算出方法と同様である。

図８を参照しながらさらに詳細に説明する。図８には、図７と同様に、補正環１１１の角度θが０°、１０°、２０°の状態で取得した画像データに含まれる画素データが模式的に描かれている。この例では、画像データは８ビット画像データであり、角度θ＝２０°で取得した画像の左から３番目と４番目の画素において画素値が飽和している。このため、演算装置２０は、ステップＳ２３では、全ての画像データの左から３番目と４番目の画素データを除いて、画像データのコントラスト値を算出する。より詳細には、全ての画像（角度θ＝０°、１０°、２０°で取得した画像）に対して、左から３番目と４番目の画素の少なくとも一方を含む画素間（具体的には、左から２番目と３番目、３番目と４番目、４番目と５番目）での画素値の差分を、コントラスト値算出のための積算対象から除外して、コントラスト値を算出する。

これにより、飽和画素を含むことによって生じる画素間の差分の不正確さを排除することができる。さらに、一部の画素の存在を無視してコントラスト値を計算しても、複数の画像の各々で等しく無視している限り、図８のコントラスト値の関係によって示されるように、複数の画像のコントラストの相対的な関係は一般に維持される。このため、飽和画素が含まれている場合であっても、複数の画像間のコントラストを正しく比較して評価することができる。従って、顕微鏡システム１によれば、飽和画素が生じた場合であっても球面収差が補正される設定を精度良く特定することができる。

また、顕微鏡システム１によれば、飽和画素が生じた場合でも球面収差を適切に補正することができるため、図４に示す目標設定を探索する処理を開始する前に行われる、光源の出力調整や検出器の感度調整といった明るさ調整が容易になる。つまり、利用者は、飽和画素の発生を過度に心配することなく、良好なＳ／Ｎ比を得るための明るさ調整を行うことができる。また、球面収差を調整する過程で、補正環の設定を変えることによって新たに飽和画素が生じた場合であっても、球面収差が補正される設定を精度良く特定することができる。

以上では、飽和画素の位置を第１の位置として特定し、第１の位置の画素の画素データを除いて各画像データのコントラスト値を算出する例を示したが、演算装置２０は、さらに他の画素データを計算から除外してもよい。具体的には、演算装置２０は、同一の観察対象面に対して取得された複数の画像データに含まれている画素値が閾値未満の画素データの位置を、第２の位置として特定し、それらの複数の画像データの各々に含まれる第１の位置と第２の位置の画素データを除いて、複数のコントラスト値の各々を算出してもよい。この点は、以降の実施形態においても同様である。なお、この閾値は、例えば、光が入射していない状態で光検出器から出力される信号に対応する画素値（以降、バックグラウンド輝度と記す）を基準に決定することが望ましい。

バックグラウンド輝度を基準にして決定した閾値未満の画素値を有する画素データは、画像の何も映っていない部分に対応していることが想定される。このため、閾値未満の画素値を有する画素データをコントラスト値の計算から除外することで、バックグラウンドノイズの影響を抑えながら、コントラスト値を算出することができる。従って、第１の位置と第２の位置の両方を特定し、それらの位置の画素データをコントラスト値の計算から除外することで、球面収差が補正される設定をさらに精度良く特定することができる。図９を参照しながら詳細に説明すると、θ＝０°の補正環位置において、左から６番目の画素（右端の画素）の輝度値がバックグラウンド輝度（ここではバックグラウンド輝度値を１０とする）未満となっている。このため、左から５番目と６番目の画素値の差分を、全ての補正環位置（θ＝０°、θ＝１０°、θ＝２０°）で取得した画像において、コントラスト値算出のための積算対象から除外すればよい。

［第２の実施形態］
図１０は、本実施形態に係る補正環設定処理のフローチャートである。本実施形態に係る顕微鏡システム（以降、単に顕微鏡システムと記す。）は、図４に示す補正環設定処理を行う代わりに、図１０に示す補正環設定処理を行う点が、顕微鏡システム１とは異なっている。その他の点は、顕微鏡システム１と同様である。なお、図１０に示す補正環設定処理は、補正環設定処理中に自動的に光量が調整される点が、図４に示す補正環設定処理とは異なっている。

具体的には、顕微鏡システムは、まず、ステップＳ３１からステップＳ３６において、補正環１１１の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得し、複数の画像データに含まれる飽和画素位置を第１の位置として特定する。これらの処理は、図４のステップＳ１からステップＳ６の処理と同様である。

次に、顕微鏡システムは、飽和画素の割合が閾値ＴＨ１以上か否かを判定する（ステップＳ３７）。ここでは、演算装置２０は、まず、メモリ２２に記憶されている第１の位置を読み出す。その後、演算装置２０は、飽和画素の割合、つまり、画像の画素数に対する第１の位置の数の割合（＝第１の位置の数／画像の画素数）を算出する。さらに、演算装置２０は、算出した割合を閾値ＴＨ１と比較することで、上記の判定を行う。なお、閾値ＴＨ１は、例えば、０．５％などである。

ステップＳ３７の判定の結果、飽和画素の割合が閾値ＴＨ１以上であると判定されると、顕微鏡システムは、レーザー１０１から出射される光量を抑制し（ステップＳ３８）、さらに、ステップＳ３６で特定した飽和画素位置をリセットする（ステップＳ３９）。その後、顕微鏡システムは、再び、ステップＳ３２からステップＳ３７の処理を行う。これは、閾値ＴＨ１以上に飽和画素が生じていることから、照明光量が強すぎると考えられるためである。ステップＳ３８では、演算装置２０は、光源制御装置１１を制御し、光源制御装置１１は、演算装置２０からの指示に従って、複数の画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの割合（飽和画素の割合）に応じてレーザー１０１の出力を制御する。さらに具体的には、光源制御装置１１は、飽和画素の割合が閾値ＴＨ１以上の場合に、レーザー１０１の出力を低下させる。なお、レーザー１０１の出力の低下量は、特に限定しないが、例えば、予め決められた一定量である。また、飽和画素の割合が閾値ＴＨ１を超えないようなレーザー１０１の出力を推定し、推定した出力になるようにレーザー１０１の出力を低下させてもよい。なお、ステップＳ３９のリセット処理は、光量抑制前に特定された飽和画素位置が現在の光量設定における飽和画素位置と混同されることを防止する、という目的で行われる。

ステップＳ３７の判定の結果、飽和画素の割合が閾値ＴＨ１未満であると判定されると、顕微鏡システムは、複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し（ステップＳ４０）、さらに、球面収差が補正される設定を目標設定として特定する（ステップＳ４１）。最後に、顕微鏡システムは、標設定に補正環１１１の設定を変更し（ステップＳ４２）、補正環設定処理を終了する。なお、ステップＳ４０からステップＳ４２の処理は、図４のステップＳ７からステップＳ９の処理と同様である。

本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、顕微鏡システム１と同様の効果を得ることができる。なお、顕微鏡システム１において、輝度が飽和した画素の割合が高すぎる場合、コントラスト計算に使える画素が少ないため、調整の精度が低下する可能性がある。また、本実施形態では、レーザー１０１の出力が高すぎる場合に、自動的に適切な光量に調整される。この方法によれば、輝度が飽和した画素の割合を下げて、コントラスト計算に使える画素を増やすことができるので、顕微鏡システム１よりもさらに調整の精度を高めることができる。

図１１は、図１０に示す補正環設定処理の変形例のフローチャートである。図１０では、補正環１１１の全ての設定で画像を取得した後に、飽和画素の割合に基づいて光量調整の要否を判定する例を示したが、光量調整の要否の判定は任意のタイミングで行ってもよく、例えば、図１１に示すように、画像データを取得する度に光量調整の要否を判定してもよい。

図１１に示す補正環設定処理は、画像データを取得する度に飽和画素位置の特定と飽和画素の割合が閾値以上か否かの判定が行われる点（ステップＳ５４、ステップＳ５５）が、図１０に示す補正環設定処理とは異なっている。

なお、各ステップにおける処理内容は、図１０に示す補正環設定処理の対応するステップの処理内容と同様である。このため、各ステップについての詳細な説明は省略する。

変形例に係る補正環設定処理によれば、画像データを取得する度に飽和画素位置の特定と飽和画素の割合が閾値以上か否かの判定とを行うことで、光量調整が必要な状態を早期に発見することができる。このため、不適切な光量設定での画像取得回数を抑制することが可能であり、画像取得によって生じる試料への悪影響を抑制することができる。また、光量設定がより短時間で最適化されるため、設定処理に要するトータルの処理時間を短縮することができる。

本実施形態、および、本実施形態の変形例の顕微鏡システムでは、飽和した画素の割合を下げるために、レーザー光源の出力を制御（抑制）している。これに替えて、又はこれに加えて、図示しない検出感度制御装置により光検出器の感度を制御（低下）させてもよい。この場合、図１０のフローチャートのステップＳ３８、および、図１１のフローチャートのステップＳ５６のステップにおいて、「光量抑制」に替えて又は加えて、「光検出器感度抑制」を行えばよい。即ち、顕微鏡システムでは、飽和画素の割合が閾値を超えている場合には、レーザー－光源の出力と光検出器の感度の両方が制御されてもよく、どちらか一方のみが制御されてもよい。

［第３の実施形態］
第１の実施形態及び第２の実施形態には、利用者が焦準操作装置６０を操作することによって指定した観察対象面を観察するときに、複数の画像データを取得してその観察対象面における目標設定を特定する例が示されている。つまり、観察対象面を変更する度に、複数の画像データを取得してその観察対象面における目標設定を特定する例が示されている。これに対して、本実施形態では、予め観察対象面の位置（観察深さ）と目標設定の関係を特定し、その後、利用者が指定した観察対象面を観察するときに、予め特定した関係から指定した観察対象面における目標設定を特定する。つまり、観察対象面を変更する度に複数の画像データを取得することなく、任意の観察対象面における目標設定を特定する。

図１２は、本実施形態に係る関係算出処理のフローチャートである。図１３は、補正環の設定と観察深さの関係の算出方法の一例を説明するための図である。図１４は、本実施形態に係るＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影処理のフローチャートである。以下、図１２から図１４を参照しながら、サンプルＳにおける補正環１１１の設定と観察深さとの関係を算出する処理と、算出した関係を用いてＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影を行う処理について説明する。

なお、Ｚ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影とは、サンプルＳの深さ方向（つまり、対物レンズ１１０の光軸方向）に観察対象面を所定距離ずつ移動しながら二次元画像の取得を繰り返す撮影方法のことであり、サンプルの３次元情報を得るために用いられる。Ｚ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影は、Ｚスタック撮影とも呼ばれる。

利用者の指示によって、図１２に示す関係算出処理が開始されると、顕微鏡システム１は、まず、サンプルＳとステージの界面に焦点を合わせる（ステップＳ７１）。ここでは、演算装置２０は、焦準制御装置１３を制御して、焦準制御装置１３がサンプルＳとステージの界面に焦点を合わせる。このステップは、既知の任意の方法により行われ得る。このときの観察深さ（観察対象面の位置）をＤ０とし、観察深さの基準とする。

その後、顕微鏡システム１は、観察深さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ７２）。ここでは、利用者が、観察する可能性がある深さ範囲を観察深さの範囲としてキーボード４０などの入力装置を用いて入力することで、演算装置２０は、観察深さ範囲の指定を受け付ける。なお、観察深さ範囲の指定は、少なくとも観察深さ範囲の両端が指定されればよく、観察深さ範囲の両端に加えてその観察深さ内の任意の深さが指定されてもよい。即ち、ステップＳ７２では、少なくとも２つの観察深さが指定される。

次に、顕微鏡システム１は、観察対象面を最初の観察深さへ移動する（ステップＳ７３）。ここでは、演算装置２０は、焦準制御装置１３を制御して、焦準制御装置１３は、例えば、観察対象面をステップＳ７２で指定された観察深さ範囲の一端である観察深さＤ１へ移動する。

さらに、顕微鏡システム１は、ステップＳ７４からステップＳ８１において、観察深さＤ１の観察対象面における球面収差が補正される補正環１１１の設定を特定する。これらの処理は、図４のステップＳ１からステップＳ８の処理と同様である。

その後、顕微鏡システム１は、ステップＳ７２で指定された全ての観察深さで設定が特定されたか否かを判定する（ステップＳ８２）。そして、顕微鏡システム１は、設定が特定されていない観察深さがある場合には（ステップＳ８２ＮＯ）、観察対象面を次の観察深さへ移動し（ステップＳ８３）、移動後の観察対象面に対して、ステップＳ７４からステップＳ８２の処理を繰り返す。ここでは、演算装置２０は、焦準制御装置１３を制御して、焦準制御装置１３は、例えば、観察対象面をステップＳ７２で指定された観察深さ範囲の他端である観察深さＤ２へ移動する。

ステップＳ７２で指定された全ての観察深さで設定が特定されると（ステップＳ８３ＹＥＳ）、顕微鏡システム１は、球面収差が補正される設定と観察深さとの関係を算出する（ステップＳ８４）。ここでは、演算装置２０は、ステップ８２で特定された観察深さＤ１における目標設定である角度θ１と、ステップ８２で特定された観察深さＤ２における目標設定である角度θ２と、を用いて球面収差が補正される設定と観察深さとの関係を算出する。具体的には、図１３に示すように、観察深さＤ１と角度θ１によって特定されるポイントＰ１と、観察深さＤ２と角度θ２によって特定されるポイントＰ２と、を線形補間することで、破線で示す関係を算出する。なお、ここでは、２点の線形補間により、関係を算出する例を示したが、３点以上の情報から関係を算出してもよく、その場合、例えば、最小二乗法などの関数近似を用いて関係を算出してもよい。

最後に、顕微鏡システム１は、算出された関係を記憶して（ステップＳ８５）、図１２に示す関係算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、算出された関係をメモリ２２に記憶する。

関係算出処理が終了した後、サンプルＳに対する図１４に示すＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影処理が開始されると、顕微鏡システム１は、まず、Ｚ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影で撮影すべき観察深さ範囲の指定を受け付ける（ステップＳ９１）。ここでは、利用者が、例えば、観察深さの範囲をキーボード４０などの入力装置を用いて入力することで、演算装置２０は、観察深さ範囲との指定を受け付ける。演算装置２０は、さらに、観察深さ範囲内で画像データを取得する複数の観察深さを決定する。複数の観察深さは、例えば、所定間隔で分布してもよく、所定間隔は、ステップＳ９１において観察深さ範囲とともに利用者によって指定されてもよい。

観察深さ範囲が指定されて、Ｚ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影の対象となる複数の観察深さが決定されると、顕微鏡システム１は、観察対象面を最初の観察深さへ移動する（ステップＳ９２）。ここでは、演算装置２０は、焦準制御装置１３を制御して、焦準制御装置１３は、例えば、観察対象面をステップＳ９１で決定された一つの観察深さへ移動する。

さらに、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定を変更する（ステップＳ９３）。ここでは、演算装置２０は、まず、図１２に示す関係算出処理によって予め算出された関係をメモリ２２から読み出し、観察対象面の観察深さに対応する目標設定（補正環１１１の角度）を算出する。その後、補正環制御装置１４は、演算装置２０の指示に従って、算出した目標設定に、補正環１１１の設定を変更する。これにより、球面収差が補正される。

その後、顕微鏡システム１は、画像データを取得する（ステップＳ９４）。これにより、球面収差が補正された画像を得ることができる。さらに、顕微鏡システム１は、ステップＳ９１で決定した全ての観察深さで画像データを取得済みか否かを判定し（ステップＳ９５）、取得済みでなければ、観察対象面を次の観察深さへ移動する（ステップＳ９６）。そして、すべての観察深さで画像データの取得が終了すると（ステップＳ９５ＹＥＳ）、顕微鏡システム１は、図１４に示すＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影処理を終了する。

本実施形態に係る顕微鏡システムによっても、顕微鏡システム１と同様の効果を得ることができる。また、本実施形態では、予め観察深さと目標設定の関係が算出されるため、観察深さを変更する度に目標設定を探索するために複数の画像データを取得する必要がない。また、察深さと目標設定の関係も、比較的少ない数の観察深さにおける情報から補間や関数近似を用いて算出される。従って、目標設定を探索するための予備的な撮影の回数を大幅に削減することができる。このため、サンプルＳへのダメージを抑制することができる。また、球面収差を良好に補正しながらＺ－Ｓｅｒｉｅｓ撮影処理を比較的短時間で終了することが可能となる。

［第４の実施形態］
第３の実施形態では、任意の深さの観察対象面において球面収差が補正された高画質な画像を得るために目標設定と観察深さの関係を算出する例を示したが、目標設定と観察深さの関係は画像データ取得以外の目的で算出されてもよい。本実施形態では、サンプルＳの屈折率を表示するために目標設定と観察深さの関係を利用する点が、第３の実施形態とは異なっている。

図１５は、本実施形態に係る屈折率表示処理のフローチャートである。図１６及び図１７は、屈折率の表示方法の一例を説明するための図である。以下、図１５から図１７を参照しながら、目標設定と観察深さの関係を用いて屈折率を表示する処理について説明する。

図１２に示す関係算出処理が行われた後に、利用者の指示によって、図１５に示す屈折率表示処理が開始されると、顕微鏡システム１は、まず、図１２に示す関係算出処理で算出された関係を表示する（ステップＳ１０１）。ここでは、演算装置２０は、例えば、図１６に示すグラフを表示装置３０に表示させる。なお、図１６に示すグラフは、図１２に示す関係算出処理において、観察深さＤ１、Ｄ２、Ｄ３のそれぞれで複数の画像データを取得してそれぞれの深さにおける目標設定を算出した場合の例である。

その後、顕微鏡システム１は、屈折率を表示すべき観察深さの指定を受け付ける（ステップＳ１０２）。ここで、例えば、図１７に示すように、サンプルＳ中の屈折率を知りたい部分に対応する観察深さを、利用者が表示装置３０に表示されたグラフ上でカーソルＣ等を用いて選択することによって、演算装置２０が指定された観察深さを検出する。

観察深さが指定されると、顕微鏡システム１は、表示装置３０に表示されている情報、即ち、観察深さ毎に特定された球面収差が補正される補正環１１１の設定に基づいて、サンプルＳの指定された観察深さにおける屈折率を算出する。具体的には、顕微鏡システム１は、まず、深さ方向の設定変化率を算出し（ステップＳ１０３）、さらに、ステップＳ１０２で指定された観察深さにおけるサンプルＳの屈折率を算出する（ステップＳ１０４）。

なお、特許文献２、３に記載されているように、観察対象面における球面収差量の変化率（＝観察対象面の深さ変化量あたりの球面収差量の変化量）は、対物レンズ１１０とサンプルＳの間の媒質（例えば、空気や浸液）の屈折率と、その観察対象面におけるサンプルＳの屈折率に依存している。また、対物レンズが定まると補正環の設定と球面収差量の関係は既知である。ステップＳ１０４では、演算装置２０は、ステップＳ１０３で算出された設定変化率から球面収差量の変化率を算出し、さらに、球面収差量の変化率と媒質の屈折率に基づいて、観察深さにおけるサンプルＳの屈折率を算出する。

屈折率を算出すると、顕微鏡システム１は、算出した屈折率を表示する（ステップＳ１０５）。ここでは、表示装置３０は、例えば、図１７に示すように、演算装置２０が算出した屈折率を表示する。なお、図１７には、図１６に示すグラフ上に、利用者によって指定された観察深さにおけるサンプルＳの屈折率が重ねて表示された様子が示されている。

本実施形態に係る顕微鏡システムによれば、利用者は、サンプルＳの構造によらず、サンプルＳの任意の面における屈折率を容易に知ることができる。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれに限定されるものではない。顕微鏡システム、設定探索方法、及び、プログラムは、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

例えば、上述した実施形態では、コントラスト値の算出において評価式として式（１）を使用したが、評価式は画素間での画素値の差分を用いてコントラスト値の算出するものであればよく、例えば、下式を用いてもよい。

式（１）の代わりに、異なる複数のシフト量（例えば、ｎ＝１、２、３、５、１０など）を使用する式（２）を用いることで、広い空間周波数領域でコントラストを安定して評価することができる。このため、画像に含まれる周波数成分によらず、即ち、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。

また、上述した実施形態では、第１の位置の画素データを、コントラスト値を算出する計算から除外する例を示したが、例えば、図１８に示すように、飽和画素の画素データを加工してコントラスト値の算出に使用してもよい。即ち、一ライン毎に飽和画素の有無を判定し、飽和画素が存在する場合には、そのライン内における飽和画素の周囲の画素の画素データから画素値についての近似曲線を算出する。そして、画像のビット数に起因する階調制限がなかった場合の飽和画素の画素データの画素値を、算出した近似曲線に基づいて推定する。このように、コントラスト計算において画像データに含まれる画素値をそのまま使用せずに加工して使用することで、飽和に起因するコントラスト評価の精度低下を抑制することが可能となる。

１ 顕微鏡システム
１０ 顕微鏡制御装置
１１ 光源制御装置
１２ ズーム制御装置
１３ 焦準制御装置
１４ 補正環制御装置
２０ 演算装置
２１ プロセッサ
２２ メモリ
２６ 可搬記録媒体
３０ 表示装置
４０ キーボード
５０ 補正環操作装置
６０ 焦準操作装置
１００ 顕微鏡
１０１ レーザー
１０２ 走査ユニット
１０７ 光検出器
１０８ Ａ／Ｄ変換器
１０９ 焦準装置
１１０ 対物レンズ
１１１ 補正環

Claims (13)

1. 球面収差補正装置を有し、前記球面収差補正装置の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得する顕微鏡装置と、
   前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する演算装置と、を備え、
   前記演算装置は、
   前記複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像データに対して共通して定義された第１の位置として特定し、
   前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数のコントラスト値の各々を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記演算装置は、
   前記複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が閾値未満の画素データの位置の各々を前記複数の画像データに対して共通して定義された第２の位置として特定し、
   前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データと前記第２の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数のコントラスト値の各々を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
3. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記顕微鏡装置は、さらに、前記球面収差補正装置の設定を制御する補正制御装置を備え、
   前記補正制御装置は、前記球面収差補正装置の設定を前記演算装置によって特定された設定に変更する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
4. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記演算装置は、観察深さ毎に特定された球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定に基づいてサンプルの屈折率を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
5. 請求項４に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
   表示装置を含み、
   前記表示装置は、前記演算装置が算出した前記サンプルの屈折率を表示する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
6. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記顕微鏡装置は、さらに、
   光源と光源制御装置との第１組み合わせと、光検出器と検出感度制御装置との第２組み合わせの、少なくとも一方を備え、
   前記第１組み合わせを備える場合に、前記光源制御装置は、前記複数の画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの割合に応じて前記光源の出力を制御し、
   前記第２組み合わせを備える場合に、前記検出感度制御装置は、前記複数の画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの割合に応じて前記光検出器の感度を制御する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
7. 請求項６に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記光源制御装置は、前記第１組み合わせを備え、且つ、前記割合が閾値以上の場合に、前記光源の出力を低下させ、
   前記検出感度制御装置は、前記第２組み合わせを備え、且つ、前記割合が閾値以上の場合に、前記光検出器の感度を低下させる
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
8. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記演算装置は、画素間での画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、前記複数のコントラスト値を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
9. 請求項１又は請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記顕微鏡装置は、さらに、対物レンズを含み、
   前記球面収差補正装置は、前記対物レンズを構成するレンズの一部を光軸方向に動かす補正環である
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
10. 請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
    前記演算装置は、前記複数の画像データの全てにおいて、前記コントラスト値の各々を 算出する
    ことを特徴とする顕微鏡システム。
11. 球面収差が補正される設定を探索する設定探索方法であって、
    球面収差補正装置の設定が異なる複数の状態の各々で画像データを取得することで複数の画像データを取得し、
    前記複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像データに対して共通して定義された第１の位置として特定し、
    前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、
    前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する
    ことを特徴とする設定探索方法。
12. 請求項１１に記載の設定探索方法において、
    前記複数の画像データの全てにおいて、前記コントラスト値の各々を算出する
    ことを特徴とする設定探索方法。
13. コンピュータに、
    球面収差補正装置の設定が異なる状態で取得した複数の画像データのうちの少なくとも１つの画像データに含まれる画素値が飽和した画素データの位置の各々を前記複数の画像 データに対して共通して定義された第１の位置として特定し、
    前記複数の画像データの各々に含まれる前記第１の位置に対応する画素データを前記複数の画像データのコントラスト値の各々の計算から除いて、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、
    前記複数の画像データの各々のコントラスト値を含む複数のコントラスト値に基づいて球面収差が補正される前記球面収差補正装置の設定を特定する、
    処理を実行させることを特徴とするプログラム。

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