JP4766591B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、薄層状の光によって標本の内部を局所的に照明する薄層斜光照明装置を備えた顕微鏡に関し、特に、生物標本の蛍光観察（例えば細胞内の蛍光分子の微量検出）に好適な顕微鏡に関する。

標本の内部をコントラスト良く観察するために、薄層斜光照明法が提案されている（例えば特許文献１を参照）。この照明法では、視野絞りと対物レンズを介して標本の表面を斜光照明すると共に、表面に入射する照明光の角度を全反射条件の臨界角より僅かに小さくし、表面での照明光の屈折角を９０度より僅かに小さくする。
また、特許文献１には、対物レンズの焦点面を標本の深さ方向に移動させて、これに合わせて薄層状の照明光Ｌｏを深さ方向に移動させることにより、標本の内部の異なる深さの観察を行うことも提案されている。
特開２００３−１８５９３０号公報

しかしながら、対物レンズの焦点面の移動に応じて薄層状の照明光Ｌｏを移動させるだけでは、標本の内部の観察を良好に行うことはできなかった。対物レンズの焦点面を移動させると、照明光の導入側の標本の表面から焦点面までの距離Ｆが変化し、この距離Ｆと標本の屈折率ｎとの積に等しい光路長(Ｆ×ｎ)が変化して、対物レンズの収差が大きくなってしまう。

この問題を回避するには、収差補正用のレンズ群を備えた対物レンズを用いて、光路長(Ｆ×ｎ)の変化に起因する対物レンズの収差を良好に補正できるように、収差補正用のレンズ群を動かすことが考えられる。しかし、単に収差補正用のレンズ群を動かすと、その位置に応じて薄層状の照明光Ｌｏによる照明状態が変化し、標本像のコントラストが低下するため、両者の調整を最適化するには煩雑な作業が必要となってしまう。

本発明の目的は、標本の表面から焦点面までの光路長(Ｆ×ｎ)の変化に対応し、収差補正用のレンズ群の調整と薄層状の照明光の調整とを迅速に最適化できる顕微鏡を提供することにある。

本願発明の顕微鏡では、収差補正用のレンズ群を有する対物レンズと、標本の内部に合焦するように対物レンズの合焦位置を設定する設定手段と、対物レンズを介して標本への照明光入射角度を前記対物レンズの光軸に垂直に近くすることにより標本の内部に薄層状の照明光を導入する導入手段と、標本の観察時に照明光の導入側の標本の表面から対物レンズの合焦位置までの光路長に関わる情報を取得する取得手段と、収差補正用のレンズ群の収差補正量を調整する第１調整手段と、薄層状の照明光が対物レンズの光軸に到達する導入位置を標本の深さ方向に調整する第２調整手段と、光路長に関わる情報と該光路長に基づいて決めた最適な前記収差補正用のレンズ群の収差補正量に関わる情報と前記収差補正量に基づいて決めた最適な前記照明光の導入位置に関わる情報とを関連づけて予め記憶する記憶手段と、取得手段が取得した光路長に関する情報に基づいて記憶手段に記憶した情報を参照し光路長に関する情報に関連づけられた収差補正量に関わる情報と照明光の導入位置に関わる情報とに基づいて第１及び第２調整手段をそれぞれ制御する制御手段と、を備えたものである。

取得手段としては、標本の表面から合焦位置までの距離に係る情報を取得し、距離に係る情報と標本の屈折率との積から標本の屈折率を考慮した光路長を取得する。この場合、記憶手段としては、標本の屈折率ごとに、光路長に関わる情報と、光路長に起因する収差を補正するための収差補正用のレンズ群の収差補正量に関わる情報と、収差補正量に基づいて予め決めた照明光の導入位置に関わる情報と、の関連づけを参照表として記憶するのが望ましい。

標本の屈折率を入力する入力手段を備えてもよい。この場合、制御手段は、入力手段によって入力された屈折率に基づいて参照表を選択し、選択した参照表にしたがって第１及び第２調整手段をそれぞれ制御すればよい。また、対物レンズを介して標本の画像を取り込む取込手段を備え、制御手段は、収差補正量と照明光の導入位置との組み合わせを変更しながら取込手段によって取り込まれた画像のコントラストが最適なときの前記組み合わせを含む参照表を選択し、選択した参照表にしたがって第１及び第２調整手段をそれぞれ制御するようにしてもよい。

さらに、照明光の導入位置に関わる情報としては、光路長に基づいて決まる収差補正量を基準にして照明光の導入位置を変えながら取込手段により標本の画像を取り込み、取り込んだ標本の画像のうちのコントラストが最も高くなる画像を取り込んだときの位置に決めるのが望ましい。

本発明の顕微鏡によれば、標本の表面から焦点面までの光路長(Ｆ×ｎ)の変化に対応し、収差補正用のレンズ群の調整と薄層状の照明光の調整とを迅速に最適化できる。

以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
ここでは、薄層斜光照明装置を備えた倒立型の蛍光顕微鏡を例に説明する。
図１に示す通り、本実施形態の蛍光顕微鏡３０には、本体３１の背面側から薄層斜光照明装置１０が装着される。また、薄層斜光照明装置１０の他に、ダイクロイックミラー３２と、対物レンズ３３と、ステージ３４と、カメラ３５と、接眼レンズ３６と、手動操作部３７と、コントローラ３８とが設けられる。コントローラ３８は、例えばコンピュータなどであり、メモリ３９と不図示の入力装置とを備え、蛍光顕微鏡３０の制御装置として機能する。

本実施形態の蛍光顕微鏡３０では、標本４０を支持するステージ３４が本体３１に固定され、このステージ３４に対して対物レンズ３３が上下方向に移動可能となっている（図２参照）。上下方向は対物レンズ３３の光軸３Ｂに平行である。図２には蛍光顕微鏡３０のうち対物レンズ３３とステージ３４の部分を拡大して示した。
対物レンズ３３の上下動には図１に示す手動操作部３７が用いられる。手動操作部３７の回転に応じて対物レンズ３３を上下動させるため、本体３１の内部には図２に示す駆動系２０が設けられる。また、対物レンズ３３の上下方向の位置（以下「Ｚ位置」）を検知するため、本体３１の内部にはセンサ２１が設けられる。センサ２１の検知信号はコントローラ３８に出力される。

駆動系２０は、手動操作部３７の回転に応じて対物レンズ３３を上下動させ、図３に太い点線で示す通り、対物レンズ３３の焦点面３Ｃを標本４０の内部に設定する（請求項の「設定手段」に対応）。図３は標本４０と対物レンズ３３の先端付近を拡大した図である。ここで、標本４０の深さ方向は対物レンズ３３の光軸３Ｂに平行である。

図２のセンサ２１は、対物レンズ３３のＺ位置を検知し、コントローラ３８に検知信号を出力する。対物レンズ３３のＺ位置は焦点面３ＣのＺ位置に一対一で対応し、焦点面３ＣのＺ位置は“標本４０の表面４Ｂから焦点面３Ｃまでの距離Ｆ(図３)”に一対一で対応するため、センサ２１は、対物レンズ３３のＺ位置を検知したことにより、距離Ｆに関わる情報を取得したことになる（請求項の「取得手段」）。さらに、距離Ｆは“距離Ｆと標本４０の屈折率ｎとの積に等しい光路長(Ｆ×ｎ)”と一対一で対応するため、センサ２１による対物レンズ３３のＺ位置の検知を、光路長(Ｆ×ｎ)に関わる情報の取得と考えることもできる。

ここで、標本４０が生物標本（例えば水溶液中の生体細胞）である場合、標本４０の下方（対物レンズ３３の側）には、図３に示す通り、カバーガラス４１が配置される。また、カバーガラス４１と対物レンズ３３の先端との間は、オイルなどの高屈折率の浸液４２で満たされる。ちなみに、対物レンズ３３は、高倍(例えば４０倍以上)で高開口数(ＮＡ＞１)の油浸系の対物レンズである。

対物レンズ３３の先端から標本４０の内部の焦点面３Ｃまでの屈折率の分布を説明すると、浸液４２の屈折率は例えば１.５１、カバーガラス４１の屈折率は１.５２、標本４０の屈折率は例えば１.３３となっている。つまり、対物レンズ３３の先端から標本４０の表面４Ｂまで屈折率が高く、表面４Ｂから焦点面３Ｃまでは屈折率が低くなっている。
このため、上記した駆動系２０が焦点面３ＣのＺ位置を調整したときに、この調整量に応じて表面４Ｂから焦点面３Ｃまでの距離Ｆ（深度）が変化し、光路長(Ｆ×ｎ)が変化すると、対物レンズ３３の収差が大きくなってしまう。

そこで、本実施形態では、対物レンズ３３の内部（図４(ａ)）に収差補正用のレンズ群２２を設けると共に、対物レンズ３３の外周部（図４(ｂ)）に補正環２３を設けた。収差補正用のレンズ群２２は、補正環２３の回転に応じて光軸方向に移動可能である。さらに、コントローラ３８の制御によって補正環２３を回転させるため、補正環２３の近傍には、図２に示す駆動系２４を設けた。

駆動系２４がコントローラ３８からの指示にしたがって補正環２３を回転させると、補正環２３の回転量に応じて、図４(ａ)に示す収差補正用のレンズ群２２が光軸方向に移動する。そして、収差補正用のレンズ群２２の移動量に応じて、レンズ群２２の収差補正量を調整することにより、対物レンズ３３の収差（上記の光路長(Ｆ×ｎ)に起因する収差）を補正できる。駆動系２４は請求項の「第１調整手段」に対応する。駆動系２４には、例えばステッピングモータ（補正環２３の回転量を読み取るエンコーダ付）が用いられる。

また、対物レンズ３３の収差を良好に補正するためには、レンズ群２２の収差補正量の調整（つまりレンズ群２２の移動量の調整)(つまり補正環２３の回転量の調整）を最適化する必要がある。そして、上記の駆動系２０が対物レンズ３３のＺ位置を変化させたときに光路長(Ｆ×ｎ)が変化すると、その変化に対応して上記の調整を最適化することが必要になる。

さらに、光路長(Ｆ×ｎ)の変化（つまり対物レンズ３３のＺ位置の変化）に拘わらず、常に、レンズ群２２の収差補正量の調整（つまり補正環２３の回転量の調整）を最適化するためには、コントローラ３８から駆動系２４に対して的確な指示を与えなければならない。的確な指示を与えることができれば、レンズ群２２の収差補正量の調整（つまり補正環２３の回転量の調整）を常に最適化することができ、対物レンズ３３の収差（上記の光路長(Ｆ×ｎ)に起因する収差）を良好に補正し続けることができる。

そのため、コントローラ３８（図１）のメモリ３９には、図５に示す「参照表」が予め記憶されている。「参照表」では、対物レンズ３３のＺ位置と、このＺ位置に対応する光路長(Ｆ×ｎ)において、補正環２３の最適な回転量とが関連づけられている。他に、薄層斜光照明装置１０（図１）の一体化ユニット１０Ａの最適な移動量も「参照表」に関連づけられているが、その説明は図６〜図１０を説明した後で行う。

図５の「参照表」において、対物レンズ３３のＺ位置に関連づけられた補正環２３の最適な回転量は、図４(ａ)に示すレンズ群２２の最適な収差補正量に一対一で対応するため、メモリ３９に補正環２３の最適な回転量を記憶させたことは、レンズ群２２の最適な収差補正量に関わる情報を記憶させたことと等価である。
また、図５の「参照表」における３つのパラメータ（Ｚ位置,回転量,移動量）の関連づけは、対物レンズ３３の複数の異なるＺ位置（Ｚ１,Ｚ２,…）について成されている。対物レンズ３３の複数のＺ位置（Ｚ１,Ｚ２,…）は、標本４０の内部における焦点面３Ｃ（図３）のＺ位置の調整範囲を想定して決められている。

さらに、図５の「参照表」は、対物レンズ３３の種類（例えば倍率）ごとに作成されると共に、各々の対物レンズ３３において標本４０の屈折率ｎごとに作成され、メモリ３９に記憶される。「参照表」の作成に当たっては、対物レンズ３３の種類や標本４０の屈折率ｎの他、環境温度(例えば２３℃)やカバーガラス４１の厚さ(および屈折率)や浸液４２の屈折率などの諸条件が考慮される。

各々の「参照表」において、補正環２３の最適な回転量は、上記の諸条件を考慮した上で計算によって求めることができる。つまり、対物レンズ３３の各々のＺ位置ごとに、標本４０の表面４Ｂ（図３）から焦点面３Ｃまでの光路長(Ｆ×ｎ)に伴って発生する収差量を計算し、この収差量を打ち消すために必要な補正環２３の最適な回転量を計算すればよい。あるいは、上記の計算の他、落射照明法での事前測定により、補正環２３の最適な回転量を求めることもできる。

次に、本実施形態の蛍光顕微鏡３０（図１）の本体３１に装着された薄層斜光照明装置１０について具体的に説明する。
薄層斜光照明装置１０は、図１に示す略Ｌ字型の本体１１の中に、図６に示す光源１２とコリメートレンズ１３と視野絞り１４と反射ミラー１５と集光レンズ１６を設け、かつ、視野絞り１４と反射ミラー１５を共通の金物(不図示)に固定して一体化ユニット１０Ａを構成し、この一体化ユニット１０Ａに駆動系１７を接続したものである。

光源１２からの照明光は、コリメートレンズ１３を介して平行光Ｌ１に変換され、視野絞り１４を介して反射ミラー１５に入射する。視野絞り１４にはスリット開口４Ａが設けられる。スリット開口４Ａの長手方向は、図６の紙面に垂直である。スリット開口４Ａを通過して反射ミラー１５に向かう平行光Ｌ２の進行方向は、コリメートレンズ１３の光軸１Ｂに平行である。

反射ミラー１５は、コリメートレンズ１３の光軸１Ｂに対して４５度に傾けて配置され、視野絞り１４からの平行光Ｌ２を入射して垂直方向に反射する。反射後の平行光Ｌ２は、後段の集光レンズ１６に向けて進行する。図６では、反射ミラー１５の法線方向が紙面に平行であり、反射ミラー１５で反射した後の平行光Ｌ２の進行方向も紙面に平行であり、その平行光Ｌ２の断面の長手方向は紙面に垂直となる。また、反射ミラー１５からの平行光Ｌ２の進行方向は、集光レンズ１６の光軸１Ｃに平行である。

さらに、一体化ユニット１０Ａ（つまり視野絞り１４,反射ミラー１５）は、駆動系１７に接続され、コリメートレンズ１３の光軸１Ｂに沿って平行移動可能となっている。コントローラ３８からの指示にしたがって駆動系１７が一体化ユニット１０Ａを平行移動させると、視野絞り１４と反射ミラー１５は、互いの位置関係を変えることなく、光軸１Ｂに沿って平行移動することになる。

このとき、図７(ａ),(ｂ)に示す通り、視野絞り１４のスリット開口４Ａも光軸１Ｂに沿って平行移動するため、反射ミラー１５で反射した後の平行光Ｌ２の光量が変化することはない。また、反射後の平行光Ｌ２は、その進行方向を集光レンズ１６の光軸１Ｃに対して平行に保ちながら、その進路が光軸１Ｃに対して垂直な方向へシフトすることになる。この平行光Ｌ２は、図６に示す集光レンズ１６を介して集光光Ｌ３に変換された後、ダイクロイックミラー３２を介して、対物レンズ３３に入射する。

対物レンズ３３の瞳面３Ａでは、対物レンズ３３の光軸３Ｂとの交点Ｑ（瞳面３Ａの中心）から外れた周辺部Ｒに集光光Ｌ３が到達し、そこで焦点を結ぶ。このような集光作用は、薄層斜光照明装置１０の集光レンズ１６による。
また、瞳面３Ａにおける集光光Ｌ３の到達位置（周辺部Ｒ）は、瞳面３Ａと集光レンズ１６の光軸１Ｃとの交点に相当し、一体化ユニット１０Ａの平行移動によって平行光Ｌ２の進路を光軸１Ｃに対して垂直な方向へシフトさせた場合（図７）でも、瞳面３Ａの常に同じ位置（周辺部Ｒ）に集光光Ｌ３を到達させることができる。

ただし、集光光Ｌ３が瞳面３Ａに入射するときの角度（例えば光軸１Ｃに対する角度）は、図８に示すような変化を示す。図７,図８から分かるように、反射ミラー１５で反射した後の平行光Ｌ２の進路が光軸１Ｃから離れるほど、瞳面３Ａに対する集光光Ｌ３の入射角度は大きく傾くことになる。ちなみに、瞳面３Ａは光源１２に共役である。この共役関係は、一体化ユニット１０Ａ(つまり視野絞り１４,反射ミラー１５)の平行移動とは無関係に保たれる。

上記のように、集光レンズ１６からの集光光Ｌ３は、対物レンズ３３の瞳面３Ａの周辺部Ｒに到達して焦点を結ぶと共に、一体化ユニット１０Ａの平行移動により、瞳面３Ａにおける到達位置（周辺部Ｒ）を変化させることなく、瞳面３Ａに対する入射角度のみが変化することになる（図８）。
そして、対物レンズ３３の瞳面３Ａに入射した集光光Ｌ３は瞳面３Ａを通過した後、対物レンズ３３の先端から出射し、標本４０（図１）に対する照明光Ｌ４となる。そして、図９(ａ)に示す通り、浸液４２とカバーガラス４１とを介した後、標本４０の表面４Ｂに入射する。瞳面３Ａの周辺部Ｒに焦点を結んだ集光光Ｌ３が標本４０に対する照明光Ｌ４となるため、この照明光Ｌ４は平行光である。ちなみに、標本４０の表面４Ｂは、視野絞り１４に共役である。この共役関係は、一体化ユニット１０Ａを平行移動させた場合でも保たれる。

また、標本４０の表面４Ｂにはスリット開口４Ａの像が形成され、このスリット像の範囲（照明光Ｌ４の入射範囲）が、照明範囲となる。表面４Ｂでのスリット像の範囲（照明範囲）は、図９(ａ)の表面４Ｂを対物レンズ３３側から見た図（図９(ｂ)）に示す通り、スリット開口４Ａと同様の細長い形状である。スリット像の長手方向は、図９(ａ)の紙面に垂直である。

一方、照明光Ｌ４が標本４０の表面４Ｂに入射するときの角度φは、対物レンズ３３の瞳面３Ａにおける集光光Ｌ３の到達位置（図６,図８の周辺部Ｒの位置)、つまり、瞳面３Ａと集光レンズ１６の光軸１Ｃとの交点の位置に応じて決まる。したがって、集光レンズ１６の光軸１Ｃを移動させなければ、標本４０の表面４Ｂに対する照明光Ｌ４の入射角度φを略一定に保つことができる。

そして、薄層斜光照明装置１０では、集光レンズ１６の光軸１Ｃの位置を予め調整することにより、標本４０の表面４Ｂに対する照明光Ｌ４の入射角度φを全反射条件の臨界角より僅かに小さくし、表面４Ｂでの照明光Ｌ４の屈折角が９０度より僅かに小さくなるように設定する。このため、照明光Ｌ４は表面４Ｂで全反射することなく標本４０の内部に向けて進行する。

さらに、標本４０の表面４Ｂに対する照明光Ｌ４の入射角度φが全反射条件の臨界角より僅かに小さく、照明光Ｌ４の入射範囲（照明範囲）が図９(ｂ)に示すようなスリット形状でかつ図９(ａ)の紙面に垂直方向に細長いため、標本４０の内部における照明光Ｌｏは、対物レンズ３３の光軸３Ｂに対して垂直に近い角度θで進行すると共に、図１１に示す光軸方向の非常に狭い範囲ｄ（＝数μｍ程度）を進行する薄層状の光となる。

薄層状の照明光Ｌｏの角度θは、標本４０の表面４Ｂに対する照明光Ｌ４の入射角度φによって（延いては集光レンズ１６の光軸１Ｃの位置によって）決まる。また、薄層状の照明光Ｌｏの光軸方向の厚さ（つまり標本４０の内部での照明範囲ｄ）は、上記した照明光Ｌ４の入射角度φによって決まると共に、表面４Ｂにおける照明光Ｌ４の入射範囲によって（延いては視野絞り１４のスリット開口４Ａの大きさによって）決まる。

上記のように構成された薄層斜光照明装置１０（図６）は、対物レンズ３３を介して標本４０の内部に薄層状の照明光Ｌｏを導入する手段（請求項「導入手段」）として機能する。そして、標本４０の内部（図９）では、薄層斜光照明装置１０によって導入された薄層状の照明光Ｌｏによって、非常に狭い範囲ｄのみが局所的に照明され、それ以外（照明光Ｌｏと表面４Ｂとの間など）が照明されることはない。以下、照明光Ｌｏが対物レンズ３３の光軸３Ｂに到達する位置を「照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂ」という。

また、図９(ａ),図１０(ａ)に示す通り、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂを深さ方向に調整するためには、薄層斜光照明装置１０（図６）の一体化ユニット１０Ａを光軸１Ｂに沿って平行移動させればよい。
コントローラ３８からの指示にしたがって駆動系１７が一体化ユニット１０Ａを平行移動させると、標本４０の表面４Ｂでは、照明光Ｌ４が、その入射角度φ（図９(ａ),図１０(ａ)）と、入射範囲の大きさ（図９(ｂ),図１０(ｂ)）とを一定に保ちながら、入射範囲の短手方向に沿って入射位置がシフトする（つまり対物レンズ３３の光軸３Ｂからの距離Ｄが変化する）。

このため、標本４０の内部では、駆動系１７による一体化ユニット１０Ａの平行移動に応じて、薄層状の照明光Ｌｏが、その角度θと光軸方向の厚さとを一定に保ちながら深さ方向にシフトし、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂも深さ方向にシフトする。駆動系１７は、請求項の「第２調整手段」に対応する。
標本４０の観察時、本実施形態の蛍光顕微鏡３０（図１）では、上記した通り、手動操作部３７の回転に応じて駆動系２０（図２）が対物レンズ３３を上下動させ、図３のように対物レンズ３３の焦点面３Ｃ（これが観察面となる）を標本４０の内部に設定する。また、コントローラ３８からの指示にしたがって駆動系２４が対物レンズ３３の補正環２３を回転させ、図４(ａ)に示すレンズ群２２の収差補正量の調整を最適化する。

さらに、標本４０の内部の観察を良好に行うためには、レンズ群２２の収差補正量の調整を最適化することに加えて、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂ（図９,図１０）の調整も最適化する必要がある。導入位置１０Ｂの調整は、コントローラ３８からの指示にしたがって薄層斜光照明装置１０（図６）の駆動系１７が一体化ユニット１０Ａを平行移動させることにより行われる。

本実施形態の蛍光顕微鏡３０では、コントローラ３８から図２の駆動系２４と図６の駆動系１７との各々に的確な指示を与えるため、図５に示す「参照表」をコントローラ３８のメモリ３９（図１）に予め記憶している。「参照表」では、対物レンズ３３のＺ位置と、対物レンズ３３の補正環２３の最適な回転量とが関連づけられ、さらに、薄層斜光照明装置１０の一体化ユニット１０Ａの最適な移動量も関連づけられている。

なお、薄層斜光照明装置１０の一体化ユニット１０Ａの最適な移動量は、照明光Ｌｏの最適な導入位置１０Ｂ（図９,図１０）に一対一で対応するため、メモリ３９に一体化ユニット１０Ａの最適な移動量を記憶させたことは、照明光Ｌｏの最適な導入位置１０Ｂに関わる情報を記憶させたことと等価である。
「参照表」を作成する際、一体化ユニット１０Ａの最適な移動量は、上記の計算または事前測定により求めた補正環２３の最適な回転量を基準にして、一体化ユニット１０Ａを平行移動させながら標本４０の画像を取り込み、そのコントラストが最も高くなるように決めることが望ましい。

「参照表」を作成する際の標本４０としては、実際に観察対象となる標本を用いても構わないが、その標本と屈折率ｎが同一と見なせる別の標本を用いてもよく、予め屈折率ｎの分かっている標本であれば何でも用いることができる。一般的な生物標本の場合、その屈折率ｎの具体的な値を知るためには、事前に、同一標本（または同一と見なせる別の標本）にて屈折率ｎの測定を行うことが好ましい。

また、「参照表」における一体化ユニット１０Ａの最適な移動量を決める際、標本４０の画像の取り込みは、蛍光顕微鏡３０のカメラ３５（図１）を用いて行われる。生物標本を用いる場合、標本４０の内部（照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂ）からは蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ３３を介して集光され、ダイクロイックミラー３２を透過した後、カメラ３５に入射する。さらに、カメラ３５の内部では、撮影レンズを介して撮像素子に入射する。

そして、「参照表」における一体化ユニット１０Ａの最適な移動量を決める際には、対物レンズ３３のＺ位置を固定し、上記の計算または事前測定により求めた補正環２３の回転量を固定した状態で、一体化ユニット１０Ａを平行移動させながら標本４０の画像を取り込み、そのコントラストが最も高くなったときの移動量を“最適な移動量”とする。また、対物レンズ３３のＺ位置と補正環２３の回転量との最適な組み合わせを変更して同様の測定を繰り返すことにより、対物レンズ３３の複数のＺ位置（Ｚ１,Ｚ２,…）における一体化ユニット１０Ａの最適な移動量を決めることができる。

上記の「参照表」は、対物レンズ３３の種類（倍率）ごとに作成され、さらに、標本４０の屈折率ｎごとに作成され、図１に示すコントローラ３８のメモリ３９に記憶された状態で、観察条件に応じて選択可能となっている。「参照表」の選択はコントローラ３８が行う。「参照表」を選択するため、コントローラ３８には、入力装置(不図示)から対物レンズ３３の種類と標本４０の屈折率ｎが入力される。

次に、本実施形態の蛍光顕微鏡３０を用いた標本４０の観察動作を説明する。
標本４０の屈折率ｎが既知の場合、コントローラ３８は、入力装置によって入力された情報（標本４０の屈折率ｎと対物レンズ３３の種類）に基づいて１つの「参照表」を選択し、その「参照表」にしたがって図２の駆動系２４と図６の駆動系１７とを制御する。駆動系２４は対物レンズ３３の補正環２３の回転量を調整する手段である。

標本４０の観察時に、手動操作部３７の回転に応じて図２の駆動系２０が対物レンズ３３を上下動させ、図３のように対物レンズ３３の焦点面３Ｃ（これが観察面となる）を標本４０の内部に設定すると、センサ２１は、対物レンズ３３の現在のＺ位置を検知して、コントローラ３８に検知信号を出力する。以下、現在のＺ位置が“Ｚ２”であるとして説明する。

そして、コントローラ３８は、センサ２１からの検知信号に基づいてメモリ３９を参照し、既に選択した１つの「参照表」において、対物レンズ３３の現在のＺ位置（ここではＺ２）に関連づけられた補正環２３の最適な回転量（θ_Z2）と、一体化ユニット１０Ａの最適な移動量（Ｘ_Z2）とを読み出す。
次に、コントローラ３８は、「参照表」から読み出した補正環２３の回転量（θ_Z2）に基づいて図２の駆動系２４に指示を出すと共に、同じ「参照表」から読み出した一体化ユニット１０Ａの移動量（Ｘ_Z2）に基づいて図６の駆動系１７に指示を出す。この指示は、メモリ３９に予め記憶された「参照表」に基づいて成されるため、対物レンズ３３の現在のＺ位置（ここではＺ２）に最適なものである。

図２の駆動系２４は、コントローラ３８からの的確な指示にしたがって補正環２３を回転させ、指示通りの回転量（θ_Z2）となったところで回転を停止させる。その結果、図４(ａ)に示すレンズ群２２の収差補正量の調整を最適化することができ、対物レンズ３３の収差（上記の光路長(Ｆ×ｎ)に起因する収差）を良好に補正することができる。
また同時に、図６の駆動系１７は、コントローラ３８からの的確な指示にしたがって一体化ユニット１０Ａを平行移動させ、指示通りの移動量（Ｘ_Z2）となったところで平行移動を停止させる。その結果、図９,図１０に示す照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂの調整を最適化することができ、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂを標本４０の内部に設定された現在の焦点面３Ｃと一致させることができる。

このとき、標本４０の内部の現在の焦点面３Ｃとその近傍のみを薄層状の照明光Ｌｏによって局所的に照明することができる。標本４０の内部で発生した蛍光は、良好に収差が補正された対物レンズ３３とダイクロイックミラー３２とを介してカメラ３５に入射し、その内部の撮影レンズを介して撮像素子に入射する。撮像素子に形成される標本像は、背景光が少なくてコントラストが高く、収差が良好に補正された最適な像となる。

また、撮像素子の出力に基づいて、標本４０の画像を取り込むこともできるし、標本４０の細胞内の蛍光分子の微量検出を行うこともできる。観察面(３Ｃ)からの蛍光を接眼レンズ３６に導いて目視観察することもできる。
さらに、標本４０の内部の異なる深さで同様の観察を行う場合には、上記の手順を繰り返せばよい。

その結果、対物レンズ３３の収差を良好に補正することができ、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂを新たな焦点面３Ｃと一致させることができる。つまり、対物レンズ３３の収差を良好に補正し続けながら、標本４０の内部の焦点面３Ｃの移動に追従して、照明光Ｌｏの導入位置１０Ｂも深さ方向に調整することができ、異なる焦点面での連続した画像の取得を良好に行える。したがって、新たな焦点面３Ｃでも、上記と同様の良好な観察を行うことができる。

このように、本実施形態の蛍光顕微鏡３０では、コントローラ３８のメモリ３９に予め記憶させた「参照表」に基づいてコントローラ３８から図２の駆動系２４と図６の駆動系１７に的確な指示を出すため、対物レンズ３３の上下動に応じて、標本４０の表面４Ｂから焦点面３Ｃまでの光路長(Ｆ×ｎ)が変化した場合でも、その変化に連動して、対物レンズ３３のレンズ群２２(図４(ａ))の収差補正量の調整と薄層状の照明光Ｌｏ(図９,図１０)の調整とを迅速に最適化することができる。

したがって、標本４０の内部の観察を複数の観察面(３Ｃ)で良好かつ迅速に行うことができる。各々の観察面(３Ｃ)で標本４０の画像を取り込んだ場合、空間的に構造を持った厚みのある標本４０の三次元画像を取得できる。また、生物標本を観察対象とする場合、標本の状態が時間的に変化するため、短時間で効率よく観察を進めることが望まれる。そのような場合にも本実施形態の蛍光顕微鏡３０は有効である。
（変形例）
なお、上記した実施形態では、「参照表」を対物レンズ３３の種類と標本４０の屈折率ｎとの組み合わせごとに作成し、メモリ３９に記憶させたが、本発明はこれに限定されない。標本４０の屈折率ｎとして予め定めた環境温度における基準値を用いる場合には、「参照表」の作成を、対物レンズ３３の種類と標本４０の屈折率ｎ(基準値)と観察時の環境温度との組み合わせごとに行えばよい。その場合、「参照表」の選択のためには、入力装置から環境温度も入力させることが好ましい。

また、上記した実施形態では、コントローラ３８のメモリ３９から１つの「参照表」を選択する際、標本４０の屈折率ｎが既知であることを前提に、入力装置(不図示)から屈折率ｎを入力させたが、本発明はこれに限定されない。標本４０の屈折率ｎが未知の場合には、次のようにして「参照表」を選択すればよい。
実際の観察を始める前に、ステージ３４に標本４０が載置された状態で、対物レンズ３３の焦点面３Ｃを標本４０の内部に固定し、対物レンズ３３の補正環２３の回転量(θ)と一体化ユニット１０Ａの移動量(Ｘ)との組み合わせを変更しながら、カメラ２５を用いて標本４０の画像を取り込む。そして、各々の画像の評価値（例えばコントラストなど）を比較し、最適な画像が得られたときの回転量(θ)と移動量(Ｘ)との組み合わせを含む「参照表」を選択する。選択した「参照表」による制御は上記と同様である。また、このような選択方法を用いる場合、選択した「参照表」の屈折率が、標本４０の未知の屈折率ｎに対応する。したがって、メモリ３９に予め記憶した複数の「参照表」を用いることで、未知の屈折率ｎを正確に求めることもできる。

さらに、上記した実施形態では、対物レンズ３３の上下動に応じて、標本４０の表面４Ｂから焦点面３Ｃまでの距離Ｆが変化し、光路長(Ｆ×ｎ)が変化したときに、レンズ群２２の収差補正量の調整と薄層状の照明光Ｌｏの調整とを迅速に最適化する場合を例に説明したが、本発明はこれに限定されない。対物レンズ３３の上下動が行われず、表面４Ｂから焦点面３Ｃまでの距離Ｆが一定のときに、標本４０の屈折率ｎが変化し、光路長(Ｆ×ｎ)が変化した場合でも、同様の効果を得ることができる。

標本４０の屈折率ｎの変化は、標本４０のおかれた環境（例えば環境温度）の変化によって生じる場合や、標本自身の生理的・生化学的な変化（溶液変化）に起因して生じる場合もある。このような変化が受動的であっても能動的であっても本発明を適用できる。さらに、標本４０の環境温度を連続的に変化させて、標本４０の画像を順に取得するような観察方法にも、本発明を適用できる。請求項の「光路長に関わる情報」には、距離Ｆに関わる情報や、屈折率ｎに関わる情報や、環境温度に関わる情報などが含まれる。

また、上記した実施形態では、手動操作部３７の回転に応じて対物レンズ３３を上下動させる例を説明したが、本発明はこれに限定されない。対物レンズ３３の上下動をモータ（例えばピエゾ）により電動で制御してもよい。この場合、図２の駆動系２０は、コントローラ３８からの指示にしたがって対物レンズ３３を上下動させることになる。そして、コントローラ３８のメモリ３９に予め記憶させた「参照表」に基づいて、コントローラ３８から図２の駆動系２０,２４と図６の駆動系１７とに的確な指示を出すことにより、標本４０の内部の観察を良好に行うことができる。

さらに、上記した実施形態では、薄層斜光照明装置１０の視野絞り１４をコリメートレンズ１３と反射ミラー１５との間に配置したが、本発明はこれに限定されない。視野絞り１４を反射ミラー１５と集光レンズ１６との間に配置する場合にも、同様の効果を得ることができる。この場合にも、一体化ユニット１０Ａの移動方向は、コリメートレンズ１３の光軸１Ｂに平行である。

また、上記した実施形態では、薄層斜光照明装置１０の視野絞り１４と反射ミラー１５を平行移動させる例を説明したが、本発明はこれに限定されない。光源手段(１２,１３)と視野絞り１４とを一体化して、コリメートレンズ１３の光軸１Ｂに垂直に平行移動させる場合にも、本発明を適用できる。
さらに、上記した実施形態では、薄層斜光照明装置１０を倒立型の蛍光顕微鏡３０に組み込む例で説明したが、正立型の蛍光顕微鏡に組み込む場合にも本発明を適用できる。また、蛍光顕微鏡に限らず、一般的な光学顕微鏡にも本発明の薄層斜光照明装置を組み込むことができる。

薄層斜光照明装置１０を備えた蛍光顕微鏡３０の全体構成を示す図である。 対物レンズ３３とステージ３４の部分を拡大した図である。 対物レンズ３３の上下動と標本４０の内部における焦点面３Ｃの移動を説明する図である。 収差補正用のレンズ群２２と補正環２３について説明する図である。 メモリ３９に記憶された「参照表」について説明する図である。 薄層斜光照明装置１０の概略構成を示す図である。 一体化ユニット１０Ａ（つまり視野絞り１４,反射ミラー１５）の平行移動について説明する図である。 集光レンズ１６からの集光光Ｌ３が瞳面３Ａに入射するときの傾き角度の変化について説明する図である。 標本４０と対物レンズ３３の先端付近を拡大し、標本４０に対する照明光Ｌ４を説明する図である。 図８とは標本４０の内部の観察面が深さ方向に異なる場合において、標本４０に対する照明光Ｌ４を説明する図である。

符号の説明

１０ 薄層斜光照明装置
１０Ａ 一体化ユニット
１１，３１ 本体
１２ 光源
１３ コリメートレンズ
１４ 視野絞り
４Ａ スリット開口
１５ 反射ミラー
１６ 集光レンズ
１７，２０，２４ 駆動系
２１ センサ
２２ 収差補正用のレンズ群
２３ 補正環
３０ 蛍光顕微鏡
３２ ダイクロイックミラー
３３ 対物レンズ
３Ａ 瞳面
３４ ステージ
３５ カメラ
３６ 接眼レンズ
３７ 手動操作部
３８ コントローラ
３９ メモリ
４０ 標本
４Ｂ 表面
４１ スライドガラス
４２ 浸液

Claims (5)

1. 収差補正用のレンズ群を有する対物レンズと、
   標本の内部に合焦するように前記対物レンズの合焦位置を設定する設定手段と、
   前記対物レンズを介して前記標本への照明光入射角度を前記対物レンズの光軸に垂直に近くすることにより、前記標本の内部に薄層状の照明光を導入する導入手段と、
   前記標本の観察時に、前記照明光の導入側の前記標本の表面から前記対物レンズの合焦位置までの光路長に関わる情報を取得する取得手段と、
   前記収差補正用のレンズ群の収差補正量を調整する第１調整手段と、
   前記薄層状の照明光が前記対物レンズの光軸に到達する導入位置を前記標本の深さ方向に調整する第２調整手段と、
   前記光路長に関わる情報と、該光路長に基づいて決めた最適な前記収差補正用のレンズ群の収差補正量に関わる情報と、前記収差補正量に基づいて決めた最適な前記照明光の導入位置に関わる情報と、を関連づけて予め記憶する記憶手段と、
   前記取得手段が取得した光路長に関する情報に基づいて前記記憶手段に記憶した前記情報を参照し、前記光路長に関する情報に関連づけられた前記収差補正量に関わる情報と前記照明光の導入位置に関わる情報とに基づいて、前記第１及び第２調整手段をそれぞれ制御する制御手段と、
   を備えたことを特徴とする顕微鏡。
   
2. 請求項１に記載の顕微鏡において、
   前記取得手段は、前記標本の表面から前記合焦位置までの距離に係る情報を取得し、前記距離に係る情報と前記標本の屈折率との積から前記標本の屈折率を考慮した前記光路長を取得するとともに、
   前記記憶手段は、前記標本の屈折率ごとに、前記光路長に関わる情報と、前記光路長に起因する収差を補正するための前記収差補正用のレンズ群の収差補正量に関わる情報と、前記収差補正量に基づいて予め決めた前記照明光の導入位置に関わる情報と、の関連づけを参照表として記憶する、
   ことを特徴とする顕微鏡。
3. 請求項２に記載の顕微鏡において、
   前記標本の屈折率を入力する入力手段を備え、
   前記制御手段は、前記入力手段によって入力された前記屈折率に基づいて前記参照表を選択し、選択した参照表にしたがって前記第１及び第２調整手段をそれぞれ制御する
   ことを特徴とする顕微鏡。
4. 請求項２に記載の顕微鏡において、
   前記対物レンズを介して前記標本の画像を取り込む取込手段を備え、
   前記制御手段は、前記収差補正量と前記照明光の導入位置との組み合わせを変更しながら前記取込手段によって前記標本の画像を取り込み、取り込まれた複数の前記画像のうちのコントラストが最適なときの前記組み合わせを含む参照表を選択し、選択した参照表にしたがって前記第１及び第２調整手段をそれぞれ制御する、
   ことを特徴とする顕微鏡。
5. 請求項２に記載の顕微鏡において、
   前記対物レンズを介して前記標本の画像を取り込む取込手段を備え、
   前記照明光の導入位置に関わる情報は、前記光路長に基づいて決まる収差補正量を基準にして前記照明光の導入位置を変えながら前記取込手段によって前記標本の画像を取り込み、取り込んだ複数の前記画像のうちのコントラストが最も高くなる画像を取り込んだときの位置に決められている、
   ことを特徴とする顕微鏡。
   

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