DE19951482C2

DE19951482C2 - Fluoreszenzmikroskop

Info

Publication number: DE19951482C2
Application number: DE19951482A
Authority: DE
Inventors: Johannes Winterot; Volker Juengel
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 1999-10-26
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2003-01-09
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: JP2001154101A; US6693742B1; JP4887556B2; DE19951482A1

Description

Die Erfindung betrifft die Beleuchtung einer Probe mit Laserlicht unterschiedli cher Wellenlängen, vorzugsweise bei der Kreuzkorrelationsvariante der Fluo reszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS).

Sie ist aber auch vorteilhaft in anderen mikroskopischen Systemen wie dem Laser- Scanning-Mikroskop und bei der Detektion zeitaufgelöster Fluoreszenz anwendbar, um Be leuchtung mehrerer Wellenfängen simultan oder sequentiell exakt an den gleichen Probenort heranzuführen.

Bei der Kreuzkorrelations-FCS erfolgt eine gleichzeitige, spektral separierte Detektion von zwei unterschiedlich markierten Reaktionspartnern und von deren zweifarbigem Reaktions produkt.

Der mathematische Vergleich der Detektorsignale liefert Informationen über Konzentration und Dynamik der assoziierten Reaktionspartner ohne störende Beiträge der Einzelkompo nenten.

Es ist erforderlich, ein kleines Probenvolumen, welches einen Durchmesser im Bereich des Airyscheibchens hat, mit zwei Lasern unterschiedlicher Wellenlänge auszuleuchten. Die bei den Volumina müssen einander dabei sehr gut überdecken.

Infolge unumgänglicher Fertigungs- und Justiertoleranzen ist ein Farbquerfehler und damit eine unzureichende Überdeckung der Volumina bei Beleuchtung mit unterschiedlichen Wel lenlängen nicht auszuschließen.

In DE 692 29 777 T2 wird eine Korrekturlinse beschrieben, die der Korrektur der longitudina len chromatischen Abberration dient. Vorhandene (rotationssymmetrische) chromatische Fehler in Querrichtung (Farbvergrößerungsdifferenz) müssen durch das Optikdesign auf wendig ausgeglichen werden.

DE 41 28 506 A1 beschreibt ein Mikroskop-Spektrometer mit einer Verschiebung des ge samten Mikroskopobjektives in Richtung der optischen Achse in Abhängigkeit der einge stellten Wellenlänge für einen chromatischen Längsausgleich.

DE 195 08 100 A1 beschreibt Bauelemente mit konstanter Dispersion, wobei zur Einkopplung unterschiedlicher Wellenlängen mehrere Lichtquellen unter unterschiedlichen Winkeln ange ordnet werden müssen.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine möglichst exakte Überdeckung der Anregungsvolumina bei der Ausleuchtung mit unterschiedlichen Wellenlängen zu gewährleisten.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruchs 1 ge löst.

Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die Erfindung und ihre Wirkungen und Vorteile werden nachstehend anhand der schemati schen Darstellungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1: Eine beispielhafte Anordnung zur Kreuzkorrelations-FCS oder anderer mikro skopischer Detektionsmethoden mit einer erfindungsgemäßen Korrektionsoptik;

Fig. 2: Einen schematisierten Strahlverlauf an der im parallelen Strahlengang einge setzten Korrektionsoptik nach Ausführung 1;

Fig. 3: Einen schematisierten Strahlverlauf an der im parallelen Strahlengang einge setzten Korrektionsoptik nach Ausführung 5.

Fig. 1

Licht mit mehreren Wellenlängen wird in den Beleuchtungsstrahlengang eingekop pelt. Dieses erfolgt über eine Einkoppeloptik EO, die auf unendlich korrigierte Strahlbündel erzeugt.

Des Einkoppeloptik ist im parallelen Strahlengang die erfindungsgemäße Korrektion soptik KO nachgeordnet, welche im Strahlengang zu Justierzwecken beweglich angeordnet ist.

Über einen Hauptfarbteiler, eine zwischenbilderzeugende Übertragungsoptik ÜO (die auch das einem Scanner nachgeordnete Scanningobjektiv eines Laser-Scanning- Mikroskopes - beispielsweise gemäß DE 197 02 753 A1 - sein kann), eine Tubuslinse TL und ein Objektiv Obj erfolgt die Beleuchtung des Probenvolu mens P.

Die Detektion des Meßsignales erfolgt in einer Detektionseinheit DE, welche sich hinter dem Hauptfarbteiler und einer fokussierenden Detektionsoptik befindet. Die Detektionseinheit enthält wellenlängendispersive Elemente, z. B. dichroitische Strahl teiler und entsprechende Filter und Detektoren.

Zwischen der Einkoppeloptik EO und der Übertragungsoptik ÜO sowie zwischen Tubuslinse TL und Objektiv Obj ist der Strahlengang parallel.

Erfindungsgemäß erfolgt über eine Korrektionsoptik KO in einem der beiden parallelen Strahlengänge eine Korrektion auftretender Farbquerfehler.

Die Korrektionsoptik besteht aus einer afokal wirkenden Kombination von Gläsern mit gleichem Brechungsindex, aber unterschiedlicher Dispersion. Durch den Dispersionssprung an einer inneren Grenzfläche GF der Korrektionsoptik wird bei Durchgang eines Strahlenbündels dieses in Abhängigkeit von seiner Wellenlänge bezüglich der optischen Achse unterschiedlich abgelenkt.

Um den gewünschten Korrektions-Effekt zu erreichen, sind verschiedene technische Realisierungen möglich.

Ein erster vorteilhafter Lösungsansatz basiert auf der Ausnützung des Brechzahlsprunges an einer gewölbten Grenzfläche zwischen einer Plankonvex- und einer Plankonkavlinse bei außeraxialem Durchgang des parallelen Beleuchtungslichtes durch ein solches Korrekturglied.

Unterschiedliche Wellenlängen werden bezüglich ihrer Richtung (Farbquerfehler) und ihrer Konvergenz/Divergenz (Farblängsfehler) unterschiedlich beeinflußt.

Eine mögliche Realisierung ist nach Ausführung 1 in Tabelle 1 aufgebaut und durch Fig. 2 veranschaulicht. Andere Realisierungen sind durch Glaskombinationen entsprechend den Ausführungen 2, 3 und 4 in Tabelle 1 charakterisiert.

Die Ausführungen 1 und 2 sind zueinander entgegengesetzt aufgebaut, d. h. einmal ist die Kronglaslinse sammelnd und die Flintglaslinse zerstreuend und umgekehrt. Die Lösungen sind gleichwertig und unterscheiden sich nur in der notwendigen Bewegungsrichtung der Verschiebung zur Kompensation des Farbquerfehlers. Die Wirkung auf den Farblängsfehler ist entgegengesetzt.

Bei den Ausführungen 3 und 4 wird durch einen gegenwirkenden afokalen Achro maten die Beeinflussung des Farblängsfehlers für die verkippten Wellenlängen kom pensiert.

Hierzu werden die Ausführungen 1 und 2 bzw. 2 und 1 miteinander kombiniert Zunachst werden beide Korrektionsglieder nach Ausführung 1 und 2 zentrisch in den Strahlengang eingesetzt und dann eines der beiden außeraxial verschoben.

Die Ausführungen 3 und 4 sind bezüglich des Farblängsfehlers nebenwirkungsfrei. Wird der Farblängsfehler im Design des Gesamtstrahlenganges berücksichtigt, sind die Ausführungen 1 und 2 vorteilhaft einzusetzen.

Tabelle 1

Ausführung 1

Ausführung 2

Ausführung 3

Ausführung 4

Ein weiterer vorteilhafter Lösungsansatz basiert auf einem Brechzahlsprung an einer ebenen Grenzfläche mit veränderlichem Neigungswinkel dieser Grenzfläche und der wellenlängenabhängigen Beeinflussung der Strahlrichtung. Eine Lösung mit einstellbarem veränderbarem Keilwinkel ist in Fig. 3 und der zugehörigen Ausführung 5 in Tabelle 2 veranschaulicht.

Eine in halbkugelförmigen Halterungen HK drehbare Glaskugel GK ist aus unterschiedlichen Materialien aufgebaut (Kronglas/Flintglas). An der Grenzfläche GF erfolgt je nach Einfallswinkel eine unterschiedliche Brechung, die wellenlängenabhängig ist.

Das Material der Halterungen HK entspricht jeweils dem Material der benachbarten Kugelhälfte, so daß die Strahlung durch die Halterungen HK unbeeinflußt bleibt. Ausführung 5 ist ohne Nebenwirkung auf den Farblängsfehler und damit optisch zu den Ausführungen 3 und 4 äquivalent. Der benötigte Bauraum ist aber größer.

Denkbar sind auch Anordnungen aus mehreren Glaskeilen mit veränderlichem Keil winkel zur Erzeugung einer Divergenz für bestimmte Wellenlängen, die auswechsel bar/drehbar im Strahlengang angeordnet werden können.

Tabelle 2

Ausführung 5

Durch Verschiebung der Korrektionsoptik senkrecht zur optischen Achse in Ausführung 1 bis 4 und Fig. 2 bzw. durch Drehen der verkitteten Kugel in Ausführung 5 und Fig. 3 erfolgt eine Einstellung der Stärke der Ablenkung und somit eine Beseitigung vorhandener Farbquerfehler in der Probe. Während die (mittlere) Wellenlänge g bei jeder Stellung der Korrektionsoptik im gewählten Beispiel gerade hindurchgeht, werden die Wellenlänge r und b unterschiedlich abgelenkt.

Das Einstellen der Korrektionsoptik kann zweckmäßigerweise unter direkter Beob achtung der Beleuchtungsvolumina oder auch indirekt durch Auswertung der Analy sensignale wie z. B. des Kreuzkorrelationssignales erfolgen.

Claims

1. Fluoreszenzmikroskop,
mit einer Laseranordnung zur Anregung einer zu untersuchenden Probe mit verschiedenen Wellenlängen,
wobei die Abbildungsoptik des Fluoreszenzmikroskops bezüglich Farblängs- und Farbquerfehler korrigiert ist, um mit jeder Anregungswellenlänge das gleiche Probenvolumen anzuregen,
dadurch gekennzeichnet,
dass in einem Parallelstrahlengang des Beleuchtungsstrahlengangs eine Korrektionsoptik (KO) vorgesehen ist, die Überdeckungsfehler bei der Probenausleuchtung korrigiert,
wobei die Korrektionsoptik (KO) eine gegenüber dem Parallelstrahlengang in ihrer Neigung einstellbare Grenzfläche (GF) aufweist und unterschiedliche Neigungen der Grenzfläche (GF) unterschiedlich starke Korrektionen der Überdeckungsfehler bei der Probenausleuchtung bewirken.

2. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grenzfläche (GF) zwischen zwei Glaskörpern ausgebildet ist, wobei die Brechungsindizes der beiden Glaskörper für eine mittlere Wellenlänge gleich und ihre Dispersionen unterschiedlich sind.

3. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Grenzfläche (GF) eben und gegenüber dem Parallelstrahlengang kippbar ausgebildet ist.

4. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Grenzfläche (GF) gewölbt und senkrecht zum Parallelstrahlengang verschiebbar ist.

5. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrektionsoptik (KO) als afokaler Achromat ausgebildet ist.

6. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrektionsoptik (KO) als zwei im Strahlengang hintereinander liegende, afokale Achromate ausgebildet ist, die entgegengesetzte Wirkung bezüglich des Farblängsfehlers aufweisen.

7. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzmikroskop als Zweifarben-Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsmikroskop ausgebildet ist.

8. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzmikroskop als Laserscanmikroskop ausgebildet ist.