CN103631010B - 一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，根据入射激光束与照明需求，利用计算机中相位图生成模块，定制多点照明排列样式以及点照明尺寸，设计出所需的波前附加相位图，并将该相位图加载至与计算机相连接的纯相位型液晶空间光调制器，通过纯相位型液晶空间光调制器对入射光束的调制，可以方便地实现激光多点阵列照明。本发明还提供了实现上述控制方法的装置。本发明相比现有技术具有以下优点：可以方便地实现激光多点阵列照明，有效提高点扫描速度，成倍地降低成像所需的扫描时间；通过手动选择照明位置和手动输入照明光斑尺寸，从而自动实现定点照明。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域，特别涉及一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法及装置。
背景技术
影像技术是人们认识世界的一种重要工具。在现代生物显微技术中，光学显微提供了从亚微米到厘米尺度观察细胞和组织整体结构的有效手段，特别是荧光显微方法具有极高的灵敏度和特异性，可用于确定组织中与细胞内特定的分子组成的分布与定位，从而揭示样品的结构及变化。
双光子成像利用非线性的双光子吸收激发样品内荧光分子。由于采用了较长的激发波长，远离了样品自发荧光的范围，可以获得较低的背景噪声；同样由于较长的激发波长，受散射影响较小，可以获得较大的穿透深度，获得样品深处的图像。由于双光子吸收的平方率特性，双光子成像无需共焦小孔就可以获得较好的分辨率，从而具有较好的荧光收集效率，而这是在深层成像时仍可保有的优势。
但是双光子成像也有自己的缺点，除了需要昂贵的飞秒激光器以满足平方率吸收的要求，由于通常采用机械振镜实现点扫描，这种成像方式导致速度也不易提高。同时，受限于样品的承受能力，激发功率不能任意加大。常规的双光子成像时使用的激光功率仅有最大功率的几十分之一。而多点并行阵列照明则可以很好地提高能量利用率，同时也可以成倍地提高点扫描速度，从而提高成像速度。
同样的问题也出现在光遗传学中常用的激光刺激试验方法中，此方法一般基于双光子成像系统，传统的单点刺激一方面满足不了复杂的实验需求，另一方面也不能充分利用激光器功率。而且光刺激试验方法要求光学平台可以实现样品内任意位置的点照明，基于机械振镜的显微光学系统显然不容易实现此功能。
发明内容
本发明就是针对现有双光子显微系统的以上不足，提供了一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法及装置，该控制方法能实现实现多点并行阵列照明、能手动选择照明位置且操作简单便捷。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，包括如下步骤：
(1)根据入射激光束与照明需求，利用计算机中相位图生成模块，基于迭代算法，定制多点照明排列样式以及点照明尺寸，设计出所需的波前附加相位图；
(2)通过计算机将上述相位图加载至与计算机相连接的纯相位型液晶空间光调制器；
(3)由激光器发出的入射激光束，照射到纯相位型液晶空间光调制器上；
(4)纯相位型液晶空间光调制器根据接收到的相位图，使用直流电控制液晶，通过改变对液晶像素单元所加的电压来改变其对入射激光束波前的附加相位，使得入射激光束波前的附加相位与相位图中相位一致，从而对入射激光束进行调制；
(5)经过纯相位型液晶空间光调制器调制并反射后的激光束，通过扫描透镜扫描后进入二色分光镜，经二色分光镜反射的反射光入射至物镜，通过物镜成像到被测物上，被测物被激发的荧光再沿原光路返回入射至二色分光镜，再由二色分光镜透射至与计算机相连接的CMOS相机中，由CMOS相机将接收到的图像传入计算机中。
作为上述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的优选，所述计算机能根据由CMOS相机传来的图像手动选择照明位置和手动输入照明光斑尺寸，并由计算机快速生成照明图样。
作为上述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的优选，所述纯相位型液晶空间光调制器为基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器。
作为上述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的优选，所述步骤(3)具体过程为：由飞秒激光器发出的入射激光束，经过第一接力透镜进入平面反射镜，由平面反射镜发射后经过第二接力透镜照射到纯相位型液晶空间光调制器上。
本发明还提供了一种实现上述的用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的装置，包括光源系统、纯相位型液晶空间光调制器、计算机、扫描单元、照明及成像单元，所述扫描单元为一扫描透镜，所述照明及成像单元包括二色分光镜、物镜、CMOS相机，所述CMOS相机和纯相位型液晶空间光调制器均与计算机相连接，所述计算机中含有相位图生成模块，所述相位图生成模块能根据照明需求定制多点照明排列样式以及点照明尺寸并生成所需的波前附加相位图，所述相位图通过计算机加载至纯相位型液晶空间光调制器上，所述纯相位型液晶空间光调制器通过计算机中的相位图生成模块来控制改变其衍射特性；所述光源系统发出入射激光束，所述入射激光束经过纯相位型液晶空间光调制器的调制并反射后，通过扫描透镜扫描后进入照明及成像单元，所述照明及成像单元中的CMOS相机将接收到的图像传入计算机中。
作为上述装置的优选，所述纯相位型液晶空间光调制器为基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器。
作为上述装置的优选，所述计算机能根据由CMOS相机传来的图像手动选择照明位置和手动输入照明光斑尺寸，并由计算机快速生成照明图样。
作为上述装置的优选，所述光源系统包括飞秒激光器、第一接力透镜、平面反射镜和第二接力透镜，由飞秒激光器发出的入射激光束，经过第一接力透镜进入平面反射镜，由平面反射镜发射后经过第二接力透镜照射到纯相位型液晶空间光调制器上。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1.利用纯相位型液晶空间光调制器对激光器输出的激光束进行调制，可以方便地实现激光多点阵列照明，有效提高点扫描速度，成倍地降低成像所需的扫描时间。
2.通过手动选择照明位置和和手动输入照明光斑尺寸，从而自动实现定点(单点或多点)照明，操作简单便捷；对于光遗传学中常用的光刺激试验方法，通过本发明提供的控制方法可对样品中感兴趣的位置定点照明，照明位置与照明光斑大小可以由操作者在计算机的图像上手动选择与手动输入，由计算机快速生成照明图样，这对于需要定点、多点照明的光刺激试验方法是极为有利的。
3.本发明提供的控制方法与现有的双光子显微平台兼容性好，便于系统升级。
4.通过计算机中相位图生成模块，根据照明需求，能方便的定制多点照明排列样式以及点照明光斑尺寸，应用范围广泛。
附图说明
图1是本发明提供的实现用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的装置的结构示意图。
图2是本发明提供的用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法所得到的一种阵列照明图样。
图3是与图2相对应的由计算机中相位图生成模块生成的加载至纯相位型液晶空间光调制器的相位图。
图4是在计算机的图像中手动选择照明位置示意图。
图5是由图4选择的照明位置生成的照明图样。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
参见图1，本实施例提供了一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，包括如下步骤：
(1)根据入射激光束与照明需求，利用计算机7中相位图生成模块，基于迭代算法，定制多点照明排列样式以及点照明尺寸，设计出所需的波前附加相位图；
(2)通过计算机7将上述相位图加载至与计算机7相连接的纯相位型液晶空间光调制器5；
(3)由飞秒激光器1发出的入射激光束，经过第一接力透镜2进入平面反射镜3，由平面反射镜3发射后经过第二接力透镜4照射到纯相位型液晶空间光调制器5上；
(4)纯相位型液晶空间光调制器5根据接收到的相位图，使用直流电控制液晶，通过改变对液晶像素单元所加的电压来改变其对入射激光束波前的附加相位，使得入射激光束波前的附加相位与相位图中相位一致，从而对入射激光束进行调制；
(5)经过纯相位型液晶空间光调制器5调制并反射后的激光束，通过扫描透镜6扫描后进入二色分光镜8，经二色分光镜8反射的反射光入射至物镜9，通过物镜9成像到被测物上，被测物被激发的荧光再沿原光路返回入射至二色分光镜8，再由二色分光镜8透射至与计算机7相连接的CMOS相机10中，由CMOS相机10将接收到的图像传入计算机7中。
上述控制方法中，纯相位型液晶空间光调制器5采用基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器，使用直流电控制液晶，通过改变对液晶像素单元所加的电压，来改变其对入射激光束波前的附加相位，从而对入射激光束进行调制。因其采用反射式工作方式，且仅对波前相位进行调制，所以光利用率很高，能达到90％以上。
上述控制方法中，计算机7中的相位图生成模块，基于迭代算法，可以根据入射激光束与照明需求，通过在相位图生成模块中定制多点照明排列样式以及点照明尺寸，快速设计并生成相位图并加载至纯相位型液晶空间光调制器5，利用纯相位型液晶空间光调制器5对飞秒激光器1输出的激光束进行调制，可以实现在样品面多点并行照明，成倍地降低成像所需的扫描时间，有效提高点扫描速度。
上述控制方法中，计算机7中的相位图生成模块，同时还具有根据CMOS相机10传来的显微图像手动指定照明位置和手动输入照明光斑尺寸并由计算机7快速生成照明图样的功能，大大增强了使用灵活性能。对于光遗传学中常用的光刺激试验方法，该控制方法可实现对样品中感兴趣的位置定点照明，照明位置与照明光斑大小可以由操作者在计算机7的显微图像上手动选择与手动输入，并由计算机7快速生成照明图样，这对于需要定点、多点照明的光刺激试验方法是极为有利的。
本实施例还提供了一种实现上述用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的装置，包括光源系统、纯相位型液晶空间光调制器5、计算机7、扫描单元、照明及成像单元，光源系统包括飞秒激光器1、第一接力透镜2、平面反射镜3和第二接力透镜4，由飞秒激光器1发出的入射激光束，经过第一接力透镜2进入平面反射镜3，由平面反射镜3发射后经过第二接力透镜4照射到纯相位型液晶空间光调制器5上。扫描单元为一扫描透镜6，照明及成像单元包括二色分光镜8、物镜9、CMOS相机10，CMOS相机10和纯相位型液晶空间光调制器5均与计算机7相连接，计算机7与纯相位型液晶空间光调制器5的连接采用DVI连接方式，由于DVI是计算机7的标准显示接口，因此装置易于连接。计算机7中含有相位图生成模块，相位图生成模块能根据照明需求定制多点照明排列样式以及点照明尺寸并生成所需的波前附加相位图；该相位图生成模块基于迭代算法，可以根据入射激光束与照明需求快速设计并生成相位图，同时还具有根据显微图像手动指定照明位置和手动输入照明光斑尺寸并由计算机7快速生成照明图样的功能，大大增强了使用灵活性。相位图通过计算机7加载至纯相位型液晶空间光调制器5上，纯相位型液晶空间光调制器5通过计算机7中的相位图生成模块来控制改变其衍射特性；光源系统发出入射激光束，入射激光束经过纯相位型液晶空间光调制器5的调制并反射后，通过扫描透镜6扫描后进入二色分光镜8，经二色分光镜8反射的反射光入射至物镜9，通过物镜9成像到被测物上，被测物被激发的荧光再沿原光路返回入射至二色分光镜8，再由二色分光镜8透射至CMOS相机10中，由CMOS相机10将接收到的图像传入计算机7中。计算机7能根据由CMOS相机10传来的图像手动选择照明位置和手动输入照明光斑尺寸，并由计算机7快速生成照明图样。其中，纯相位型液晶空间光调制器5采用基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器。
参见图2和图3，图2为上述用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法所得到的其中一种阵列照明图样，首先在相位图生成模块中定制多点照明排列样式为5×7阵列照明、点照明尺寸为直径2微米的圆斑，利用相位图生成模块生成相位图，所生成的相位图如图3所示，并将该相位图加载至基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器中，用于调制入射激光波面，从而在样品面形成5×7阵列照明图样。图2所示为非等间距阵列照明图样，同理，等间距阵列照明图样同样可以实现。
参见图4和图5，图4是在计算机7的图像中手动选择照明位置示意图，通过在计算机7中接收到的由CMOS相机10传来的图像上，手动选择照明位置，即图4中的三点，并手动输入照明光斑直径为2微米，由计算机7自动生成相应相位图并加载至基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器中，实现在样品面相应位置的照明，图5是由图4选择的照明位置生成的照明图样。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据入射激光束与照明需求，利用计算机中的相位图生成模块，基于迭代算法，定制多点照明排列样式以及点照明尺寸，设计出所需的波前附加相位图；
(2)通过计算机将上述相位图加载至与计算机相连接的纯相位型液晶空间光调制器；
(3)由激光器发出的入射激光束，照射到纯相位型液晶空间光调制器上；
(4)纯相位型液晶空间光调制器根据接收到的相位图，使用直流电控制液晶，通过改变对液晶像素单元所加的电压来改变其对入射激光束波前的附加相位，使得入射激光束波前的附加相位与相位图中相位一致，从而对入射激光束进行调制；
(5)经过纯相位型液晶空间光调制器调制并反射后的激光束，通过扫描透镜扫描后进入二色分光镜，经二色分光镜反射的反射光入射至物镜，通过物镜成像到被测物上，被测物被激发的荧光再沿原光路返回入射至二色分光镜，再由二色分光镜透射至与计算机相连接的CMOS相机中，由CMOS相机将接收到的图像传入计算机中。
2.如权利要求1所述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，其特征在于，所述计算机能根据由CMOS相机传来的图像手动选择照明位置和手动输入照明光斑尺寸，并由计算机快速生成照明图样。
3.如权利要求1所述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，其特征在于，所述纯相位型液晶空间光调制器为基于硅基液晶的纯相位型空间光调制器。
4.如权利要求1至3任一所述的一种用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法，其特征在于，所述步骤(3)具体过程为：由飞秒激光器发出的入射激光束，经过第一接力透镜进入平面反射镜，由平面反射镜发射后经过第二接力透镜照射到纯相位型液晶空间光调制器上。
5.一种实现权利要求1至4任一所述的用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的装置，其特征在于，包括光源系统、纯相位型液晶空间光调制器、计算机、扫描单元、照明及成像单元，所述扫描单元为一扫描透镜，所述照明及成像单元包括二色分光镜、物镜、CMOS相机，所述CMOS相机和纯相位型液晶空间光调制器均与计算机相连接，所述计算机中含有相位图生成模块，所述相位图生成模块能根据照明需求定制多点照明排列样式以及点照明尺寸并生成所需的波前附加相位图，所述相位图通过计算机加载至纯相位型液晶空间光调制器上，所述纯相位型液晶空间光调制器通过计算机中的相位图生成模块来控制改变其衍射特性；所述光源系统发出入射激光束，所述入射激光束经过纯相位型液晶空间光调制器的调制并反射后，通过扫描透镜扫描后进入照明及成像单元，所述照明及成像单元中的CMOS相机将接收到的图像传入计算机中。
6.如权利要求5所述的一种实现用于双光子显微镜的多点并行照明控制方法的装置，其特征在于，所述光源系统包括飞秒激光器、第一接力透镜、平面反射镜和第二接力透镜，由飞秒激光器发出的入射激光束，经过第一接力透镜进入平面反射镜，由平面反射镜发射后经过第二接力透镜照射到纯相位型液晶空间光调制器上。
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