CN115201156A - 分析血液样本中红细胞的方法及血液分析系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分析血液样本中红细胞的方法及血液分析系统，包括：将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合以溶解红细胞，形成第二悬浮液；测量第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；测量第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；分析第一悬浮液的该电阻抗信号以获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息；其中，第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；分析第二悬浮液的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；基于血小板的第一体积分布信息和血小板的第三体积分布信息校正第二体积分布信息，获得血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
Description
技术领域
本发明涉及血细胞检测领域，具体涉及分析血液样本中红细胞的方法及血液分析系统。
背景技术
血细胞分析仪是一种可检测血液中细胞相关信息的仪器，可以对白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)等细胞进行计数及分类。
对于红细胞和血小板的计数，最常采用的方法有诸如小孔电阻抗法。在该方法中，当血液中的细胞粒子通过小孔时，引起瞬间电压变化，形成电压脉冲。电压脉冲的强度反映了细胞的体积大小，其数量反映了通过微孔的细胞数量，由此获得所测血细胞的体积分布直方图，通过直方图，可以区分血小板和红细胞。
采用小孔阻抗法的血液细胞分析仪除了能获得红细胞的计数值，还能通过红细胞的直方图分布参数，获得常用的红细胞参数，如平均红细胞体积(MCV，Mean CorpuscularVolume)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH，Mean Corpuscular Hemoglobin)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC，Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration)、红细胞分布宽度变异系数 (RDW-CV，Red Blood Cell Distribution Width Coefficient of Variation)、红细胞分布宽度标准差(RDW-SD，Red Blood Cell Distribution Width StandardDeviation)、红细胞压积(HCT， Hematocrit)等。
然而，当血液中具有较多的小红细胞或红细胞碎片时，由于小红细胞、红细胞碎片与血小板大小相似，因此容易误将小红细胞、红细胞碎片识别为血小板，导致血小板假性偏高，同时造成红细胞假性偏低，进而引起错误的临床诊断；当血液中具有较多的大血小板时，由于大血小板与红细胞体积大小相似，因此容易误将大血小板识别为红细胞，导致血小板计数不准确，假性降低，红细胞计数结果假性偏高。
针对阻抗法计数血小板和红细胞的局限性，许多血液细胞分析仪采用新增一个光学血小板检测通道计数血小板总数和红细胞总数，但是新增一个光学血小板检测通道需增加额外的临床检验成本，同时仪器的体积和复杂度会显著增加。
发明内容
针对目前以电阻抗法原理对红细胞进行测量的血液细胞分析仪，在检测含有小红细胞、红细胞碎片和/或大血小板血液样本时，其红细胞计数结果及形态参数测量结果易被干扰的缺陷，提供一种去除上述干扰的分析方法以及相应的血细胞分析仪。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种分析血液样本中红细胞的方法，包括：
将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；
将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合以溶解红细胞，形成第二悬浮液；
测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；
测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；
分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息；其中，第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；
分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息获取血小板的第四体积分布信息；
基于所述血小板的第四体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述光学信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
优选地，所述光学信号至少包括前向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号还包括侧向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和 /或有核红细胞。
一个实施例中，所述方法还包括：分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
一个实施例中，所述第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号，以及任选地侧向散射光信号。
一个实施例中，分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号与任选地侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞。
一个实施例中，所述方法还包括：分析所述第二悬浮液的所述侧向散射光信号和所述荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，所述第一体积分布信息、第二体积分布信息、第三体积分布信息、第四体积分布信息以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
本发明一方面提供另一种分析血液样本中红细胞的方法，包括：
将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；
将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合，形成第二悬浮液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；
测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；
测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；
分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第二体积分布信息；
分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；
用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号至少包括前向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号还包括侧向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述方法进一步包括根据前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选地，白细胞分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，更优选地，对分类获得的单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，所述第二反应试剂还包括荧光染料，所述光学信号包括前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述方法进一步包括根据侧向散射光信号和荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，所述细胞的第二体积分布信息、血小板的第五体积分布信息、以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
本发明另一方面提供一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统，所述分析系统包括采样部、试剂供应部、反应部、检测部、和处理器，其中：
所述采样部，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部；
所述试剂供应部，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部；
所述反应部，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中红细胞被溶解；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；
所述检测部，包括电学检测部和光学检测部，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号；
所述处理器，配置用于执行以下步骤：
从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；
根据所述电阻抗信号获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息，其中第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；
根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器配置基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息获取血小板的第四体积分布信息；
基于所述血小板的第四体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二混悬液的所述光学信号以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
优选地，所述光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二混悬液的所述至少前向散射光信号以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号还包括侧向散射光信号，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和 /或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器还配置用于执行以下步骤：
分析所述第二悬浮液中细胞粒子的所述前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
一个实施例中，其中所述第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号，任选地还包括侧向散射光信。
一个实施例中，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号与任选地侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器还配置用于执行以下步骤：分析所述第二悬浮液的所述侧向散射光信号和所述荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，所述第一体积分布信息、第二体积分布信息、第三体积分布信息、第四体积分布信息以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
本发明另一方面提供一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统，所述分析系统包括采样部、试剂供应部、反应部、检测部、和处理器，其中：
所述采样部，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部；
所述试剂供应部，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部；
所述反应部，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；
所述检测部，包括电学检测部和光学检测部，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号；
所述处理器，配置用于执行以下步骤：
从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；
根据所述电阻抗信号获取细胞的第二体积分布信息；
根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；
用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
根据所述光学信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
根据所述至少前向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号还包括侧向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
根据所述前向散射光信号和侧向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器还配置用于执行以下步骤：
根据前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选地，白细胞分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，更优选地，对分类获得的单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，所述第二反应试剂还包括荧光染料，所述光学信号包括前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述处理器还配置用于执行以下步骤：
根据侧向散射光信号和荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞分别进行计数。
一个实施例中，述细胞的第二体积分布信息、血小板的第五体积分布信息、以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
本发明的血细胞分析方法利用现有的白细胞(溶血)光学检测通道和CBC计数的阻抗检测通道(不溶血)，就能够有效排除样本中，红细胞碎片、小红细胞和大PLT对红细胞分析的干扰，以获得准确的红细胞计数及相关参数，从而为临床诊断和治疗提供准确的检验信息。常规的血液分析仪中通常可以通过将白细胞(溶血)光学检测通道和阻抗检测通道(不溶血) 两者血小板检测结果融合，获得准确的血小板检测结果。同时，仅利用现有的白细胞(溶血) 光学检测通道(如WBC/BASO通道、DIFF通道、NRBC通道、WNB通道)，也可获得准确的血小板检测结果。用准确的血小板检测结果来校正包含血小板和红细胞的体积分布信息，获得准确的红细胞体积分布信息。本发明的方法和分析系统能够以简单的方法获得准确的红细胞计数及相关形态参数。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本申请一个实施例中的分析血液样本中红细胞的方法的示意性流程图。
图2示出了本申请一个实施例的分析方法中，得到的血小板的第一体积分布信息。
图3a示出了本申请一个实施例的分析方法中，获取的第二悬浮液中血小板分布的一种形式的示意图；图3b示出了本发明一个实施例的分析方法中，获取的第二悬浮液中血小板分布的另一种形式的示意图。
图4示出了本申请一个实施例中的分析方法中，获取的第二悬浮液中血小板的第三体积分布信息的一种形式的示意图。
图5示出了将图2与图4所示直方图进行叠加的示意图。
图6示出了根据本申请实施例的分析方法中，生成融合血小板直方图的示例性示意图。
图7示出了根据本申请实施例的分析方法中，获得的第一悬浮液的血小板分布中，用于确定血小板谷峰比的两个分界线的示意图。
图8a示出根据本申请实施例的分析方法中，获得的第二悬浮液的血小板分布中指定区域的一种形式的示意图；图8b示出根据本申请实施例的分析方法中，获得的第二悬浮液的血小板分布中指定区域另一种形式的示意图。
图9A到图9B示出确定异常血液样本的血小板的第四体积分布信息的一个示例的过程。
图10A到图10B示出确定异常血液样本的血小板的第四体积分布信息的另一个示例的过程。
图11示出了根据本申请实施例的分析方法中，获得的第二悬浮液的血小板分布中指定区域粒子正常的一种形式的示意图。
图12示出了根据本申请实施例的分析方法中，获得的第二悬浮液的血小板分布中指定区域粒子异常的一种形式的示意图。
图13示出了确定异常血液样本的红细胞计数的一个示例的过程。
图14示出基于图3a或3b所示的白细胞区域W的光学信息进行白细胞分群的示例性示意图。
图15示出本申请一个实施例中的分析血液样本中红细胞的方法的另一示意性流程图。
图16A示出本申请一个实施例的分析方法中，基于获得的第二悬浮液的前向散射光和侧向散射光信号，区分血小板区域、白细胞区域和红细胞碎片的一种示意图；图16B示出基于图16A所示的白细胞区域W的光学信息，进行白细胞分群的示例性示意图。
图17A示出本申请一个实施例的分析方法，对血样进行深度溶血条件下，基于获得的光学信号可将血小板和血影(如红细胞碎片)区分开；图17B示出本申请一个实施例的分析方法，对血样采用常规溶血剂处理，基于获得的光学信号无法将血小板和血影(如红细胞碎片)区分开。
图18示出了确定异常血液样本的红细胞计数的另一个示例的过程。
图19示出了本申请一个实施例的分析方法，基于白细胞区域的光学信息进行白细胞分群的示例性示意图。
图20示出了根据本申请实施例的血液分析系统2100的示意性框图。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案和优点更为明显，下面将参照附图详细描述根据本发明的示例实施例。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是本发明的全部实施例，应理解，本发明不受这里描述的示例实施例的限制。基于本发明中描述的本发明实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的情况下所得到的所有其它实施例都应落入本发明的保护范围之内。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本文定义优先。
本上下文中提及的术语“直方图”是细胞体积分布的图形形式，是呈现连续变量概率分布的常见形式。可选地，该细胞体积分布也可以采用与该体积直方图具有等同或相近分辨率的表格或列表的数字形式呈现，或者采用任何本领域已知的其他适合的方式呈现。
针对利用血液分析仪对血液样本中红细胞进行分析时，若血样中含有红细胞碎片、小红细胞、和/或大PLT细胞，会对血样的红细胞计数及形态参数产生干扰的问题，本发明提供一种简便的去除上述干扰的红细胞分析方法。
对于正常样本，一般不含小红细胞、红细胞碎片和大PLT，在常规的阻抗法获得的RBC 检测参数不受影响。但是，对于含有红细胞碎片、小红细胞、和/或大PLT细胞的异常样本来说，用常规的阻抗法进行检测时，由于小红细胞、红细胞碎片与血小板大小相似，因此容易误将小红细胞、红细胞碎片识别为血小板，导致血小板假性偏高，同时造成红细胞假性偏低；当血液中具有较多的大血小板时，由于大血小板与红细胞体积大小相似，因此容易误将大血小板识别为红细胞，导致血小板计数不准确，假性降低，红细胞计数结果假性偏高，从而影响了红细胞的计数及其他形态学分析结果，并进一步对正确的诊断造成不利影响。
本申请利用血液分析仪中已有的通道和检测设备，分析得到血小板的直方图，并根据血小板的直方图来校正按照常规的阻抗法检测得到的红细胞直方图，从而获得与真实的红细胞信息相近的校正的直方图，并进一步获得正确的红细胞的计数及其他形态学分析结果。
首先，参照图1来描述根据本申请实施例的血液样本的检测方法。图1示出了根据本申请实施例的血液样本的检测方法100的示意性流程图。如图1所示，根据本申请实施例的分析血液样本中红细胞的方法100可以包括如下步骤：
在步骤S110，将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液。
在步骤S120，将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合以溶解红细胞，形成第二悬浮液。
在步骤S130，测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号。
在步骤S140，测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号。
在步骤S150，分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息；其中，第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息。
在步骤S160，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息。
在步骤S170，基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
在本申请的实施例中，第一悬浮液为被稀释的血液样本。血液稀释液通常被应用于血液分析仪，用于稀释血液样本以测量红细胞和血小板。稀释液通常包括一种或多种盐，例如碱金属盐，并被调节为等渗的(isotonic)以维持红细胞体积。可以采用商业血液稀释液稀释血液样本的第一份试样以形成第一悬浮液，例如，采用由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 (深圳，中国)生产的M-68DS稀释液、M-53D稀释液等。
在本申请的实施例中，第一悬浮液的电阻抗信号可以通过装配有直流(DC)阻抗检测器和非聚焦流动孔或聚焦流动孔的流动路径进行测量。当悬浮在导电溶液中的粒子或血液细胞通过小孔时，可以基于阻抗变化测量电信号。该阻抗信号的脉冲形状、高度和宽度与粒子的尺寸或体积直接相关，并可以被转换为主要粒子的体积。当具有不同尺寸的两种或多种粒子被测量时，由阻抗测量获得的频率直方图可以反映这些粒子的尺寸分布。通过配置有DC 阻抗测量设备的血液分析仪对血细胞进行技术的检测方法是已知的，在美国专利U.S. 2,656,508及U.S.3,810,011中均有所描述，其全部公开内容通过引证结合于此。
依照本文所公开的方法，在分析来自第一悬浮液的电阻抗信号中，可以生成该稀释后的血液样本中血小板和红细胞的体积分布直方图。如图2所示，血小板的第一体积分布信息D1 为来自第一悬浮液的血小板直流阻抗直方图(简称为血小板DC直方图)HPlt-I，表示该第一悬浮液中血小板2a的尺寸分布。在该直方图中，血小板2a的体积Volp以飞升(fL)表示。从图2中可以看出，在直方图中红细胞20的一部分与血小板10a紧密相邻。
在本申请的实施例中，第二悬浮液为溶血后的血液样本。血液样本中的红细胞可以被溶血剂溶解，溶血剂可以是阳离子、非离子、阴离子、两亲性表面活性剂中的任意一种或几种的组合。本公开中用于溶解第二份试样中红细胞的溶血剂可以是任意一种用于血液分析仪白细胞分类的已知的溶解试剂。用于血液分析仪白细胞分类的溶解试剂通常是含有一种或多种溶血剂的水溶液，其中可以包括阳离子、非离子、阴离子、两亲性表面活性剂、或其组合。在一些实施方式中，所述溶解试剂可以包括用于溶解红细胞的一种或多种溶解剂及用于染色有核血细胞的荧光染料，从而通过测量光散射和荧光将例如白细胞的有核血细胞与其他类型的细胞进行分类。例如，可以采用美国专利U.S.8,367,358所描述的溶解试剂配方，其全部公开内容通过引证结合于此。在美国专利U.S.8,367,358中所披露的溶解试剂包括一种阳离子花菁化合物(一种荧光染料)、一种阳离子表面活性剂、一种非离子表面活性剂和一种阴离子化合物，该溶解试剂可以用于溶解红细胞和使用荧光和光散射测量将白细胞分类为其亚群。其他现有的荧光染料也可以被用在该溶解试剂中。例如，美国专利U.S.8,273,329中所描述的荧光染料，其全部公开内容通过引证结合于此。此外，在一些实施方式中，荧光染料可以包含在独立的染色溶液中，其可以与不含有荧光染料的溶解试剂一起使用。所述染色溶液可以在溶血剂之前、之后或同时加入血液样本以染色有核血细胞。
在本申请的实施例中，第二悬浮液的光学信息可以通过设置在光学流动室的光学检测器进行测量。在本文中，光学流动室指适于检测光散射信号和荧光信号的聚焦液流的流通池 (focused-flow flow cell)，例如现有的流式细胞仪和血液分析仪中所使用的光学流动室。当粒子，例如一血细胞，通过光学流动室的检测孔(orifice)时，来自光源的被导向该检测孔的入射光束被该粒子向各方向散射。可以在相对于该入射光束的各角度通过光检测器检测被散射的光或光散射信号。由于不同的血细胞群体具有不同的光散射特性，因此光散射信号可以用于区分不同的细胞群体。在入射光束附近所检测的光散射信号通常被称为前向散射光信号或小角度散射光信号。在一些实施方式中，前向散射光信号可以从与入射光束约1°至约10°的角度上进行测量。在其他一些实施方式中，前向散射光信号可以从与入射光束约2°至约6°的角度上进行检测。在与入射光束呈约90°的方向所检测的光散射信号通常被称为侧向散射光信号，且来自被荧光染料染色的血细胞所发出的荧光信号一般也在与入射光束呈约90°的方向上检测。在一些实施方式中，该侧向散射光信号是从与入射光束呈约65°至约115°的角度测量。
可以使用一个或多个光学检测器测量来自该第二悬浮液的前向光散射、侧向光散射信号和荧光信号。基于本公开的目的，可以使用多种已知的光学检测硬件的设计。
一个实施例中，分析所述第二悬浮液的所述光学信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息。一个实施例中，所述光学信号至少包括前向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息，包括：分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。其他实施例中,利用前向散射光信号和以下光信信号：侧向散射光信号以及荧光信号(在第二反应试剂含有荧光染料的条件下可检测获得)中的一种或两种，也能以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞。此外，区别出血小板后，利用血小板的前向散射光信号、前向散射光信号和侧向散射光信号、或者前向散射光信号、侧向散射光信号和荧光信号，能获取血小板的第三体积分布信息。
在此描述分析所述第二悬浮液的所述光学信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞。
如图3a所示，在由血液样本的第二悬浮液所得到的前向光散射(FSC)分布直方图中，血小板区域P(本文中的血小板区域是指可能含有血小板的区域，不排除其他粒子一定程度与血小板粒子群重叠)与白细胞区域W可以明显地被区分，其中血小板区域对应于第二悬浮液中的血小板3a在直方图中的位置，白细胞区域W对应于第二悬浮液中的白细胞在直方图中的位置。如图3b所示在由血液样本的第二悬浮液所得到的荧光(SFL)与前向光散射(FSC) 的散点图中，血小板区域P与白细胞区域W可以明显地被区分，其中血小板区域对应于第二悬浮液中的血小板3b在散点图中的位置，白细胞区域W对应于第二悬浮液中的白细胞在散点图中的位置。
图4至图14进一步示出了本申请所提供的一些实施方式中获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息的方法。如图4所示，根据图3a和图3b中的血小板区域P的光散射信号生成衍生血小板体积直方图HPlt-D，作为血小板的第三体积分布D2。
在一个示例中，该第二悬浮液中血小板的衍生血小板体积可以通过血小板区域P中血小板3a和3b的光散射信号的函数计算。在一实施例中，血小板区域P的每一血小板的衍生血小板体积Volp2可以使用方程式(1)计算：
Volp2＝α*FSC 方程式(1)
其中，FSC为该血小板区域的一单独事件(individual event)的前向光散射信号，α为一常数。
可选地，该血小板区域P的每一血小板的衍生血小板体积也可以采用方程式(2)计算：
Volp2＝β*exp(γ*FSC)方程式(2)
其中，FSC为该血小板区域的一单独事件的前向光散射信号，β和γ为常数。
进一步地，也可以依据Mie散射理论利用该第二悬浮液的前向光散射信号和侧向光散射信号计算该血小板区域P的每一血小板的衍生血小板体积。而且，基于血小板DC直方图中的血小板体积与相应的从第二悬浮液获取的光散射信号之间具有尺寸相关性，当采用方程式 (1)或方程式(2)或依据Mie散射理论的方法进行计算时，该第二悬浮液的血小板的衍生血小板体积与血小板DC直方图中的血小板体积是相关的。因此，在图4所示的衍生血小板体积直方图HPlt-D中的血小板尺寸范围与图2所示的血小板DC直方图中的血小板尺寸范围相同。在本文中，采用方程式(1)或方程式(2)或依据Mie散射理论所得到的衍生血小板体积和衍生血小板体积直方图均可以被称为衍生血小板体积直方图HPlt-D。
图5示意性地将上述方法所获得的两种直方图HPlt-I和HPlt-D进行叠加。如图5所示，将来自血液样本的第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I与来自该血液样本的第二悬浮液的衍生血小板体积直方图HPlt-D这两者叠加。图5所示的实施例中所采用的该血液样本为通过手工参考方法所确定的含有红细胞碎片的异常血样样本。如图5所示，除了在血小板群体的高段(high end)，即约20fL及其以上的区域，因为红细胞碎片的干扰导致血小板DC直方图(HPlt-I) 抬升之外，两个直方图基本上相互重叠。可以理解地，在该第二悬浮液中的红细胞，包括小红细胞和红细胞碎片等，被溶解。因此，在从该第二悬浮液获取的衍生血小板体积直方图HPlt-D中，血小板群体分布的高段仅反映血小板的信息，而不受到红细胞如小红细胞和红细胞碎片等干扰物质的影响。此外，对于含有大血小板(large platelets)的血液样本，从该第二悬浮液获取的衍生血小板体积直方图HPlt-D反映包括大血小板的血小板的分布，并不会像从该第一悬浮液获取的血小板直流DC直方图HPlt-I中那样可能发生血小板与红细胞的重叠。相似地，这一特点也适用于含有巨大血小板(giant platelets)的血液样本。
在一些实施方式中，在获取衍生血小板体积直方图HPlt-D之后，该方法生成一融合血小板直方图HPlt-ID，该融合血小板直方图HPlt-ID是第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I与第二悬浮液的衍生血小板体积直方图HPlt-D的函数：HPlt-ID＝f(HPlt-I,HPlt-D)。该融合血小板直方图 HPlt-ID并入了来自第一悬浮液和第二悬浮液的血小板检测的信息。
在一示范性实施方式中，该融合血小板直方图HPlt-ID是采用方程式(3)生成的：
HPlt-ID(i)＝ki1*HPlt-I(i)+ki2*HPlt-D(i)(i＝1,2,…,n)方程式(3)
其中，HPlt-ID(i)是该融合血小板直方图中的事件(i)；HPlt-D(i)是第二悬浮液的衍生血小板体积直方图中的事件(i)；HPlt-I(i)是第一悬浮液的血小板DC直方图中的事件(i)；ki1和ki2是系数。
在一些实施方式中，方程式(3)中的ki1和ki2可以是常数，也可以是变量。例如，在一示范性实施例中，ki1和ki2依照下述判据设定：
当Volp(i)>20fL时,ki1＝0,ki2＝1；
当Volp(i)≤20fL时,ki1＝1,ki2＝0。
图6进一步示意了采用上述方法及生成融合血小板直方图HPlt-ID的判据检测图5中的异常血样样本的过程。在图6所示的融合血小板直方图HPlt-ID中，血小板的尺寸范围与图2所示的血小板DC直方图HPlt-I及图4所示的衍生血小板直方图HPlt-D相同。如图6所示，发生在图5实施例中由于血液样本中红细胞碎片的干扰而产生的血小板群体的曲线在高段的升高在该融合血小板直方图HPlt-ID中已被校正。该融合血小板直方图HPlt-ID，就是基于所述血小板的第一体积分布信息HPlt-I和所述血小板的第三体积分布信息HPlt-D，获取的血小板的第四体积分布信息或血小板的计数。
上述各实施方式中的直方图是体积分布的图形形式，是呈现连续变量概率分布的常见形式。可选地，上述各实施方式中的直方图也可以采用与该体积直方图具有等同或相近分辨率的表格或列表的数字形式呈现，或者采用任何本领域已知的其他适合的方式呈现。因此，为了本公开的目的，上述融合血小板直方图可以被用于指代融合血小板分布，而不受其图形呈现形式的局限。此外，从第一悬浮液获取的血小板DC直方图也可以被指代为DC血小板体积分布，而不受其图形呈现形式的局限。
进一步地，在本公开所描述的方法中，当异常血样样本中含有有核红细胞时，从第二悬浮液获取的SFL-FSC散点图中可以根据至少FSC信号将血小板区域P与有核红细胞区分开。
在其他实施方式中，利用从第一悬浮液获取的血小板的第一体积分布信息和从第二悬浮液获取的血小板的第三体积分布信息，获取血小板的第四体积分布信息。可以使用下文中参考图7至图10B所描述的方法。
在一实施方式中，该方法包括：确定第一悬浮液的血小板DC直方图中的血小板谷峰比 Rv/p，将所得该血小板谷峰比与一预定的比值阈值RT进行比较。如图7所示，该血小板谷峰比Rv/p是通过将Line-C处所对应的血小板数量除以位于Line-P所示的波峰处所对应的血小板数量所确定的，换言之，是将曲线在Line-C处的高度除以位于Line-P处的波峰的高度。如上文中所述，Line-C位于图7的两个群体之间的边界区域B，其示出该直方图中血小板与红细胞之间的波谷的底部。可以用大量的正常血液样本得到所述预定的比值阈值RT。例如，该预定的比值阈值RT可以是正常血液样本的血小板谷峰比的最大值。
进一步地，如图8a所示，该方法还包括：确定第二悬浮液的FSC分布直方图中血小板区域P中一指定区域PG中的事件数N，该指定区域为图8a中两条虚线分界线之间的区域，我们发现该血小板区域P内的该指定区域PG中的事件数N与大血小板相关。同样，还可在第二悬浮液的散点图中确定血小板区域P中一指定区域PG中的事件数N，该指定区域为图 8b中两条虚线分界线之间的区域，该血小板区域P内的该指定区域PG中的事件数N也与大血小板相关。对于正常血液样本，在出现在该指定区域PG中的事件数非常有限。因此，该指定区域PG中的事件数N的抬高表示由于大血小板与红细胞的重叠对DC阻抗测量第一悬浮液的血小板结果的潜在干扰，其抬高程度可以进一步反映上述潜在干扰的程度。可以依照一预定的事件数阈值GT评估该指定区域PG中的事件数N的抬高。该预定的事件数阈值GT可以通过大量的正常血液样本得到，其反映正常血液样本中该指定区域PG中的事件数的最大值。在血液样本的分析中，如果检测到的N值超过GT值，表明该指定区域PG中的事件数存在不正常的抬高。
当一血液样本的血小板谷峰比Rv/p和指定区域PG中的事件数N确定之后，该方法进一步确定从第一悬浮液获取的血小板DC直方图中血小板和红细胞之间的波谷的衍生分隔阈值 Td，从而用这些参数将血小板同红细胞区分开。
在一实施方式中，该衍生分隔阈值Td可以依照方程式(4)确定：
Td＝Tap+Fof 方程式(4)
其中，Tap为表观(apparent)分隔阈值，为现有技术中分隔第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板与红细胞的阈值，根据这两个群体之间波谷的底端位置和血小板已知的尺寸范围确定；Fof为偏移量，是第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板谷峰比Rv/p和上述第二悬浮液的散点图中血小板区域P中指定区域PG中的事件数N的函数。
在一示范性实施方式中，Fof可以依照一偏移量判据用方程式(5)或方程式(6)确定：
Fof＝b1*Rv/p–b2*N+c 方程式(5)
其中，Rv/p为第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板谷峰比；N为第二悬浮液的散点图中血小板区域P中指定区域PG中的事件数；b1、b2为大于0的常量；c为一常量。
Fof＝b11*Rv/p+b21*N+c1 方程式(6)
其中，Rv/p与N的含义与方程式(5)中相同；b11、b21为大于0的常量；c1为一常量。
该偏移量判据可以规定为，如果Rv/p大于RT而N小于GT，使用方程式(5)确定方程式(4) 中的该衍生分隔阈值Td；如果Rv/p大于RT且N也大于GT，使用方程式(6)确定方程式(4)中的该衍生分隔阈值Td。此外，根据该偏移量判据，如果Rv/p没有超过RT，不使用方程式(5)或方程式(6)，也即是说方程式(4)中的Fof为0。
通过方程式(4)-(6)及该偏移量判据得到该衍生分隔阈值Td之后，该衍生分隔阈值Td被用于区分第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中两个细胞群体，即，用于分隔血小板与红细胞。基于该直方图中该衍生分隔阈值Td所确定的血小板群体的曲线，可以确定该血液样本的血小板的第四体积分布信息。
图9A-9B、图10A-10B、图11及图12分别示出了用上述方法确定异常血液样本的血小板的第四体积分布信息的过程。图9A-9B示出了确定一含有大血小板的异常血液样本中的血小板的第四体积分布信息的过程。如图9A或图12所示，在来自该血液样本的第二悬浮液的 FSC直方图或散点图中，该指定区域PG中出现较大数量的事件数N，该N超过预定的事件数阈值GT。另一方面，在图9B中的左边视图所示的第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中，其血小板谷峰比Rv/p也超过了预定的比值阈值RT(即血小板DC直方图HPlt-I中边界区域B 出现了异常)。因此，根据上述偏移量判据，方程式(6)被用于确定偏移量Fof。如图9B中的右边视图所示，在该血液样本的第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中，由方程式(4)所得到的该衍生分隔阈值Td相对于该表观分隔阈值Tap向右偏移，其偏移的程度有方程式(6)所得的 Fof决定。
在图9A-9B、12所示的实施例中，通过流式细胞仪作为参考方法检测所得的血小板浓度为87*109/L，而采用图9B中的右边视图中所示的表观分隔阈值Tap的现有阻抗检测方法所报告的血小板浓度为63*109/L，后者远远低于流式细胞仪参考方法所得的结果。采用由方程式(4)所得的衍生分隔阈值Td及上文所述的偏移量判据得到的血小板浓度为84*109/L。由此说明，本方法能够评估第二悬浮液的直流阻抗直方图中大血小板的存在，亦能够补偿大血小板对血小板DC直方图HPlt-I检测结果的影响，因此本方法能够修正现有阻抗方法检测含有大血小板的血液样本的血小板分布信息中经常现的误差。
图10A-10B进一步示出了确定一含有红细胞碎片的异常血液样本的血小板的第四体积分布信息的过程。如图10B中的左边视图所示，在该血液样本的检测中，来自第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板谷峰比Rv/p超过了预定的比值阈值RT(即血小板DC直方图HPlt-I中边界区域B出现了异常)；然而，如图10A或11所示，第二悬浮液的FSC直方图或散点图中该指定区域PG的事件数N是正常的，并没有超过预定的事件数阈值GT。根据上述偏移量判据，方程式(5)被用于确定偏移量Fof。如图10B中的右边视图所示，在该血液样本的第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中，由方程式(4)所得到的该衍生分隔阈值Td相对于该表观分隔阈值Tap向左偏移，其偏移的程度由方程式(5)所得的Fof决定。在该实施例中，基于流式细胞仪参考方法检测所得的血小板浓度为46*109/L，而采用图10B中的右边视图中所示的表观分隔阈值Tap的现有阻抗检测方法所报告的血小板浓度为66*109/L，高于流式细胞仪参考方法所得结果40％。采用由方程式(4)所得的衍生分隔阈值Td及上文所述的偏移量判据得到的血小板浓度为42*109/L。由此说明，本方法能够修正现有阻抗方法检测含有红细胞碎片的血液样本的血小板分布信息中经常现的误差。
进一步地，在某些实施方式中，该衍生分隔阈值也可以基于方程式(7)确定：
Td’＝Tap+g*(N-GT)+h*(Rv/p-RT)+s 方程式(7)
其中，N为第二悬浮液的直流阻抗直方图中血小板区域P中指定区域PG中的事件数；GT为预定的事件数阈值；Rv/p为第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板谷峰比；RT为预定的比值阈值；g、h及s为常量，其中当Rv/p≤RT时，g、h及s的值均为0。
当使用方程式(7)确定血液样本的血小板浓度时，该衍生分隔阈值Td’通过一N和Rv/p的函数计算，其分别来自于对第二悬浮液的DC阻抗信号的分析和对第一悬浮液的DC阻抗信号的分析，如上文所述。通过与图9B中的右边视图和图10B中的右边视图所示的相同方式，采用方程式(7)所得的衍生分隔阈值Td’可以区分第一悬浮液的血小板DC直方图HPlt-I中的血小板和红细胞。之后，基于该直方图中该衍生分隔阈值Td’所确定的血小板群体的曲线，可以确定该血液样本的血小板的第四体积分布信息或血小板的计数。
可以理解的是，在上述与方程式(4)-(7)相关的实施方式中，用衍生分隔阈值从第一悬浮液所得的血小板DC直方图将血小板与红细胞区分后所得的血小板分布可以看作是血小板的第四体积分布信息。该血小板的第四体积分布信息是，基于来自第一悬浮液的血小板的第一体积分布信息和来自第二悬浮液的血小板的第三体积分布信息获取的。前文的融合血小板分布也可以看作是血小板的第四体积分布信息。
可以理解的是，在上文所描述的任一实施方式中，根据所获取的血小板的第四体积分布，如融合血小板直方图HPlt-ID或利用衍生分隔阈值Td或Td’在血小板DC直方图中所区分的血小板群体的曲线，可以得到多种形式的血小板分析数据。所得的血小板分析数据包括但不仅限于血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT) 等。
图13示出了利用血小板的第四体积分布信息，校正所述第一悬浮液中细胞的第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息的过程。其中，第二体积分布信息可为阻抗通道检测获得的：红细胞(RBC)和血小板(PLT)的体积分布直方图或两者的计数。图13所示的实施例中，所采用的该血液样本为通过现有血液分析仪中，独立的RET 光学检测通道检测红细胞参数，确定的含有小红细胞的异常血样样本，并获得RBC的参考值为4.08×10^12/L。利用前述方法双通道融合获得的血小板体积直方图(即血小板的第四体积分布信息)，校正阻抗通道检测获得的：红细胞(RBC)和血小板(PLT)的体积分布直方图，即利用图13中RBC+PLT体积直方图曲线下方面积，减去融合的PLT体积直方图曲线下方面积，计算得到血液样本中红细胞的校正体积分布，进而可获得准确的红细胞计数，排除小红细胞对其计数的影响。利用该方法，其中经融合获得的血小板计数为265×10^9/L；用阻抗通道检测获得的血小板计数为689×10^9/L，红细胞计数为3.5×10^12/L；修正后的RBC计数为3.92x 10^12/L，与获得RBC的参考值为4.08×10^12/L基本一致。可见，本申请的方法，即使针对异常样本的分析，也能够获得准确的红细胞计数。此外，其他实施例中，也可利用阻抗法获得红细胞和血小板计数，减去前文方法(融合或分割阈值)获得准确的血小板计数，以获得准确的RBC计数。
进一步地，在某些实施方式中本方法可以进一步包括利用第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数，也可利用白细胞区域的前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数。优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
在其他实施例中，本方法的第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号和侧向散射光信号。图14示出基于图3a或3b所示的白细胞区域W的光学信息进行白细胞分群的示例性示意图，如图14所示，显示了放大的白细胞区域中白细胞的二维分布。该白细胞的二维分布是从第二悬浮液的白细胞的侧向散射光信号和荧光信号所获取的白细胞分布的一种形式。如图14所示，根据白细胞的侧向散射光信号和荧光信号，可以获取血液样本中的白细胞的分类结果，包括：将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞。此外，根据白细胞的侧向散射光信号和荧光信号，还可以获取血液样本中的白细胞的计数结果，包括：对血液样本中的白细胞进行计数，或者，将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞后，对所述淋巴细胞、所述单核细胞、所述中性粒细胞以及所述嗜酸性粒细胞分别进行计数。此外，对于一些特殊样本，可能包含一些白细胞的特殊分群数据，诸如图14所示的未成熟粒细胞，其也可根据侧向散射光信号和荧光信号获取得到。本领域技术人员可以理解，本方法还可以包括基于该第二悬浮液的光散射信号和荧光信号识别有核红细胞、未成熟细胞或原始细胞的步骤。
本申请还提供另一种血液样本的检测方法。图15示出了根据本申请实施例的血液样本的检测方法200的示意性流程图。如图15所示，根据本申请实施例的分析血液样本中红细胞的方法200可以包括如下步骤：
S210：将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；
S220：将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合，形成第二悬浮液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；
S230：测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；
S240：测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；
S250：分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第二体积分布信息；
S260：分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；
S270：用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
本申请实施例，制备获得第一悬浮液所用试剂如稀释液，以及分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第二体积分布信息的详细描述。如前文图1-图14所述实施例中详细介绍，此处不再重复赘述。
在本申请的实施例中，第二悬浮液为溶血后的血液样本。溶血剂能够使红细胞深度裂解。溶血剂没有特别限制，可采用本发明中红细胞深度溶血剂。举例来说，这样的溶血剂可为烷基糖苷、三萜皂苷、甾族皂苷等等。
一种具体的溶血剂可为具有通式I的糖苷类化合物：
R-(CH2)n-CH3(I)
其中，R选自由单糖、去氧单糖和多糖所组成的组，n为5～17的整数。
上述糖苷类化合物能够起到快速溶解红细胞的作用。糖苷类化合物是由糖(或多糖)的半缩醛羟基同烷醇的羟基脱水形成的化合物。本发明的溶血剂中糖苷类化合物可以是单一的化合物，也可以是符合上述通式的两种或更多种糖苷类化合物的混合物。
通式(I)中，单糖没有特别限制，常用的可选自五碳糖、甲基五碳糖和六碳糖，但不限于此。五碳糖诸如阿拉伯糖、木糖、核糖、来苏糖等。甲基五碳糖诸如夫糖、鼠李糖、鸡那糖等。六碳糖诸如葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、山梨糖。去氧单糖也没有特别限制，诸如去氧核糖、去氧葡萄糖等，但不限于此。多糖诸如麦芽糖、蔗糖等，但不限于此。n优选为6～14的整数，更优选为7～11的整数。
所述通式I的糖苷类化合物具体可为辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，十四烷基麦芽糖苷，十二烷基葡萄糖苷，优选辛基葡萄糖苷，壬基葡萄糖苷，葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷，更优选葵基葡萄糖苷，十二烷基麦芽糖苷。
所述通式I的糖苷类化合物在本申请实施例的溶血剂中的浓度根据所选糖苷的性质、反应时间、反应温度和其他成分的使用量而有所不同，通常用量为0.025g/L～10g/L范围内，优选0.1g/L～5.0g/L。
溶血剂进一步包括具有通式II的非离子型表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)m-H(II)
其中，R1为C8-C23的烷基，R2为-O-、或-COO-，m为10～50的整数；和可选地，至少一种有机酸或其盐，其中所述有机酸或其盐选自由具有至少一个羧基或磺酸基的有机酸及其碱金属的盐所组成的组中。所述有机酸或有机酸盐在溶血剂中的浓度为0.05g/L到2g/L，优选 0.1g/L到0.5g/L。
通式II的非离子型表面活性剂，在一定程度上能够与细胞膜结合，起到保护白细胞和血小板的细胞膜不受前述糖苷类化合物的影响而保持或基本保持其细胞形态的作用。
根据优选的实施方式，所述通式II的非离子型表面活性剂中，R1为C8-C18的直链烷基。 C8-C18的直链烷基具体可为辛基、葵基、月桂基、十四烷基、十六烷基或硬脂基。更优选 R1为C12-C16的直链烷基，具体可为月桂基、十四烷基或十六烷基。R2优选为-O-。m为 10～50，优选为15～30。
所述通式II的非离子型表面活性剂具体实例可为十六烷醇聚氧乙烯(15)醚、十二烷醇聚氧乙烯(21)醚、十六烷醇聚氧乙烯(23)醚、十六烷醇聚氧乙烯(25)醚、十六烷醇聚氧乙烯(30) 醚，但不限于此。
通式II的非离子型表面活性剂的浓度没有特别限制，但可为0.03～1.5g/L，优选0.05～1.0g/L。
在本申请实施例中，该非离子表面活性剂可以以单一物质使用，也可以两者或更多种的混合物来使用。取决于所使用的非离子表面活性剂的种类，其在溶血剂中的浓度也是不同的。通常来说，烷基链越长、聚氧乙烯部分的重复单元数目越多的非离子型表面活性剂，其浓度相对较低。
在本申请实施例中，通式I和通式II的化合物配合使用，一方面能够获得对红细胞的快速深度裂解的效果，另一方面，为了能够有效检测血小板，起到对血小板细胞膜的保护作用。
此外，第二反应试剂中还可包括常规的添加剂。这些添加剂可根据需要选择性加入，例如(但不限于)缓冲剂、金属螯合剂、渗透压调节剂、防腐剂等。这些试剂均为本领域常用的试剂，只要不妨碍本发明溶血剂中的上述成分发挥作用即可。
在一些实施方式中，所述溶解试剂可以包括用于溶解红细胞的一种或多种溶解剂及荧光染料，所述荧光染料包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种染料。所述膜特异性染料可以选自DiA、DiD、DiI、DiO、DiR、DiS、FDA、Alexa Fluor 488、Super Fluor488 及以它们为母体的变形结构中的一种或多种。优选地，所述膜特异性染料为AlexaFluor 488。所述线粒体特异性染料可选自Janus Green B、MitoLite Red、罗丹明123和Mitotracker系列及以它们的母体的一种或多种。优选地，所述线粒体特异性染料为Mitotracker Deep Red或 Mitotracker Red。本发明中，染料的变形结构包括商业化的变形结构或非商业化的变形结构，根据染料的名称、结构等，本领域技术人员能够从现有技术中确认出以已知染料为母体的变形结构(如商业化变形结构)；同时，能够根据母体结构和/或已存在变形结构来得到非商业化的变形结构，并可以合理预期这些变形结构能实现与其母体类似的染色效果。这些变形结构均落入本发明的保护范围之中。
本发明中，“膜特异性染料”是指能够对血小板膜进行特异性染色的荧光染料；类似地，“线粒体特异性染料”是指能够对血小板线粒体进行特异性染色的荧光染料。当血液样本经包含溶血剂和膜特异性染料或线粒体特异性染料的第二试剂处理后，血小板和被裂解的红细胞产生了差异性更为显著的荧光特性，因而可通过检测前向散射光强度，或者前向散射光强度和选自荧光强度和侧向散射光强度中的至少一种，特别是通过检测荧光强度和前向散射光强度可更进一步地使血小板区分于被裂解的红细胞碎片。
举例来说，血液样本与第二反应试剂的体积混合比可为1:40～1:60。溶血反应在诸如 40～60℃的温度下，反应15～100秒，优选反应40～80秒。反应温度和时间可根据具体条件进行调节。
通常来说，较高的反应温度和较长的反应时间，可以获得对于红细胞程度较深的裂解。但是由于任何溶血剂会对任何细胞膜产生作用，因此，本申请实施例中红细胞深度裂解(深度溶血)指反应条件的选择使红细胞相比常规被进一步地裂解，但血小板可基本保持其细胞形态，优选也使白细胞能基本保持其细胞形态。在利用光信号包括至少前向散射光信号，血小板和被裂解的红细胞能形成区分开的两个群。于此相对，本文中的红细胞常规裂解指使用常规的溶血剂，反应后，被裂解的红细胞会混在血小板粒子群的情况。
通过以下具体实施例将详述的，以下实施方式的方法，能够对红细胞造成更深程度的裂解，使红细胞的细胞膜破碎成更小的碎片，从而通过光学检测得到至少前向光信号，能够清晰地区分出红细胞碎片和血小板，即实现血小板的全区分，故能实现对血小板的准确和精确的检测、计数，而无需与阻抗通道的血小板检测结果结合来获得，这也是与图1-图14所述实施例不同之处，但光学检测硬件、光学信号定义等可参考图1-图14所述实施例的描述，此处不再赘述。此外，还能获得至少包括单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的白细胞亚群。
在此描述分析分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息。
一个实施例中，所述光学信号至少包括前向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号(如前向散射光信号以及任选地侧向散射光信号、或者前向散射光信号和荧光信号(在第二反应试剂含有荧光染料条件可检测得到，荧光染料包含选自膜特异性染料和线粒体特异性染料中的一种染料)以及任选地侧向散射光信号)，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。该方法获得血小板的参数如体积分布和/或计数，同样不受小红细胞、红细胞碎片和大体积PLT 的影响，溶血剂将小红细胞、红细胞碎片裂解为更小的碎片，利用检测的光信号可以将此碎片与血小板完全区分开，使血小板检测不受影响。其中，血样中包含大体积PLT的话，同样可以被一起区分开，故也能被准确识别和检测。
图16A所示在由血液样本的第二悬浮液所得到的侧向散射光信号(SFL)与前向散射光信号(FSC)的散点图中，血小板区域P’与红细胞裂解的产生的碎片以及白细胞区域W可以明显地被区分。
同时，采用前文图4所示实施例中方法，利用图16A中的血小板区域P’的光散射信号生成衍生血小板体积直方图HPlt-D’，作为血小板的第五体积分布D2。具体利用方程式(1)或方程式(2)或依据Mie散射理论，所得到的衍生血小板体积和衍生血小板体积直方图，均可以被称为衍生血小板体积直方图HPlt-D’。详细描述可参考前文实施例，此处不再赘述。
图17A和图17B两图可以看出，采用本申请实施例的方法对血样进行深度溶血后(A图) 可明显将血小板(中部的粒子团)和红细胞的碎片区(左下部的粒子团)分开，通过划分PLT 散点的比例，以及根据流式细胞仪的进样量，可以计算出该样本的PLT浓度为198×109/L，而用人工镜检的方法计算的PLT浓度为202×109/L。而用常规溶血剂处理的样本完全无法区分血影与血小板(图17B)。可见，本申请深度溶血条件下的方法，可获得准确的PLT计数或体积分布。
图18中示出利用血小板的第五体积分布信息，校正所述第一悬浮液中细胞的第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息的过程。其中，第二体积分布信息可为阻抗通道检测获得的：红细胞(RBC)和血小板(PLT)的体积分布直方图或两者的计数。所用血液样本与图13所示实施例相同，为含有小红细胞的异常血样样本，并获得RBC的参考值为4.08×10^12/L。利用溶血通道获得血小板的体积直方图(即血小板的第五体积分布信息)，校正阻抗通道检测获得的：红细胞(RBC)和血小板(PLT)的体积分布直方图，即利用图18中RBC+PLT体积分布直方图曲线下方面积，减去通过溶血通道获得的PLT体积直方图(即血小板的第五体积分布直方图)曲线下方面积，计算得到血液样本中红细胞的校正体积分布，进而可获得准确的红细胞计数，排除小红细胞对其计数的影响。利用该方法，其中经溶血通道获得的血小板计数为255×10^9/L；用阻抗通道检测获得的血小板计数为 689×10^9/L，红细胞计数为3.5×10^12/L；修正后的RBC计数为3.93x 10^12/L，与获得RBC 的参考值为4.08×10^12/L基本一致。可见，本申请实施例的方法，即使针对异常样本的分析，也能够获得准确的红细胞计数。此外，其他实施例中，也可利用阻抗法获得红细胞和血小板计数，减去溶血通道获得准确的血小板计数，以获得准确的RBC计数。
同样地，在某些实施方式中本方法可以进一步对白细胞进行三类或四分类。一个是实施例中还包括：利用第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/ 或计数，也可利用白细胞区域的前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数。优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。图16B示出基于图16A所示的白细胞区域W的光学信息进行白细胞分群的示例性示意图，如图16B所示，显示了放大的白细胞区域中白细胞的二维分布。该白细胞的二维分布是从第二悬浮液的白细胞的侧向散射光信号和前向散射光信号所获取的白细胞分布的一种形式。如图16B所示，根据白细胞的侧向散射光信号和前向散射光信号，可以获取血液样本中的白细胞的分类结果，包括：将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。此外，根据白细胞的侧向散射光信号和前向散射光信号，还可以获取血液样本中的白细胞的计数结果，包括：对血液样本中的白细胞进行计数，或者，将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞后，对所述淋巴细胞、所述单核细胞、所述中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
在其他实施例中，本方法的第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号和侧向散射光信号。图19示出，基于白细胞区域的光学信息进行白细胞分群的示例性示意图。该白细胞的二维分布是从第二悬浮液的白细胞的侧向散射光信号和荧光信号所获取的白细胞分布的一种形式。如图19所示，根据白细胞的侧向散射光信号和荧光信号，可以获取血液样本中的白细胞的分类结果，包括：将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。此外，根据白细胞的侧向散射光信号和荧光信号，还可以获取血液样本中的白细胞的计数结果，包括：对血液样本中的白细胞进行计数，或者，将血液样本中的白细胞区分为淋巴细胞、单核细胞、以及中性粒细胞和嗜酸性粒细胞后，对所述淋巴细胞、所述单核细胞、所述中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
以上示例性地示出了根据本申请实施例的血液样本的检测方法。基于上面的描述，根据本申请实施例的血液样本的检测方法，利用现有的检测通道：全血计数检测通道(非溶血检测电阻抗信号)和白细胞检测通道(分类或计数通道)，获得准确的RBC计数。首先，通过全血计数检测通道(非溶血检测电阻抗信号)和白细胞检测通道(溶血条件下对白细胞进行分类或计数通道)结合获得准确的PLT体积分布信息或计数；或者仅利用白细胞检测通道获得准确的PLT体积分布信息或计数。然后，利用获得的准确的PLT参数，校正全血计数检测通道，检测阻抗信号获得的PLT和RBC的参数，即使在样本异常时，也能获得准确的RBC 参数。
下面结合图20描述根据本申请另一方面提供的一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统。图20示出了根据本申请实施例的血液分析系统2100的示意性框图。所述分析系统包括采样部2110、试剂供应部2120、反应部2130、检测部2140、和处理器2170，其中：
所述采样部2110，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部 2130；所述试剂供应部2120，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部2130；所述反应部 2130，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中红细胞被溶解；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；所述检测部2140，包括电学检测部2150和光学检测部2160，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号。
所述处理器2170，配置用于执行以下步骤：从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；根据所述电阻抗信号获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息，其中第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息；基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
在本申请的实施例中，处理器2170配置基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息时执行以下步骤：基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息获取血小板的第四体积分布信息；基于所述血小板的第四体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
在本申请的实施例中，处理器2170配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：基于所述第二混悬液的所述光学信号以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
在本申请的实施例中，光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器2170配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：基于所述第二混悬液的所述至少前向散射光信号(如：前向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号)以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
在本申请的实施例中，处理器2170进一步配置用于：分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数；或者分析所述白细胞的前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数；优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
在本申请的实施例中，第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号，任选地还包括侧向散射光信；所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号与任选地侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
在本申请的实施例中，处理器2170进一步配置用于：分析所述第二悬浮液的所述侧向散射光信号和所述荧光信号，对白细胞进行分类和/或计数；或者分析白细胞的所述侧向散射光信号和所述荧光信号，对白细胞进行分类和/或计数。优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
在本申请的实施例中，所述第一体积分布信息、第二体积分布信息、第三体积分布信息、第四体积分布信息以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
同样结合图20描述根据本申请提供的另一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统。血液分析系统包括采样部2110、试剂供应部2120、反应部2130、检测部2140、和处理器2170，其中：所述采样部2110，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部2130；所述试剂供应部2120，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部2130；所述反应部2130，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；
所述检测部2140，包括电学检测部2150和光学检测部2160，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号。所述处理器2170，配置用于执行以下步骤：从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；根据所述电阻抗信号获取细胞的第二体积分布信息；根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
在本申请的实施例中，所述光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：根据所述至少前向散射光信号(如：前向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号)以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号(如：前向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号和荧光信号) 获取血小板的第五体积分布信息。
在本申请的实施例中，处理器2170进一步配置用于：分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数；或者分析所述白细胞的前向散射光信号和侧向散射光信号，对白细胞进行分类和/或计数；优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
在本申请的实施例中，所述第二反应试剂还包括荧光染料，所述光学信号包括前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，所述处理器2170配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号(如：前向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号，或者前向散射光信号和侧向散射光信号和荧光信号)获取血小板的第五体积分布信息。
在本申请的实施例中，所述第二体积分布信息、第五体积分布信息以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。此外，在本申请的实施例中，光学检测器可以进一步包括检测不同光学信号的检测器(未示出)，诸如检测前向散射光信号的检测器、检测侧向散射光信号的检测器和检测荧光信号的检测器。
基于上面的描述，根据本申请实施例的血液分析，利用全血计数检测通道(非溶血检测电阻抗信号)和白细胞检测通道(分类或计数通)，即可获得准确的红细胞计数结果，需要额外增加光学检测通道，降低了临床检验成本和仪器复杂度。
另外，本发明实施例还提供了一种计算机存储介质，其上存储有计算机程序。在所述计算机可读存储介质上可以存储一个或多个计算机程序指令，处理器可以运行存储装置存储的所述程序指令，以实现本文所述的本发明实施例中(由处理器实现)的功能以及/或者其它期望的功能，例如以执行根据本发明实施例的分析血液样本的方法的相应步骤，在所述计算机可读存储介质中还可以存储各种应用程序和各种数据，例如所述应用程序使用和/或产生的各种数据等。
例如，所述计算机存储介质例如可以包括智能电话的存储卡、平板电脑的存储部件、个人计算机的硬盘、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、便携式紧致盘只读存储器(CD-ROM)、USB存储器、或者上述存储介质的任意组合。所述计算机可读存储介质可以是一个或多个计算机可读存储介质的任意组合。
尽管这里已经参考附图描述了示例实施例，应理解上述示例实施例仅仅是示例性的，并且不意图将本发明的范围限制于此。本领域普通技术人员可以在其中进行各种改变和修改，而不偏离本发明的范围和精神。所有这些改变和修改意在被包括在所附权利要求所要求的本发明的范围之内。
本领域普通技术人员可以意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、或者计算机软件和电子硬件的结合来实现。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。
Claims (20)
1.一种分析血液样本中红细胞的方法，包括：
将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；
将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合以溶解红细胞，形成第二悬浮液；
测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；
测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；
分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息；其中，第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；
分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息，还包括：
基于所述血小板的第一体积分布信息和所述血小板的第三体积分布信息获取血小板的第四体积分布信息；
基于所述血小板的第四体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述光学信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
优选地，所述光学信号至少包括前向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述光学信号还包括侧向散射光信号，分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞；
优选地，所述方法进一步包括：分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选所述白细胞的分类包括：嗜碱性粒细胞，更优选地对区分后的嗜碱性粒细胞计数。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，其中所述第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号，以及任选地侧向散射光信号。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号与任选地侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：分析所述第二悬浮液的所述侧向散射光信号和所述荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞分别进行计数。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一体积分布信息、第二体积分布信息、第三体积分布信息、第四体积分布信息以及红细胞的校正体积分布信息为直方图。
9.一种分析血液样本中红细胞的方法，包括：
将所述血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合，形成第一悬浮液；
将所述血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合，形成第二悬浮液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；
测量所述第一悬浮液流过小孔的电阻抗信号；
测量所述第二悬浮液流过光学流动室的光学信号；
分析所述第一悬浮液的所述电阻抗信号以获取细胞的第二体积分布信息；
分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；
用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述光学信号至少包括前向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述至少前向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述光学信号还包括侧向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和侧向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括根据前向散射光信号和侧向散射光信号对白细胞进行分类和/或计数；优选地，白细胞分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，更优选地，对分类获得的单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞分别进行计数。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二反应试剂还包括荧光染料，所述光学信号包括前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，其中分析所述第二悬浮液的所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息，包括：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括根据侧向散射光信号和荧光信号对白细胞进行分类和/或计数；
优选的，所述白细胞的分类包括：区分单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞，更优选对区分后单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和/或识别幼稚粒细胞分别进行计数。
15.一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统，所述分析系统包括采样部、试剂供应部、反应部、检测部、和处理器，其中：
所述采样部，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部；
所述试剂供应部，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部；
所述反应部，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中红细胞被溶解；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；
所述检测部，包括电学检测部和光学检测部，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号；
所述处理器，配置用于执行以下步骤：
从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；
根据所述电阻抗信号获取细胞的第一体积分布信息和第二体积分布信息，其中第一体积分布信息为血小板的第一体积分布信息；
根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
16.如权利要求15所述的血液分析系统，其特征在于，所述处理器配置基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第一体积分布信息和所述第三体积分布信息获取血小板的第四体积分布信息；
基于所述血小板的第四体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
17.如权利要求15或16所述的血液分析系统，其特征在于，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二混悬液的所述光学信号以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的光学信号获取血小板的第三体积分布信息；
优选地，所述光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二混悬液的所述至少前向散射光信号以区别中的血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
18.如权利要求15-17任一项所述的血液分析系统，其特征在于，其中所述第二反应试剂还含有荧光染料；所述光学信号还包括荧光信号，任选地还包括侧向散射光信；所述处理器配置根据所述光学信号获取血小板的第三体积分布信息时执行以下步骤：
基于所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号与任选地侧向散射光信号以区别血小板与白细胞和/或有核红细胞，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第三体积分布信息。
19.一种用于分析血液样本中红细胞的血液分析系统，所述分析系统包括采样部、试剂供应部、反应部、检测部、和处理器，其中：
所述采样部，配置为从血液样本获取至少两份待测样本，分别输送到所述反应部；
所述试剂供应部，配置为将所需的反应试剂供应到所述反应部；
所述反应部，包括至少一个反应室，用于将血液样本的第一份待测样本与含有稀释液的第一反应试剂混合制备第一混悬液，和用于将血液样本的第二份待测样本与含有溶血剂的第二反应试剂混合制备第二混悬液，其中所述溶血剂将所述血液样本中的红细胞裂解为其光散射特性显著不同于血小板的碎片；且所述反应部配置为将第一混悬液和第二混悬液分别供应到所述检测部；
所述检测部，包括电学检测部和光学检测部，其中所述电学检测部包括微孔及电阻抗检测器，所述电阻抗检测器用于检测所述第一混悬液通过所述微孔的电阻抗信号，所述光学检测部包括光学流动室、光源及光学检测器，所述光学流动室与所述反应室连通，所述光源用于将光束对准所述光学流动室，所述光学检测器用于检测通过所述光学流动室的所述第二混悬液的光学信号；
所述处理器，配置用于执行以下步骤：
从所述检测部获取所述电阻抗信号和所述光学信号；
根据所述电阻抗信号获取细胞的第二体积分布信息；
根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息；
用所述血小板的第五体积分布信息校正所述第二体积分布信息，获得所述血液样本中红细胞的校正体积分布信息。
20.根据权利要求19所述的血液分析系统，所述光学信号至少包括前向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
根据所述至少前向散射光信号以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息；或者
所述第二反应试剂还包括荧光染料，所述光学信号包括前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，所述处理器配置用于在根据所述光学信号获取血小板的第五体积分布信息时执行以下步骤：
分析所述第二悬浮液的所述前向散射光信号和荧光信号以及任选地侧向散射光信号，以将血小板与裂解的红细胞碎片区分开，并根据所述血小板的至少前向散射光信号获取血小板的第五体积分布信息。
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