BR112013019523A2 - dispositivo e processo de medidas multiparamétricas de micropartículas em um fluido - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO E PROCESSO DE MEDIDAS MULTIPARAMÉTRICAS DE MICROPARTÍCULAS EM UM FLUIDO. A invenção refere-se a um dispositivo eletro-óptico de medidas em fluxo para a caracterização de micropartículas compreendendo uma câmera de medida (CUM), na qual circula o fluxo do fluido a caracterizar, pelo menos duas fontes luminosas (S1, S2) de espectros disjuntos, um dispositivo de medida de resistividade (RES) e pelo menos três outros detectores (D1, D2, D3), permitindo cada um a medida de um parâmetro óptico, os parâmetros ópticos sendo escolhidos dentre a fluorescência (FL), a extinção (EXT), a difração nos ângulos maiores (SSC), a difração nos ângulos menores (FSC).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVO E PROCESSO DE MEDIDAS MULTIPARAMÉTRICAS DE MICROPARTÍ- CULAS EM UM FLUIDO". Planejamento da invenção 5 A presente invenção se refere ao domínio ao domínio geral dos dispositivos eletro-ópticos de medidas em fluxo pela caracterização de mi- cropartículas, notadamente de células biológicas compreendendo uma câ- mara de medida na qual circula o fluxo do fluido a caracterizar e contendo as células a caracterizar.

Esse domínio se baseia na utilização de métodos de 10 análise baseados na utilização de medidas elétricas e ópticas para medir e diferenciar as células presentes em uma amostra a analisar.

A presente in- venção se refere mais especificamente a um dispositivo eletro-óptico multi- paramétrico para a contagem e a caracterização celular.

O fluido a caracterizar é preferencialmente uma amostra sanguí- 15 flea, mas pode ser também um líquido biológico de uma outra natureza do tipo líquido cérebro-espinhal, medula óssea, etc.

A amostra pode também conter partículas de qualquer natureza que será necessário diferenciar e medir.

Mais precisamente, a invenção se refere aos dispositivos com- 20 preendendo pelo menos duas fontes luminosas, um dispositivo de medida de resistividade e vários detectores permitindo a medida de um parâmetro ópti- co, tipicamente, uma medida de extinção e uma medida de difrações nos ângulos maiores.

Essas medidas permitem a caracterização das células biológicas 25 presentes no fluido.

No caso das células hematopoiéticas, o técnico sabe que a aná- lise morfológica da célula, obtida por volumetria ou difractometria, incluindo os fenômenos de extinção ou de absorção, permite a discriminação das principais linhagens celulares, incluindo os eritrócitos ou glóbulos vermelhos, 30 os trombócitos ou plaquetas e os leucócitos ou glóbulos brancos.

Esta última população é ele própria subdividida em várias categorias, tais como, por e- xemplo, os linfócitos, os monócitos, os neutrófilos, os eosinófilos e os basófi-

los.

Pode-se, em uma certa medida, apreciar o nível de maturidade dessas células determinando simultaneamente seu volume e sua absorção aparente em luz branca, tal como descrito na patente US 5138181, deposi- 5 tado pela requerente.

Um dispositivo desenvolvido em um modo de realiza- ção em luz quase monocromática é, por exemplo, descrito na patente WO 2006/053960. Essa apreciação da maturidade celular é muito importante, pois ela permite fazer diagnósticos precoces.

De forma geral, e na ausência de 10 patologias, só as células maduras estão presentes na maioria no sangue circulante.

Para cada um dos tipos celulares citados mais acima, são co- nhecidos os diferentes níveis de maturação.

Assim, os glóbulos vermelhos, ainda denominados eritrócitos, ou hemácias, são inicialmente fabricados sob 15 a forma de proeritroblastos, depois de eritroblastos basófilos, mais ainda de eritroblastos policromatófilos, que evoluem em eritroblastos acidófilos, de- pois em reticulócitos.

São reticulócitos que, enfim, se diferenciam em eritróci- tos, uma vez passado no sangue circulante.

Os glóbulos brancos ou leucócitos são oriundos da medula ós- 20 sea sob a forma prévia de mieloblastos.

Esses mieloblastos darão, em se- guida, os pró-granulócitos que se transformarão então em granulócitos basó- filos, eosinófilos ou neutrófilos, inicialmente não segmentados, depois dos quais os núcleos vão cada vez mais se segmentar à medida que ocorre sua maturação. 25 Esses mesmos mieloblastos estão também na origem da linha- gem monocitária que dará os monoblastos, os promonócitos, a partir dos monócitos que passarão no sangue periférico.

A célula cepa pluripotente, da qual é originário o mieloblasto, dá também origem à linhagem linfocitária por uma diferenciação sob a forma de 30 célula cepa linfoide, da qual uma parte de sua linhagem, linhagem dos linfó- citos T, irá continuar sua maturação no timo e os gânglios e a outra parte permanecerá na medula óssea a fim de dar a linhagem dos linfócitos B.

Es-

ses linfócitos B, uma vez ativados sob a forma de plasmócitos, produzem os anticorpos para combater os antígenos patógenos.

As plaquetas sanguíneas ou trombócitos provêm dos megacari- oblastos, eles próprios oriundos do progenitor mielóide, do qual é originário o 5 mieloblasto, que, uma vez chegado ao estágio último de sua maturação, que são megacariócitos trombocitógenos, produzem plaquetas por divisão de seus citoplasmas.

As plaquetas jovens, plaquetas reticuladas, contêm uma carga em ARN que é o resquício de sua célula de origem.

O diagnóstico de determinadas patologias necessita da numera- 10 ção e da caracterização cada vez mais fina das células hematopoiéticas no sangue circulante.

Em particular, torna-se necessário poder colocar em evi- dência populações específicas, tais como os reticulócitos e os eritroblastos que são as versões imaturas dos eritrócitos.

Da mesma forma, a colocação em evidência de células imaturas, precursores dos leucócitos, denominados 15 Iinfócitos, monócitos ou granulócitos imaturos reveste uma grande importân- cia.

A classificação e a contagem dos linfócitos ativados ou ainda plaquetas reticuladas permitiria também melhorar verdadeiramente o diagnóstico dos pacientes.

Objeto e resumo da invenção 20 A presente invenção tem, portanto, por finalidade principal de- senvolver um dispositivo de análise e um processo associado, permitindo melhor diferenciação e, portanto, melhor contagem de cada uma das popu- lações particulares contidas em uma amostra, propondo um dispositivo ele- tro-óptico de medidas em fluxo para a caracterização de micropartículas, 25 compreendendo uma câmara de medida, na qual circula o fluxo do fluido a caracterizar, pelo menos duas fontes luminosas de espectros disjuntos, um dispositivo de medida de resistividade e pelo menos três outros detectores, permitindo cada um a medida de um parâmetro óptico, os parâmetros ópti- cos sendo escolhidos dentre a fluorescência, a extinção, a difração nos ãn- 30 gulos maiores, a difração nos ângulos menores, o dispositivo eletro-óptico tal que: - a primeira fonte luminosa, a menos coerente, apresentando o comprimento de onda o mais elevado, define um eixo óptico principal per- pendicular ao fluxo de partículas, o eixo óptico principal suportando dois con- juntos ópticos, situados de ambos os lados da cuba, um dito canhão de "e- missão" permitindo a enformação do feixe oriundo dessa primeira fonte e o 5 outro dito canhão de "recebimento", permitindo a coleta do sinal oriundo dessa primeira fonte luminosa e situado após a cuba de medida; - a segunda fonte luminosa, a mais coerente, apresentando o comprimento de onda o menor, define um eixo óptico secundário cruzando o eixo óptico principal e perpendicular ao fluxo de partículas; 10 - um primeiro detector é colocado diante da primeira fonte na ex- tremidade do canhão de recebimento operando assim em campo claro; - o canhão de recebimento compreende uma óptica de coleta do feixe proveniente da interação entre a primeira fonte luminosa e as partículas no fluxo em direção ao primeiro detector, essa óptica de coleta sendo tal que 15 sobre uma parte de seu trajeto, o feixe luminoso transmitido é um feixe subs- tancialmente colimado; - um primeiro espelho dicroico é colocado no canhão de recebi- mento no nível da parte de trajeto, na qual o feixe luminoso é substancial- mente colimado, para refletir parcialmente o feixe luminoso oriundo da inte- 20 ração entre a segunda fonte luminosa e as partículas no fluxo, para um se- gundo detector colocado sobre o trajeto do feixe parcialmente refletido; - o canhão de emissão compreende uma óptica de enformação do feixe emitido pela primeira fonte luminosa, essa óptica de enformação sendo tal que, em uma parte de seu trajeto, o feixe luminoso é substancial- 25 mente um feixe colimado; - um segundo espelho dicroico é colocado no canhão de emis- são entre a primeira fonte luminosa e a cuba, no nível da parte de trajeto, na qual o feixe luminoso é substancialmente colimado, para refletir parcialmente o feixe oriundo da interação entre a segunda fonte luminosa e as partículas 30 no fluxo, para um terceiro detector colocado sobre o trajeto do feixe parcial- mente refletido.

Assim, o dispositivo comporta classicamente um micro-orifício através do qual passam as partículas, dando assim uma primeira medida de resistividade.

Depois, graças a duas fontes luminosas, das quais uma é de pequena coerência temporal, o dispositivo permite obter pelo menos três outras medidas, graças a pelo menos três vias de medida suplementares. 5 0 dispositivo, de acordo com a invenção, compreende uma via de medida suplementar, graças à introdução no canhão de emissão de um sistema de espelho(s) dicroico(s) permitindo a obtenção de medida(s) su- plementar(es). Essa inovação permite tornar o dispositivo modular e apto múltiplas medidas em um espaço limitado e com aparelhagens em número 10 menor.

Além disso, os parâmetros medidos podem, conforme a necessida- de, ser modificados, conservando os mesmos elementos estruturais.

Os re- sultados de classificação de partículas obtidos são bem superiores àqueles obtidos com os dispositivos conhecidos.

Com efeito, a multiplicidade e a mo- dularidade dos parâmetros acessíveis tornam o dispositivo, de acordo com a 15 invenção, particularmente com bom desempenho, sensível e polivalente em termos de resultados de classificação.

O dispositivo da invenção é muito simples de utilizar, barato e permite obter numerosas medidas, portanto numerosas características celu- lares. 20 0 dispositivo, de acordo com a invenção, autorizando um núme- ro aumentado de medidas de parâmetros permite a caracterização, a dife- renciação e a contagem absoluta das células contidas em uma amostra bio- lógica, da qual o sangue.

Além disso, as fontes luminosas sendo separadas, podem facil- 25 mente ser conjugadas ou não.

Essa característica permite notadamente se livrar de problemas de compensação eventuais, quando de medidas com fluorocromos.

Sem modificar drasticamente a montagem óptica descrita, pode- se facilmente conseguir medidas suplementares.

Por exemplo, podem ser 30 obtidas medidas de difração nos ângulos menores, medidas de fluorescên- cias, pelo menos tantas fontes coerentes utilizadas, que podem fornecer as informações suplementares sobre a natureza das partículas estudadas.

O dispositivo, de acordo com a invenção, é modulável pelo fato de permitir obter numerosos parâmetros que podem ser de natureza muito diferente.

Com efeito, pode-se obter, por exemplo, uma medida em extinção, uma medida de difração nos ângulos maiores e uma medida de fluorescên- 5 cia.

Essa combinação de medidas permite, por exemplo, obter, facilmente e de modo rápido, uma caracterização muito boa das partículas que circulam na câmara de medida.

Adaptando-se as medidas utilizadas, a invenção permite medir muito precisamente o conteúdo intracelular em hemoglobina de cada popu- 10 lação eritrocitária_ Por extensão, o dispositivo e o processo, de acordo com a invenção, podem permitir uma melhor análise das populações leucocitárias da amostra.

De acordo com uma característica particular, um detector de di- fração/difusão é colocado na face da segunda fonte luminosa do outro lado 15 da cuba de medida.

Essa característica pode ser útil para participar da classificação das células em certos casos particulares ou ainda, de maneira mais geral, para acionar as medidas ópticas.

De acordo com uma característica vantajosa da invenção, o pri- 20 meiro detector apresenta um ganho comutável, tornando apto a realizar dois tipos de medida, uma em extinção e uma outra escolhida dentre as difrações e as fluorescências.

Essa característica autoriza a utilização de um único detector pa- ra duas medidas de parâmetros que colocam em jogo intensidades lumino- 25 sas muito diferentes, tipicamente uma medida de extinção e uma medida de fluorescência.

Essa característica permite, portanto, acrescentar uma medi- da no canhão de emissão.

O dispositivo, de acordo com a invenção, é, en- tão, ainda mais modulável, pois o primeiro detector pode ser utilizado, seja para uma medida de extinção, seja para uma medida de um outro parâmetro 30 óptico.

A presença dessa dupla medida na mesma banda espectral permite acrescentar parâmetros para a classificação das células sem necessidade de mudança material no meio do banco de medidas, desde que uma fluores-

cência nessa banda espectral existe e pode vantajosamente ser utilizada na classificação das células.

Isto evita de ter de instalar vias bem distintas para as medidas de fluorescência_ Segundo uma aplicação particular, o primeiro detector realiza uma medida de extinção, o segundo detector realiza uma 5 medida de difração nos ângulos maiores e o terceiro detector realiza uma medida de fluorescência.

As medidas assim obtidas permitem a contagem e a diferencia- ção de 8 populações de células nucleadas ou ainda uma imunofenotipagem, em função das amostras analisadas e da análise dos resultados feita em 10 conseqüência da confecção de medidas.

Em uma outra aplicação particular da invenção, o primeiro detec- tor realiza uma medida de extinção, o segundo detector realiza uma medida de fluorescência e o terceiro detector realiza uma medida de fluorescência.

As medidas assim obtidas permitem a detecção de determina- 15 das particularidades, por exemplo, colocadas em evidência por fluorocro- mos, ou ainda uma imunofenotipagem em função das amostras analisadas e da análise dos resultados feita na seqüência da realização de medições.

De acordo com uma característica preferencial, os dois espelhos dicroicos têm propriedades ópticas idênticas, gerando o reflexo total dos 20 comprimentos de ondas superiores ao comprimento de onda da segunda fonte e inferiores aos comprimentos de ondas da primeira fonte.

Essa característica permite modificar à vontade as medidas as- sociadas a cada detector sem ter de modificar a estrutura física do dispositi- vo, de acordo com a invenção. 25 De acordo com uma característica particular da invenção, pelo menos um outro espelho dicroico é acrescentado no canhão de emissão elou o canhão de recebimento.

A introdução de um segundo espelho dicroico apresentando as características adaptadas em pelo menos um dos canhões permite acres- 30 centar uma outra medida a 90° do eixo óptico principal.

O princípio da inven- ção pode assim ser completado pela introdução de vários espelhos dicroicos em cada um dos canhões de recebimento elou de emissão.

A multiplicidade das medidas pode ainda ser aumentada e a classificação das particulares é, então, ainda mais precisa e podendo comportar mais classes.

Breve descrição dos desenhos Outras características e vantagens da presente invenção so- 5 bressairão da descrição feita abaixo, com referência aos desenhos anexa- dos que dela ilustram um exemplo de realização desprovido de qualquer ca- ráter limitativo.

Nas figuras: - a figura 1 mostra um dispositivo, de acordo com a invenção; - a figura 2 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- 10 positivo, de acordo com a invenção, no caso de um sangue que não apre- senta patologia obtida com os parâmetros de resistividade RES e de extin- cão EXT; - a figura 3 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- positivo, de acordo com a invenção, no caso de um sangue que contém eri- 15 troblastos, obtida com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT e de fluorescência FL1 = TO; - a figura 4 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- positivo, de acordo com a invenção, no caso de um sangue contendo basófi- los, obtida com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT, de 20 fluorescência FL1 = TO e de difração nos ângulos maiores SSC; - a figura 5 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- positivo, de acordo com a invenção, no caso de um sangue contendo imatu- ros granulosos, obtida com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT, de fluorescência FL1 = TO e de difração nos ângulos maiores SSC; 25 - a figura 6 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- positivo, de acordo com a invenção, no caso de um sangue contendo células imaturas obtida com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT e de fluorescência FL1 = TO; - a figura 7 mostra uma classificação celular, obtida com um dis- 30 positivo, de acordo com a invenção, no caso de uma leucemia linfoide obtida com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT, de fluorescência FL1 = TO e de difração nos ângulos maiores SSC;

- as figuras 8a e 8b mostram as matrizes comuns obtidas com um dispositivo, de acordo com a invenção, e com um dispositivo da técnica anterior com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT, de fluo- rescência FL1 = TO, no caso de um sangue mielodisplásico; a figura 8c 5 mostra uma matriz obtida unicamente com um dispositivo, de acordo com a invenção, que utiliza o novo parâmetro da difração nos ângulos maiores SSC; - a figura 9 ilustra um sangue cujo índice de refringência dos neutrófilos é muito baixo, essa ilustração sendo obtida graças à medida de 10 extinção EXT; - a figura 10 ilustra um sangue cujos neutrófilos possuem dois índices de refringência distintos, distinguidos sobre a base da medida de extinção EXT; - a figura 11 ilustra o caso de um sangue que tem neutrófilos hi- 15 po-segmentados na base da medida de difração nos grandes ângulos SSC; - a figura 12 ilustra a caracterização linfoblástica das células ima- toras de um sangue na base da medida de difração nos ângulos maiores SSC.

Descrição detalhada de um modo de realização 20 A figura 1 mostra esquematicamente os princípios estruturais e funcionais de um dispositivo, de acordo com a invenção.

O dispositivo óptico compreende um bocal de focalização não visível, pelo menos duas fontes de luz Si e S2 conjugadas ou não na cuba de medida, aptas a emitirem em zonas espectrais diferentes. 25 Uma das duas fontes luminosas Si é de baixa coerência tempo- ral, de comprimento de coerência Lc < 100 pm, com um comprimento de onda central de 650 nm.

Ela define um primeiro eixo óptico.

A segunda fonte de luz S2, aqui situada a 90° do eixo óptico da fonte Si, é constituída por uma ou várias fontes monocromáticas tal como 30 tipicamente utilizada para a detecção óptica tri-paramétricas de fluorescên- cias, anotadas FL1, FL2 elou de uma detecção nos grandes ângulos, anota- da SSC, de acordo com uma das configurações escolhidas descritas a se-

guir.

A fonte de luz S2 é vantajosamente constituída com um diodo laser de comprimento de onda 488 nm que permite de gerar os fenômenos de fluo- rescência em células marcadas com Tiazol Laranja.

Uma cuba de medida CUM é colocada na interseção dos eixos 5 ópticos das duas fontes luminosas Si e S2. Em uma realização vantajosa, um capilar dirige a suspensão ce- lular em um bocal de focalização constituído de um micro-orifício.

Um fluido secundário assegura a centragem da suspensão celular até a travessa do orifício de medida.

Esse orifício é utilizado para o emprego da medida do 10 volume por método elétrico, tipicamente uma medida de resistividade.

Esse orifício é atravessado por uma corrente constante.

Quando uma célula atra- vessa o orifício, a resistividade do canal é modificada e produz uma variação de tensão nos bornes do orifício de contagem.

Essa tensão é proporcional ao volume da célula.

Esse processo de medida é conhecido pela denomina- 15 cão de "Princípio de Coulter" e o conjunto dos dispositivos eletrônicos para seu emprego não é descrito nessa patente.

Em seguida, as células são conduzidas, em uma janela óptica de análise obtida, projetando um retículo de intensidade luminosa tão uni- forme quanto possível na cuba de medida CUM.

A luz difratada, refletida ou 20 absorvida pela partícula induz uma perturbação da propagação da luz, que é detectada pelo dispositivo, de acordo com a invenção.

De acordo com a invenção, o eixo óptico da fonte Si suporta dois elementos ópticos: um canhão de emissão CE situado entre a fonte Si e a cuba de medida CUM e um canhão de recebimento CR situado entre a 25 cuba de medida CUM e o detector D1. A cuba de medida pode ser de seção circular.

Isto gera, entre- tanto, correções ópticas consequentes, que encarecem o custo de fabrica- ção de um dispositivo, de acordo com a invenção.

Em uma realização vanta- josa, a cuba de medida é poligonal, e apresenta pelo menos quatro faces, 30 das quais pelo menos duas faces são paralelas uma à outra.

Essas duas faces paralelas são colocadas de maneira a ficarem perpendiculares ao eixo óptico da fonte Si.

Com relação ao eixo óptico da segunda fonte S2, ele se-

rã perpendicular a uma outra face da cuba de medida CUM.

A realização preferencial segunda a qual o eixo da segunda fon- te S2 é perpendicular ao eixo da primeira fonte Si emprega vantajosamente uma cuba de medida com quatro faces.

Isso permite uma realização muito 5 simples e pouco onerosa do dispositivo, de acordo com a invenção.

Com efeito, nesse caso, as correções ópticas a serem realizadas para a travessa das paredes da cuba são fáceis e a orientação dos eixos ópticos é ótima.

O canhão de emissão CE compreende uma óptica de enforma- ção OM.

Essa óptica OM ilustra um retículo sobre o fluxo amostra oriunda do 10 bocal, e presente na cuba de medida CUM.

A óptica de enformação OM é tal que, em uma parte do caminho, anotada CM, o feixe luminoso é colimado.

O canhão de recebimento compreende uma óptica de coleção OC para coletar a imagem do retículo para um detector D1. Salvo se o co- nhecimento da extinção não for desejado, o detector D1 realiza uma medida 15 de extinção EXT.

De acordo com a invenção, a óptica de coleta OC é tal que em uma parte do caminho, anotada com CC, o feixe luminoso é colimado.

A óptica de enformação OM é tal que, no nível da cuba de medi- da CUM, a abertura numérica do feixe luminoso convergente é ON1 = n*sen u, n sendo o índice óptico do ar (portanto n = 1) e u sendo o semiângulo de 20 abertura no nível da entrada da óptica de enformação OM.

A uniformidade de iluminação é tradicionalmente obtida por uma montagem de tipo Kohler.

Em seu princípio, a iluminação de Kohler consiste em ilustrar a fonte de luz Si na óptica de coleta OC.

Isso permite, por um lado, ter uma imagem única da fonte Si situada na pupila da óptica de coleta 25 OC e, por outro lado, uniformizar a repartição da luz na imagem do retículo.

A fonte Si é vantajosamente um diodo eletroluminescente com cavidade ressonante.

Esses diodos apresentam a vantagem de mostrar um espectro bem determinado com comprimentos de onda absorvidos pelas células que se quer caracterizar.

Assim, para as medidas de extinção, um diodo eletroluminescente com cavidade ressonante que apresenta um pico espectral centrado no comprimento de onda 650 nm e de banda passante de 40 nm é vantajosamente utilizado.

Todavia, é conhecido que esse diodo emi-

te no vermelho, mas apresenta um harmônico no verde.

É, portanto, neces- sário colocar um filtro passa banda no canhão de emissão CE para evitar que essa componente verde venha poluir as outras medidas, por exemplo, de fluorescência, gerando um ruído de fundo.

Vantajosamente, o canhão de 5 recebimento compreende o mesmo filtro, a fim de só considerar o sinal de extinção.

O sistema de iluminação pode ser baseado sobre a utilização de uma fibra óptica conformada, de acordo com a indicação na patente WO 20061053960 da Requerente. 10 De maneira geral, o dimensionamento do banco óptico é basea- do no tamanho de uma janela óptica desejada, assim como sobre abertura do feixe na célula de contagem ou cuba de medida.

A imagem do retículo é tipicamente de forma retangular e suas dimensões são fixadas por dois limi- tes.

A maior dimensão é fixada pelo tamanho do fluido de envoltório, esse 15 diâmetro sendo sensivelmente aquele do orifício, servindo para a medida volumétrica.

Ela é, portanto, fixada em torno de 100 pm.

A menor dimensão determina a resolução espacial da medida, que é a capacidade de discrimi- nar duas células muito próximas.

Idealmente, essa dimensão deve ser a menor possível.

A partícula biológica que atravessa a janela luminosa à ve- 20 locidade v, a menor dimensão da janela define a duração de exposição da célula ao fluxo luminoso e, portanto, a duração do impulso elétrico corres- pondente aos fenômenos físicos de extinção de difração no eixo.

Pratica- mente, essa dimensão é da ordem de 30 pm.

Anotar-se-á na passagem que o fator de espectro da janela de análise é, então, da ordem de 3. Deve ser 25 observado que a abertura numérica do feixe da óptica de recebimento é i- gual àquela do feixe de iluminação.

Têm-se então ON2 = ON1. Vantajosamente, quando o dispositivo funciona em regime de extinção EXT com o detector D1, o feixe de iluminação de abertura angular compreendido entre 1° e 60° é escolhido em função do intervalo de volume, 30 do intervalo de índice de refração e da composição intracitoplasmática das partículas estudadas.

Ele apresenta o comprimento de onda central escolhi- do.

Ele apresenta também uma uniformidade de iluminação melhor que 10%

em um volume de medida paralelepipédica axbxc na qual axb é a seção re- tangular do feixe, cujo fator de aspecto alb é inferior a 4 e c é a profundidade de campo definida como intervalo geométrico em torno do ponto de medida para o qual a potência não varia mais de 10%. 0 valor desse intervalo fica 5 situado tipicamente em torno de 500 pm +1- 250 pm.

Referindo-se à segunda fonte luminosa S2, o posicionamento de seu eixo de maneira tal que esse eixo óptico cruze aquele da primeira fonte Si, é particularmente vantajosa.

Com efeito, o eixo óptico da fonte de luz a menos coerente Si, emitindo nos comprimentos de onda centrados em torno 10 de 650 nm e servindo tipicamente para fazer uma medida de extinção, fica alinhado com aquele de um detector de luz D1, tipicamente um fotodiodo.

Ao mesmo tempo, o eixo óptico da fonte de luz 52 de excitação da fluorescên- cia elou de difração é perpendicular aos eixos ópticos do detector D1 e da outra fonte de luz S1. Anota-se no caso que um simples cruzamento dos 15 eixos ópticos com um ângulo distinto de 90° permite obter também as vanta- gens descritas.

Essa característica permite, além disso, um bom comportamento do detector D1 para a extinção, a fluorescência e a difração, se for necessá- rio utilizar o detector D1 para a medida de um desses parâmetros.

Com efei- 20 to, quando o detector D1 funciona em regime de extinção, para o qual o de- tector D1 mede um parâmetro de extinção EXT, assegura-se que o detector D1 fica bem situado face à fonte de luz.

A detecção é feita assim sobre fun- do claro.

Vantajosamente, um filtro F1 permite filtrar espectralmente os com- primentos de onda oriundos da fonte Si. 25 Quando o detector D1 é utilizado para uma medida de fluores- cência, colocando a fonte a mais coerente S2, tipicamente um laser, para induzir a fluorescência do ou dos marcadores ou corantes presentes sobre ou na célula no momento da passagem da célula sobre o caminho óptico perpendicular ao detector D1, a arquitetura, de acordo com a invenção, per- 30 mite que a medida seja feita sobre fundo negro.

Isto é, com efeito, necessá- rio, quando a detecção da fluorescência é feita obrigatoriamente na banda de freqüências da extinção.

Nesse caso, a detecção da FL2 é feita obrigato-

riamente na banda de freqüências da extinção e a fonte Si deve ser obriga- toriamente apagada.

O posicionamento a 90° apresenta, todavia, a vanta- gem de simetrizar o dispositivo, de acordo com a invenção.

Além disso, isto permite uma utilização amplamente facilitada.

Anota-se no caso, neste caso, 5 o detector D1 compreende vantajosamente um ganho variável comutável, permitindo-lhe medir as intensidades luminosas muito diferentes conforme indicado na patente FR 2 933 192 da Requerente.

De acordo com a invenção, o dispositivo inclui dois espelhos di- croicos MR e ME judiciosamente escolhidos em função dos parâmetros que 10 se deseja medir.

O primeiro espelho dicroico MR é inserido no canhão de recebimento CR no nível em que o feixe luminoso é colimado.

O segundo espelho dicroico ME é inserido no canhão de emissão CE, e, de maneira original, explora o princípio de retorno inverso da luz.

Na realização preferencial da invenção, os dois espelhos MR e 15 ME são idênticos.

Eles provocam o reflexo total dos comprimentos de ondas superiores ou iguais ao menor dos comprimentos de ondas da ou das fontes situadas a 900 e inferiores aos comprimentos de ondas da primeira fonte Si.

Os custos de fabricação do dispositivo, de acordo com a invenção, são as- sim limitados.

No exemplo apresentado, esses espelhos MR e ME deixam, 20 portanto, passar a 98% a componente vermelha, oriunda da primeira fonte S1, e refletem a componente azul e verde da fluorescência FL1. Os espelhos MR e ME permitirão vantajosamente separar os componentes difrativos nos ângulos maiores, anotada com SSC, elou de fluorescência oriundas da interação entre a luz emitida pela fonte Si e pela 25 célula observada.

Assim, essa montagem óptica permite notadamente sepa- rar facilmente populações de células, por exemplo, as 8 populações de célu- las nucleadas em uma amostra de sangue total, pois permite dispor de uma diversidade até aqui desconhecida de medidas de parâmetros em um único dispositivo. 30 De acordo com a invenção, a montagem óptica é mais simples que os dispositivos da técnica anterior.

Com efeito, a exploração do princípio de retorno inverso da luz permite acrescentar uma medida de difração aos ângulos maiores ou de fluorescência, sem modificar a estrutura geral do dis- positivo, acrescentando somente espelhos dicroicos.

Para realizar essas medidas, a fonte S2 é ativada.

A luz oriunda da fonte S2 é focalizada com o auxílio de uma lente convergente L2 no plano 5 perpendicular ao plano de medida da extinção.

A imagem obtida no ponto de medida é uma elipse que mede aproximadamente 100 pm x 30 pm pelas mesmas razões que aquelas citadas anteriormente.

Devido ao fato da fonte S2 ser um diodo laser e, portanto, apresenta um feixe elíptico, previamente escolhido com uma relação de 113, na saída, não está na obrigação de inse- 10 rir um sistema óptico geralmente bem caro para enformar o feixe bem co- nhecido do técnico.

A luz oriunda da interação entre a luz emitida pela fonte S2 e pe- Ia célula toma o trajeto inverso no canhão de emissão.

A componente difrati- va é separada da componente de extinção pelo espelho dicroico ME coloca- 15 do no canhão de emissão.

A luz oriunda de fluorescência é separada da componente de extinção pelo espelho dicroico ME colocado no canhão de recebimento.

A luz difratada nos ângulos maiores SSC é coletada pela óptica de enformação OM do canhão de emissão CE, segundo o princípio de retor- 20 no inverso da luz.

O espelho dicroico ME inserido na óptica de enformação OM, permite refletir essa componente a 900 do eixo de extinção para um de- tector D3. A fluorescência sendo isotrópica, isto é, que esta emite raios lu- minosos uniformemente em todas as direções do espaço, um filtro passa 25 banda, anotado com F3, centrado sobre o comprimento de onda da fonte S2 permite suprimir a componente de fluorescência da medida de difração nos ângulos maiores SSC efetuada pelo detector D3. O filtro F3 é vantajosamen- te um filtro passa banda centrado sobre 488 nm com um bloqueio de 10-6 sobre a componente de fluorescência.

A associação da óptica de enforma- 30 cão OM, do filtro F3 e do detector D3 permite uma medida da difração nos ângulos maiores anotada com SSC.

Vantajosamente, uma óptica comple- mentar, anotada com OE, é colocada na seqüência do espelho dicroico ME entre este e o detector D3. Essa óptica OE permite focalizar o feixe de difra- ção proveniente do espelho dicroico ME sobre o detector D3. A fluorescência FL1 é coletada pela óptica de coleta OC do ca- nhão de recebimento CR.

O espelho dicroico MR, inserido no meio da óptica 5 de coleta OC, permite refletir essa componente a 900 do eixo óptico da fonte Si para um detector D2. Para separar o componente difrativo, um filtro pas- sa banda F2, centrado sobre o pico de fluorescência esperada de FL1 é in- serido sobre o caminho óptico situado entre o espelho dicroico MR e o de- tector D2. O filtro F2 é vantajosamente um filtro passa banda centrado sobre 10 530 nm associado a um filtro NOTCH duplo que suprime, com um bloqueio 10-a, a componente de difração que é em média 1000 vezes superior a com- ponente de fluorescência para uma marcação ao Tiazol Laranja e a compo- nente vermelha oriunda da primeira fonte Si.

A associação da óptica de co- leta OC do filtro F2 e do detector D2 permite uma medida de fluorescência, 15 anotada com FL1. Vantajosamente, uma óptica complementar, anotada com OR, é colocada na seqüência do espelho dicroico MR entre este e o detector D2. Essa óptica OR permite focalizar o feixe de fluorescência proveniente do espelho dicroico MR sobre o detector D2. A configuração da montagem, de acordo com a invenção, é tal 20 que a fluorescência FL1 e a difração nos ângulos maiores SSC são coleta- das por uma parte da óptica também destinada à medida de extinção EXT.

Essa abordagem permite chegar a um nível de integração ótimo característi- co da invenção.

Uma redução dos custos de realização e uma facilidade de utilização são, portanto, vantagens importantes dessa invenção. 25 Com esse dispositivo, cada célula é medida em quadriparamétri- co, a saber: uma medida de resistividade, uma medida de extinção, uma medida de fluorescência e uma medida de difração nos ângulos maiores.

O dispositivo, de acordo com a invenção, compreende assim uma óptica OC associada a um filtro F1 que filtra em comprimento de onda a 30 imagem do retículo, uma óptica OE assim como filtro passa banda F3, cen- trado sobre o comprimento de onda da fonte S2 coletando a difração nos ângulos maiores SSC oriunda da interação entre a luz oriunda da fonte S2 e a célula observada, uma óptica OR assim como um filtro passa banda F2, centrado sobre o pico da fluorescência, coletando esta oriunda da interação entre a luz emitida pela fonte S2 e a célula e dois espelhos dicroicos MR e ME permitindo separar os componentes difrativa e de extinção, por um lado, 5 e as componentes de fluorescência e de extinção, por outro lado, e enfim três detectores D1, D2 e D3 que são três fotodiodos ou preferencialmente, de maneira respectiva, dois fotodiodos e um fotodiodo com efeito avalanche de ganho variável.

Classicamente, as luzes de fluorescência e de difração são se- 10 paradas sobre a base de suas propriedades espectrais.

Para isso, utilizam- se, geralmente, filtros ópticos interferenciais F1, F2, F3 do tipo multi- dielétricos, isto é, filtros obtidos pelo depósito alternado de dois ou vários materiais transparentes tendo índices de refração distintos.

São vantajosa- mente filtros de bombardeamento iônico, o que lhe confere um bloqueio mui- 15 to bom fora da banda e uma transmissão muito boa.

Esses filtros F1, F2, F3 são instalados sobre os caminhos luminosos entre a cuba de medida CUM e os detectores D1, D2, D3, em função das medidas desejadas.

Os filtros di- versos podem ser utilizados em função dos comprimentos de ondas de fluo- rescência esperadas e comprimentos de onda de iluminações utilizadas. 20 0 dispositivo, de acordo com a invenção, pode assim ser modu- lado escolhendo-se extrair os parâmetros mais pertinentes para a aplicação visada: medida e de diferenciação dos leucócitos imunofenotipagem ou de- tecção de certas características particulares das populações celulares pre- sentes na amostra, etc.

Com efeito, a extinção faz intervir em uma ampla 25 medida aos fenômenos de refringência/difração celular.

No caso de utiliza- ção de Tiazol laranja, a fluorescência caracteriza o conteúdo em ARN de cada célula.

Enfim, a difração nos ângulos maiores SSC reflete a lobularida- de das células.

Esse conjunto de medidas permite obter suficientemente da- dos confiáveis para serem obtidos resultados sensíveis e específicos sobre o 30 conjunto das populações celulares estudadas.

As modulações podem ser, por exemplo: • Resistividade RES, Extinção EXT, Side scatter SSC e uma flu-

orescência FL1 para a medida e a diferenciação de 8 populações de células nucleadas; • Resistividade RES, Extinção EXT, duas Fluorescências, FL1 e FL2, para a detecção de certas particularidades, por exemplo, colocadas em 5 evidência por fluorocromos. • Resistividade RES, Extinção EXT ou uma Fluorescência FL2, side scatter SSC e uma Fluorescência FL1 para uma aplicação em imunofe- notipagem.

Quando a medida nos ângulos maiores SSC é substituída por 10 uma fluorescência FL2, o filtro passa banda centrado sobre o comprimento da fonte S2 é substituído pelo mesmo tipo de filtro centrado sobre o pico de emissão da fluorescência FL2. Deve ser anotado que os feixes oriundos de Si e de S2 devem então ser conjugados no ponto de medida.

É apenas nesse caso que será judicioso defasar temporalmente as medidas das fluo- 15 rescências FL1 e FL2 oriundas de duas fontes monocromáticas utilizadas para as medidas de fluorescências S2 e S3, esta última fonte S3 sendo co- locada no mesmo local que a fonte S2. A medida da segunda fluorescência poderá ser efetuada sobre o detector D3 colocado do lado do canhão de e- missão CE ou ser realizada com o detector D1 que serve também para a 20 medida de extinção.

Nesse caso, o detector D1 apresenta um ganho comu- tável a fim de poder medir intensidades de ordens de grandeza muito dife- rente.

A segunda fluorescência será vantajosamente uma fluorescência sobre um marcador leucocitário do tipo CD45. Esse marcador tem a caracte- 25 rística de provocar uma fluorescência a cerca de 665 nm que corresponde à banda passante do diodo que constitui a primeira fonte Si.

Essa fluorescên- cia permite evitar ter de mudar os filtros sobre o caminho óptico para o de- tector D1. Com efeito, para aceder à medida de fluorescência sobre o detec- tor D1, a única obrigação é de ter de apagar a primeira fonte Si, quando 30 uma de uma marcação no CD45. A medida dessa segunda fluorescência é, então, realizada com o detector D1 oscilado em modo avalanche.

Em uma outra configuração, o filtro passa banda F3 pode ser substituído pelo mesmo tipo de filtro centrado sobre este, sobre o pico de fluorescência FL2. Nesse caso, o acréscimo de uma segunda fonte mono- cromática situada também a 900 do eixo da fonte Si permite a medida da segunda fluorescência.

Deve ser anotado que, nesse caso preciso, é prefe- 5 rível que as medidas de fluorescências sejam defasadas temporalmente, a fim de evitar o fenômeno de compensação conhecido do técnico.

Um quinto parâmetro que mede a difração nos ângulos menores FSC ("Forward Scatter", em inglês) poderá ser acrescentado em determina- das aplicações colocando um detector no eixo do laser.

Observa-se que es- 10 se detector poderá ser utilizado como um acionador das medidas ópticas.

A medida de resistividade é, então, vantajosamente associada, a fim de se obter uma informação volumétrica, além da contagem absoluta.

Esses pa- râmetros permitem também caracterizar as plaquetas que são os menores elementos do sangue, utilizando o mesmo dispositivo. 15 0 dispositivo descrito no que precede é utilizada para a identifi- cação e a caracterização dos eritroblastos, assim como sete populações leucocitárias que são os linfócitos, os monócitos, os neutrófilos, os eosinófi- los, os basófilos, os imaturos granulosos e as células imaturas.

Esse dispositivo analisador de líquido biológico é ligado a meios 20 de recebimento para receber os dados medidos correspondentes a n = 4 parâmetros físicos: altura resistiva RES, altura SSC, altura extinção EXT e altura FL1. Vantajosamente, o parâmetro de fluorescência FL1 = TO para Tiazol laranja corresponde a uma fluorescência após marcação no Tiazol laranja.

Em sua versão de base, o reagente "Fluowhite" (patente FR 2 821 25 428) fabricado pela sociedade Horiba Medical permite uma lise total dos gló- bufos vermelhos, preservando e marcando no Tiazol Laranja o conjunto das células nucleadas contidas no sangue total.

Esses n parâmetros definem um acontecimento.

Efetua-se, em seguida, a classificação de cada acontecimento 30 de acordo com uma das oito populações celulares apresentadas acima.

Os meios de visualizações são matrizes, isto é, espaços ortogonais que utilizam cada um dois parâmetros de medidas.

As quatro matrizes usuais que permitem essa visualização são, em geral: RESxEXT, SSCxFL1, EXTxFL1 e EXTxSSC.

Segundo o dispositivo da invenção, no caso de um sangue que não apresenta patologia, as medidas RES e EXT são suficientes para identi- 5 ficar completamente as populações linfócitos L, monócitos M, neutrófilos N e eosinófilos E.

A figura 2 mostra uma classificação celular no caso de um san- gue que não apresenta patologia.

Todavia, essas misturas não permitem apenas resolver a identi- 10 ficação dos basófilos, dos eritroblastos, dos imaturos granulosos e das célu- las imaturas.

Essas populações sendo freqüentemente reveladoras de uma patologia, é importante poder identificá-las e contá-las o mais precisamente possível.

O dispositivo, de acordo com a invenção, permite uma identifica- 15 ção precisa dos eritroblastos, graças à medida em fluorescência FL1 permi- tida pela invenção.

Os eritroblastos podem possuir a mesma altura resistiva, a mesma altura em extinção e a mesma altura em SSC que os linfócitos.

Todavia, após ter incubado a amostra com o Tiazol Laranja específico dos ácidos nucléicos, os eritroblastos têm uma resposta em fluorescência menor 20 que os linfócitos.

Assim, a medida da fluorescência FL1 é necessária para identificar corretamente os eritroblastos_ A figura 3 ilustra essa vantagem no caso de um sangue contendo eritroblastos representados por pontos negros envolvidos ERB nessa figura.

Anota-se aqui e na seqüência que determina- dos somente dos pontos visíveis nas zonas envolvidos representam as po- 25 pulações identificadas, trata-se dos únicos pontos negros.

Zonas envolvidas são utilizadas por razões gráficas.

Sempre após ter incubado a amostra com o Tiazol Laranja, o dispositivo permite uma identificação precisa dos basófilos, graças à medida em fluorescência FL1 e a medida de difração nos ângulos maiores SSC.

Os 30 basófilos têm uma posição muito difusa na matriz RESxEXT e são facilmente confundidos com os linfócitos, monócitos e neutrófilos.

Também, em caso de presença de basófilos, a identificação dessas populações com as únicas medidas em RES e EXT é impossível.

Ao contrário, os basófilos são facil- mente identificáveis na matriz SSCxFL1, conforme ilustra a figura 4. Os ba- sófilos são representados pelos pontos negros envolvidos BAS nessa figura.

O dispositivo permite uma identificação precisa dos imaturos 5 granulocitários, graças à matriz EXTxFL1. A medida em fluorescência FL1, sempre graças ao Tiazol Laranja, permite determinar a maturidade dos gra- nulosos, neutrófilos ou imaturos granulosos.

Os imaturos granulosos podem possuir as mesmas alturas resistivas, SSC e FL1 que monócitos.

Assim, pa- ra poder identificá-las perfeitamente, as medidas em extinção EXT e de fluo- 10 rescência FL1 são necessárias.

A matriz SSCxFL1 é menos discriminante, todavia, ela é utilizada em caso de hipogranulação dos neutrófilos e dos ima- turos granulosos.

A figura 5 ilustra essa vantagem, no caso de um sangue que possui imaturos granulosos que são representados por pontos negros envol- 15 vidos IG nessa figura.

O dispositivo, de acordo com a invenção, permite uma identifica- ção precisa das células imaturas, graças à medida em fluorescência, sempre com o Tiazol Laranja.

Com efeito, as células imaturas que possuem mais ARN que as células maduras, sua resposta em fluorescência é mais impor- 20 tante.

A figura 6 ilustra essa vantagem.

Vê-se que as células imaturas repre- sentadas por pontos negros contando dentre as particuladas envolvidas CIM nessa figura são mais diferenciadas no diagrama (SSC, TO) que no diagra- ma (ABS, RES). O conjunto das duas figuras permite, todavia, uma boa dife- renciação. 25 0 dispositivo permite, ainda, uma identificação precisa das célu- Ias imaturas no caso de patologia linfoide, graças à medida em SSC.

Os lin- foblastos possuem as mesmas alturas resistivas, extinção e FL1 que os mo- nócitos.

Assim, para poder identificá-los perfeitamente, a medida comple- mentar em SSC é necessária.

A figura 7 ilustra essa vantagem no caso de 30 uma leucemia linfoide.

Os linfoblastos são, no caso, representados por pon- tos negros envolvidos CIM-L.

O dispositivo permite, portanto, vantajosamente identificar as se-

- 22/24 te populações leucocitárias assim como as eritroblastos, no caso de sangues normais e no caso de sangues patológicos.

Por outro lado, ele demonstra também sua superioridade no caso de patologias freqüentemente encontra- das sobre as células maduras. 5 As figuras 8a e 8b mostram as matrizes comuns obtidas com o auxílio do dispositivo, de acordo com a invenção, e com um dispositivo da técnica anterior com os parâmetros de resistividade RES, de extinção EXT, de fluorescência FL1 = TO, nos casos de um sangue mielodisplásico.

Nes- sas matrizes, é impossível identificar os neutrófilos desgranulados NDG que 10 são confundidos com os monócitos e os linfócitos.

A figura 8c, ao contrário, mostra uma matriz obtida unicamente com um dispositivo, de acordo com a invenção, utilizando o novo parâmetro de medida da difração nos ângulos maiores SSC que permite identificar os neutrófilos desgranulados NDG.

O dispositivo, de acordo com a invenção, permite ainda uma ca- 15 racterização da granulação dos neutrófilos, graças à medida em extinção EXT.

Com efeito, a presença de granulações aumenta a altura em extinção EXT, é porque os neutrófilos e eosinófilos têm uma extinção EXT superior aos linfócitos e monócitos que não possuem granulação.

Assim, é possível definir um índice de granulação.

Este é calculado como a média dos índices 20 de refringência dos neutrófilos.

A figura 9 ilustra um sangue, cujo índice de refringência dos neutrófilos representados por pontos negros envolvidos NEU é muito baixo.

O dispositivo, de acordo com a invenção, permite têm "alarmar" um sangue que possuiria uma população de neutrófilos normais e uma po- 25 pulação de neutrófilos desgranulados.

Isto se traduz pela presença de neu- trófilos que apresentam dois índices de refringências distintos.

Isto pode ser detectado pela utilização da medida em extinção EXT.

A figura 10 ilustra um sangue cujos neutrófilos representados pelos pontos negros envolvidos NEU e NDG possuem dois índices de refringências distintos. 30 0 dispositivo, de acordo com a invenção, permite uma caracteri- zação da iobularidade dos neutrófilos, graças à medida em SSC.

A medida SSC é muito sensível à estrutura interna da célula e reflete, portanto, a for-

ma do núcleo.

Assim, quanto mais o núcleo possui lobos, mais a altura em SSC vai ser grande e inversamente.

Assim, é possível definir um índice de lobularidade como a média das alturas em SSC dos neutrófilos.

A figura 11 ilustra o caso de um sangue que tem neutrófilos hipo-segmentados que es- 5 tão representados pelos pontos negros envolvidos NHY.

O dispositivo, de acordo com a invenção, permite uma caracteri- zação do tipo de células imaturas, graças à utilização do SSC.

Quanto me- nor for a média em SSC das células imaturas, mais haverá chances para que se trate de linfoblastos.

A média em SSC dos linfoblastos se situa em 10 torno de 245, aquela dos monócitos em torno de 644 e aquela dos HRC (Hi- gh RNA Content ou células ricas em ARN) em torno de 332. A figura 12 ilus- tra a caracterização linfoblástica das células imaturas de um sangue.

Os lin- foblastos são representados pelos pontos negros envolvidos LYM.

Deve ser observado que esse dispositivo poderá permitir tam- 15 bém colocar em evidência glóbulos vermelhos de formas e de tamanhos di- ferentes.

Poder-se-ão assim colocar em evidência, por exemplo, glóbulos vermelhos com as inclusões, hemácias falciformes, etc.

Para isto, o disposi- tivo, de acordo com a invenção, compreende duas medidas de fluorescência que ocorreram para comprimentos de onda de iluminação distintos.

Filtros 20 particulares serão então utilizados.

O interesse da imunofetipagem por citometria em fluxo (CMF) em biologia clínica atinge numerosos domínios notadamente: • a descrição das populações normais no sangue, a medulas e os diferentes órgãos; 25 • a análise dos antígenos de diferenciação leucocitária; • a estudo do nascimento, da vida, da morte celular; • a descrição dos mecanismos de sinalização celular e diferen- tes funções celulares; • a exploração das rubricas da imunopatologia: diagnóstico e 30 controle dos déficits imunitários, diagnóstico e seguido das doenças autoi- munes, imunologia dos enxertos e dos transplantes, doenças linfo- proliferativas, hipersensibilidades;

• a participação no diagnóstico em numerosas doenças hemato- lógicas; • e no domínio da cancerologia, avaliação das reações do hos- pedeiro contra o tumor, e seguido da imunoterapia. 5 A possibilidade de identificar em citometria em fluxo antígenos celulares e aí o estudo dos ácidos nucléicos, do ciclo celular e a ploidia fez vencer um grande passo para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos de diversas doenças.

No caso da aplicação do dispositivo da invenção em imunofeno- 10 tipagem, o fotodiodo que permite a detecção da extinção é substituído por um fotodiodo com efeito de avalanche conectado a um circuito de polariza- ção apto a inibir o ganho interno de avalanche.

Essa implementação permite reduzir o comportamento do fotodiodo com efeito da avalanche no compor- tamento de um fotodiodo clássico de ganho unitário, tal como utilizado clas- 15 sicamente para as medidas de extinção EXT.

Na ausência de inibição de ganho, o fotodiodo com efeito de avalanche saturaria desde quando fosse utilizado para uma mistura de extinção onde a intensidade luminosa é eleva- da.

Esse processo é descrito na patente FR 2 933 192 da Requerente.

Observa-se enfim que diversas utilizações podem ser feitas, se- 20 gundo os princípios da invenção.

Em particular, outros espelhos dicroicos podem ser instalados em série no canhão de recebimento e no canhão de emissão do dispositivo, de acordo com a invenção, a fim de desviar o feixe luminoso proveniente da cuba de medida em direção aos detectores que fariam outras medidas.

Os espelhos dicroicos serão então todos diferentes, 25 a fim de atingir os componentes do fluxo luminoso para cada um dos detec- tores.

Essa realização que multiplica ainda o número de medidas acessíveis apresenta, todavia, o inconveniente de ser cara de utilizar, por causa da di- versidade e da precisão dos espelhos que devem ser utilizados.

Anota-se também que a utilização de uma cuba de medida que apresenta um número 30 de faces mais elevado do que no exemplo apresentado, por exemplo, com 6 ou 8 faces permitiria multiplicar as medidas, de acordo com os princípios da invenção.

Claims (7)

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo eletro-óptico de medidas em fluxo para a caracte- rização de micropartículas, compreendendo uma câmera de medida (CUM) na qual circula o fluxo do fluido a caracterizar, pelo menos duas fontes lumi- 5 nosas (Si, S2) de espectros disjuntos, um dispositivo de medida de resistivi- dade (RES) e pelo menos três outros detectores (Dl, D2, D3), permitindo cada um a medida de um parâmetro óptico, os parâmetros ópticos sendo escolhidos dentre a fluorescência (FL), a extinção (EXT), a difração nos ãn- gulos maiores (SSC), a difração nos ângulos menores (FSC), o dispositivo 10 eletro-óptico sendo tal que: - a primeira fonte luminosa (Si), a menos coerente, que apre- senta o comprimento de onda o mais elevado, define um eixo óptico principal perpendicular ao fluxo de partículas, o eixo óptico principal suportando dois conjuntos ópticos, situados em ambos os lados da cuba, esse canhão de 15 "emissão" (CE) permitindo a enformação do feixe oriundo dessa primeira fonte (Si) e o outro dito canhão de "recebimento" (CR), permitindo a coleta do sinal oriundo dessa primeira fonte luminosa (Si) e situado após a cuba de medida (CUM); - a segunda fonte luminosa (S2), a mais coerente, apresentando 20 o comprimento de onda mais baixo, define um eixo óptico secundário cru- zando o eixo óptico principal e perpendicular ao fluxo de partículas, - um primeiro detector (D1) é colocado diante da primeira fonte (Si) na extremidade do canhão de recebimento (CR) operando assim em campo claro, 25 - o canhão de recebimento (CR) compreende uma óptica de co- leta (OC) do feixe proveniente da interação entre a primeira fonte luminosa (Si) e as partículas no fluxo em direção ao primeiro detector (D1), essa ópti- ca de coleta (OC) sendo tal que sobre uma parte de seu trajeto (CC), o feixe luminoso transmitido é um feixe substancialmente colimado, 30 - um primeiro espelho dicroico (MR) é colocado no canhão de recebimento (CR) ao nível da parte de trajeto (CC), na qual o feixe luminoso é substancialmente colimado, para refletir parcialmente o feixe luminoso ori-

undo da interação entre a segunda fonte luminosa (S2) e as partículas no fluxo, para um segundo detector (D2) colocado sobre o trajeto do feixe par- cialmente refletido, - o canhão de emissão (CE) compreende uma óptica de enfor- 5 mação (OM) do feixe emitido pela primeira fonte luminosa (Si), essa óptica de enformação (OM) sendo tal que, em uma parte de seu trajeto (CM), o fei- xe luminoso é substancialmente um feixe colimado, - um segundo espelho dicroico (ME) é colocado no canhão de emissão (CE) entre a primeira fonte luminosa (Si) e a cuba (CUM), ao nível 10 da parte de trajeto (CM), na qual o feixe luminoso é substancialmente coli- mado, para refletir parcialmente o feixe oriundo da interação entre a segunda fonte luminosa (S2) e as partículas no fluxo, para um terceiro detector (D3) colocado sobre o trajeto do feixe parcialmente refletido.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado 15 pelo fato de um detector de difração/difusão ser colocado na face da segun- da fonte luminosa (S2) do outro lado da cuba de medida (CUM).

3. Dispositivo, de acordo com uma das reivindicações preceden- tes, caracterizado pelo fato de o primeiro detector (D1) apresentar um ganho comutável que o torna apto a realizar dois tipos de medidas, uma em extin- 20 cão (EXT) e uma outra escolhida dentre as difrações (SSC, FSC) e as fluo- rescências (FL).

4. Dispositivo, de acordo com uma das reivindicações preceden- tes, caracterizado pelo fato de o primeiro detector (D1) realizar uma medida de extinção (EXT), o segundo detector (D2) realizar uma medida de difração 25 nos ângulos maiores (SSC) e o terceiro detector (D3) realizar uma medida de fluorescência (FL1).

5. Dispositivo, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, ca- racterizado pelo fato de o primeiro detector (D1) realizar uma medida de ex- tinção (EXT), o segundo detector (D2) realizar uma medida de fluorescência 30 (FL2) e o terceiro detector (D3) realizar uma medida de fluorescência (FL1).

6. Dispositivo, de acordo com uma das reivindicações preceden- tes, caracterizado pelo fato de os dois espelhos dicroícos (MR, ME) terem propriedades ópticas idênticas, gerando a reflexão total dos comprimentos de ondas superiores no comprimento da onda da segunda fonte (S2) e infe- riores aos comprimentos de ondas da primeira fonte (Si).

7. Dispositivo, de acordo com uma das reivindicações preceden- 5 tes, caracterizado pelo fato de pelo menos um outro espelho dicroico ser acrescentado no canhão de emissão (CE) elou o canhão de recebimento (CR).