CN105917211A - 用于流式细胞仪的光学引擎、流式细胞仪系统及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于台式流式细胞仪的光学引擎，该光学引擎包括激光源组；用于每个激光源的不同的光束整形光学系统组，其中每一组包括两个透镜，沿X轴水平可调地聚焦光线到同一水平位置，并且沿Y轴竖直可调地聚焦光线到沿同一平面的不同竖直位置；采集光学系统，其从流通室中采集荧光；过滤光学系统，其根据波长范围将从流通室中已采集的荧光过滤到不同检测通道中；以及用于每个检测通道的检测器，其将过滤的荧光转换成电信号，其中电信号被处理以使得来自位于不同竖直位置的每个激光源的荧光在同一检测器中被区分。

Description

用于流式细胞仪的光学引擎、流式细胞仪系统及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年11月19日递交的序列号为61/906,367的美国临时专利申请的优先权，以及2014年5月18日递交的序列号为61/994,980的美国临时专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及流式细胞测量仪器，更具体地涉及用于流式细胞仪的具有可互换部件的光学引擎，光学引擎具有用于每个激光源的光束整形光学系统和滤光光学系统组，光束整形光学系统将激发激光光束沿被测样本的流动方向竖直定位在不同位置，过滤光学系统组将来自不同竖直位置的荧光过滤到多个过滤器通路，其中来自每个竖直位置的荧光可以通过同一个检测器单独测量。
背景技术
流式细胞测量是基于激光的生物物理技术，其中，耦合在细胞上的荧光分子通过流通室，并且由激光源组所激活。利用特定的检测波长将荧光采集和分离至不同的通路，并且转换成电信号，通过电脑分析。多色流式细胞测量，例如三色流式细胞测量使用具有不同激发和发射波长的荧光识别生物样本的不同染色情况。具体地，激发光通过光束整形、转向、和导向光学部件而传送至流通室。一般来说，此类部件设置用于使来自全部激光源的光线，在到达流通室前，通过相同组的光束整形、转向和导向光学部件。这种光束整形光学系统包括，例如，消色差透镜(圆柱形或球形)以适应不同激光源的不同波长。此外，光束转向/导向部件引导全部光束至流通室的中心区域到沿着样本流动方向的相同位置或者不同位置。然而，这种方法的局限性是，提供用于激光源组的光学系统组相同，光束整形和光束导向光学系统的作用被折中，，它们将不同波长的光束整形为一些次优的光束尺寸和转向到次优的聚焦位置。因此，需要能够改善光束尺寸和聚焦点的光学照明方法。此外，光束尺寸和聚焦点应该可以根据每个激光源而单独调整。
除了荧光，还有其他两种类型的光散射能够在流式细胞测量中被测量，即侧散射和前向散射。前向散射(FSC)被视为是低角度散射并且大致与细胞的直径成正比。因此，前向散射对于基于细胞的尺寸从其他亚群中识别出特定的细胞亚群有益。由于前向散射通常沿与光束传播相同的路径测量，通常将光束遮挡板添加在流通室的后面，沿着激光束传播的光路来阻挡非散射的、高强度的原激光束。遮挡板设计的挑战在于，它应该阻挡非散射的原激光束，但是允许低角度的前向散射光通过并用于检测。一般来说，遮挡板可以是矩形或者十字形状。遮挡板的几何图形通常是根据经验来设计的，一些几何图形阻挡过多的前向散射光，而其他一些设计又缺乏对非散射光的充分阻挡。因此，需要改进光束遮挡板，使得其能够改进在对非散射光阻挡而允许前向散射光通过阻挡上的平衡。
在另一种流式细胞测量中，荧光从流经流通室中心的粒子(例如细胞)中采集。应用复杂的设计从粒子中采集荧光光线，该复杂的设计包括在相对于彼此和相对于流通室的精确位置上设置多个透镜。这样的采集光学系统制造昂贵，并且校准和调整困难。在很多情况下，光线采集效率是有限的。因此，也需要改善采集光学系统，使其包括更少的光学部件，并且具有高的光束采集效率。
发明内容
本发明解决在流式细胞测量的设计和技术途径中的上述不足之处。本发明的一个方面，提供了一种用于流式细胞仪的光学引擎，该光学引擎包括激光源组，每个激光源被调谐到适合荧光分子激发的波长；用于每个激光源的光束整形光学系统组，其中每组包括两个透镜，可调地将光线沿X轴水平聚焦到同一水平位置，并将光线沿Y轴垂直地聚焦到同一平面内的不同竖直位置，其中该平面作为通过流式细胞仪的流通室的流动路径；采集光学系统，其用于从流通室中采集荧光；过滤光学系统，其根据波长范围，从流通室中将已采集的荧光过滤至不同过滤通道中；以及用于每个过滤通道的检测器，其用于将每个已过滤的荧光转化成电信号，其中电信号被处理，以便将来自每个激光源的不同竖直位置的荧光在同一个检测器中区分出来。对于本申请，每个激光源的光传播方向定义为Z轴，其垂直于水平的X轴和竖直的Y轴。
光学引擎允许使用任意数量的激光源，但在某些实施例中至少具有三个激光源，其中每个激光源被调谐到不同的波长，并聚焦于流通室的不同的竖直位置上。将至少三个激光源中的每一个沿着样本的流动方向分别竖直聚焦在不同位置上，这使得能够通过相同的光检测器区分出由三个不同激光源中的每一个所激发的荧光，因为当通过三个不同激光源中的每一个时，三个不同激光源沿竖直轴线在空间上的分离将转变为由粒子发射的荧光的时序差异。在同一检测器中区分和分离来自不同激发激光源的荧光信号在本发明中是至关重要的，其中来自不同激发激光源的不同荧光信号检测通道共用同一个检测器。激光聚焦点沿流通室的分离，导致在检测到的由空间上分离的激光源所激发的荧光信号上的时间延迟。
参考从特定激光源发射的前向散射，荧光信号的延迟时间是由激光源的分离距离和所检测样本的流速所决定的固定数值，它可用来确定所检测到的荧光信号和对应的激发激光源之间的关系。在其他的方法中，不同的激光源在时域被调制成不同频率。通过对应的调制信号对电信号(从荧光光线转换而来)解调，能够将检测到的荧光与激发激光源相互关联。用于激光源调制和已采集电信号(从荧光光线转换后)的解调的详细设备、方法和技术，可以在名称为“用于在流动通道中检测多个激发诱导光线的系统和方法”的在先申请中找到，其美国专利申请号是13/657,845，并作为引用整体合并于此。在一些实施例中，相邻的竖直位置之间的竖直间隔是80μm。在示例性实施例中，实现了来自单个样本通过流通室的十荧光信号的采集和分析。在另一实施例中，除了前向散射和侧散射测量之外，还可以从通过流通室的单个样本获得十三种荧光信号的采集。要强调本发明的一个重要特征是，来自不同的激发激光源的荧光通道之间共用用于测量和转换荧光光线的检测器。
光学引擎的光学系统包括光束整形光学系统、采集光学系统和过滤光学系统。在优选的实施例中，光束整形光学系统组包括柱面透镜或者鲍威尔棱镜。在优选的实施例中，采集光学系统包括后跟有双合透镜的半球透镜。优选地，半球透镜由高折射率的材料制成。过滤光学系统可以包括长通和/或短通的双色镜、带通过滤器、聚焦透镜和其他过滤器或透镜。在一些实施例中，过滤光学系统通过半球透镜和双合透镜将已采集的荧光光线过滤至检测通道，检测通道具有以下波长特征：780/60nm、615/24nm、530/30nm、445/45nm、585/40nm(或572/28nm)和675/30nm。注意，全部的波长单位都是nm。上述的通道波长仅作为典型地例子，并不用于限制本发明。
每个过滤通道设置检测器，其中，优选地为光电倍增管形式。优选地，荧光光线信号被转换成模拟电信号。同样优选地，模拟电信号然后通过模数转换器(ADC)被转换成数字信号，并且为了提高精度和速度被处理成数字形式。
在优选的实施例中，细胞的前向散射(FSC)特征包括前向散射检测器、采集前向散射光线的前向散射聚焦透镜，以及将入射激光光束与其所要进入的前向散射聚焦透镜和前向散射检测器所隔开的遮挡板。荧光光线检测器处荧光信号的时序与前向散射检测器处的前向散射信号的时序之间的关系，提供用于确定哪个激光源诱导激发了在检测通道中检测的荧光信号的方法。进一步地，通过开发新的遮挡板已实现改进的前向散射检测。在优选地实施例中，提供了一种菱形的遮挡板。在另一实施例中，设置遮挡板来阻挡入射的激光光束，遮挡板为矩形，并且它的水平尺寸与竖直尺寸一样或者长于竖直尺寸。在另一实施例中，遮挡板的周界遵循于阻挡入射激光光束的光线强度分布图的轮廓。在一种实施例中，遮挡板遵循入射激光光束强度分布图的0.1％轮廓线以内的轮廓。0.1％的轮廓线或者边界对应于一条线，其中在轮廓上的每个点的光线强度为入射光线的最大光线强度的0.1％。遵循光线强度分布图在0.1％轮廓以内的轮廓的遮挡板，被确定为从前向散射检测器中阻止99％的非散射光束。因此，本发明还提供了大体为菱形的遮挡板以及它的成形方法，该遮挡板遵循光线强度分布图在0.1％、0.2％、0.5％、1.0％或2.0％的范围内的轮廓线。
光学引擎的部件优选地被设置在单个单元系统中，其可以被移除以及为了改进与其他部件互换。为此目的，还提供了被配置为容纳光学引擎部件的壳体。壳体包括光学引擎部件，如激光源组、光束整形光学系统、采集光学系统、过滤光学系统、检测器，还有过滤器和透镜，以及用于电连接至电路板的电接口，其可以连接外部微处理器或远程计算机。优选地，同一壳体内的部件配置用于不同的激光源、聚焦透镜、长通和短通分色镜、过滤器、针孔通路和检测器的互换。这通过标准化的接合特征完成，如定位孔的定位、扣合、螺纹连接或穿过用于互换的不同部件的其他紧固件，还可以通过为每个激光源单独地设置光束整形光学系统组来完成。在一些实施方案中，流动通道安装在壳体中，并配置用于通过连接管道耦合到流式细胞测量装置，该流式细胞测量装置用于样本(包括粒子，例如微球或细胞)的水力聚焦。
在相关的实施例中，本发明还包括流式细胞仪，其包括任何一种如本文所公开的光学引擎；流动通道；以及与抽吸针流体连通的泵，用于吸取并传送细胞悬浮液通过流动通道。在优选的实施例中，流式细胞仪的进一步特征在于：至少有三个激光源，每个调谐至不同的波长，并聚焦在流通室不同的竖直位置；用于从流通室中采集光线的采集光学系统；以及过滤光学系统，其基于聚焦的激发光束的竖直位置，在相同的通道内区分已过滤的荧光。最后，设置流式细胞测量装置，其除了包括侧散射和前向散射测量之外还包括来自通过流通室的单个样本的多达十种或十三种的荧光颜色通道。
在相关的实施例中，流式细胞测量系统已经被开发出来，其中包括：如本文提供的流式细胞仪；以及软件，其用于在计算机中加载和执行获取并分析流式细胞测量的数据。因此，用于在计算机中加载的流式细胞测量软件被开发。在一些实施例中，软件提供了执行下列功能的程序，从荧光通道中为每个检测器采集数据，其中，由相同的检测器采集到的荧光信号被转换成不同的数据系列，与激光源在不同竖直位置所激发的荧光所对应；产生图形用户界面(GUI)，用于显示所获取数据的多种图，其中，图形用户界面进一步包括与补偿图相邻的补偿滚动条，以调整一个或多个通道之间光谱重叠的补偿；从流式细胞仪中获取数据并将该数据存储到计算机硬盘中作为数据文件。该软件还包括一个圈门功能，其允许用户从数据图中选择亚群，并为所选亚群生成附加的图。该处理可以对于全部荧光通道数据以及侧散射和前向散射数据重复执行。
在又一相关实施例中，提供了流式细胞测量方法，其包括提供本文所述的流式细胞测量系统；用多个荧光标签来标记细胞悬浮液；泵送细胞样本通过流通室；采集流式细胞测量数据；并分析流式细胞测量数据，从而确定在样本细胞上或者样本细胞内多个荧光标签中的一个或多个的存在、不存在或者多少。
附图说明
图1A是示例的流式细胞测量系统5的图片，其包括具有可选的自动进样器20的流式细胞仪10；
图1B提供细胞悬浮液通过光学引擎100的传输概况的示意图；
图2是自动进样器20的图片；
图3是示出在FITC通道(530/30nm)上，在竞争者的流式细胞仪(面板A)中和我们的流式细胞仪(面板B)中，所检测到的六个不同的荧光强度组成的，硬染色微球种群的计数的图，，以揭示我们的装置和系统为信号检测和处理提供了107动态范围，其高于其他流式细胞仪两个数量级；
图4示出对于某种微球，基于已鉴定的浓度和稀释因子，根据我们的流式细胞仪所确定的微球浓度相对于预期的微球浓度的体积测定计数的示意图；该图示出我们的细胞仪的重要特征，其中体积测定注射泵提供非常准确的和可重复的样本体积吸取；
图5是示出典型的光学引擎100的表示的俯视图；
图6示出沿Z轴的三个光路P1-3激光光线传播的示意性俯视图；其中水平X轴与包括三个激光激发源的光学照明系统的激光光线传播方向(即Z轴)垂直；也示出遮挡板190对来自路径P2的非散射光线的阻挡；
图7是绘出流通室130的放大视图的示意图，其示出三个光路P1-P3的共同聚焦位置H和每个光路P1，P2，P3的不同的竖直聚焦位置Vv、Vb、Vr；
图8A-8B示出在有(图8B)或没有(图8A)水力聚焦核心的情况下，流通室在流动通道中心用聚焦的椭圆激光光束照明，在遮挡板位置处的光线强度图，其中所示的水力核心是17μm的流动路径；在图8A中，流动通道的各处充满鞘液流体。在图8B中，流动通道充满鞘液流体并在中心区域设有水力聚焦核心，其中核心的反射率与鞘液流体的反射率不同；
图9示出与在激光光束穿过具有如图8B所示的水力聚焦核心的流动通道，并且每个轮廓线的外部区域所产生的激光功率对应于20mW的激光照明的情况下的光线强度分布轮廓相比下，遮挡板(右侧面板)形状的示意图；
图10是示出使用菱形遮挡板(面板A)、垂直遮挡板(面板B)、或者水平遮挡板(面板C)和使用FSC相对于SSC图以有效识别淋巴细胞(E2种群)的不同能力的一系列图；出于比较目的，SSC相对于CD45的图被用作对每个面板的控制。如示例中所示，当使用菱形遮挡板(面板A)时，淋巴细胞E2种群被从碎片或者其他种群中分离出来；
图11示出来自流通室的流动通道的已采集的光线分离成六个不同荧光波长范围和一个侧散射(SSC)通道的示意图；使用本发明的装置和方法，六个荧光波长范围可以与十三种荧光颜色通道相对应；
图12是一个示意图，其示出来自同一流通室130的三个不同的竖直位置(Vr、Vg、Vb)的荧光光线被采集光学系统采集，并且行进通过分光模块142被带通过滤器144过滤并通过透镜146聚焦以在检测器160中被检测；
图13A示出一系列直方图，其示出我们的细胞仪能够在不同的荧光检测通道上使用八个可区分的荧光强度清楚地分离微球；
图13B前向散射相对于侧散射图，其示出具有尺寸为0.21μm、0.39μm、0.60μm和0.79μm的不同尺寸微球的形象；
图14是当软件系统在电脑上加载和运行时，其图形用户界面的屏幕截图；
图15是通过屏幕上显示的可移动滚动条调整补偿前后示出的图的屏幕截图；
图16示出对于A549细胞来自实验的细胞周期分布的一系列直方图(反映由蓝色激光源激发的在585/40nm通道上测量的DNA含量)；
图17是示出蓝色激光(BL1)的530/30检测通道检测的平均荧光强度(MFI)和变异系数(CV)的Levy-Jennings图的一系列图；
图18示出使用SSC相对于CD45选通淋巴细胞的一系列图，确定CD3+细胞并进一步通过FITC/CD4相对于PerCP/CD8的图识别细胞；
图19是一系列图，其中在CD45RA相对于CD45RO的图中进一步分析CD4+/CD8-细胞；并且，CD45RA+/CD45RO-和CD45RA-/CD45RO+细胞的种群在CCR7相对于CD62L的图中被分析；
图20示出一系列示意图，其比较从我们的流式细胞仪(X轴)中和从竞争者的流式细胞仪(Y轴)中所获得的计数，以证明当在质控的外周血样本中计数全部淋巴细胞、CD3+细胞、CD3+/CD8+细胞和CD3+/CD4+细胞时的密切的统计关系；以及
图21示出一系列示意图，其比较从我们的流式细胞仪(X轴)中和从竞争者的流式细胞仪(Y轴)中所获得的计数，以证明当从来自HIV患者的外周血样本中计数CD3+细胞和全部淋巴细胞、CD3+/CD8+细胞和全部淋巴团，以及CD3+/CD4+细胞和全部淋巴团时的密切的统计关系。
具体实施方式
本发明提供了结合有光学引擎的流式细胞仪，该光学引擎可单独地配置并且通过可互换激光源、光学系统配置和检测器可扩展，提供了多达十五种参数的测量，这为单个样本带来十三色荧光通道。光学引擎内的部件的互换性允许用户根据独特的实验条件和个体需求裁剪激发和检测通道。这允许用户在相同的流式细胞仪中添加或替换部件，同时保持较高的检测灵敏度和分辨率。
为此，我们对流式细胞分析仪的测试证明了高灵敏度、高分辨率和高精度。此外，流式细胞分析仪提供了可靠的直接的绝对细胞计数，其可以用于在淋巴细胞亚群上有多种变化的病症诊断或监测，如人类免疫缺陷病毒(HIV)，无需使用常见于其他商业可用系统中的昂贵的参考微球。值得注意的是，此功能已结合在台式系统中。
流式细胞仪包括：光学引擎，在此以多种非限制的实施例来描述；流动通道；和与抽吸针流体连通的泵体，用于吸取和传送通过流动通道的细胞悬浮液。所示泵体可重复地高速传送细胞通过流体通道以可重复地进行超过35000事件/秒的采样率。此外，附加的自动进样器和可选的振动器以及自动化地将样本馈送到抽吸针，可以实现这样的采样率样本。此外，流式细胞分析仪可在程控下具有例如抽吸针的自动清洗功能，以减少样本转移和交叉感染的可能性。
在优选的实施例中，流式细胞仪中的光学引擎进一步地具有以下特征：具有激光源组，例如一个到三个激光源，每个调谐到适合激发荧光分子的不同波长。通过为每个激光源提供光束整形光学系统组，实现多个激光光束中的每一个改善地聚焦至沿流通室的不同位置，其中每个光束整形光学系统组优选地包括两个透镜，两个透镜可调整地将光线沿X轴水平地聚焦至同一水平位置，并且沿Y轴竖直地聚焦至同一平面的不同竖直位置，该平面具有以下特征：其位于通过流式细胞仪的流通室的流动路径内。对于这里描述的光束整形光学系统，激光光线传播方向被定义为Z轴，其垂直于的水平的X轴和竖直的Y轴。光束整形光学系统优选地包括柱面透镜，使得光束聚焦在流通室的中心线处并且呈椭圆形状。通过分配光束整形光学系统至每个激光源，每个激光源可以精确地聚焦到流通室的不同竖直位置处，从而消除与配置相关联的折中，该配置需要在激光源之间共用光束整形、转向和导向光学系统，如在商业可用系统中常提供的。此外，激光源这种在沿着流通室的不同位置的精确聚焦，允许荧光信号和前向散射信号的时序之间的比较，这可以用来确定已检测的荧光和激发激光源之间的关系。此外，我们的过滤光学系统根据波长范围，过滤来自流通室的已采集的荧光至不同的过滤通道内。每个过滤通道的检测器将过滤光转换成电信号，其中对电信号进行处理，使得来自聚焦激光光束的每个竖直位置的光线(荧光光线)在相同的检测器中被区分开来。不同激光源沿流通室的激光焦点的分离导致荧光信号的时序差异。当与来自特定激光源的前向散射发射相比时，荧光信号的时序将允许确定已检测的荧光和激发激光源之间的关系。例如，对于具有红色、蓝色和紫色激光的三激光源系统，激光光束聚焦到沿流通室的三个不同的竖直位置处，并从低位置到高位置，按照第一个红色，然后蓝色再紫色的顺序。随着粒子(如细胞)移动通过这三个激光光束，对于给定的荧光检测器，由红色激光激发所诱导的荧光光线将在由蓝色激光源诱导的前面，然后由紫色激光源诱导的荧光在由蓝色激光源诱导的之后。假设在粒子通过蓝色激光光束时检测到前向散射，粒子的前向散射时序将与蓝色激光源所诱导的荧光一致。可以开发用于将与前向散射时间一致的荧光光线分配到蓝色激光激发的信号处理方法和算法。基于粒子在流通室的移动速度和激光源之间的竖直分离距离，在蓝色激光诱导的荧光前面给定时间窗口中的荧光光线，可以被分配至红色激光激发。同样地，基于粒子在流通室的移动速度和激光源之间的竖直分离距离，在蓝色激光诱导的荧光后面给定时间窗口中的荧光光线，可以被分配至紫色激光激发。在其它方法中，不同的激光源暂时地调制成不同的频率。例如，红色激光源可以调制到4MHz的频率，紫色激光源可以调制到2MHz的频率，而蓝色激光源可以在非调制恒定功率(CW)模式下操作。通过4MHz的调制信号对来自相同检测器的电信号的解调，将获得由红色激光源所诱导的荧光光线。通过2MHZ调制信号对来自相同的检测器的电信号解调，将获得由紫色激光源诱导的荧光光线。对来自同一检测器的电信号进行低通滤波将滤除由红色激光源和紫色激光源导致的任何调制信号，而产生由蓝色激光源激发的荧光信号。这里说明的例子于用于示出用于区分来自不同的激光源的荧光光线的调制和解调的工作原理。名称为“用于在流动通道中检测多个激发诱导光线的系统和方法”，公开号为20130200277的在先专利申请，描述了在流式细胞仪应用中用于激光光束的调制和解调的装置、方法和技术，并且可以引用于此。用相应的激光激发进行荧光信号的识别，可以通过与前向散射时间一致的方法或者激光调制和荧光解调的方法，或者两者结合来实现。这样，可以在每个检测器处执行检测，以便将已检测的、已过滤的荧光信号分配至被聚焦在沿流通室不同的竖直位置上相应的激光源。
流式细胞仪优选地作为流式细胞测量系统的一部分，其包括用于获取和分析流式细胞测量数据的计算机软件。流式细胞测量软件可操作地将流式细胞仪连接至计算机，并提供各种易于使用的功能。这些功能包括：滑动补偿滚动条，其位置邻近在显示数据图上的相应荧光通道；易于使用的实验管理器；以及示出被圈门选择的种群和相应计数的改进的实验报告。
最后，优选的流式细胞测量系统包括可配置的检测荧光通道；一到三个激光源；优化的光电倍增管电压；自动化的流体维持功能；注射泵采样流体系统；新颖的光学设计，其具有增强的信号检测作为逐细胞甄别的强有力的分析工具。这个系统允许可靠的定量测量，以及快速获取用于高密度多重测定的有统计意义的数据。
现参考附图1A、1B和6，流式细胞测量系统包括流式细胞仪10，流式细胞仪与抽吸针14流体连通用于吸取细胞悬浮液，并且还与容器12流体连通，例如充满鞘液的鞘液容器12a，充满清洗液的清洗液容器12b，以及众所周知的在流式细胞测量领域中用于传送废弃物的废液容器12c。流体容器12可以重复使用或者一次性使用，并且它们连接至内部泵16。图1B示出操作概况，泵16驱动鞘液至流通室130，样本也通过其他机械装置如泵180传送到流通室内。具有悬浮粒子(例如细胞)的样本将在鞘液作用下水力聚焦到流通室的中心。细胞有组织地通过不同的激发激光源会导致荧光产生，这将在光线采集和分光之后由检测器检测出来。有许多方法和途径用于驱动并传送鞘液和包含悬浮细胞的样本流体进入流通室内用于样本流体的水动力聚焦。这些在流式细胞测量技术中是众所周知的，并且通常使用泵16，180，阀门18和流动通道19的组合来完成。
流式细胞仪10能够手动操作，例如通过如流式细胞测量技术中所知的或者在附图1和2中所示的抽吸针(图1B)的吸取，可单独提供一次一管的细胞悬液至流式细胞仪10，也可通过结合可选的模块化自动进样器20可以适用于高通量。模块化自动进样器20可兼容不同的加载管。这其中包括一般为12x75mm的流体管架、1.5/2.0mL管，例如常见由埃普多夫国际制造的管，多孔板，例如24孔、96孔、平底、V底、圆底或者其他适用于管体或者板体来维持悬浮细胞的结构。测试显示对于96孔板样本使用自动进样器20和每孔10μL的样本悬浮液样本采集不到1小时。在优选的实施例中，自动进样器20配备有用于样本搅拌和混合的振动器。在优选实施例中，自动进样器20包括易于安装和维护的自校准协议，允许用户方便地安装。
在优选的实施例中，流式细胞仪包括微处理器(例如一或多个微处理器)以控制多种功能，例如流体或者样本的传送，细胞悬浮或者振动，以及样本容器的自校准。微处理器典型地设置在电路板上，耦合存储器并电连接至电动机构，如电子泵和致动器，以完成预定功能。进一步地，微处理器可以调节检测器、激光源、吸取泵或者其他电子元件的电压。微处理器可以确定每个通道内的荧光检测时间，以及同一细胞或者粒子的前向散射检测时间，以确定哪个激光源诱导相应的荧光激发，该荧光激发被分配至相应的颜色和试剂。微处理器可以包括模数转换器，用于将来自光电检测器的模拟信号转换成数字信号。微处理器通信地连接至电脑，其给微处理器提供多种控制命令并接收来自微处理器的数据，并由开发软件所控制。
优选的实施例包括存储在微处理器中的可执行的控制程序，如在每次样本吸取后，自动清洗样本抽吸针14(当从连接至细胞仪的计算机接收到清洁命令时)，以减少细胞悬浮液的交叉污染的风险。当使用自动进样器20时这仍然更优选。这通过控制用鞘液和清洗液来清洗抽吸针14的内外表面的多种泵和阀门来完成。此功能的测试表明，在使用自动进样器20的实施例中，交叉污染少于0.05％。
优选的实施例还包括自动去气泡和疏通的功能，这将避免在细胞悬浮液的流通中由于气泡或堵塞导致的错误，并进一步确保了精确的直接的绝对计数，无需昂贵的参考计数微球。在优选的实施例中，流式细胞仪还包括在流式细胞仪启动和停止时的自动清洗功能。这种编程改善使用的方便性并且减少使用者对这些乏味且耗时步骤的操作的需要。在仍进一步的实施例中，当系统流体水平低时，结合自动液位检测报警，例如以适当的液位传感器的形式来通知用户。
为了证明我们的流式细胞仪改进的数据采集、分辨率以及使用简便，我们将其与其他竞争者的流式细胞仪做了比较。图3中的面板A描述了竞争者的流式细胞仪典型结果，而面板B示出了我们的流式细胞仪的结果。图3代表了我们的发现，我们的设备和系统为信号检测和处理提供107的动态范围，其可高于其他流式细胞仪两个数量级。这些结果部分归功于光学系统配置和高质量的光电倍增管模块，其保证了高灵敏的荧光通道检测。我们的系统不仅提高了灵敏度，也消除复杂而费力的光电倍增管电压调整的需要。取而代之的数据采集仅需要装入并执行。在我们系统中使用的高速度的样本采集率可高达35,000事件/秒。此外，在采集期间或者采集之后，还可以使用结合在软件中的滚动条来做简单补偿。
图4的示意图示出我们的细胞仪中的体积绝对计数的准确性，其中注射泵(将位于图5中流通室130下面，但未示出)提供了样本准确的体积吸取和传送。粒子的计数值(例如，大约5.7微米直径的微球)和已知的粒子浓度之间的线性关系，示出体积吸取的准确性和我们的系统的计数准确性。此外，我们直接的绝对细胞/粒子计数消除了对使用昂贵的参考计数微球的需求，并且提供了多次运行之间一致的结果。通过高精度的注射泵控制注射样本体积和流体中细胞的最小流失，流式细胞仪在不需要昂贵的计数微球情况下实现精确直接的细胞计数。
参考附图5，提供了我们的光学引擎100的概略示意图。光学引擎100包括一个到三个的激光源110和用于每个激光源110的光束整形光学系统组120，光束整形光学系统组使每个激发光源110独立成形并引导至流通室130。荧光由采集光学系统150采集，并由过滤光学系统140分离至不同的通道。荧光检测通过使用针对每个通道的光电倍增管(PMT)160来完成。还示出容纳印刷电路板的印刷电路板(PCB)壳体170，印刷电路板包括一个或者更多用于流式细胞仪100的操作的微处理器，流式细胞仪100包括响应于来自开发的控制软件的命令的自动系统功能，荧光检测的时间监控以及前向散射检测，用于将荧光与相应的激发激光源110相互关联。注射泵流体与流通室130的流体连接没有在此示出。
尽管光学引擎可以使用单个的激光源110，光学引擎100允许流式细胞仪10执行多颜色流式细胞测量分析，例如测量多达十五个参数和来自每个荧光标记细胞的十三种荧光信号。如图5所示通过三个激光源110来完成。方便地，由于单独地分配采集光学系统150，激光源110可以增加，移除或者至少部分地互换。用于十三色流式细胞仪的示例配置在附图5中示出，包括发射波长为405nm(也称为紫色激光)的第一激光源110v，发射波长为488nm(也称为蓝色激光)的第二激光源110b，发射波长为405nm(也称为红色激光)的第三激光源110r。本领域技术人员知道一个或多个激光源110的互换性，允许使用者以基础流式细胞测量系统开始，并且添加其他的或者不同的激光源110，根据实验决定这种需要。在一个或者多个激光源的交换或者互换期间，可以改变或者调整相应的光束整形光学系统以实现在流通室中心的最优激光光束。
图6提供了简化的俯视示意图，其示出对于来自图3中三个激光源(110v，110b，110r)的三种示例光路(P1，P2，P3)的光束整形光学系统120，其中第一激光源110v(例如405nm)的第一柱面透镜112v沿着X轴聚焦激发光，第二柱面透镜114v将来自第一激光源110v的激发光沿着Y轴聚焦。同样地，第二激光源114b(例如488nm)的第一柱面透镜112b沿着X轴聚焦激发光，第二柱面透镜114b沿着Y轴聚焦激发光。两个放大镜组111r放大来自第三激光源110r(例如640nm)的激发光，之后第一柱面透镜112r沿着X轴聚焦激发光，第二柱面透镜114r沿Y轴聚焦激发光。来自每个激光源110的光路P1、P2、P3被聚焦到单个流通室130，通过流通室130，细胞被水动力聚焦到位于流动的鞘液流体中心区域的狭窄流线中。
还示出当行进通过流通室130时用于采集从荧光标记的细胞中发射的荧光和侧散射光的半球透镜152。还示出遮挡板190，其阻挡从P2传来通过流通室130并朝向前向散射(FSC)聚焦透镜192的原始激光光束；前向角散射聚焦透镜本身将来自第二激光源110b(例如488nm)的前向散射光聚焦穿过带通滤波器194(488/10nm)用于被光电二级管196所检测，光电二极管接收前向散射光并将其转换成用于数据采集的电信号。
图7示出三个光路(P1、P2、P3)的放大视图，三个光路引导光束穿过相应的第二透镜114v、114b、114r，在沿着流通室130的共同的/相同的聚焦位置H(中心线)会聚，但是将激光光束聚焦在沿着流通室130的不同竖直位置Vv、Vb、Vr。作为非限制的例子，不同的竖直聚焦可以通过调整第二柱面透镜114引导一个光束在中心光束上方、一个光束在中心光束下方来实现。例如，图5所示的结构，来自上面第一激光源110v的第一光路P1竖直地聚焦到Vv，其相对来自第二激光源110b并通过第二柱面透镜114b的光路P2的竖直聚焦位置Vb，具有给定距离(如80μm)。这使得在流通室13中的第一激光光束/光路P1的竖直聚焦Vv，竖直地位于第二光路P2的竖直聚焦Vb的上方的相同距离处(如80μm)。同样地，向下调整第三激光源110r的第二柱面透镜114r，相对于第二激光源110b的第二柱面透镜114b的竖直位置Vb一个给定的距离(例如80μm)，这将导致第三激光光束P3在流通室130中的竖直聚焦Vr，相对于第二激光光束P2在竖直上低相同的距离(例如80μm)。本领域技术人员可以获知，虽然这种分离被描绘为相距80μm，其他的比80μm或多或少的分离距离也可以被执行。在一些实施例中，光束P1-P3被分离为距离相邻光束P1一P3以70μm。在另一些实施例中，分离距离是75μm、85μm、90μm、100μm、125μm、150μm、175μm、或200μm。另外，调整上述三个第二柱面透镜114v、114b、114r的Z轴位置，允许三个激光束的Z轴焦点与流通室130的中心线重合，从而导致在所聚焦的样本窄流内激光光束Z轴聚焦点的一致性。通过聚焦在沿流通室130的不同的竖直位置Vv、Vb、Vr，可以在荧光信号时序和前向散射信号时序之间进行比较，以确定诱发特定检测出的荧光的激发激光源的身份。
在可替换的方法中，激光源可以以不同的频率调制。在特定时间点上，可以对荧光转换电信号进行解调，以确定给定的荧光信号的激光源。名称为“用于在流动通道中检测多个激发诱导的光线的系统和方法”的在先申请，美国公布号为20130200277，描述了在流式细胞仪中激光光束调制和解调的装置、方法和技术，并且可以作为参考。用相应的激光源激发的荧光信号的识别可以通过前向散射时间一致性方法或者激光调制和荧光解调的方法，或者两者相结合来实现。这样，可以在每个检测器处执行检测，使得已检测、已过滤的荧光信号被分配至相应的激光源，相应的激光源被聚焦在流通室的不同竖直位置。
集中参考图5-7，独立控制来自三个激光源110v、110b、110r的三个分开的光路P1、P2、P3具有独特的优势。首先，通过调整第一柱面透镜112的X轴位置，分离地调整每个聚焦光束沿着X轴校准至水力聚焦样本流。这可以用于消除不同激光光束之间和不同光路P1、P2、P3之间的干涉，因此允许每个激光光束调整到最优校准状态。
其次，对于每个激光光束可以独立调整第二圆柱透镜114的Z轴位置，确保Y轴光束的聚焦平面与在流通室130中的水力聚焦流体流一致或者校准。再者，不同激光光束之间和不同光路P1、P2、P3之间不存在干涉，因此允许每个激光光束调整到最优校准状态。
第三，对于每个激光束，简单地通过调整和移动第二柱面透镜114沿Y轴的高度，可以容易地调整和控制在流通室130中的三个不同光束之间沿Y轴的分离距离。通过这样的方法，能够在相对大的范围内连续地调整光束分离距离。
第四，通过为每个激光源彼此独立地提供分离的光束整形和光束导向光学系统，可以选择或使用具有相同或不同的原始光束直径的激光源110，因为对于每个通道，可以用具有不同焦距的不同柱面透镜112、114来适应原始光束直径的差异。
第五，这种光学照明设计将允许激光照明源的简单配置和可能的升级。例如，可以以具有单个激光源110作为激发源的系统开始。当需要提供不同波长的附加的激光源110时，新的激光源110，连同它或它们的相应的光束整形和导向光学部件120，可以随时被添加到系统中，而不影响现有的激光源110和它的光束整形光学系统120。这些独特的优势将允许最优校准和流通室130中的每个激光源光束的聚焦，克服相比其他光照明设计的局限性，其他光照明设计中不同的激光源对于光束整形和光束分离共用相同的光路，不同的激光源聚焦和校准需要折中。
前向光散射(也称为前向散射或低角度散射)指在流式细胞测量中这样的测量：其包括由于细胞穿过激光光束而引起的光线向前折射，并大致与细胞的直径成正比。当没有细胞通过激光光束的路径时，光束不间断的传送通过流通室130，并由遮挡板190阻挡，使得没有来自激光源光束本身的光线到达检测器。然而，当细胞通过流通室130时，光在全部方向上被折射。沿向前方向折射的光错过遮挡板190而到达前向散射检测器162。因此，不同的遮挡板被我们开发和测试。
图8A-B示出确定前向散射遮挡板190位置处的激光源光束效果的光强度分布图。图8A示出无水力(HD)聚焦核心的结果，即流通室充满均匀鞘液流体。在这个例子中，激光光束具有竖直的椭圆形，并可以被竖直板阻挡。然而，如图8B示出当水力核心形成(在本例中为17μm的聚焦核心)时，当折射率高于鞘液流体的折射率的样本流体水力聚焦到鞘液流体包围的核心区域时，可以看到具有水平放大光束的双凸透镜效应。这说明需要改进前向散射遮挡板以匹配和阻挡该水平放大的光束。
如上所述，图8B揭示由于鞘液流体包围水力核心的凸透镜效应(在图8A中所示的竖直激光光束上)而形成的光强分布，证明了激光源光束在前向散射遮挡板190位置处是水平放大的。为了阻挡这样的光分布，一种途径是设计矩形的遮挡板，其中，水平尺寸比竖直尺寸长。因此，优选地，用于阻挡入射激光光束的遮挡板，其具有水平尺寸与其垂直尺寸一样长或者长于其垂直尺寸的矩形形状。图9描述了形成我们的新的前向散射遮挡板190的技术方法的概略图。遮挡板190可以使用在我们的系统中或者其他系统中。为了证明和测试不同形式的遮挡板190，我们绘制了在前向散射板位置处的激光光束能量分布的轮廓图，并且决定轮廓线外部的激光源能量的量值以评估不同配置的效率。我们在图9的轮廓图中绘图标记0.1％、0.2％、0.5％、1.0％和2.0％的轮廓水平，并在图形上面的表格中提供多个不同轮廓水平的数据，其反映在该轮廓线外的全部的激光能量。例如，我们的计算表明，0.2％轮廓线外的能量是0.34mW，0.1％轮廓线外的能量是0.21mW。为了阻挡约99％的光束，我们可以基于0.1％的轮廓线设计菱形的遮挡板190，留下约0.2mW的激光光束不被阻挡。这样，在优选地实施例中，遮挡板190遵循0.1％轮廓水平；而遵循0.2％、0.5％、1.0％、2.0％的遮挡板190可以低于最优结果使用。图9还示出我们优选的菱形的0.1％遮挡板190的尺寸。图10是当使用不同的遮挡板，即菱形板(板A)、垂直板(板B)、和水平板(板C)比较前向散射信号的一系列视图。根据实验，血液样本被溶解而不被洗涤。如板B所示，竖直板不允许淋巴细胞从其它白细胞中清楚的分离。在CD45-PerCP相对于SSC的图中，淋巴细胞的百分比大约为8.7％，然而关于FSC相对于SSC的选通示出更高的百分比(14％)。注意E1种群是在CD45相对于SSC的图中用于比较的淋巴细胞。E2是从FSC相对于SSC的图中选通的种群。对于竖直板的情况(板B)，虽然淋巴细胞似乎与其他白细胞分离，但他们不能容易地从碎片中分离。我们的菱形板(板A)提供了种群的最好的分离。
当通常沿着激光源的传播路径检测前向散射时，侧散射正交于入射激光光束被采集。侧散射光线与细胞的总体尺寸成正比，但也受到细胞特性的影响，如细胞的内部复杂性或细胞的粒度，以及细胞膜的平滑度。作为普通的经验法则，粗糙的细胞或内部复杂的细胞会导致相对高的侧散射。本发明还提供了一种用于检测侧散射的方法，其在图11中更为明显。
流式细胞测量通常包括用一个或多个荧光对细胞进行标记。通常通过添加荧光标记的试剂，如抵抗表面标志的荧光标记抗体，到细胞的悬浮液中，然后洗去未结合的试剂。存在在细胞上或者细胞内的荧光，随着细胞传送通过激光光束，添加来自细胞的累积信号。这种试剂在本领域是众所周知的，可从许多供应商获得。侧散射和荧光均通过采集光学系统而被采集，采集光学系统一般正交于激光光束路径设置，然后使用双色镜过滤和反射到不同的通道。双色镜允许一定波长范围通过，并反射剩余的波长。图11示出这种概况，使用采集光学系统150将来自流通室130的荧光和侧散射信号采集，然后通过过滤光学系统140分流至不同检测通道，检测通道主要由长通或短通双色镜142和带通滤波器144组成。其中，示出了六个光电倍增管(160a-f)用于检测以下六个波长的荧光：780/60nm(160a)，615/24nm(160b)，530/30nm(160c)，445/45nm(106d)，585/40nm，572/28nm(160e)，675/30nm(106f)。光电倍增管160与用于数据采集的计算机200电通信，其还可以包括模拟到数字的转换。使用图11中所示的通道结构，表1提供了当每个光电倍增管检测器用于从不同的激光源中获取荧光信号时，用于进行十三色流式细胞测量分析的兼容荧光的非限制性清单。
表1
另外，通过沿着流通室130在不同竖直位置聚焦激发激光光束，为每个用于测量的竖直位置定义光路，提供具有足够灵敏度的检测器，以及确定相同的细胞或者粒子的荧光信号和前向散射信号之间的差异，使用图11中所示的具有六个光电倍增管配置的三个激光源，已经实现了单个细胞的十三种荧光色的测量。表1示出每个光电倍增管通道在由不同激光源激发的不同荧光通道中是如何被共用的。例如，530/30nm的光电倍增管通道被共用于检测波长范围从515至545nm的由紫色激光源和蓝色激光源共同激发的荧光信号。在另一实例中，675/30nm的光电倍增管通道被共用于检测波长范围从660至690的由紫色激光源、蓝色激光源以及红色激光源共同激发的荧光信号。
在图12中示出沿单个通道空间上不同位置的采集和测量的更详细示意。使用高折射率的半球透镜152(本例中n＝2)采集沿流通室130的三个不同竖直位置(Vv，Vg，Vr)的荧光。每个光路继续通过消色差双合透镜154(本例子中N.A.＝1.0)用于校准荧光光线，并通过一个或多个双色镜142过滤。不再赘言，半球透镜152优选由高折射率的材料制成。这样的选择是为了最大化数值孔径(NA)，并且降低通过半球透镜152的荧光光束的总体直径/尺寸。减小光束直径也允许较小直径用于双合透镜154，设计和制作这样的双合透镜154困难小。我们已经发现，高折射率的半球透镜152和双合透镜154的结合，带来用于有效采集荧光光束的高数值孔径的物镜。这样的设计不仅带来高的采集效率，还使物镜的设计和制造成本减少。光路然后通过带通滤波器144，聚焦透镜146，针孔148并最后到达光电倍增管160。放大的光电倍增管160示意图在附图中示出，其示出来自流通室130的每个竖直位置Vv、Vg、Vr空间上的区别。为了评估系统的灵敏度，通过ZEMAX软件中的多个光电倍增管160测定光线采集效率，并且在示例情况下，发现光采集效率的70％是在沿光路最后的光电倍增管160处达到的，这被认为是高效光采集。
在不同的荧光通道上进一步测试分辨率和灵敏度，以确保通过荧光通道的可靠性。典型的结果如图13A-B所示，其中图13A示出当在FITC(530/30nm，488nm蓝色激光源激发)，PE(585/40nm，由488nm蓝色激光源激发)、APC(675/25nm，由640nm红色激光源激发)，或Pacific Blue(445/40nm，由405nm紫色激光源激发)的荧光检测通道中被分析时，八峰微球种群(由八个不同荧光强度组成)中的每个都清楚地彼此分离开来。如图13B所示，使用前向散射和侧散射，尺寸为0.2μm、0.4μm、0.6μm的微球也能清楚地观察到。
使用通讯地耦合到流式细胞仪的计算机来执行用于设置和数据采集的流式细胞仪的控制与通信。因此，也开发了用于加载在计算机上的流式细胞测量软件。流式细胞测量软件优选地包括数据采集功能和数据分析功能。在流式细胞测量技术领域，数据采集包括从实验中采集和存储数据。这也可以包括用于获取数据的设置功能，例如补偿调整，在特殊的选定种群中确定将被计数的细胞数量，设置采样流量率，以及在流式细胞测量技术中遇到的其他实验控制。数据分析功能包括通过一个或多个荧光颜色绘制细胞亚群，进行特定细胞亚群的绝对计数，计算特定亚群的相对百分比，细胞周期分析，以及在流式细胞测量程序中的其他数据分析功能。因此，该软件提供丰富多样，用户友好和直观的绘图和选通工具，以及它的提供了卓越的统计数据分析能力的统计工具。在优选实施例中，全部的采集参数、实验和样本文件，以及绘制图可以在一个窗口区域可见和可访问。
在一些实施例中，数据采集过程包括：对同一检测器的荧光信号计算和处理，以将它们分离出来进入到来自不同激光源(在不同的竖直位置)的不同荧光通道内；生成图形用户界面(GUI)，其显示一个参数相对于另一个参数(例如，FSC相对于SSC，FSC相对于荧光信号，或者一个荧光信号相对于另一个荧光通道)的二维图，其中图形用户界面进一步包括邻近对照图的补偿滚动条，以调节一个或者多个通道之间的光谱重叠的补偿；从每个光散射通道和每个荧光通道采集数据；以及存储数据到数据文件。该软件还优选地包括圈门选通功能，允许用户从一个直方图或一个二维图中选择亚群，并产生另一个图(其可能是一个参数的直方图或用于选定亚群的两个参数的二维图)。这种“选通”和“选通种群”的进一步分析可以重复。
图14示出典型的界面截图，其示出实验管理器屏幕，该屏幕概览在单窗口中所显示的多数据图形的实验文件。该软件可以提供自动的实验报告，该实验报告显示直方图或二维图以及用于门内数据的选通和其他统计等。
如图15所示，该软件在每个图的每个轴上提供方便和易于使用的补偿滚动条202，以允许快速补偿，消除繁琐和容易出错的调整，并且允许实时补偿。图16示出来自细胞周期模块的数据，其中包括沃森实用模型，其本身是不假设S期分布的实用模型。其他的分析模型，如Dean-Jett-Fox模式，也可以用于细胞周期分析。图17显示Levey-Jennings质控图，其显示流式细胞仪随时间的质控结果。
在另一个相关的实施例中，提供了一种流式细胞测量的方法，包括提供上述的流式细胞仪或流式细胞仪系统；通过多个荧光标签标记细胞样本；泵送细胞样本通过流动通道；采集流式细胞测量数据；并分析流式细胞测量数据以确定在样本细胞上或者细胞内的一个或者更多的荧光标签的存在、不存在或者多少。
实施例
实施例1：十色流式细胞测量的T淋巴细胞分析
在这个例子中，流式细胞仪配备有配置用于十色流式细胞测量分析的光学引擎。以一个人的全血样本开始，红细胞通过将血液样本与红细胞溶解缓冲液一起培养而溶解。将细胞离心并弃去上清液。细胞将重新悬浮，计数，并分成相等的用于染色的种群。已洗涤细胞的免疫荧光染色是通过表2中所示的标记抗体进行的。
表2
表3提供了染色方法的概述。染色以一式两份进行，其中包括十色染色。单一颜色染色是按照标准流式细胞测量操作来调整补偿。作为进一步的控制，荧光扣除(FMO)染色被用于确保对已获得的荧光数据的合适解释。荧光扣除包含除了正被测量之外的平面内全部荧光物，从而确保任何荧光物向通道的扩散能够及时地被识别。
表3
T淋巴细胞是根据CD4和CD8的存在而被确定的，并且其后T淋巴细胞的亚群是根据从免疫染色试剂中所测量的荧光信号的存在、不存在、或多少而确定为：中央记忆T细胞，效应记忆T细胞，幼稚T细胞，调节性T细胞(Treg)。种群按照表4分类。
表4
如图21所示，在获得数据之后，接下来的圈门架构用于识别T细胞。首先，从全部的细胞种群中，淋巴细胞根据CD45-APC-Cy7相对于侧散射(SSC)被确定，其占细胞种群的26.77％。淋巴细胞种群绘制在FSC-A相对于FSC-H的图上，以选择性地识别单一种族相对于双重种族。通过更紧密地观察单一种族，可以发现单一种族占有淋巴细胞的95.75％。之后，根据CD3-BV510相对于侧散射(SSC)，单一淋巴细胞被绘制以确定单一淋巴细胞的85.48％为T淋巴细胞CD3+。如图22所示，之后根据CD4-FITC相对于CD8-PerCP绘制CD3+细胞，来确定以下亚群：30.31％CD4-/CD8+；62.98％CD4+/CD8-；6.10％CD4-/CD8-；和0.60％CD4+/CD8+。之后根据以下子图：CD25-BV42相对于CD127-PE(确定调节性T细胞作为CD4+，CD25+，CD127-/低)；以及CD45RO-PE-Cy7相对于CD45RA-BV785来绘制CD4+/CD8-亚群。根据CCR7-BV650相对于CD62L-APC绘制CD45RO-、CD45RA+(CD4+/CD8-的30.84％)和CD45RO+、CD45RA-(CD4+/CD8-的41.60％)亚群。被确定为CD62+、CCR7+的幼稚T细胞，被发现占有CD45RA+/CD45RO-细胞的96.28％，并且效应T细胞被发现占有CD45RA+/CD45RO-细胞的1.73％。被确定为CD62L+/CCR7+的中央记忆T细胞(Tern)，被发现占有CD45RA-/CD45+细胞的63.54％，被确定为CD62-/CCR7-的效应记忆细胞(Tern)，被发现占有CD62-/CCR7-T细胞的19.81％。
实施例2：我们的NovoCyte流式细胞仪与竞争者的流式细胞仪之间的绝对细胞计数的比较。
为了验证我们的流式细胞仪系统的计数准确性，我们使用商业可用的质控血液，正常供体的外周血，和HIV患者的外周血，在我们的系统与其他的商业可用的系统之间比较了绝对计数结果。
正常供体的外周血(FB)和质控血(QC)在参考微球容纳管内由CD3-PereCP/CD4-FITC/CD8-PE染色。使用我们的2060NovoCyte流式细胞仪以及竞争者的细胞仪分别获取数据，并通过我们的软件进行分析。所测得的细胞浓度如表5所示，其中每个样本被编号并被指定成质控血液(QC)或新鲜的外周血(FB)，并且提供的值是每微升的细胞计数(/μL)。
表5
回归分析用于统计性地从淋巴细胞总数、CD3+细胞、CD3+、CD8+细胞和CD3+、CD4+细胞的测量计数中，评估我们的NovoCyte流式细胞仪相对于竞争对手的流式细胞仪的关系。我们发现，回归系数均超过98％，表明流式细胞仪之间对于计数的密切统计关系。代表结果如图23所示。
为了进一步证明在诊断方面的潜在应用，我们使用患有人类免疫缺陷病毒(HIV)的病人的血液，将我们的系统与竞争对手的细胞仪进行来比较。人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的慢性病毒。艾滋病患者外周血在参考微球容纳管内由CD3-PereCP/CD4-FITC/CD8-PE染色。使用我们的2060NovoCyte流式细胞仪以及竞争者的细胞仪分别获取数据，并通过我们的软件进行分析。所测得的细胞浓度如表6所示，其中每个样本被编码为从S7-H到S11-H，并且提供的值是每微升细胞计数浓度(/μL)。
表6
回归分析用于统计性地从CD3+细胞；CD3+/CD4+细胞；和CD3+/CD8+细胞的测量计数中，评估我们的NovoCyte流式细胞仪相对于竞争对手的流式细胞仪的关系。我们发现，回归系数均超过99％，表明流式细胞仪之间对于计数的密切统计关系。代表结果如图24所示。
在上述教导下，对所描述的示例和实施例的修改和变化，对本领域技术人员来说是显而易见的。所公开的示例和实施例是仅用于说明的目的。其他替代实施例可以包括一些或全部本文所公开的特征。因此，意图覆盖全部的修改和替代实施例落入本发明的范围内。

Claims (21)

1.一种用于台式流式细胞仪的光学引擎，所述光学引擎包括：
a)激光源组，每个激光源被调谐至适用于激发荧光分子的波长；
b)用于每个激光源的不同的光束整形光学系统组，其中每组包括两个透镜，用于沿X轴水平可调地聚焦光束至同一水平位置和沿Y轴竖直可调地聚焦光束至同一平面的不同竖直位置，其中所述平面位于通过所述流式细胞仪的流通室的流动路径内；
c)采集光学系统，用于从所述流通室采集荧光；
d)过滤光学系统，其根据波长范围将从流通室采集的荧光过滤至不同的过滤通道中；以及
e)用于每个过滤通道的检测器，其将已过滤的荧光转换成电信号，其中所述电信号被处理以使得来自位于不同竖直位置处的每个激光源的荧光在同一检测器中被区分。
2.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述激光源组包括三个激光源，每个激光源被调谐至不同的波长并且指向所述平面的不同竖直位置，从而提供沿所述流通室的三个不同的竖直位置。
3.根据权利要求2所述的光学引擎，其中竖直位置之间分离80μm。
4.根据权利要求2所述的光学引擎，包括来自通过所述流通室的单个样本的13个荧光通道。
5.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述光束整形光学系统组包括柱面透镜或者鲍威尔棱镜。
6.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述光束整形光学系统的第一透镜沿水平的X轴调整光束，所述光束整形光学系统的第二透镜沿竖直的Y轴调整光束。
7.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述采集光学系统包括后跟随有双合透镜的半球透镜。
8.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述过滤光学系统包括选自包括双色镜、带通过滤器和聚焦透镜的组中的部件。
9.根据权利要求1所述的光学引擎，其中所述过滤通道包括以下波长：780/60nm、615/24nm、530/30nm、445/45nm、585/40或572/28nm和675/30nm。
10.根据权利要求1所述的光学引擎，进一步包括前向散射(FSC)检测器、FSC聚焦透镜和遮挡板。
11.根据权利要求10所述的光学引擎，其中所述遮挡板为菱形或矩形，所述矩形的水平尺寸与竖直尺寸一致或者长于竖直尺寸。
12.根据权利要求10所述的光学引擎，其中所述遮挡板的周界遵循于光线强度分布图的轮廓，可选地在0.1％的轮廓线内。
13.根据权利要求12所述的光学引擎，其中所述遮挡板阻挡非散射光的99％免于被所述FSC检测器所检测。
14.根据权利要求1所述的光学引擎，进一步包括配置用于容纳光学引擎部件的外壳，所述光学引擎部件包括所述激光源组、光束整形光学系统、采集光学系统、过滤光学系统、以及检测器，其中同样的壳体被配置用于不同的激光源、透镜、平面镜、过滤器和检测器的互换。
15.根据权利要求1所述的光学引擎，进一步包括所述流通室。
16.根据权利要求1所述的光学引擎，其中在同一检测器中区分来自位于不同竖直位置处的不同激光源的荧光，通过前向散射时间一致性方法或者激光调制和荧光解调的方法，或者两种方法的结合来实现。
17.一种流式细胞仪，包括：
a)根据权利要求1所述的光学引擎；
b)流通室；以及
c)与抽吸针流体连通的泵，用于吸取和传送细胞悬浮液通过所述流通室。
18.根据权利要求17所述的流式细胞仪，进一步特征在于
a)所述激光源组包括三个激光源，每个激光源被调谐至不同的波长并且聚焦在沿所述流通室的不同竖直位置；以及
b)所述过滤光学系统在空间上区分由三个不同激光源中的每一个所激发的在同一通道上的已过滤荧光。
19.一种流式细胞测量系统包括：
a)根据权利要求16所述的流式细胞仪；以及
b)操作地加载有已开发的流式细胞测量软件的计算机，以获取和分析流式细胞测量数据。
20.根据权利要求19所述的流式细胞测量系统，其中所述软件提供包括执行下列功能的编程：
i)获取来自每个检测器的荧光通道的数据，其中由同一检测器采集的荧光信号被转换成不同的数据系列，对应于由位于不同竖直位置的激光源所激发的荧光；
ii)生成用于示出已获取数据的多种图形的图形用户界面(GUI)，其中所述GUI进一步包括邻近比较图形的补偿滚动条，以调整一个或者多个通道之间的光谱重叠补偿；
iii)将已获取的数据存储至数据文件。
21.一种流式细胞测量方法，包括：
i)提供如权利要求19所述的流式细胞测量系统；
ii)用多个荧光标签标记细胞悬浮液；
iii)泵送所述细胞悬浮液通过所述流通室；
iv)采集流式细胞测量数据；以及
v)分析所述流式细胞测量数据以确定所述多个荧光标签中的一个或多个在样本的细胞上或者细胞内的存在、不存在或者多少。
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