CN116981931A - 用于分析生物学材料的系统和方法 - Google Patents
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
- G01N21/80—Indicating pH value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01S—RADIO DIRECTION-FINDING; RADIO NAVIGATION; DETERMINING DISTANCE OR VELOCITY BY USE OF RADIO WAVES; LOCATING OR PRESENCE-DETECTING BY USE OF THE REFLECTION OR RERADIATION OF RADIO WAVES; ANALOGOUS ARRANGEMENTS USING OTHER WAVES
- G01S17/00—Systems using the reflection or reradiation of electromagnetic waves other than radio waves, e.g. lidar systems
- G01S17/88—Lidar systems specially adapted for specific applications
Abstract
公开了一种用于测量样品、诸如生物学材料样品中的荧光团的系统和过程。所述过程和系统特别很好地适于测量许多不同生物学参数的荧光寿命。所述系统包括飞行时间传感器，所述飞行时间传感器可以以能够测量极短、诸如持续仅几纳秒的荧光寿命的调制速率操作。尽管所述系统和过程具有广泛的适用性，但是所述系统和过程特别很好地适于测量细胞的代谢特性，诸如pH、氧气和温度。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月14日提交的美国专利申请序列号63/160,841的优先权，所述美国专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
生物医学分析和成像在大量诊断和治疗规程中起着作用，所述生物医学分析和成像包括可视化外部的和内部的解剖及生理结构、特征和系统，以及评估体内器官、组织、细胞和分子水平的复杂生物学事件。生物学和细胞分析允许内科医生和其他医疗保健专业人员在早期阶段检测和诊断疾病、损伤和其他疾患的发作，并且准确地监测疾病的进展或缓解。生物学和细胞分析还可以促进靶向微创疗法的递送，以用于治疗和管理一系列健康状况。生物学分析的大量应用已经成熟为稳健的、广泛使用的临床技术。
在一些应用中，生物学材料(诸如细胞和组织)的分析包括通过检测由材料透射的、发射的和/或散射的电磁辐射、核辐射、声波、电场和/或磁场来生成图像或信号。经由与诸如生物学分子和组织结构的材料相互作用而提供给样品的能量(例如，辐射、声学等)的和/或颗粒的调制产生透射的、散射的或发射的辐射声波、电场或磁场的图案，所述图案包含有用的解剖学、生理学、和/或生物化学信息。调制可以经由涉及样品中内源性材料的相互作用的机制和/或涉及引入到样品中的外源性成像剂(诸如造影剂、染料、光学或放射性标记材料、生物标记和其他试剂)的相互作用的机制来发生，以增强所采集的图像或信号的有用性。已经证明各种不同生物医学仪器通常可用于提供组织样品的表面组分和表面下组分的图像，并且还提供了在体内和体外实时监测生物学样品组分的手段。
生物医学成像和分析技术特别地很好适于测定装置。测定是对未知分析物进行定性的和/或定量的分析。在一个方面，例如，测定装置可以被用于对包含在细胞样品中的分析物的类型和浓度进行分析，诸如活组织检查。这些类型的装置很好地适于分析活细胞并且提供有关所述细胞内部发生的代谢过程的有用信息。例如，所述装置可以提供实时细胞分析物测量，所述实时细胞分析物测量为驱动细胞信号传导、增殖、激活、毒性和生物合成的关键功能提供清晰的窗口。更具体地，这些装置可以在相对短的时间内生成代谢表型。
发明内容
使用飞行时间传感器的光探测和测距(“LiDAR”)通过发射非常短的光脉冲并测量光从所述传感器行进到周围目标的往返时间来检测所述目标并采集它们到所述传感器的距离。LiDAR是用于包括自动驾驶车辆、智能交通系统、无人飞行器、清扫机器人等若干应用的关键技术。汽车制造商与LiDAR传感器合作以开发用于自动驾驶汽车的先进技术。LiDAR技术可以在各种天气条件下实时生成车辆周围环境的三维点云。
本公开文本总体上涉及以独特且新颖的方式将部分LiDAR技术结合到荧光寿命的询问中，以用于例如生物制药行业和用于生物制药应用。本公开文本描述并证明了飞行时间传感器在生物学系统和装置中的使用，以用于对响应剂(诸如荧光团)对pH改变的纳秒级响应进行测量，或者以用于对可以作出相同纳秒级响应的任何生物学材料的改变进行测量。申请人已经证明，这些测量可以以纳秒级的时间尺度进行，从而允许对先前无法测量的一种或多种响应剂(诸如荧光团或任何生物学材料)进行可靠且准确的测量。
另外，随着LiDAR传感器的成本下降，在生物学装置和系统中使用LiDAR为进行生物学样品的纳秒寿命测量提供了经济有效的解决方案。
因此，在一个实施方案中，本公开文本涉及一种用于分析生物学材料的系统。所述系统可选地包括用于所述生物学材料的样品暂存位点。所述生物学材料例如可以是包含待测试的、待监测的或待绘制的成分的任何材料。所述生物学材料可以是细胞材料。所述生物学材料例如可以是活细胞。根据本公开文本，所述系统进一步包括光源，所述光源被配置为将激发光发射到包含在所述样品暂存位点上的所述生物学材料上。所述激发光具有使与所述生物学材料相关联的成分经历发光发射(诸如荧光发射或磷光发射)的波长。如本文所使用的，成分是包含在所述生物学样品中或与所述生物学样品相关联的任何组分。所述成分单独可以产生所述发光发射，或者所述发光发射可以由受所述成分影响的荧光团产生。光学通信路径被安置成获得光学信号，所述光学信号指示与安置在所述样品暂存位点上的所述生物学材料的成分相关联的所述发光发射(诸如荧光发射或磷光发射)。包括多个像素的飞行时间传感器被配置为从所述光学通信路径接收指示所述发光发射、所述荧光发射或所述磷光发射的信号。所述多个像素中的每个像素或像素组被配置为至少部分地基于所述光学信号提供与所述像素或像素组的光子响应相关联的信号。所述系统进一步包括与所述飞行时间传感器相连通的一个或多个处理器。所述一个或多个处理器被配置为根据所述发光发射来确定或绘制所述生物学材料的特性。例如，可以至少部分地基于每个像素的或像素组的光子响应来确定所述成分的荧光寿命或荧光强度。所述一个或多个处理器可以被配置为根据所述荧光寿命或所述荧光强度来确定所述成分的存在和/或确定与所述成分有关的参数的量值特性。
本公开文本的系统可以并入被设计用于检查生物学材料的任何合适的系统中，包括检查活细胞的系统。例如，使用飞行时间传感器的本公开文本的系统可以并入到所有类型的细胞代谢分析系统、微流控系统、微型板读取器、多模和吸光度读取器以及成像系统(诸如荧光寿命成像显微镜(FLIM)系统)中。
在一个方面，所述光学通信路径的至少一部分和所述飞行时间传感器可以是被设计用于实现为光探测和测距(LiDAR)子系统的一部分的CMOS飞行时间传感器。所述光学通信路径可以包括至少一根光导管或至少一根光纤。光源可以被配置为发射相干光束。例如，所述光源可以是激光器、激光二极管或发光二极管。所述光源可以被配置为以调制速率发射脉冲形式的或正弦形式的激发光，以测量荧光寿命。可以至少部分地根据与所述生物学样品的成分相关联的所述荧光发射或磷光发射的衰变时间来确定所述调制速率。例如，所述调制速率可以是从约0.01MHz至约1,000MHz，诸如从约25MHz至约200MHz。被测试的所述成分的衰变时间或荧光寿命通常可以小于一秒，诸如小于约1000微秒。本公开文本的系统特别很好地适于在非常高效的事项中检测极短的荧光寿命。例如，在一个实施方案中，所述系统可以检测并测量小于约20纳秒(诸如小于约10纳秒、诸如小于约5纳秒、诸如小于约3纳秒、诸如小于约2纳秒)且通常大于约0.001纳秒的荧光寿命。所述调制速率可以根据所述荧光团进行优化。随着所述调制速率的优化，所述测量准确性得以改善。可以通过调整所述调制速率以匹配所述荧光团或传感器的特性或匹配应用程序的要求来进一步提高测量性能。
指示所述光子响应的所述信号可以包括指示针对所述像素的响应相位的信号。例如，可以至少部分地基于通过执行包括以下的操作来确定针对所述像素的响应相位：从第一模拟积分器确定针对所述像素的第一响应；使用第二模拟积分器确定针对所述像素的第二响应；并且至少部分地基于所述第一响应和所述第二响应来确定所述响应相位。
在一个实施方案中，所述飞行时间传感器中的每个像素均可以被配置为从与所述光源同相的所述光学通信路径接收荧光发射或磷光发射，使得所述像素在所述生物学材料已经暴露于光脉冲之后并且在暴露于后一个光脉冲之前接收所述荧光发射或磷光发射。
在一个实施方案中，所述系统包括多个样品暂存位点，其中每个样品暂存位点与光学通信路径相关联。所述飞行时间传感器的像素被分成多个区。每个样品暂存位点的每个光学通信路径均可以与所述多个区中的至少一个相连通。所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为从每个样品暂存位点接收荧光发射或磷光发射，并确定来自每个样品暂存位点的成分的荧光寿命或荧光强度。所述系统可以包括例如至少5个样品暂存位点(诸如至少10个样品暂存位点、诸如至少50个样品暂存位点、诸如至少75个样品暂存位点、诸如至少100个样品暂存位点)以及多达约5,000个样品暂存位点。例如，所述多个样品暂存位点可以包含在微型板或细胞板中。在一些实施方案中，所述样品暂存位点可以包含在玻璃载玻片、传感器阵列、硅芯片、微阵列或微流控装置上。在特定实施方案中，所述微流控装置可以包括一系列并行的或互连的通道，其中每个通道包括一个或多个暂存位点。在一些实施方案中，所述样品暂存位点可以包含在孔板中，诸如6孔板、24孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等。
所述系统可以进一步包括相对于所述微型板移动的柱塞阵列或探针阵列。所述柱塞间隔开，以便与所述微型板上的所述样品暂存位点对准。所述柱塞是固定的或被配置为朝向所述样品暂存位点移动，以用于被放置在位于所述样品暂存位点上的生物学样品附近。所述柱塞可以与所述光学通信路径相连通，以用于将所述激发光递送到所述生物学材料并且用于将由所述生物学材料产生的信号递送到所述飞行时间传感器。
在一个实施方案中，所述系统还可以包括荧光剂或荧光团源，用于向所述生物学材料供应至少一种荧光团。在一个实施方案中，所述荧光团可以与淬灭剂相连通。所述荧光团源例如可以位于与所述生物学材料相连通的柱塞或探针上。替代性地，所述荧光团源可以位于所述生物学材料样品中。所述生物学材料可以包括细胞，并且所述荧光团可以位于所述细胞中或者可以位于所述细胞周围的流体中。在一个实施方案中，所述荧光团可以包括纳米颗粒或微粒，所述纳米颗粒或微粒与所述柱塞或探针偶联、处于所述细胞周围的悬浮液中、或者处于所述细胞周围的溶液中。
在一个方面，所述生物学材料可以被放置为与不同的荧光团相连通，以用于同时测量不同的成分。实际上，所述系统不仅能够同时对多个生物学样品进行测量，而且还能够进一步同时对每个生物学样品中的多于一种成分进行测量。在一些实施方案中，所述荧光团由细胞材料本身供应，即所述细胞材料可以是自动荧光的。在一些实施方案中，将所述荧光团添加到所述细胞材料中，或者添加到与所述细胞材料接触的溶液或材料中。在一些实施方案中，所述荧光团可以是在细胞中表达的蛋白质，诸如荧光蛋白。在一些实施方案中，所述荧光团可以与蛋白质结合，或者它可以以蛋白质结合的和蛋白质未结合的状态存在于细胞中。在一些实施方案中，所述荧光团可以附着于抗体或其他亲和剂，所述抗体或其他亲和剂结合于细胞内或细胞表面上的蛋白质或其他成分。
本公开文本的示例方面还涉及一种用于分析生物学材料的方法。所述方法包括将包括所述至少一种荧光团的生物学材料暴露于激发光中，其方式为使得至少一种荧光团经历荧光发射或磷光发射。所述荧光发射或磷光发射被传送到飞行时间传感器并由其感测。确定分析物的荧光寿命或荧光强度。在一个方面，所述方法可以包括不仅验证所述分析物的存在，而且根据所述荧光寿命或所述荧光强度确定所述分析物的量值特性。在一个方面，所述方法可以包括根据所述荧光寿命或所述荧光强度推断所述荧光团的环境特性(例如，结合状态或未结合状态、或与淬灭剂的接近度)。
被测试的所述生物学材料可以包括细胞材料。所述生物学材料可以包含活细胞，所述活细胞包括：细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞、真核细胞、酶等。所述细胞可以是动物细胞、人细胞、免疫细胞或永生细胞。在一些方面，所述细胞材料可以包括源自细胞的材料，诸如细胞裂解物。在一些方面，所述细胞材料可以包括细胞的组分，诸如蛋白质、酶、细胞器(诸如线粒体或叶绿体)。在一些方面中，所述细胞材料可以包括源自感染病原体(诸如病毒、真菌或细菌)的细胞的材料。被测量的所述成分或参数可以是溶解气体、离子、蛋白质或多肽、代谢物、核酸、脂质、底物、氧化态、粘度、盐、矿物质或其组合。可以被测量的溶解气体包括氧、二氧化碳、一氧化氮或氨。所述成分可以包含在所述细胞内，或者可以包括由所述细胞分泌到周围培养基中的材料。
与可以被测量的所述成分有关的特定成分或参数包括氧、pH、或温度。所述成分可以与感兴趣的参数直接有关(例如，相同)或者可以是与所述参数有关的允许确定所述参数的特性。在一个实施方案中，测量pH特性的荧光寿命。所述荧光寿命可以是极短的，诸如小于约20纳秒，诸如小于约15纳秒，诸如小于约10纳秒，诸如小于约5纳秒，诸如甚至小于约2纳秒。在其他实施方案中，所述荧光寿命可以更长，诸如长于20纳秒、长于100纳秒、长于500纳秒、长于1微秒、或长于25微秒。熟练技术人员将理解，荧光寿命的范围将取决于特定荧光团。
被检查的所述成分可以是自动荧光的，或者可以与一种或多种荧光团相关联放置，以产生荧光发射或磷光发射。例如，被测量的所述分析物可以包括内在荧光代谢辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)、NAD(P)H和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD/FADH2)。在一些方面，被测量的所述成分或参数可以包括细胞中的另一种内在荧光分子，诸如蛋白质、脂质、核苷酸或代谢物。例如，FLIM系统可以被用于研究脂质双层中荧光团的寿命，从而提供有关膜流动性或脂质微域(诸如脂质筏)的信息。
所述方法可以进一步包括同时地或几乎同时地确定来自生物学材料的相同样品的多种成分的荧光寿命的步骤。也可以同时地或几乎同时地测量生物学材料的多个样品。
下面将更详细地讨论本公开文本的其他特征和方面。
附图说明
在说明书的剩余部分(包括对附图的参考)中更具体地阐述了本公开文本的完整且能够实现的公开内容，其中：
图1仅出于示例性目的并且展示了根据本公开文本的示例实施方案的用于分析生物学材料的系统的一个实施方案；
图2是图1中所展示的系统的截面视图；
图3是展示根据本公开文本的示例性实施方案的荧光强度测量与荧光寿命测量之间的差异的框图；
图4A是根据本公开文本的示例性实施方案制成的系统的一个实施方案的图解视图；
图4B是根据本公开文本的示例性实施方案制成的系统的一个实施方案的另一个图解视图；
图4C是根据本公开文本的示例性实施方案制成的系统的一个实施方案的又一图解视图；
图5是展示根据本公开文本的示例实施方案的结合传感器的相位调制的照明控制信号的图解附图；
图6是根据本公开文本的可以被用于测试生物学样品的微型板的示例实施方案的分解透视图；
图7是图6中所展示的微型板的倒置分解透视图；
图8是根据本公开文本的示例方面的包含在样品暂存位点中的生物学样品的一个实施方案的截面视图，所述样品暂存位点与用于进行测量的探针或柱塞以及一个或多个部件端口相关联；
图9是根据本公开文本的示例实施方案的示例过程的流程图；
图10是根据本公开文本的可以被用于测试生物学样品的微型板的另一个实施方案的透视图；
图11是根据本公开文本的示例方面的用于进行测量的探针或柱塞的一个实施方案的截面视图；
图12是根据本公开文本的示例方面的用于进行测量的探针或柱塞的另一个实施方案的截面视图；
图13是根据本公开文本的示例性实施方案的微流控系统的一个实施方案的截面视图；
图14是根据本公开文本的示例性实施方案的微流控系统的一个实施方案的平面视图；
图15是根据本公开文本的可以进行的三维分析的透视图；以及
图16是在下面例子中获得的结果的图形表示。
在本说明书和附图中重复使用的附图标记旨在表示本发明的相同的或类似的特征或元件。
具体实施方式
本领域的普通技术人员应当理解，本讨论仅是对示例性实施方案的描述，而不旨在限制本公开文本的更广泛的方面。
本公开文本的示例方面涉及用于分析包含在生物学材料样品(诸如细胞培养物)中或与之相关联的一种或多种生物学成分(包括细胞参数)的过程和系统。所述过程和系统以不仅高效地获取读数、而且可以比许多常规系统更快地进行测量的方式利用光探测和测距部件。
本公开文本的系统可以并入被设计用于检查生物学材料的任何合适的系统中，包括检查活细胞的系统。例如，使用飞行时间传感器的本公开文本的系统可以并入到所有类型的细胞代谢分析系统、微流控系统、微型板读取器、多模和吸光度读取器以及成像系统(诸如荧光寿命成像显微镜(FLIM)系统)中。
一种已经取得巨大进步的特定装置是由Agilent Technologies(安捷伦科技有限公司)制造和销售的SEAHORSE分析平台。SEAHORSE分析平台例如可以对线粒体功能和细胞生物能学进行定量测量。例如，仪器可以测量基于细胞的测定的细胞外培养基中的氧浓度和pH。SEAHORSE分析平台的不同方面在美国专利号7,276,351、美国专利号7,638,321、美国专利号8,697,431、美国专利号9,170,253、美国专利公开号2014/0170671、美国专利公开号2015/0343439、美国专利公开号2016/0077083、已经美国专利公开号2016/0096173，它们全部通过引用并入本文。本公开文本的过程和系统可以并入到上面描述的装置中，以用于提供各种优点和益处。例如，上面的仪器基于光强度进行测量，这要求以规则的间隔校准光源。然而，本公开文本的系统和过程不仅可以基于光强度进行测量，而且还可以基于消除重复校准的需要的发光寿命进行测量。本公开文本的系统和过程还可以在不显著增加成本的情况下提高速度并进行更快速的测量。
本公开文本的系统和过程也可以并入到包括多模和吸光度读取器的微型板读取器中。例如，本公开文本的检测系统可以并入包括全部可以从Agilent Technologies购得的以下的各种示例性装置中：SYNERGY混合多模读取器、CYTATION混合多模读取器、LOGPHASE微生物学读取器、EPOCH微型板分光光度计、ELx808吸光度读取器和800TS吸光度读取器。
本公开文本还涉及荧光寿命成像显微镜(FLIM)系统。FLIM系统是可以确定来自样品的荧光团发射的指数衰变速率的差异的基于图像的系统。根据本公开文本可以产生图像，所述图像可以被用于确定分子氧绘制、确定不同位置处的不同脱氧动力学、和/或确定并成像包括L-氨基酸氧化酶的活性的酶活性。在一些方面，FLIM系统可以被用于测量供体荧光团与受体荧光团之间或荧光团与淬灭剂之间的荧光共振能量转移(FRET)。由于FRET会导致荧光寿命的改变，因此寿命测量可以被用于测量FRET供体-受体对的接近度或取向。FLIM-FRET系统可以被用于测量生物学过程，诸如蛋白质-蛋白质相互作用、受体二聚化、受体-配体相互作用、或荧光团与细胞结构(诸如膜、核酸、脂质、聚糖或细胞骨架元件)的相互作用。
本公开文本还涉及可以包括芯片实验室(lab-on-a-chip)系统和器官芯片(organ-on-a-chip)系统的微流控系统。在微流控系统中，微流控装置可以包括一系列并行的或互连的通道，其中每个通道包括用于生物学测试的一个或多个暂存位点。当微流控系统处于灌注模式时，可能会进行测试，使得活细胞样品连续地供给细胞培养基。在美国专利号8,858,886中披露了一种示例性系统，所述美国专利通过引用并入本文。在微流控系统中进行的一种分析类型是可以在DNA测序、DNA克隆、基因绘制和其他形式的核酸序列分析中使用的聚合酶链式反应(qPCR)。通常，qPCR依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。将包含DNA分子的样本与各种试剂(包括结合DNA的荧光染料)一起放置在微型板的一个或多个孔中。孔板被加热以破坏构成样本中DNA分子的两条链之间的键。接下来冷却所述孔板，如此引物可以结合到链的末端。最后，加热所述孔板并将核苷酸添加到所述引物，并且最终形成DNA模板的互补副本。与DNA分子结合激活了荧光染料。因此，由激活的荧光染料输出的发射光的强度提供了已被激活的荧光染料的量的度量，并且因此提供了已经产生的DNA分子的数量。
本公开文本还涉及血细胞计数器系统。流式细胞术是基于激光的生物物理学技术，其中与细胞偶联的荧光分子经过流动细胞并被光源(诸如一组激光器)激发。荧光被收集并分离到具有特定检测波长的不同通道中、转换为电信号，并使用处理器进行分析。多色流式细胞术(诸如三色流式细胞术)使用具有不同激发波长和发射波长的荧光团来标识生物学样品的不同染色。更具体地，可以通过束成形光学部件、束控制光学部件和束引导光学部件将激发光递送到流动细胞。在时间分辨流式细胞术中，可以测量荧光团的荧光寿命。通常根据量子产率或其他化学特性的差异来选择用于流式细胞术的不同荧光团，但是也可以根据荧光寿命来选择流式细胞术荧光团，从而实现时间分辨流式细胞术。在美国专利号9,575,063中披露了一种血细胞计数器系统，所述美国专利通过引用并入本文。出于在流式细胞术仪器中测量荧光寿命的目的，曝光时间必然会很短，但是常规地以小于1毫秒的积分间隔进行LIDAR测量。为了在单次曝光中采集两个相位，利用光纤的光学延迟线(在一个实施方案中)可以被用于将延迟的光学信号馈送到成像阵列的一部分，而所述阵列的其余部分采集所述信号的未延迟部分。此外，在一个实施方案中，样品可以用多种染料标记以用于同时进行样品分析。
本公开文本涉及可以被添加到任何光谱仪器中的飞行时间传感器模块，当光经过保持在诸如比色皿的容器内的生物学样品时，所述光谱仪器可以产生足够的信号，以测量所述样品的荧光强度和/或荧光寿命。LiDAR模块也可以被用于测量吸光度、透射比和荧光偏振。光谱仪器的例子包括但不限于光谱仪、分光光度计和荧光计。飞行时间模块也可以类似地并入扫描显微镜系统中。本公开文本的示例方面涉及结合飞行时间传感器(诸如已经发现以极其精确的方式增加测量速度的CMOS飞行时间传感器)的检测系统和过程。在一些实施方案中，飞行时间传感器可以是被设计用于在例如光探测和测距(LiDAR)系统中使用的CMOS飞行时间传感器。
飞行时间传感器例如可以精确地测量荧光发射或磷光发射对经调制光学信号的响应相位(例如，同相响应和/或正交响应)。响应相位可以被用于确定荧光发射的特性，诸如荧光强度和/或远低于20纳秒的荧光寿命。因此，根据本公开文本的示例方面的系统和过程能够测量难以被许多现有仪器检测到的极短的荧光事件。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以很好地适于测量所有不同类型的样品(诸如生物学样品)中的成分。在一个方面，例如，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以被用于测量一种或多种成分或与细胞材料中的成分有关的参数。所述一种或多种成分可以被包含在细胞周围的培养基中，或者可以被包含在细胞自身内。在一些实施方案中，被测试的生物学样品可以包含源自细胞的细胞材料，诸如细胞器、线粒体或细胞提取物。特别有利的是，可以以无标签的方式完成测量。
由于提高了进行测量的速度，根据本公开文本的示例方面的系统和过程是特别通用的。例如，系统和过程结合可以在以下频率下操作的飞行时间传感器：能够对仅持续几纳秒的定时事件进行测量。例如，在一个方面，飞行时间传感器可以使用正弦调制并且以远大于20MHz(诸如大于约50MHz、诸如大于约70MHz、诸如大于约100MHz)的频率测量响应的相位。例如，当以100MHz操作时，飞行时间传感器可以测量持续小于2纳秒的响应。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以测量用于对生物学参数进行测定的荧光响应。根据本公开文本的示例方面的系统和过程不仅可以通过测量荧光发射或磷光发射的强度来操作，而且还可以很好地适于测量荧光寿命。尽管在某些情况下强度测量可能是优选的，但是测量荧光寿命的能力可以提供各种优点和益处。本公开文本的系统和过程也很好地适于产生图像并进行图像分析。此外，本公开文本的方法和过程还可以对包含在生物学样品中的成分或与所述成分有关的生物学参数进行三维分析。
例如，参考图3，展示了进行强度测量与荧光寿命测量之间的比较。例如，当根据图形2进行强度测量时，在进行测量之前进行仪器的校准，以量化光学通量。校准通常是在没有任何生物学活性的情况下使用已知的分析物浓度进行的。进行校准步骤不仅量化测量装置的光学通量，而且量化存在的荧光团的光学通量。一旦已完成校准，就可以将样本(诸如生物学样本)引入样品暂存位点以测量一种或多种成分。
如图3中所示出的，当测量荧光寿命(图形4)时，另一方面，校准步骤不仅被取消，而且可以在不具有均匀的光学通量的情况下进行测量。因而，不仅可以针对一种或多种成分测量生物学样本，而且可以在没有与校准相关联的延迟的情况下使用仪器进行替代测定。本公开文本的过程和系统还提供了信号到测量的更稳健的转换，而对光学耦合的要求更少。这些优点以低成本实现，并且不增加显著的复杂性。
过去，由于通量和测量速度的限制，许多类似的仪器仅限于进行强度测量。然而，如上面所讨论的，将飞行时间传感器并入到根据本公开文本的示例方面的系统和过程中允许荧光寿命测量，即使当荧光寿命小于几纳秒时也是如此。例如，许多pH传感器的或荧光团的荧光寿命都在几纳秒的范围内。准确的pH读数(包括随时间改变的准确pH)在许多生物学测定中尤为重要。根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以提供用于准确地且直接地测量与pH有关的荧光寿命的机会。此外，根据本公开文本的示例方面的系统和过程还能够复用荧光寿命测量，以同时对大量样品执行测量，诸如pH测量。在另一个实施方案中，系统和过程可以用于直接寿命测量，或使用直接的和复用的荧光寿命的混合寿命测量。
在一些实施方案中，生物学样品(诸如细胞材料)可以是自动荧光的(例如，荧光团本身)，或者可选地，所述生物学样品可以与荧光团相关联放置。所述荧光团最初处于基态。然后使所述荧光团和所述样品经受由任何合适的光源发射的激发光(例如，经调制的激发光)。荧光团吸收光，从而提高其能级，直到所述荧光团达到高能激发态。由于荧光团在高能激发态下是不稳定的，因此在激发寿命过程期间，所述荧光团会失去一些能量并采用较低能量的激发态以成为半稳定状态。在发射过程期间，荧光团通过发射光而释放其多余的能量，直到所述荧光团返回其基态。所释放的能量的量可以取决于与生物学样品相关联的成分的存在和/或存在的量。
荧光发射或磷光发射的强度以基本上指数的速率衰变，直到达到基态。荧光团的寿命τ被称为在发射光子之前分子“活”在其激发态的时间。荧光服从一级动力学机制，因为其强度根据以下等式呈指数衰变：
I(t)＝I0e-t/τ
寿命涉及荧光强度衰变至原始强度的1/e或36.7％的时间。对于许多荧光团，该寿命的值在亚纳秒至数十纳秒范围内、到微秒范围内，并且是其化学结构的函数，所述化学结构可能受到所述荧光团的、包括淬灭剂的或荧光增强剂的接近度的环境的影响。
荧光团分子的荧光寿命指示分子在其返回到基态之前保持在激发态的平均时间。由于其涉及从激发态到基态的衰变速率，寿命数据可以揭示许多不同类型的信息，诸如与淬灭剂发生碰撞的频率、能量转移的速率、以及激发态反应(诸如光致电子转移)的速率。这些荧光衰变在生物学传感器系统中的精确性质可以进一步揭示有关荧光团分子与其环境相互作用的细节。例如，多个衰变常数可以是荧光团分子处于若干不同环境中的结果(诸如所述分子被束缚为游离的)和/或是激发态过程的结果(诸如光致电子转移)。
用于测量荧光寿命的示例方法是脉冲法(也称为时间分辨荧光分析法)和谐波或相位调制法。在脉冲法中，用短暂的光脉冲激发样品，并测量荧光强度的时间相关性衰变。在谐波法中，用正弦调制的光激发样品。在这种方法中，发射相对于入射光的相移和解调被用于计算寿命。
如上面所描述的，尽管根据本公开文本的例子的系统和过程可以进行强度测量，但是还进行荧光寿命测量的选项可以提供各种优点。例如，荧光寿命测量与许多实验参数(诸如样品浓度和体积、激发强度和实验性几何形状)无关。本公开文本的系统结合了LiDAR部件，可以提高光学耦合效率。此外，所述系统提高了系统部件的传输性效率、降低了样品浊度、并具有固有的内部过滤器特性。
根据本公开文本，飞行时间传感器(例如，CMOS飞行时间传感器)可以被用于显著地改善生物学测量系统。更具体地，根据本公开文本的示例方面的系统和过程结合飞行时间传感器以接收荧光发射信号或磷光发射信号并且快速且高效地处理所述信号。进一步地，单个飞行时间传感器可以包括包含数千个像素的像素阵列，所述像素阵列具有在宽范围的调制频率上测量经调制光学信号的相位的能力。以此方式，飞行时间传感器不仅能够对非常短的荧光发射或磷光发射进行快速测量，而且还被配置为同时地或几乎同时地对单个荧光团或成分或者多个荧光团或多种成分进行大量测量。飞行时间传感器还能够以异常低的附加噪声测量相位。本质上，本公开文本的系统和过程结合飞行时间传感器，所述飞行时间传感器被设计成测量反射光信号的延迟到达并将其应用于荧光信号的迅速衰变的测量。更具体地，在一个方面，飞行时间传感器被设计成接收在量值上相对较大的荧光发射或磷光发射，并且然后测量信号衰变所花费的时间。替代性地，如果需要的话，飞行时间传感器也可以测量光学强度。
参考图4A，出于示例目的，示出了根据本公开文本制成的系统的一个实施方案的简化图。如图4A中所展示的，所述系统包括被安置成从光源12接收激发光的样品暂存位点10。光源12发射激发光(例如，经调制的激发光，诸如正弦曲线或一系列脉冲)，所述激发光使与样品暂存位点10上的样品相关联的荧光团经历荧光发射或磷光发射。所述荧光发射或磷光发射然后由飞行时间传感器14(诸如CMOS飞行时间传感器)感测。荧光团可以是天然地包含在生物学样品中的成分，或者可以被添加到生物学样品中并受存在于所述生物学样品中的成分的影响。
所述系统进一步包括光学通信路径16。光学通信路径用于将由光源12发射的激发光引导到样品暂存位点10上并且用于将对应的荧光发射或磷光发射引导到飞行时间传感器14。光学通信路径16可以包括光纤。然而，如下面所讨论的，光学通信路径16可以包括用于传送光学信号的任何合适的光路和/或光学元件。
在一个方面，飞行时间传感器14可以包括像素阵列，所述像素阵列包括被配置为从光学通信路径16接收信号的多个像素。例如，从光学通信路径16接收到的信号可以是指示由包含在样品暂存位点10中的荧光团发生的荧光发射或磷光发射的光学信号。像素阵列中的每个像素或像素组例如可以被配置为至少部分地基于所接收到的光学信号来提供与所述像素或像素组的光子响应相关联的信号。在一些实施方案中，飞行时间传感器14可以是例如由Sony制造的IMX556飞行时间传感器。
所述系统可以进一步包括可以被放置成与飞行时间传感器14和光源12相连通的一个或多个处理器18。所述一个或多个处理器18可以包括例如执行操作的任何合适的处理装置，诸如一个或多个微处理器、集成电路(例如，专用集成电路)、CPU、GPU、现场可编程门阵列等。在一些实施方案中，所述一个或多个处理器18可以被配置为执行存储在一个或多个存储器装置中的计算机可读指令以执行操作(诸如用于确定响应相位、荧光强度和/或荧光寿命、和/或本文所述的特性的量值的任何操作)。所述一个或多个存储器装置可以是用于存储计算机可读指令和数据的任何合适的介质。例如，所述一个或多个存储器装置可以包括随机存取存储器，诸如动态随机存取存储器(DRAM)、静态存储器(SRAM)或其他易失性存储器。此外，和/或在替代性方案中，所述一个或多个存储器装置可以包括非易失性存储器，诸如ROM、PROM、EEPROM、闪存、光学存储设备、磁性存储设备等。
所述一个或多个存储器装置可以存储计算机可读指令，所述计算机可读指令在由所述一个或多个处理器18执行时使所述一个或多个处理器执行操作，诸如由本文所描述的一个或多个处理器实现的操作中的任何操作。指令可以是以任何合适的编程语言编写的软件，或者可以在硬件中实现。
所述一个或多个处理器18可以被配置为从包含在飞行时间传感器14中的一个或多个像素接收信号。基于从飞行时间传感器14接收到的信息，所述一个或多个处理器18可以被配置为确定存在于样品暂存位点10中的荧光团的荧光寿命或荧光强度。根据本公开文本的示例方面，所述一个或多个处理器不仅可以用于确定生物学成分的存在，而且还可以被配置为根据荧光发射或磷光发射确定所述成分的或与所述成分有关的参数的量值特性。所述量值特性例如可以是量、浓度、改变速率等。所述量值特性可以以二维或以三维形式绘制。
如图4A中所示出的，所述一个或多个处理器18也可以与光源12相连通。以此方式，所述一个或多个处理器18可以结合使用飞行时间传感器14感测荧光发射或磷光发射来控制和协调来自光源12的光发射。
如图4A中所示出的，根据本公开文本的示例方面的系统可以可选地包括各种不同的光学元件，用于将光引导到样品上和/或用于将荧光发射或磷光发射引导朝向飞行时间传感器14。例如，所述系统可以包括电光调制器、束成形透镜、扫描装置、多元件透镜、诸如干涉滤波器的滤光器、分束器、孔径装置等。例如，如图4A中所示出的，所述系统可以包括与透镜24、26和28组合的滤光器20和22。所述系统还可以包括反射装置25，用于将来自光源12的光引导到被测试的样品上。然而，所有这些光学装置都是可选的并且可以基于所使用的不同设备而被取消。然而，光学元件可以有助于将光聚焦在特定区域上。例如，如果光学通信路径16大于飞行时间传感器的感测区域或成像区域，则可以使用一个或多个透镜来改变或引导光。在一些实施方案中，光学路径可以包括一根或多根光纤或光导管。
光源12通常可以包括任何合适的光源。例如，光源12可以被配置为发射相干光(例如，相干光束)或非相干光。当发射非相干光时，如果需要的话，可以使用一个或多个滤波器以滤除不需要的波长。所述一个或多个滤波器可以在由光源12发射的光接触生物学材料之前被安置，以用于过滤所述光和/或可以安置在生物学材料与飞行时间传感器之间，以用于过滤由荧光团产生的荧光发射或磷光发射。可以在本公开文本的系统中使用的合适的光源12包括例如发光二极管、激光二极管、激光器等。光源12还可以包括上面光装置中的一个或多个。例如，光源12可以包括多个激光器、多个光二极管或多个发光二极管，以用于在所需区域上提供足够的强度。
光源12工作的波长可以根据存在的荧光团和/或被检查的生物学成分而变化。波长例如可以从约250nm至约10,000nm(诸如从约300nm至约2000nm之间)变化。如本文所使用的，与数值结合的术语“约”的使用是指与所表明的数值的±10％。光源12例如可以发射紫外光、可见光、近红外光或它们的混合物。
光源12的照明强度可以取决于各种因素和参数，包括飞行时间传感器14的工作波长、灵敏度、以及系统的信噪比。在一个方面，光源12能够递送每秒至少102个光子，诸如大于每秒约104个光子，诸如大于每秒约108个光子，诸如大于每秒约109个光子，诸如大于每秒约1010个光子，诸如大于每秒约1011个光子，诸如大于每秒约1012个光子。光强度通常小于约1030，诸如小于约1020。
在一个实施方案中，光学通信路径16可以包括一根或多根光导管或光纤。例如，在一个实施方案中，光学通信路径16可以包括光纤束阵列。相同的光纤可以被用于将来自光源12的光递送到包含在样品暂存位点10上的样品上并被用于将荧光发射或磷光发射传送到飞行时间传感器14。替代性地，可以使用不同的光纤来实施不同的功能。
在一个方面，可以使用不同的光纤或不同的光纤束阵列来将光引导到位于飞行时间传感器上的传感器元件或像素的不同区上。以此方式，可以同时地或几乎同时地对包含在样品暂存位点10上的相同样品或不同样品进行多次测量。
例如，所述系统能够同时地或几乎同时地检测和测量来自包含在相同样品或不同样品中的不同荧光团的多个荧光发射或磷光发射。
复用也可以被用于同时地或几乎同时地测量多个样品中的相同荧光团。例如，在一个方面，所述系统可以包括多个样品暂存位点。单个光源或多个光源可以同时地或几乎同时地将光发射到每个样品暂存位点上。可以使用光学通信路径16，以将来自每个样品暂存位点的荧光发射或磷光发射传输到飞行时间传感器14上的传感器元件的或像素的不同区，以用于同时地进行多个测量。实际上，所述系统能够同时地或几乎同时地测量来自多个样品上的每个样品中的多个荧光团的荧光发射或磷光发射。例如，所述系统可以包括多于10个样品暂存位点(诸如多于25个样品暂存位点，诸如多于50个样品暂存位点，诸如多于75个样品暂存位点，诸如多于100个样品暂存位点，诸如多于125个样品暂存位点，诸如多于150个样品暂存位点，诸如多于175个样品暂存位点，诸如多于200个样品暂存位点，诸如多于225个样品暂存位点，诸如多于250个样品暂存位点，诸如多于300个样品暂存位点，诸如多于400个样品暂存位点，诸如多于500个样品暂存位点)且通常少于约10,000个样品暂存位点。在一个方面，所述系统可以包括与一个或多个光源结合的多个飞行时间传感器，以用于进一步增加包含在所述系统内的样品暂存位点的数量。
在一个实施方案中，本公开文本的系统可以包括光扫描能力。例如，如美国专利号8,858,886中所描述的，所述系统可以包括用于接收含有生物学样品的微型板容器和包括光学盒容器的台。所述光学盒容器可以包括光源和可选地飞行时间传感器。所述台或所述微型板容器中的至少一个可以相对于另一个在多个方向上(诸如在正交方向上)移动。在一个实施方案中，本公开文本的系统可以包括多个窗口和对应数量的光纤，所述多个窗口连接到单个激发光源以用于光耦合，所述对应数量的光纤返回到飞行时间传感器上的单个像素阵列，以用于创建扫描实现方式。窗口和光纤的数量可以为从约4个至约12个，诸如从约6个至约10个。
在一个方面，飞行时间传感器14可以是距离成像系统或LiDAR系统的一部分。尽管飞行时间传感器14可以被配置为通过测量光信号的往返行程时间来解析传感器与图像的每个点的目标之间的距离，但是代替测量信号的往返行程，飞行时间传感器14测量荧光发射或磷光发射的强度或迅速衰变。例如，当测量荧光寿命时，飞行时间传感器14在荧光发射峰值处开始测量，并且然后测量所述信号衰退的速度。
在一个实施方案中，飞行时间传感器14可以是具有一个或多个相位检测器的经调制光源。例如，飞行时间传感器14可以通过用载波调制光束并且然后测量所述载波的相移来操作。替代性地，飞行时间传感器可以是距离选通成像器，其内置快门打开和关闭，使得通过光源12发射光脉冲。
在图4A中展示的系统中，光源12、飞行时间传感器14、以及所述一个或多个处理器18被示出为单独的元件。然而，应该理解的是，这些元件中的每一个都可以并入单个装置中。
为了进行测量或测量根据本公开文本的荧光发射或磷光发射，所述系统可以操作以测量荧光强度或荧光寿命，如图3中所示出的。当测量荧光强度时，可以执行初始校准步骤，以便确保存在已知的光学通量。
当测量荧光寿命时，生物学样品首先被放置在样品暂存位点10上，所述样品暂存位点包含至少一种待被感测、绘制或测量的成分。所述成分可以是自动荧光的。替代性地，可以将一种或多种荧光团与样品相关联放置，以用于在与所需波长的光接触时生成荧光发射或磷光发射。一旦光束接触(多个)目标荧光团，所述(多个)目标荧光团就会经历荧光发射或磷光发射。所述荧光发射或磷光发射然后经由光学通信路径16传送到飞行时间传感器14。飞行时间传感器14然后可以结合所述一个或多个处理器18对荧光衰变或荧光寿命进行测量。由飞行时间传感器14接收的信号可以被用于不仅确定成分的存在，而且还确定所述成分的量值特性(如果需要的话)。
尽管光源12和飞行时间传感器14可以使用不同的方法和技术来操作，但是在一个实施方案中，光源12被配置为以调制速率发射脉冲形式的激发光。例如，光源12可以被控制(例如，通过所述一个或多个处理器)发射作为上升正弦曲线的激发光，其中所述正弦曲线的底部处于零光发射或接近零光发射。可以至少部分地基于测试期间存在的荧光团的荧光发射或磷光发射的衰变时间来选择调制速率。例如，调制速率可以是从约0.01MHz至约1,000MHz的任何位置，包括介于其间的0.01MHz的所有增量。例如，在一个方面，调制速率可以大于约1MHz，诸如大于约10MHz，诸如大于约20MHz，诸如大于约30MHz，诸如大于约40MHz，诸如大于约50MHz，诸如大于约60MHz，诸如大于约70MHz，诸如大于约80MHz，诸如大于约90MHz，诸如大于约100MHz，诸如大于约120MHz，诸如大于约140MHz，诸如大于约160MHz，诸如大于约180MHz，诸如大于约200MHz。在一个方面，调制频率可以小于约500MHz，诸如小于约400MHz，诸如小于约300MHz，诸如小于约200MHz，诸如小于约150MHz。
在一个实施方案中，所述系统可以使用正弦调制并测量荧光响应的相位。例如，可以根据以下关系获得最佳灵敏度：
2πfmod＝1/τ衰变
其中，fmod为调制，并且τ衰变为荧光寿命。以此方式，可以至少部分地基于荧光发射或磷光发射的荧光寿命来确定或选择由光源发射的激发光的调制速率。
飞行时间传感器中每个像素的光子响应可以被用于确定荧光发射的或磷光发射的荧光寿命。例如，可以基于每个像素的光子响应来确定荧光发射或磷光发射对经调制的激发光的响应相位。在一些实施方案中，响应相位可以包括每个像素处的同相响应(I)和正交响应(Q)两者。在一些实施方案中，荧光寿命可以至少部分地基于下式(例如，通过一个或多个处理器)来确定：
更具体地，可以分析来自具有指定衰变时间的荧光团集合的信号，就好像它们来自具有相同衰变时间的简单RC网络一样。时域响应将是
其中量值已经被设置成提供统一DC响应。拉普拉斯变换表示将是位于处的实轴上的单极。当该网络被频率为fmod的正弦信号激励时，响应将为
如果测量响应的同相分量和正交分量(如I和Q)，则可以确定：
对于I和Q中的相对于其各自的分量为较小的误差，可以确定：
如果存在有限的总光子成本并且散粒噪声是有限的，选择I≈Q的操作点可以是有益的。转换光子计数并施加泊松统计，可以确定：
例如，同相信号是两个光子计数过程的差。当形成这些差时，所产生的方差是两个方差之和，但是可用信号是所述差。因此，如果确定I＝IA-IB(其中A和B表示构成完整求和的两个半区间)，那么，
如果激发信号是在最小值处恰好触及零的升高的正弦曲线，那么它将包括DC分量和AC分量之和，所述DC分量的量值等于所述AC分量的量值。随着AC分量改变频率(调制速率)，输出的DC分量将继续具有相同的单位值，但是随着AC频率的增加，AC响应将减弱。在此方面，过高的调制速率会导致将是几乎恒定的光子流的输出信号，并且大的恒定分量的散粒噪声会进行干扰而无法辨别出待评估的小调制。即使驱动信号被完全调制，响应信号也将仅包含微弱的调制。
为了评估实际的光子计数，我们可以首先假设我们具有相对于DC响应的I和Q的模拟表达。我们可以确定将用于确定NI的两个单独的光子计数。它们将通过在半个周期上对正弦波进行积分而获得：
因此
如果我们用τ2πfmod＝1操作，则/>
例如，图5展示了根据本公开文本的示例实施方案的光源控制信号的时序的一个实施方案，所述光源控制信号被用于提供激发光以及测量在飞行时间传感器的像素处的光子响应。
曲线110表示照明控制信号的时序。如所示出的，照明控制信号具有多个周期112，其中光源被控制为在周期112的前半段发射激发光，并且被控制为在周期112的后半段不发射激发光或发射减弱的激发光。以此方式，可以控制光源以根据调制速率调制激发光。
在一些实施方案中，用于每个像素的信号可以在每个周期期间在两个模拟积分器之间切换。这种积分方案可以继续进行，直到关闭全局快门并经由模数转换器读出帧为止。可以与激发光源的调制同相地执行该过程，以确定同相响应。可以重复该过程(但是相移90°)以获得正交响应。
曲线120表示根据本公开文本的示例方面的荧光发射或磷光发射的响应相位的同相分量的像素的测量。如所示出的，针对第一半周期，第一响应122被提供给第一积分器。针对第二半周期，第二响应124被提供给第二积分器。对于某一帧，该过程被重复多个周期(例如，数百个周期、一千个周期、数千个周期、数百万个周期)。响应相位的同相分量可以根据第一响应122和第二响应124确定。例如，响应相位的同相分量可以通过从第一响应122中数字地减去第二响应124来确定。
曲线130表示根据本公开文本的示例方面的荧光发射或磷光发射的响应相位的正交分量的像素的测量。如所示出的，在第一积分器与第二积分器之间切换的时序相对于曲线120移位了90°。针对第一半周期，第一响应132被提供给第一积分器。针对第二半周期，第二响应134被提供给第二积分器。对于某一帧，该过程被重复多个周期(例如，数百个周期、数千个周期)。响应相位的正交分量可以根据第一响应132和第二响应134确定。例如，响应相位的正交分量可以通过从第一响应122中数字地减去第二响应124来确定。
如上面所讨论的，所述一个或多个处理器可以被配置为至少部分地基于响应相位来确定荧光寿命。更具体地，所述一个或多个处理器可以被配置为至少部分地基于响应相位的同相分量和正交分量来确定荧光寿命。在一些实施方案中，荧光寿命可以至少部分地基于下式(例如，通过一个或多个处理器)来确定：
在图4A中所展示的系统中，光源12和飞行时间传感器14都被安置在被测试的生物学样品的同侧。图4A的配置类似于图4B中展示的系统的配置。如图4B中所示出的，光源12和飞行时间传感器14都被安置在限定多个样品暂存位点10的微型板11的同侧。在图4B中，光源12和飞行时间传感器14被集成到单个部件中。
参考图4C，示出了根据本公开文本的系统的替代性布置。在图4C中，光源12和飞行时间传感器14被安置在被测试的生物学样品的相对侧。如图4C中所示出的，光源12被安置在微型板11和样品暂存位点10上方，而飞行时间传感器14被安置在微型板11和多个样品暂存位点10下方。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程很好地适于测量可以单独地或与荧光团结合产生荧光发射或磷光发射的任何生物学成分。在一个方面，例如，成分可以包含在生物学样品中，诸如在细胞材料中。被测试的成分可以是气体、固体、凝胶或液体。被测量的一种或多种成分可以从活的或活性的样品或从非活性的样品中测量。
可以从生物学样品中测量的成分包括所有不同类型的代谢物。所述方法可以包括不仅验证成分的存在，而且根据荧光寿命或荧光强度确定所述成分的量值特性或与所述成分有关的参数。所述成分可以是脂质、离子、溶解气体、盐、矿物质、核酸、蛋白质、多肽或酶。与所述成分有关的参数可以是温度、pH、氧化态、或粘度以及由于细胞代谢的结果，所述成分导致这些参数的改变。可以被测量的溶解气体包括氧、二氧化碳、一氧化氮或氨。本发明考虑测量成分和/或与所述成分有关的参数。在一个实施方案中，被测量的成分是细胞的线粒体的耗氧量，并且被测量的参数是耗氧量的副产物，诸如二氧化碳、乳酸等。在另一个实施方案中，被测量的成分或参数可以包括内在荧光代谢辅因子，诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)、NAD(P)H或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD/FADH2)。在一个实施方案中，可以监测并分析亚硝酸还原酶(NAD(P)H)。亚硝酸还原酶是催化与氮代谢有关的反应的酶。
所述成分可以包含在所述细胞内，或者可以包括由所述细胞分泌到周围培养基中的材料。例如，可以在细胞的微环境中及其周围监测、分析或绘制上面描述的任何特定成分或参数。在一个实施方案中，所述系统可以被用于测量成分或参数的改变，并且提供特定参数或成分的改变速率。在一个实施方案中，可以经由外部操作来监测和调制一个或多个细胞的微环境，作为模拟体内条件的手段，诸如缺氧应用、TME建模、缺血再灌注等。
本公开文本的系统可以以二维或三维形式提供关于参数或成分的信息。例如，图15是三维测量的图示。三维图形80例如可以表示气体浓度或分压，诸如氧。另一个方面，三维图形82可以表示pH或温度。如所示出的，图形80和82可以提供关于感兴趣的参数的稳健信息，包括在特定位置和/或在特定时间点的关于参数的信息。
在一个方面，根据本公开文本的示例实施方案的系统和过程可以被用于实时监测活细胞的生物能学。例如，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以被用于监测活细胞的线粒体呼吸和/或糖酵解。在一些实施方案中，所述系统和过程可以被用于监测细胞内或微环境的pH、氧浓度、氧化还原电位等。这些细胞功能通常围绕氧消耗和质子射流。在一些实施方案中，本发明的系统和过程可以被用于监测代谢或生物能学的其他实施方案，诸如氧化还原电位，或代谢物或辅因子(诸如NAD(P)H或FAD/FADH)的相对浓度。根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以被用于检测这些参数中的细胞外改变，以便测量细胞呼吸的、细胞糖酵解的和细胞ATP产生的速率。
被测试的细胞可以包括任何合适的细胞样品，包括但不限于经培养的细胞、原代细胞、人细胞、神经元、T细胞、B细胞、上皮细胞、肌细胞、干细胞、诱导多能干细胞、永生化细胞、病原体感染细胞、细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、古生菌细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、爬行动物细胞、两栖动物细胞等。被测试的细胞还可以包括三维细胞样品，诸如组织样品、细胞球、活检样品、细胞支架、器官芯片(organs-on-a-chip)等。可以被测量并与上面的细胞功能有关的参数的例子包括二氧化碳浓度、氧浓度或氧分压、钙离子、氢离子等。通过这些测试，可以获得对驱动细胞表型和功能的因素的了解和/或细胞环境或微环境的准确图片。在一个实施方案中，根据本公开文本的来自组织样品的背景荧光可以生成组织切片的图谱。由于每个结构的不同荧光特性，于是可以标识细胞的不同结构。以此方式，可以根据所述组织切片绘制不同的蛋白质、细胞器和分子。可以生成人工染色。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程特别地很好适于监测具有非常短的荧光寿命的荧光团，包括指示包括pH速率随时间改变的pH的荧光团。例如，已知与pH有关的荧光团具有极短的荧光寿命。然而，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以在能够测量以下荧光寿命的调制速率下操作：小于约500纳秒、100纳秒，诸如小于约75纳秒、诸如小于约50纳秒、诸如小于约40纳秒、诸如小于约30纳秒、诸如小于约20纳秒、诸如小于约15纳秒、诸如小于约10纳秒、诸如小于约8纳秒、诸如小于约6纳秒、诸如小于约4纳秒、诸如小于约3纳秒、诸如小于约2纳秒、诸如甚至小于约1纳秒。实际上，认为的是，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以检测短至0.1纳秒或更短的荧光寿命。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以被用于测量任何活性细胞的活细胞代谢数据或(微)环境条件。被测试的细胞材料例如可以包括细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞、真核细胞等。可以被测试的细胞包括哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括动物细胞和人细胞。可以被测试的特定细胞包括癌细胞、免疫细胞、永生细胞、原代细胞、诱导多能干细胞、感染病毒或细菌性病原体的细胞等。
例如，在一个方面，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以被用于辅助免疫疗法。免疫疗法是增强患者的免疫系统以用于对抗癌症、感染和其他疾病的治疗类型。免疫疗法过程例如可以包括T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞的产生。例如，在T细胞疗法期间，从患者的血液中去除T细胞。然后将T细胞送入生物反应器并进行扩增或培养。此外，T细胞可以被改变，使得它们具有称为受体的特定蛋白质。T细胞上的受体被设计成识别并靶向体内不需要的细胞，诸如癌细胞。经修改的T细胞在生物反应器中培养以达到一定的细胞密度，并且然后供应给患者的身体以对抗癌症或其他疾病。T细胞疗法通常称为嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。由于在对抗血液疾病方面取得了巨大成功，因此T细胞用于CAR疗法的用途最近已激增。在一些实施方案中，本发明的方面可以被用于监测在(CAR)T细胞疗法中使用的T细胞的健康度。在一些实施方案中，本发明的方面可以被用于监测T细胞活化、T细胞耗竭、T细胞代谢等。
NK细胞是可以寻找出并破坏体内受感染细胞的细胞毒性淋巴细胞类型。NK细胞可以展现非常快的免疫反应响应。因此，NK细胞在抗癌疗法中的使用已引起极大的兴趣和普及。然而，哺乳动物的血液中只有有限数量的NK细胞，从而要求NK细胞在生物反应器内生长到相对较高的细胞密度。
培养细胞(诸如T细胞、NK细胞或其他哺乳动物细胞)通常需要从接种到在患者体内使用的有些复杂的过程。本公开文本的系统和过程可以被用于在培养过程中的任何点期间监测细胞代谢，以确保细胞是健康的，和/或具有所需的代谢表型，并且确保细胞生长的培养基含有优化水平的营养物质。所述系统和过程例如可以被用于进行调整，以确保细胞在它们生长时的代谢适应性。
除了免疫细胞外，还可以监测癌细胞的代谢，以用于了解哪些营养物质为癌细胞提供养料。例如，根据本公开文本的示例方面的系统和过程可以揭示影响癌细胞的代谢以抑制生长的机制或组分。根据本公开文本的示例方面的系统和过程还可以被用于确定癌细胞可能增殖的速度。本公开文本的系统和过程也很好地适于在毒理学中使用。例如，本公开文本的过程和系统可以被用于检测潜在疗法之中的线粒体功能(liability)。例如，线粒体毒性的风险可以用高特异性和灵敏度来评估。以此方式，可以确定某些线粒体毒物的作用机制。
根据本公开文本的示例方面的系统和过程还可以被用于辅助治疗肥胖症、糖尿病和代谢紊乱。例如，所述过程和系统可以被用于测量遗传改变对代谢途径组分的功能影响。可以检查健康细胞模型和患病细胞模型中使用的营养物。进一步地，可以在不同的细胞类型中评估脂肪酸氧化和糖酵解。
当测量与细胞材料有关的细胞参数时，感兴趣的成分可以包含在所述细胞内，或者可以从所述细胞周围的培养基中测量。例如，细胞参数或成分可以由细胞分泌到周围的培养基中并被测量。样品暂存位点可以被配置为与贴壁细胞和悬浮细胞两者以及分离的线粒体都具有兼容性。
当根据本公开文本的示例方面对荧光团进行测试和测量时，在一些情况下可以进行单次测量。然而，本公开文本的系统和过程很好地适于非常快速地进行多次测量，以准许多次确定与生物学参数有关的荧光团的荧光寿命或荧光强度。例如，快速循环次数与显著的复用能力相结合，允许非常快速地对荧光团进行多次测量。例如，与细胞参数有关的荧光团的荧光寿命或荧光强度可以在小于约60秒(诸如小于约30秒、诸如小于约10秒、诸如小于约5秒、诸如小于约1秒、诸如甚至小于约0.5秒)内被确定多次。在上面的时间段中，荧光团可以被测量多于10次，诸如多于100次，诸如多于200次。多个测量可以被用于确定改变速率和/或可以被求平均以提高准确性。
如在图4A、图4B或图4C中示出的系统可以并入许多且不同的仪器中，以用于对成分的存在和/或对成分的存在或参数浓度进行测量。参考图1-图2和图6-图8，示出了结合图4A中所展示的部件的系统的一个实施方案。图1-图2和图6-图8中所展示的系统特别很好地适于同时进行多种生物学样品(诸如细胞材料)的测定。图1和图2中所展示的系统例如可以被用于同时测试多个生物学样品并且同时测试每个样品中的一种或多种成分或细胞参数。
仅出于说明目的，图1和图2中的发明在很好地适于监测活细胞的代谢过程的仪器配置中得到证明。图1和图2的实施方案决不旨在限制本公开文本的范围。本公开文本的光学检测系统可以并入任何合适的生物学传感器或成像系统。如图1和图2中所示出的，所述系统包括限定用于接收生物学样品的多个样品暂存位点的微型板30。微型板30被设计成与多个柱塞或探针32相关联放置，所述多个柱塞或探针被配置为朝向和远离装载到设备中的微型板30移动。每个柱塞32均与光导管34相连通。光导管34可以是单根光纤或如所示出的光纤束。光导管34用于将光递送到微型板30中包含的生物学样品并用于将荧光发射或磷光发射传送到飞行时间传感器。
如图1和图2中所示出的，所述系统可以包括安装块36，所述安装块可以保持柱塞32。所述安装块可以与电机可操作地关联，以用于使所述安装块36来回往复运动。替代性地，微型板30可以被放置在将所述微型板提升到与柱塞32接触的平台上。
光导管34可以被放置成与光源和飞行时间传感器相连通。飞行时间传感器和/或光源也可以被放置成与一个或多个处理器92相连通(图2)。根据本文描述的任何系统和过程，所述一个或多个处理器92可以从飞行时间传感器获得并处理测量结果。所述一个或多个处理器92可以经由显示装置94或其他适合的(多个)用户接口(例如，音频接口、视觉接口、和/或交互式接口)向用户提供信息。
参考图6和图7，示出了微型板30的一个实施方案，所述微型板可以用于保持生物学样品、将一种或多种流体递送到样品、以及协助将样品放置成与柱塞32相连通。微型板30可以包括限定多个样品暂存位点42的孔板40。孔板40可以与可移除的盖44结合。尽管图6中展示的孔板40示出为包含24个样品暂存位点42，但是应当理解，如上面所描述的，孔板40可以包含更多或更少的样品暂存位点42。实际上，样品暂存位点42的数量可以从一到几千或更多变化。在一些实施方案中，可以制造几乎任何大小的单个样品暂存位点，或者可以以一维布置或二维布置制造多个样品暂存位点。
例如，微型板30的替代性实施方案在图10中示出。图10中展示的微型板30包括96个单独的样品暂存位点42。图10中示出的微型板30可以容易地并入本公开文本的在图1和图2中展示的系统中。
返回参考图6和图7，微型板30通常是包括框架46的平坦元件。微型板30的不同元件可以由任何合适的材料(诸如模制塑料)或由模块化玻璃固定装置制成。框架46可以包括限定多个区域50的表面48。所述多个区域50可以与图1和图2中展示的柱塞的数量和位置相对应。同样地，所述多个区域50的数量和位置也与样品暂存位点42的数量和位置相对应。在图6中展示的实施方案中，每个区域50均包括第一、第二、第三和第四端口52。如将在下面更详细地描述的，端口52促进将气体和/或试剂递送到样品暂存位点42。每个区域50还包括中心孔口54，用于接收对应的柱塞32。端口52被设定大小且被安置成使得四个端口的组可以安置在单个样品暂存位点42之上。来自四个端口的气体或液体可以被递送至相应的样品暂存位点42。在其他实施方案中，每个区域中的端口的数量可以小于四或大于四。中心孔口54和每个对应的柱塞32可以相对于孔板40顺应地安装，以便准许其通过适应横向移动而嵌套在所述孔板内。
端口52中的每一个都可以具有限定通过框架46的表面48的开口的圆柱体形状、圆锥体形状或立方体形状。每个端口52也可以在面向样品暂存位点42的底部是闭合的，除了诸如毛细管孔口的小孔之外。孔口或孔可以沿底表面居中。毛细管孔口被适配成用于在缺少外部力(诸如正压差力、负压差力或可能的离心力)的情况下诸如通过表面张力将测试流体保留在端口52中。每个端口52可以由不渗透气体、测试流体的聚合物材料或由任何其他固体材料制造而成。每个端口52的液体体积可以变化。在一个方面，例如，每个端口52的液体体积可以在200微升至约500微升的范围内，尽管设想了该范围外的体积。
参考图7，微型板30以倒置配置示出。此外，柱塞32被示出为延伸通过框架46的中心孔口。柱塞32被适配成用于插入到每个样品暂存位点42中，用于接近被测试的生物学样品。
可移除的盖44也在图7中展示。盖44可以用于帮助防止布置在微型板中的样品的或培养基的蒸发或污染。
参考图8，示出了单个样品暂存位点42的截面视图。样品暂存位点42包含生物学样品58，所述生物学样品包含在培养基60中。生物学样品58包含待测试的一种或多种成分或细胞参数。在图8中，探针或柱塞32与样品暂存位点42相关联地示出，使得柱塞32接触或几乎接近生物学样品58。如上面所描述的，柱塞32被设计成在如图8中示出的测试位置与柱塞从样品暂存位点42中抽出的非接合位置之间往复运动。
还展示了两个端口52，所述两个端口被设计成将流体(诸如液体和气体)递送到样品暂存位点42。例如，在一个实施方案中，端口52可以与外部气体供应装置62和内部空气控制装置64相连通。外部气体供应装置62和内部空气控制装置64可以控制供给到培养基60上方的顶部空间的气体或将气体从所述顶部空间去除。内部空气控制装置64可以是来自仪器内部的环境空气，所述环境空气经由小型内部压缩机压缩以对端口52加压以递送流体，诸如药物化合物。将气体递送到顶部空间可以允许操纵测试样品周围的环境，以创造模拟低氧、缺氧或常氧和/或低pH的条件。在一些实施方案中，诸如氮气的生物惰性气体可以被注入到样品暂存位点42中的培养基60中、在培养基60的表面上方，以用于控制顶部空间中或培养基中的气体成分。如果需要的话，气体可以用于冲洗顶部空间。
如上面所描述的，例如，每个样品暂存位点42可以与四个端口52结合。端口52可以用于将各种化合物递送至样品暂存位点42内的生物学样品58。例如，在仪器上执行的常见测试是线粒体应力测试。在该测定中，通过微型板的药物端口递送一系列注射剂，以便测量生物学样品对各种化合物(寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素)的响应。在执行测定之前，将这些化合物预装载到微型板上的药物储器(端口)中。当微型板被插入到仪器中时，它被联接到歧管，所述歧管在被电磁阀激活时，向储器的顶部空间提供气动压力，从而迫使化合物通过小注孔并进入包含生物学样品的样品暂存位点42中。可以修改气动歧管和阀系统，以将这些端口之一重定向到外部气体供应装置(气体圆筒或气体瓶)。气体供应装置可以通过后连接器面板上的端口连接到仪器。所述瓶可以位于仪器附近，并且可以包含用于加湿进入气体的调节器和起泡器。当被激活时，电磁阀会打开，从而允许气体流过歧管/微型板接口，流过药物端口注孔，并流入生物学样品上方的顶部空间中。通过垂直地振荡柱塞(探针)，气体将与培养基混合，从而允许控制样品中的可用氧。例如，通过将氮灌注到顶部空间中，培养基中可用的O2被取代，并且在样品周围产生更低氧的条件。通过关闭气体并混合，可以重新建立O2的环境水平。
在一些实施方案中，生物学活性物质的溶液源可以与样品暂存位点42中的培养基流体连通，以用于使样品暴露于所述物质。
与每个样品暂存位点42相关联的端口52的数量确定了测试期间可以添加到样品暂存位点42的组分的数量。在一些实施方案中，不需要流体来进行测试。在其他实施方案中，诸如当进行如上面所描述的线粒体应力测试时，可以将多种不同的组分供给样品暂存位点，以用于影响生物学样品58周围的条件。通过具有多个端口52，所述系统和过程还可以准许根据每个单个暂存位点42测试多个条件。除了线粒体应力测试之外，可以使用图1-图2和图6-图8中展示的系统操作的其他测试是：ATP速率测定测试，其同时根据糖酵解和线粒体呼吸测量ATP产生的速率；糖酵解测定测试，其测量活细胞中的糖酵解，揭示了其他测定中不可察觉的瞬时响应和快速代谢转换；底物氧化测试，其通过评估活细胞中耗氧量的改变来测量细胞底物氧化；以及细胞能量表型测试，其测量线粒体呼吸和糖酵解。
如图8中所示出的，柱塞或探针32包括多根光纤34，所述多根光纤将激发光递送至生物学样品58并将荧光发射或磷光发射传输到飞行时间传感器，以用于测量荧光寿命和/或荧光强度。在某些应用中，生物学样品58中被测试的成分可以是自动荧光的，或者其中荧光团对生物学样品58是内源性的，以用于使所述成分在与激发光接触时经历荧光发射或磷光发射。本公开文本的系统也很好地适于使用FLIM产生图像。所述图像可以被用于对包括NAD(P)H的各种参数进行测量。
替代性地，所述系统可以将一种或多种荧光发射剂或磷光发射剂(诸如荧光团)递送至生物学样品58，当经历荧光发射或磷光发射时，所述一种或多种荧光发射剂或磷光发射剂会受到生物学成分存在的影响。例如，如图8中所示出的，柱塞32可以包括一对荧光团传感器66和68。对于测量不同成分或在不同条件下的相同成分，荧光团传感器66和68可以是相同的或可以是不同的。
荧光团传感器66和68可以包含促进荧光发射或磷光发射的任何合适的荧光团或荧光剂。通常，荧光团吸收特定波长的光能量，并重新发射不同波长(诸如更长波长)的光。被吸收的波长、能量转移效率和发射前的时间取决于荧光团的结构及其化学环境两者。
当被测量的成分是氧浓度或氧分压时，荧光团可以与同氧浓度成反比例的信号一起使用，诸如被固定为颗粒或均匀地分布在透氧聚合物(诸如硅橡胶或聚氨酯水凝胶)中的卟啉、钌或罗丹明化合物。在测量pH时，可以将荧光指示剂染料结合到荧光团传感器中。一种这样的染料是荧光素，在染料质子化时，所述荧光素的信号降低，并且所述荧光素在悬浮在载体聚合物中或共价附着到亲水聚合物上的颗粒之中、之上或包埋在所述颗粒中。
指示pH的可能荧光团的列表包括但不限于表1中的以下内容：
表1：用于测量pH的示例荧光团
上面提供了磷酸盐缓冲溶液中pH在5.2至7.9之间的染料的荧光寿命。所述数据是针对含氧溶液和脱氧溶液。
当测量二氧化碳时，可以使用基于pH敏感换能器的传感器。由于二氧化碳与水的反应，可以通过碳酸的产生间接调制荧光。
也可以使用检测葡萄糖的荧光团，诸如基于使用硼探针的非酶转导的或酶促葡萄糖换能器的荧光团，所述硼探针与葡萄糖络合，从而产生调制所述探针的荧光的电荷转移，所述酶促葡萄糖换能器将葡萄糖氧化酶偶联到荧光氧传感器，其中葡萄糖的结合和氧化导致所述氧传感器的定量调制。采用荧光团或对生物学分子(诸如例如，乳酸、氨或尿素)敏感的其他类型的传感器也在本公开文本的实施方案的范围内。乳酸传感器可以基于酶传感器配置，其中乳酸氧化酶偶联至荧光氧传感器，并且其中乳酸的结合和氧化导致氧传感器的定量调制。氨或铵离子传感器可以被配置将质子化的pH指示剂固定在疏水、透气的聚合物中，并且被配置通过与瞬态氨反应定量地调制荧光输出。尿素传感器可以是基于酶传感器配置，其中脲酶偶联至荧光氨换能器，并且其中尿素与氨结合和还原，从而导致氨传感器荧光的调制。传感器的性质通常不形成本发明的实施方案的方面。
如图8中所示出的，荧光团源可以位于被放置成与生物学材料相连通的柱塞或探针上。替代性地，荧光团源可以位于生物学材料样品中。生物学材料可以包括细胞，并且荧光团可以位于所述细胞内、所述细胞上，或者可以位于所述细胞周围的微环境中。在一个实施方案中，荧光团可以被包封在纳米颗粒或微粒中，所述纳米颗粒或微粒偶联至柱塞或探针、处于细胞周围的悬浮液中、或者处于细胞周围的溶液中。
在一个方面，荧光团传感器还可以包括淬灭剂。淬灭剂可以通过影响荧光学信号来促进测量。在一个方面，例如，使用氧淬灭荧光团传感器。
如图8中所示出的，柱塞32被设计成降低到样品暂存位点42中，以用于与生物学样品58相关联放置。在一个方面，柱塞32可以降低以形成微室70。产生微室允许快速、实时地测量正在改变的成分或参数。微室的形成例如允许测量细胞外培养基中不断改变的氧浓度和质子浓度。更具体地，微室70能够在更大体积的细胞培养基内临时产生高度浓缩体积的生物学样品58或细胞。这准许对由细胞的生物学活性引起的培养基的成分的改变进行灵敏测量。
在一个实施方案中，如果需要的话，柱塞32还可以通过在生物学样品58上方的培养基柱中产生静水压力来提供灌注。例如，柱塞32可以通过样品暂存位点42竖直地往复运动，从而使培养基跨生物学样品58流动并且有时穿过所述生物学样品。通过上下移动柱塞32，培养基跨生物学样品58移动，从而补充营养、提供氧、并清除废物。因此，生物学样品58周围的微环境可以在测量之间被连续不断地灌注。随着柱塞32移动到样品暂存位点42的底部部分中，运动停止，产生小的瞬态体积，并进行测量。通过样品暂存位点42的灌注效率可以通过改变冲程高度、速度和柱塞32与样品暂存位点42的底部之间的间隙来提高。
参考图11和图12，示出了根据本公开文本的可以使用的探针32的进一步实施方案。相同附图标记已用于表示相同或相似的元件。如图11中所示出的，探针32包括延伸穿过探针32的光纤束74。探针32包括用于与被测试的生物学材料相关联放置的荧光团传感器66。在图11中所展示的实施方案中，探针30进一步包括屏障部分72，所述屏障部分被设计成在样品暂存位点中形成微室，以促进测量的进行。
如图11中所示出的，包括光源和飞行时间传感器的光学照明系统和测量系统两者都位于样品暂存位点的同侧上，所述样品暂存位点将被放置在探针32下方，类似于图4B中展示的实施方案。
图12中展示的探针32类似于图11中展示的探针。如图12中所示出的，探针32包括光纤74、屏障部分72和荧光团传感器66。然而，在图12中展示的实施方案中，光源78被放置在探针32下方。以此方式，光源78被安置在被测试的样品下方，而探针32被安置在所述样品上方。这类似于图4C中展示的实施方案，仅光源和探针的位置被颠倒。
如上面所描述的，本公开文本的光学系统可以并入所有不同类型的生物学测量和成像系统中。参考图13和图14，例如，示出了微流控系统100，其可以配备有根据本公开文本的光源和飞行时间传感器。微流控系统100包括被设计成使培养基在生物学材料158上及周围循环的培养基通道106。培养基通道106与培养基入口102和培养基出口104相连通，以用于循环培养基，如图14中特别示出的。例如，细胞培养基可以流过通道106，用于使可以包括活细胞的生物学样品158浸润。流速率可以是相对低的，诸如从1微升/分钟到100微升/分钟，诸如从2微升/分钟到20微升/分钟，诸如从5微升/分钟到15微升/分钟。流动培养基可以确保生物学材料158具有足够的氧、营养物质等的供应。以此方式，微流控系统100以灌注模式操作。图13和图14中展示的系统特别很好地适于监测呼吸速率和酸化速率。
如所示出的，微流控系统100进一步包括根据本公开文本的探针132，所述探针被设计成监测与生物学材料158相关联的生物学成分或参数。探针132可以被制成类似于如图8、图11或图12中展示的探针32。探针132与光导管或光纤134相连通，以用于将探针130连接到根据本公开文本的光源和/或飞行时间传感器。
在一个实施方案中，探针132中的一个用于监测和测量pH，而另一个探针132用于监测和测量氧浓度。在此方面，可以将生物学材料158放置成与合适的荧光团相连通，以测量荧光强度或荧光寿命。
参考图14，示出了被分组在一起并安装在框架(诸如芯片)110上的多个微流控系统100。如所展示的，每个微流控系统100均包括用于循环培养基或流体的入口102和出口104。根据本公开文本，所述多个微流控系统100可以与单个或多个光源和/或飞行时间传感器相连通，以用于根据本公开文本监测细胞参数。
图9描绘了根据本公开文本的示例实施方案的示例过程200的流程图。可以使用本文描述的任何系统来至少部分地实现过程200。出于说明和讨论的目的，图9描绘了以特定顺序执行的过程200的步骤。使用本文提供的公开文本，本领域的普通技术人员将理解，在不偏离本公开文本的范围的情况下，本文提供的任何过程的各种步骤可以被适配、重新布置、省略，包括未示出的、扩展的和/或以各种方式修改的步骤。
在202处，所述过程包括以以下方式将生物学材料暴露于激发光：使成分单独或与荧光团结合以产生荧光发射或磷光发射。例如，所述过程可以包括将生物学材料暴露于根据调制速率调制的激发光。所述调制速率可以是例如从约0.5MHz至约1,000MHz，诸如从约25MHz至约200MHz。
在204处，所述过程包括确定荧光发射或磷光发射的荧光寿命或荧光强度。例如，在一些实施方案中，用于每个像素的信号可以在每个周期期间在两个模拟积分器之间切换。这种积分方案可以继续进行，直到关闭全局快门并经由模数转换器读出帧为止。可以与激发光源的调制同相地执行该过程，以确定同相响应。可以重复该过程(但是相移90°)以获得正交响应。
荧光寿命可以至少部分地基于响应相位的同相分量和正交分量来确定。在一些实施方案中，荧光寿命可以至少部分地基于下式(例如，通过一个或多个处理器)来确定：
在206处，所述过程包括根据荧光寿命或荧光强度确定成分的量值特性。例如，一个或多个处理器可以访问将荧光寿命或荧光强度与成分的量值特性进行相关的模型(例如，经机器学习的模型)、查找表、算法、相关性等。
参考以下实施例，可以更好地理解本公开文本。
实施例
使用飞行时间传感器模块进行测量，以量化具有几纳秒量值的荧光寿命。光探测和测距系统利用安装在Melexis EVK75027评估模块中的Sony IMX556飞行时间成像芯片。该成像传感器在十微米间距上具有300,000个像素。与提供高复用水平的目标一致，利用从250个可用像素获得的信号来执行测量。因此，所产生的测量性能可以被认为是可以利用超过一百根光纤将荧光发射信号或磷光发射信号同时递送到单个成像芯片而获得的性能的投射。
所使用的荧光团是在聚酯薄膜上发现的PVC基质中的八乙基卟啉酮(OEPK)的制备物。当暴露于pH值为从4至8.5的缓冲溶液中时，该系统提供从大约3纳秒至几乎6纳秒变化的寿命响应。激发由Thorlabs L405P150激光二极管(以405nm发射)提供。激光器工作的偏置电流远低于其设计极限，从而导致发射的光学功率为大约50毫瓦。在到达传感器光斑之前，使用中性密度滤波器将束衰变50倍，从而导致递送的光学功率小于1毫瓦。用以647nm为中心、半峰全宽为10nm的带通滤波器对发射进行滤波。照明路径包括起始波长为490nm的45度长通二向色镜。
图16显示了带有误差线的测量结果，所述误差线是超过十次重复测量获得的标准偏差的十倍。在所有情况下，标准偏差值为0.01纳秒或更小。在中心区域，响应曲线的斜率为每单位pH 1.7纳秒，因此该区域中对pH的隐含灵敏度为6milli-pH。单个测量的总积分时间不超过20毫秒。
图16中示出的曲线图包括通过使用常规光电倍增管(PMT)和对时域衰变曲线的最小二乘拟合获得的两个数据点。PMT仅能够进行单个测量，而不是并行进行100个测量。
对于某些应用，注意到这种表观寿命的改变提供了有关变化的pH的信息，所述变化的pH证明了LiDAR在荧光寿命测量中的使用。通过将光探测和测距信号视为通过光学信号的正弦解调获得的信号，可以获得额外的准确性。在这种情况下，可以通过使用三角函数来估计相位。通常，解调过程非常接近方波，因此三角函数分析可能导致不稳定的值，所述不稳定的值取决于系统中的总(任意)相位延迟。正弦解调不受调制自身的谐波含量的影响，但是使用方波解调时，系统可能会受到调制的非理想性的影响。
作为对上面的改进，进行了两次单独的测量，其中一次测量的激励相位相对于另一次测量的激励相位偏移了诸如45度。然后，如果将最终相移评估为两次测量的平均值，则可以消除由于非正弦解调而导致的最严重的劣化。这是两步过程，提供了更高的准确性，并被用于获得图16中示出的曲线图中的数据。三步程序可导致更接近于所期望的正弦解调系统。这两个版本都不会显著影响积分时间要求，因为组合的信噪比将比单个贡献有所改善。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本公开文本的这些和其他修改和变化可以由本领域的普通技术人员实施，本发明的精神和范围更具体地在所附权利要求中阐述。此外，应当理解的是，各种实施方案的方面可以全部或部分地互换。此外，本领域的普通技术人员将理解，前述描述仅作为示例，并不旨在限制在所附权利要求中进一步描述的本发明。
Claims (67)
1.一种用于分析生物学材料的系统，所述系统包括：
光源，其被配置为将激发光发射到生物学材料样品上，所述激发光具有使所述生物学材料附近或内部的荧光团经历荧光发射或磷光发射的波长；
光学通信路径，其被安置成获得指示与所述荧光团相关联的所述荧光发射或磷光发射的光学信号；
包括多个像素的飞行时间传感器，所述飞行时间传感器被配置为从所述光学通信路径接收指示所述荧光发射或磷光发射的所述信号，所述多个像素中的每个像素被配置为至少部分地基于所述光学信号来提供与所述像素的光子响应相关联的信号；以及
与所述飞行时间传感器相连通的一个或多个处理器，所述一个或多个处理器被配置为至少部分地基于每个像素的所述光子响应来确定所述荧光团的荧光寿命或荧光强度。
2.根据权利要求1所述的系统，其进一步包括用于保持生物学材料的样品的样品暂存位点。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述光源和所述飞行时间传感器是光探测和测距(LiDAR)子系统的一部分。
4.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统包括多个样品，每个样品与光学通信路径相关联，其中所述飞行时间传感器的像素被分成多个区，与每个样品相关联的每个光学通信路径与所述多个区中的至少一个相连通，并且其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为从每个样品接收荧光发射或磷光发射，并且确定来自每个样品的荧光团的荧光寿命或荧光强度。
5.根据权利要求4所述的系统，其进一步包括用于保持所述多个样品的多个暂存位点。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述系统包括至少25个样品暂存位点，诸如至少50个样品暂存位点，诸如至少75个样品暂存位点，诸如至少96个暂存位点，诸如至少384个暂存位点，诸如至少1536个暂存位点。
7.根据权利要求5所述的系统，其中所述系统包括少于25个样品暂存位点。
8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其进一步包括用于放置与所述生物学材料相关联的至少一种荧光团的荧光团源。
9.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述光源包括激光器、激光二极管或发光二极管(LED)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述光源被配置为以调制速率发射所述激发光。
11.根据权利要求10所述的系统，其中至少部分地基于与所述荧光团相关联的所述荧光发射或磷光发射的荧光寿命来选择所述调制速率。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述调制速率的范围是约0.01MHz至约1000MHz。
13.根据权利要求12所述的系统，其中衰变时间在约0.1纳秒至约20纳秒的范围内。
14.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中指示所述光子响应的所述信号包括指示针对所述像素的响应相位的信号。
15.根据权利要求14所述的系统，其中至少部分地基于执行操作来确定针对像素的所述响应相位，所述操作包括：
确定来自第一模拟积分器的针对所述像素的第一响应；
使用第二模拟积分器确定针对所述像素的第二响应；
至少部分地基于所述第一响应和所述第二响应来确定所述响应相位。
16.根据权利要求15所述的系统，其中一个或多个处理器被配置为至少部分地基于所述响应相位来确定所述荧光寿命。
17.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述光源被配置为发射非相干光束。
18.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括限定多个样品暂存位点的托盘，所述系统进一步包括相对于所述托盘移动的柱塞阵列，所述柱塞间隔开以便与所述托盘上的样品暂存位点对准，所述柱塞被配置为朝向所述样品暂存位点移动以用于接触位于所述样品暂存位点中的所述生物学材料，所述柱塞与所述光学通信路径相连通，以用于将所述激发光递送到所述生物学材料并且用于将由所述荧光团产生的所述荧光发射或磷光发射递送到所述飞行时间传感器。
19.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述光源和所述飞行时间传感器以一定的频率操作，其准许在小于约1秒、诸如小于约0.5秒内多次确定所述荧光团的荧光寿命或荧光强度。
20.根据权利要求8所述的系统，其中所述荧光团源被配置为放置与所述生物学材料相关联的多个荧光团，并且其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为确定所述多个荧光团的荧光寿命或荧光强度。
21.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学通信路径不包含任何光纤。
22.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学通信路径包括成像光学器件。
23.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学通信路径包括聚光光学器件。
24.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为在不用在测试所述生物学材料的连续样品之间校准所述光源的情况下确定所述荧光寿命。
25.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述荧光团的荧光发射或磷光发射指示与细胞代谢有关的参数，诸如溶解气体、离子、蛋白质、代谢物、核酸、酶、pH、氧化态、粘度、温度、NAD(P)H、盐或矿物质。
26.根据权利要求25所述的系统，其中所述参数包括pH，并且其中所述荧光团展现出小于5纳秒的荧光寿命。
27.根据权利要求25所述的系统，其中所述系统进一步被配置为确定所述参数的浓度或所述参数的变化速率。
28.根据权利要求2所述的系统，其中所述样品暂存位点是微流控装置的一部分。
29.一种用于分析生物学材料的系统，所述系统包括：
光探测和测距(LiDAR)子系统，所述光探测和测距(LiDAR)子系统包括：
(a)光源，其被配置为将激发光发射到生物学材料上，所述激发光具有使与所述生物学材料相关联的荧光团经历荧光发射或磷光发射的波长；
(b)光学通信路径，其被安置成感测由所述荧光团产生的所述荧光发射或磷光发射；以及
(c)包括多个像素的飞行时间传感器，所述飞行时间传感器被配置为从所述光学通信路径接收所述荧光发射或磷光发射；以及
一个或多个处理器，其与所述飞行时间传感器相连通，以用于基于所述荧光团的荧光发射或磷光发射来确定所述荧光团的荧光寿命或荧光强度。
30.根据权利要求29所述的系统，其中所述一个或多个处理器进一步被配置为基于所述荧光寿命或所述荧光强度来确定生物学参数的量值特性。
31.根据权利要求29或30所述的系统，其中所述系统包括多个样品暂存位点，每个样品暂存位点均与光学通信路径相关联，并且其中所述飞行时间传感器的像素被划分为区，与每个样品暂存位点相关联的每个光学通信路径与对应的区相连通，并且其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为同时从每个样品暂存位点接收荧光发射或磷光发射，并确定来自每个样品暂存位点的所述荧光团的荧光寿命或荧光强度。
32.根据权利要求31所述的系统，其中所述系统包括至少25个样品暂存位点，诸如至少50个样品暂存位点，诸如至少75个样品暂存位点，诸如至少96个暂存位点，诸如至少384个暂存位点，诸如至少1536个暂存位点。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的系统，其中所述一个或多个处理器被配置为确定所述荧光团的荧光寿命，并且其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为在不用在测试所述生物学材料的连续样品之间校准所述光源的情况下确定荧光团的荧光寿命。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的系统，其进一步包括用于放置与所述生物学材料相关联的至少一种荧光团的荧光团源。
35.根据权利要求34所述的系统，其中所述光源被配置为以调制速率发射所述激发光。
36.根据权利要求35所述的系统，其中所述调制速率至少部分地基于与所述荧光团相关联的所述荧光发射或磷光发射的衰变时间来确定。
37.根据权利要求36所述的系统，其中所述调制速率的范围是约0.01MHz至约1000MHz。
38.根据权利要求37所述的系统，其中衰变时间在约0.1纳秒至约20纳秒的范围内。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的系统，其中指示所述光子响应的所述信号包括指示针对所述像素的响应相位的信号。
40.根据权利要求39所述的系统，其中至少部分地基于执行操作来确定针对像素的所述响应相位，所述操作包括：
确定来自第一模拟积分器的针对所述像素的第一响应；
使用第二模拟积分器确定针对所述像素的第二响应；
至少部分地基于所述第一响应和所述第二响应来确定所述响应相位。
41.根据权利要求40所述的系统，其中一个或多个处理器被配置为至少部分地基于所述响应相位来确定所述荧光寿命。
42.根据权利要求29或30所述的系统，其中所述飞行时间传感器中的每个像素均被配置为从与所述光源同相的所述光学通信路径接收荧光发射或磷光发射。
43.根据权利要求29至42中任一项所述的系统，其中所述系统进一步包括限定多个样品暂存位点的托盘，所述系统进一步包括相对于所述托盘移动的柱塞阵列，所述柱塞间隔开以便与所述托盘上的样品暂存位点对准，所述柱塞被配置为朝向所述样品暂存位点移动以用于接触位于所述样品暂存位点中的所述生物学材料，所述柱塞与所述光学通信路径相连通，以用于将所述激发光递送到所述生物学材料并且用于将由与所述生物学材料相关联的荧光团产生的所述荧光发射或磷光发射递送到所述飞行时间传感器。
44.根据权利要求29至43中任一项所述的系统，其中所述光源和所述飞行时间传感器以一定的频率操作，其准许在小于约1秒、诸如小于约0.5秒、诸如小于约10毫秒内多次确定来自所述生物学材料的样品的所述荧光团的荧光寿命或荧光强度。
45.根据权利要求34所述的系统，其中所述荧光团源被配置为放置与所述生物学材料相关联的多个荧光团，其中所述飞行时间传感器和所述一个或多个处理器被配置为确定所述多个荧光团的荧光寿命或荧光强度，并且其中所述系统被配置为同时地或同相地确定所述多个荧光团的荧光寿命或荧光强度。
46.根据权利要求29至45中任一项所述的系统，其中所述荧光团的荧光发射或磷光发射指示与细胞代谢有关的参数，诸如溶解气体、离子、蛋白质、代谢物、核酸、酶、pH、氧化态、粘度、温度、NAD(P)H、盐或矿物质。
47.根据权利要求46所述的系统，其中所述参数包括氧分压、pH、氧化态、粘度或温度。
48.一种用于分析生物学材料的方法，所述方法包括：
将所述生物学材料暴露于激发光中，其方式为使得与所述生物学材料相关联的荧光团产生荧光发射或磷光发射；
将所述荧光发射或磷光发射传送到飞行时间传感器；
确定所述荧光团的荧光寿命或荧光强度；以及
确定与所述确定的荧光寿命或荧光强度有关的生物学参数的量值特性。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述生物学材料包含活细胞，所述活细胞包括细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞、真核细胞、动物细胞、人细胞、免疫细胞、或永生细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述参数包括溶解气体、离子、蛋白质、代谢物、核酸、脂质、底物、盐、或矿物质。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述溶解气体选自氧、二氧化碳、一氧化氮、或氨。
52.根据权利要求48或49中任一项所述的方法，其中所述生物学材料包含细胞，并且所述参数包括由所述细胞分泌到周围培养基中的材料的浓度。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述荧光团的荧光寿命或荧光强度在小于约1秒、诸如小于约0.5秒、诸如小于约10微秒内被多次确定。
54.根据权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述参数的量值特性包括浓度或所述浓度的改变速率。
55.根据权利要求48至54中任一项所述的方法，其进一步包括同时确定与所述生物学材料相关联的多个荧光团的荧光寿命或荧光强度的步骤。
56.根据权利要求48至55中任一项所述的方法，其中确定所述荧光团的荧光寿命。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述荧光团的荧光寿命小于约20纳秒，诸如小于约15纳秒，诸如小于约10纳秒，诸如小于约5纳秒。
58.根据权利要求48至57中任一项所述的方法，其中将多个荧光团与所述生物学材料的对应的多个样品可操作地关联放置，所述生物学材料的每个样品单独地暴露于激发光中，其方式为使得生物学材料的每个样品中的荧光团都经历所述荧光发射或磷光发射，并且其中所述多个荧光发射或磷光发射被感测并传送到所述飞行时间传感器，以用于同时确定来自每个样品的荧光团的荧光寿命或荧光强度。
59.一种用于分析生物学材料的方法，所述方法包括：
将所述生物学材料暴露于激发光中，其方式为使得荧光团产生荧光发射或磷光发射；以及
感测所述荧光发射或磷光发射并确定所述荧光团的荧光寿命，所述荧光团与细胞代谢参数或细胞环境参数有关，并且具有小于约20纳秒的荧光寿命。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物学材料包含活细胞，所述活细胞包括细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、原核细胞、真核细胞、动物细胞、人细胞、免疫细胞、或永生细胞。
61.根据权利要求59或60所述的方法，其中所述参数包括溶解气体、离子、蛋白质、代谢物、核酸、脂质、温度、氧化态、底物、盐、或矿物质。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述溶解气体选自氧、二氧化碳、一氧化氮、或氨。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述生物学材料包含细胞，并且所述参数包括由所述细胞分泌到周围培养基中的材料。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述荧光团的荧光寿命在小于约1秒、诸如小于约0.5秒、诸如小于约10微秒内被多次确定。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其进一步包括同时确定与所述生物学材料相关联的多个荧光团的荧光寿命的步骤。
66.根据权利要求59至65中任一项所述的方法，其中将多个荧光团与生物学材料的对应的多个样品可操作地关联放置，所述生物学材料的每个样品单独地暴露于激发光中，其方式为使得生物学材料的每个样品中的荧光团都经历荧光发射或磷光发射，并且其中所述多个荧光发射或磷光发射被感测用于同时确定来自每个样品的荧光团的荧光寿命。
67.根据权利要求59所述的方法，其中所述生物学材料在暴露于所述激发光期间被包含在微流控装置中，并且正在经历灌注。
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