ES2273384T3 - Uso de particulas polimericas sinteticas como pratones y calibradores en citometria de flujo. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA CALIBRAR O NORMALIZAR INSTRUMENTOS DE CITOMETRIA DEL FLUJO, USANDO PARTICULAS O PERLAS DE POLIMERO SINTETICO QUE TIENEN PROPIEDADES FISICAS QUE PROPORCIONAN VENTAJAS PARA SU USO EN TALES INSTRUMENTOS. LAS PARTICULAS O PERLAS DE POLIMERO EMPLEADAS EN LOS PROCEDIMIENTOS DE CALIBRACION SON ESFERICAS, TIENEN UN DIAMETRO MEDIO DE PARTICULAS DE 1 A 8 MICRAS APROXIMADAMENTE, UNA DISTRIBUCION RELATIVAMENTE ESTRECHA DE PARTICULAS Y UN BAJO INDICE DE REFRACCION, ES DECIR, DE 1,35 A 1,45 APROXIMADAMENTE. LAS PARTICULAS SON SEGURAS, ESTABLES DURANTE PERIODOS PROLONGADOS DE TIEMPO Y SON PARTICULARMENTE ADECUADAS PARA SU EMPLEO COMO SUSTANCIAS DE CALIBRACION DE ANALIZADORES EN HEMATOLOGIA. LA INVENCION PROPORCIONA UN PERFECCIONAMIENTO VENTAJOSO RESPECTO A LOS TIPOS DE PATRONES USADOS ACTUALMENTE PARA CALIBRAR UNA SERIE DE INSTRUMENTOS QUE SE APOYAN EN LA DIFUSION LUMINOSA, COMBINADA CON OTROS PARAMETROS QUE IDENTIFICAN Y MIDEN PARTICULAS BIOLOGICAS O CELULAS, ASI COMO PARTICULAS NO BIOLOGICAS. EN PARTICULAR, USANDOSE EL PROCEDIMIENTO DE CALIBRACION/NORMALIZACION Y LAS PARTICULAS POLIMERICAS SEGUN LA PRESENTE INVENCION, SE PERMITE LA CALIBRACION Y NORMALIZACION DE LOS INSTRUMENTOS DE HEMATOLOGIA PARA LA SUBSIGUIENTE DETERMINACION, EXACTA Y FIABLE, DEL NUMERO DE GLOBULOS ROJOS, RETICULOCITOS, GLOBULOS BLANCOS Y PLAQUETAS EN MUESTRAS DE SANGRE COMPLETA.

Description

Uso de partículas poliméricas sintéticas como patrones y calibradores en citometría de flujo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos utilizados en instrumentos de citometría de flujo para el análisis de células o partículas biológicas. Más particularmente, la invención se refiere al uso de materiales poliméricos sintéticos para normalizar o calibrar los instrumentos de citometría de flujo antes de utilizar los instrumentos para analizar tales partículas, por ejemplo, los componentes celulares de la sangre completa.

Antecedentes de la invención

El análisis de las partículas, particularmente de las partículas biológicas, y de las células, se realiza rutinariamente utilizando una variedad de instrumentos comercialmente disponibles que determinan las características de tales partículas basándose en una o varias señales relacionadas con la luz que pasa a través del instrumento. Los citómetros de flujo permiten la determinación de las características de las partículas utilizando técnicas en las que las partículas se están moviendo en una corriente de líquido o se llevan en una suspensión. Normalmente, en los instrumentos de citometría de flujo, las células u otras partículas biológicas fluyen en una corriente de líquido, de manera que cada partícula, prácticamente una célula cada vez, pasa a través de una región de detección que puede medir las características físicas o químicas de las partículas.

Puede detectarse una variedad de señales asociadas con las diferentes características de las partículas en análisis. Tales señales incluyen las señales eléctricas, acústicas, ópticas y radiactivas. Los citómetros de flujo generalmente se basan en señales ópticas para el análisis de las partículas que pasan a través del instrumento. Independientemente de que un instrumento analice o no las partículas en un estado estático o dinámico, los expertos en la técnica apreciarán que se requieren la calibración y la normalización antes de realizar los análisis a las partículas. En circunstancias normales, se produce la calibración como una o varias pre-etapas preliminares en la preparación de los instrumentos para su uso apropiado y en la medición y para garantizar resultados de ensayo exactos y fidedignos. Esto es especialmente importante, ya que las células, u otras partículas biológicas, son extremadamente pequeñas y las señales que van a detectarse, en relación con el tamaño de las células o partículas, a menudo son de baja magnitud.

Los citómetros de flujo y otra partícula biológica y los instrumentos para el análisis de las células se calibran comúnmente con partículas que simulan o se aproximan a los tipos de partículas o células que se pretende someter a análisis. Por tanto, las partículas de calibración deben seleccionarse o diseñarse de manera que tengan características y parámetros que sean bastante similares a los de las partículas o células que van a probarse en los instrumentos. Características y parámetros ejemplo incluyen similitudes en tamaño, volumen, características de superficie, propiedades de granularidad y, si es necesario, rasgos de color, tales como manchas, tintes, marcadores inmunofluorescentes, y similares. En consecuencia, debe entenderse que no es necesario que las partículas que van a analizarse tras la calibración o normalización de un analizador sean células biológicas limitadas. Por ejemplo, pueden encontrarse partículas que van a someterse a ensayo en suspensiones de aceite en agua, leche, u otro medio no biológico.

Los analizadores de hematología representan un tipo específico de instrumento diseñado y empleado para la determinación y medición de las características de células y partículas biológicas en sangre completa. Como ejemplo particular, aunque no limitativo, los sistemas de hematología comercialmente disponibles de Bayer Corporation analizan ópticamente, determinan las características de y miden los eritrocitos (glóbulos rojos), los reticulocitos (glóbulos rojos inmaduros), los leucocitos (glóbulos blancos) y las plaquetas en muestras de sangre completa.

Los procedimientos de calibración pasados y presentes para los instrumentos de citometría de flujo, incluyendo los analizadores de hematología, suponen el uso de glóbulos rojos fijados y/o esféricos, por ejemplo, glóbulos rojos humanos y de pollo, para las etapas de calibración y para la normalización de las señales ópticas tales como la dispersión de la luz. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.489.162 concedida a Hawkins et al. y la patente de los EE.UU. número 4.777.139 concedida a S.-C. Wong et al. Aunque el uso de glóbulos rojos obtenidos de mamíferos y seres humanos puede ser fidedigno en algunos aspectos de los procedimientos de calibración, hay inconvenientes al uso de estos tipos de células calibradoras "naturales". Por ejemplo, la preparación de glóbulos rojos fijados y esféricos implica el proceso de la extracción de sangre y otras manipulaciones de la sangre, lo que supone el contacto con material de posible riesgo biológico. Además, dado que la estabilidad de los glóbulos rojos como patrones ópticos es limitada, es decir, es de aproximadamente seis meses, los patrones celulares deben reproducirse periódicamente, normalmente, dos o más veces al año.

Además de las muestras biológicas para fines de calibración y normalización, también se han utilizado microesferas o microperlas para calibrar los instrumentos para el análisis celular. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.331.862 concedida a W.L. Ryan describe perlas compuestas de material de látex para calibrar un instrumento de recuento de partículas. En la patente de los EE.UU. número 4.704.891 concedida a D. J. Recktenwald et al se describen microperlas de plástico para calibrar citómetros de flujo e instrumentos para el análisis de las células. Las perlas de calibración para calibrar instrumentos de citometría de flujo están comercialmente disponibles de la Flow Cytometry Standards Corporation, Research Triangle Park, NC. En general, tales perlas de microesferas no se producen con una consideración a los valores de índice de refracción apropiados para las células y las partículas biológicas reales.

En la patente de los EE.UU. número 5.093.445 concedida a W. Podszun et al. se describen polímeros de perla no biológicos que tienen un diámetro de partícula promedio de desde 0,5 hasta 10 Tm y que contienen del 1% al 60% de flúor unido químicamente para su uso como agentes deslustradores y espaciadores en materiales de registro fotográfico. Esta patente no se refiere a calibradores de partícula para citometría de flujo y no reconoce el índice de refracción como un parámetro crítico para tal uso. De hecho, los presentes inventores han determinado que las perlas poliméricas dadas como ejemplo en esta patente tienen índices de refracción que son significativamente superiores a 1,45, lo que se considera estar en o cerca del límite superior del índice de refracción, particularmente ya que se refiere a células sanguíneas, tal como se describe adicionalmente más adelante en el presente documento.

Otros tipos de instrumentos de citometría de flujo, tales como citómetros de flujo por fluorescencia, utilizan perlas poliméricas hechas de materiales tales como poliestireno para normalizar las señales ópticas. Las señales normalmente incluyen la dispersión frontal (0-2 grados), la dispersión lateral (90 grados) y la intensidad de la fluorescencia. Los materiales de perlas poliméricas, aunque son seguros y estables durante aproximadamente cinco años o más, son particularmente poco satisfactorios para los instrumentos de citometría de flujo por dispersión de la luz. Más particularmente, para partículas de un volumen dado, las perlas poliméricas disponibles en la actualidad producen señales de dispersión que son diferentes de las de los glóbulos rojos del mismo volumen, aun cuando los glóbulos rojos son esféricos. Esto se debe a que el índice de refracción (i.r.) de un material polimérico tal como poliestireno es bastante diferente del de los glóbulos rojos. Mientras que el i.r. del poliestireno es alto, es decir, de aproximadamente 1.59, el i.r. de un glóbulo rojo es de aproximadamente 1,40-1,42. Es bien conocido, a partir de la teoría de la dispersión de Mie que las propiedades de dispersión de la luz de las esferas pequeñas están significativamente influidas por sus valores de i.r. Por tanto, los patrones de dispersión de las perlas poliméricas utilizadas en la actualidad en los instrumentos de citometría de flujo no son realmente representativos de los patrones de dispersión de los glóbulos rojos reales. En consecuencia, las señales de dispersión frontal y lateral no proporcionan información importante, tal como el tamaño de la célula y el índice de refracción, que están relacionados con la densidad celular y el estado de
activación.

Además, las señales de dispersión de la luz de las plaquetas se normalizan en la actualidad utilizando glóbulos rojos fijados o esféricos en el caso de algunos tipos de analizadores, por ejemplo, analizadores de hematología comerciales, o utilizando perlas poliméricas dimensionadas apropiadamente en el caso de los citómetros de flujo por fluorescencia. Sin embargo, las señales de dispersión de las plaquetas normalmente son mucho menores que las del glóbulo rojo (es decir, en más de un factor de 10). También, el índice de refracción de las plaquetas sólo es de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 1,40.

Además, las señales de dispersión de la luz de los glóbulos blancos se normalizan actualmente utilizando perlas poliméricas o glóbulos rojos fijados o esféricos. Las señales de dispersión de los glóbulos blancos normalmente son mayores que las de los glóbulos rojos y sus índices de refracción son inferiores, normalmente de aproximadamente 1,37 a aproximadamente 1.40.

Como un ejemplo particular adicional, algunos analizadores de hematología comerciales enumeran reticulocitos (glóbulos rojos inmaduros) basándose en una combinación de sus propiedades de dispersión de la luz y su capacidad para unirse a colorantes catiónicos, tales como Oxazina 750, y por tanto, absorben luz a la longitud de onda de absorción de los colorantes. Actualmente, el canal de absorción se normaliza utilizando glóbulos rojos fijados y esféricos que no contienen colorante. La normalización se basa en la luz dispersada fuera del ángulo de conicidad de recogida del detector de absorción para proporcionar una señal de "pseudo-absorción" que imita a la absorción de luz verdadera. Sin embargo, este método no es óptimo, ya que la señal de pseudo-absorción es significativamente inferior que la señal de absorción verdadera producida por muchos reticulocitos. Por tanto, el patrón óptico utilizado no representa mejor las señales verdaderas encontradas en la práctica. Las perlas poliméricas apropiadamente coloreadas hechas de materiales tales como poliestireno tampoco son útiles para este fin, ya que sus altos valores de i.r. dan como resultado señales de dispersión que están fuera de los intervalos del detector de señales de dispersión. Por tanto, para normalizar las mediciones de absorción y dispersión de la luz de los reticulocitos, es deseable producir un material que tiene las propiedades de dispersión de la luz (y absorción) de los reticulocitos y que también es seguro y estable. En el caso de la citometría de flujo por fluorescencia en la que se utiliza la combinación de las propiedades de dispersión y fluorescencia para analizar las células sanguíneas, es deseable producir un material que tenga las propiedades de dispersión de la luz y fluorescencia de las células particulares que se están analizando, y que tenga la seguridad y la estabilidad de los materiales poliméricos no biológicos.

Por tanto, existe una necesidad y un deseo actuales de materiales y procedimientos de normalización y calibración que proporcionen resultados exactos y reproducibles en la determinación de las características tanto de células como de partículas biológicas y no biológicas, en una variedad de instrumentos de análisis, incluyendo los analizadores de hematología. También existe una necesidad actual para la producción de partículas de calibración seguras y estables para normalizar los instrumentos de citometría de flujo. Tales partículas necesitan tener óptimamente un largo término de caducidad y tener propiedades, tales como el tamaño de partícula y el índice de refracción, que sean prácticamente idénticas a las de las partículas naturales y las células a las que representan durante el proceso de calibración/normalización.

Además, para los análisis de hematología, existe la necesidad del desarrollo de métodos para normalizar citómetros de flujo, en los que la normalización de las partículas poliméricas empleadas representa con exactitud todos los parámetros necesarios de las células sanguíneas componentes respectivas que van a analizarse tras la calibración/normalización del instrumento. La presente invención se refiere al cumplimiento ventajoso de estas necesidades y objetivos actuales en la técnica.

Sumario de la invención

En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar usos novedosos de partículas poliméricas sintéticas en métodos para calibrar o normalizar un citómetro de flujo, particularmente un analizador de hematología, antes del análisis de partículas no biológicas, o partículas biológicas o células, en los que las partículas de calibración/normalización tienen prácticamente todas las propiedades ópticas y físicas de las partículas o células sanguíneas reales, por ejemplo, glóbulos rojos, reticulocitos, plaquetas y/o glóbulos blancos auténticos, que van a analizarse, y la estabilidad y seguridad de los materiales poliméricos no biológicos.

Las partículas de calibración que van a utilizarse en la presente invención se diseñan para que tengan una distribución de diámetro de partícula promedio estrecha, un diámetro de partícula bien definido y un valor de índice de refracción bien definido que son prácticamente idénticos a los de las partículas auténticas en diversos medios, o tipos celulares en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre, que va a analizarse.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos para calibrar o normalizar un instrumento de citometría de flujo antes del análisis de células o partículas biológicas, particularmente con respecto al análisis de las células componentes en una muestra de sangre completa.

La invención proporciona la capacidad para los expertos en la técnica de calibrar un instrumento de análisis de partículas mediante el empleo y basándose en patrones de calibración (y/o umbrales) que se han determinado previamente y que se manipulan fácilmente y que están disponibles para el usuario. La utilización de los patrones y los métodos de la presente invención durante los procedimientos de normalización y calibración de los instrumentos de citometría de flujo permite la normalización y calibración apropiada de un instrumento, la alineación apropiada de los componentes ópticos del instrumento, y la optimización del rendimiento del instrumento para el análisis posterior de partículas y células, incluyendo la determinación del tamaño de la célula y del índice de refracción a partir de las mediciones de la dispersión frontal y lateral.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de calibración/normalización para su uso en varios análisis de partículas y sistemas de detección diferentes que se basan en una combinación de dispersión de la luz como un parámetro medido y la medición de otro parámetro conocido, tal como dispersión de la luz (es decir, detección por dispersión-dispersión), impedancia eléctrica (es decir, detección por dispersión-impedancia), radiofrecuencia (es decir, detección dispersión-RF) y similares. Debe entenderse adicionalmente que la presente invención y las ventajas y características que comporta la misma también pueden utilizarse en otros instrumentos de análisis de citometría de flujo tales como separadores de células activados por fluorescencia, y pueden extenderse a instrumentos tales como analizadores de imagen, microscopios automatizados, microscopios cuantitativos, microscopios por fluorescencia y similares. Los materiales y las técnicas de la presente invención proporcionan garantía de calidad para una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones de diagnóstico médico y clínico para identificar y determinar tanto estados normales como anómalos.

Otros objetos y ventajas permitidos por la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A y 1B muestran la determinación del recuento de partículas y el volumen relativo de las partículas poliméricas sintéticas de normalización/calibración, basándose en un contador de impedancia de apertura (ejemplo 3). La figura 1A presenta la distribución de frecuencia numérica para las partículas preparadas tal como se describe en el ejemplo 1. En la figura 1A, el eje X representa el diámetro de la partícula en micras y el eje Y representa el recuento relativo de partículas. La figura 1B presenta la distribución de frecuencia de volumen para las mismas partículas que las de la figura 1A. In La figura 1B, el eje X representa el diámetro de la partícula en micras y el eje Y representa el volumen relativo ocupado por las partículas.

La figura 2 muestra un citograma de dispersión/dispersión para las mismas partículas que las descritas en las figuras 1A y 1B. El eje X representa la intensidad de dispersión de las partículas a 5°-15° y el eje Y representa la intensidad de dispersión de las partículas a 2°-3°. Los valores del eje X y del Y oscilan desde 0 hasta 50. Además del citograma, se presentan la media y la desviación estándar (DE), denominadas Sigmax y Sigmay, de la distribución de las partículas en el recuadro de RBC. Se muestra el recuento de partículas, denominado RBC (10^{6}/\mul); el volumen de partícula medio, denominado MCV (fl); el índice de refracción medio, transformado matemáticamente en una concentración de hemoglobina celular media equivalente, CHCM (g/dl), tal como se describe en el presente documento; y las anchuras de distribución del volumen y de la concentración de hemoglobina, denominadas RDW (%) y HDW (DE), respectivamente (véase el ejemplo 3).

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona usos novedosos de partículas poliméricas sintéticas (también denominadas perlas o perlas de partículas en el presente documento) en un método de calibrar o normalizar instrumentos de citometría de flujo para el análisis de células o partículas biológicas. Las partículas poliméricas utilizadas se diseñan para que tengan propiedades y parámetros que les permitan normalizar y calibrar con exactitud instrumentos útiles para el análisis celular y de partículas biológicas antes de llevar a cabo ensayos sobre las propias células o partículas biológicas reales.

La presente invención se refiere particularmente al uso de partículas sintéticas en la calibración o normalización de analizadores de hematología para el análisis de los componentes celulares de muestras de sangre completa.

Más particularmente, las partículas poliméricas son sustancialmente perlas esféricas y comprenden haluro de flúor. Las partículas tienen un diámetro de partícula promedio bien definido (diámetro del tamaño de partícula), es decir, masa promedio, de aproximadamente 1 \mum a aproximadamente 10 \mum, preferiblemente, de aproximadamente 1 \mum a aproximadamente 8 \mum, más preferiblemente, de aproximadamente 4 \mum a aproximadamente 6 \mum. Los diámetros de partícula promedio preferibles para las partículas poliméricas sintéticas utilizadas en la presente invención como materiales de normalización/calibración para tipos de células sanguíneas particulares son los siguientes: aproximadamente 5,5 \mum para los glóbulos rojos; aproximadamente 2,5 \mum para las plaquetas; aproximadamente 8,0 \mum para los neutrófilos; aproximadamente 7,2 \mum para los linfocitos; aproximadamente 9,0 \mum para los monocitos; aproximadamente 8,5 \mum para los eosinófilos y aproximadamente 7,4 \mum para los basófilos, con una distribución de tamaño de partícula de aproximadamente +/-0.25 \mum, más preferiblemente, de aproximadamente +/- 0,1 \mum para cada uno de estos tipos celulares. En general, la anchura de distribución del tamaño de partícula de las partículas sintéticas de normalización/calibración es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 5%. La anchura de distribución del tamaño de partícula se define en el presente documento como una desviación estándar de la distribución de los diámetros de partícula dividida entre el diámetro medio.

Además, las partículas poliméricas esféricas utilizadas en la presente invención tienen un índice de refracción generalmente de desde aproximadamente 1,35 hasta aproximadamente 1,45, preferiblemente de aproximadamente 1,35 a aproximadamente 1,42. Los índices de refracción preferibles para las partículas poliméricas sintéticas utilizadas en la presente invención como materiales de normalización/calibración para los tipos de células sanguíneas particulares son los siguientes: aproximadamente 1,410 para los glóbulos rojos; aproximadamente 1,380 para las plaquetas; aproximadamente 1,395 para los neutrófilos; aproximadamente 1,385 para los linfocitos; aproximadamente 1,375 para los monocitos; aproximadamente 1,395 para los eosinófilos y aproximadamente 1,385 para los basófilos, con un intervalo de aproximadamente +/- 0,01, más preferiblemente, de aproximadamente +/- 0,005 para cada uno de estos tipos celulares. Las partículas que comprenden flúor proporcionan valores de índice de refracción bajos óptimos para su uso como materiales de normalización/calibración. Como un ejemplo particular no limitativo, las partículas que son óptimas para su uso en la normalización y calibración de analizadores de hematología para el análisis de glóbulos rojos según la presente invención tienen un diámetro del tamaño de partícula de aproximadamente 5 a aproximadamente 5,5 +/- 0,1 \mum y un índice de refracción de aproximadamente 1,41 +/- 0,005.

La monodistribución de las partículas de calibración poliméricas de la presente invención es de al menos aproximadamente el 65%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 75% y más preferiblemente de al menos aproximadamente el 85%. La monodistribución, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al porcentaje de partículas poliméricas cuyo diámetro de partícula promedio está en el intervalo del diámetro de partícula promedio \pm el 33%, en peso, y se logra mediante el procedimiento de polimerización utilizado para producir las partículas. Pueden lograrse mejoras o refinamientos adicionales de la propiedad de monodistribución, por ejemplo, para estrechar la distribución del diámetro del tamaño de partícula, mediante la aplicación de procedimientos de purificación físicos, tales como el tamizado o la ultracentrifugación, durante la preparación de las partículas.

En una realización que supone el análisis de eritrocitos utilizando citometría de flujo, se preparan partículas poliméricas de perlas esféricas que tienen un diámetro de partícula promedio de aproximadamente 5,5 \mum y un índice de refracción de 1,4. Tales sustancias de calibración logran una normalización y calibración óptima del instrumento analizador para las determinaciones exactas y fidedignas de glóbulos rojos. Otras realizaciones de la presente invención engloban el uso de materiales de normalización y calibración de partículas poliméricas de perlas esféricas para reticulocitos, glóbulos blancos y plaquetas. Para el análisis de los reticulocitos utilizando citometría de flujo, las perlas poliméricas se preparan para que tengan un diámetro de partícula promedio de aproximadamente 5,5 \mum y un índice de refracción de aproximadamente 1,410. Para el análisis de los glóbulos blancos utilizando citometría de flujo, las perlas poliméricas se preparan para que tengan diámetros de partícula promedios tal como se describió anteriormente en el presente documento. Para el análisis de las plaquetas utilizando citometría de flujo, las perlas poliméricas se preparan para que tengan un diámetro de partícula promedio de aproximadamente 2,5 \mum y un índice de refracción de aproximadamente 1,380.

Partículas poliméricas adecuadas para su uso en un método de la presente invención son perlas o partículas esféricas a modo de monómeros polimerizados seleccionados del grupo de acrilato de 2-fluoroetilo, acrilato de 2,2,2-trifluoroetilo, acrilato de 2,2,3,3- tetrafluoropropilo, acrilato de 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutilo, acrilato de 1H,1H-heptafluorobutilo, acrilato de 1H,1H,5H-octafluoropentilo, acrilato de 1H,1H-pentadecafluorooctilo, metacrilato de 2-fluoroetilo, metacrilato de 2,2,2-trifluoroetilo, metacrilato de 2,2,3,3,3-pentafluoropropilo, metacrilato de 1H,1H-heptafluorobutilo, metacrilato de 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutilo, metacrilato de 1H,1H,5H-octafluoropentilo y metacrilato de 1H,1H,11H-eicosafluoroundecilo. Las partículas poliméricas sintéticas también pueden contener mezclas o combinaciones de las unidades monoméricas.

Los polímeros que comprenden las unidades polimerizadas de fórmula I preferiblemente contienen flúor en una cantidad de desde aproximadamente el 22% hasta aproximadamente el 65%, en peso, basándose en el peso total del polímero y, preferiblemente, de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 55%, en peso, basándose en el peso total del polímero. Las partículas pueden comprender un único monómero sustituido con flúor o mezclas de dos o más monómeros sustituidos con flúor.

Las partículas poliméricas esféricas para su uso como materiales de calibración/normalización se producen mediante la polimerización de al menos un monómero tal como se describió anteriormente, opcionalmente junto con al menos otro compuesto monoetilénico insaturado. Los monómeros se polimerizan en un medio polar que comprende un disolvente para el(los) monómero(s) descrito(s) anteriormente y un compuesto de precipitación para la partícula polimérica resultante, en presencia de un agente de dispersión de alto peso molecular y un formador de radicales como iniciador. En general, las partículas poliméricas pueden sintetizarse tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.093.445.

Medios polares ejemplo adecuados para su uso incluyen disolventes tales como dioxano, acetona, acetonitrilo, dimetilformamida y alcoholes. Se prefieren los alcoholes inferiores, es decir, los que tienen desde 1 hasta 4 átomos de carbono, en particular, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol y terc-butanol. También son adecuadas las mezclas de diferentes disolventes; se prefieren las mezclas de diferentes alcoholes. Preferiblemente, se utiliza una mezcla de disolvente y agua. En tales mezclas de alcohol/disolvente, los alcoholes pueden contener hasta aproximadamente el 25% en peso de agua.

Cuando el medio polar contiene agua, el peroxodisulfato de sodio (Na_{2}S_{2}O_{8}) también puede ser adecuado para su inclusión en el esquema de preparación. En general, el formador de radicales se añade en una cantidad de desde aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 10% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 5% en peso, basándose en el peso total del monómero o mezcla de monómeros.

Los agentes dispersantes de alto peso molecular utilizados para preparar las partículas pueden ser compuestos macromoleculares naturales o sintéticos que son solubles en el medio polar utilizado y tienen un peso molecular, Mw (cromatografía de permeación en gel) de desde aproximadamente 5 x 10^{3} hasta aproximadamente 5 x 10^{5}, preferiblemente desde aproximadamente 1 x 10^{4} hasta aproximadamente 2 x 10^{5}. Ejemplos no limitativos incluyen derivados de celulosa, tales como metilcelulosa, etilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, así como poli(acetato de vinilo). Son particularmente adecuados los poli(acetatos de vinilo) parcialmente saponificados, preferiblemente con un grado de saponificación de desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 25%. La polivinilpirrolidona, polivinilpirrolidonas sustituidas, polivinilcaprolactama y copolímeros de vinilo se utilizan preferiblemente en cantidades de desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 10% en peso, preferiblemente desde aproximadamente el 0,2% hasta aproximadamente el 5% en peso, basándose en el peso total del(de los) monómero(s) o mezclas de los mismos.

Otros agentes de dispersión que pueden utilizarse en la preparación de los polímeros de perla sintéticos según la presente invención incluyen atentes tensioactivos iónicos y no iónicos. Ejemplos no limitativos de tensioactivos aniónicos adecuados son las sales de sodio de ésteres del ácido sulfosuccínico. Tensioactivos catiónicos adecuados incluyen, pero sin limitarse a, sales de N-alquilamonio, por ejemplo, cloruro de metilcaprilamonio. El nonilfenol etoxilado es un ejemplo de un tensioactivo no iónico adecuado para su uso. Los agentes tensioactivos pueden utilizarse en una cantidad de desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 5% en peso, preferiblemente desde aproximadamente el 0,2% hasta aproximadamente el 2%, en peso, basándose en el medio polar.

La polimerización de las unidades monoméricas se inicia con formadores de radicales convencionales, en particular, compuestos de peróxido y compuestos azo, por ejemplo peróxido de dibenzoílo, peróxido de dilaurilo, bis(peróxido de p-clorobenzoílo), peroxidicarbonato de diciclohexilo, peroctoato de terc-butilo, 2,5-bis(2-etilhexanoilperoxi)-2,5-dimetilhexano, terc-amilperoxi-2etilhexano, 2,2 -azo-bis(isobutironitrilo).

La temperatura de polimerización empleada depende de la temperatura de descomposición del iniciador y del punto de ebullición del disolvente y está preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente 50°C hasta 1400C. La polimerización se lleva a cabo ventajosamente en el punto de ebullición del disolvente. El tiempo de polimerización generalmente se extiende durante varias horas (por ejemplo, de aproximadamente 2 a 12 horas).

La mezcla de polimerización normalmente se agita. El aislamiento del polímero se lleva a cabo por filtración o por precipitación, por ejemplo, utilizando una centrífuga. Para las partículas del calibrador según la presente invención, el índice de refracción se determina mediante el(los) monómero(s) que comprende(n) las partículas. El diámetro de partícula promedio y la monodistribución (es decir, distribución estrecha) se obtienen utilizando las habilidades que poseen los expertos en la técnica (por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.093.445), mediante el ajuste adecuado de los parámetros de polimerización para lograr el tamaño de partícula y la monodistribución específicas requeridas, basándose en el(los) tipo(s) de partículas de calibración/normalización que se desean para los análisis de citometría de flujo.

La determinación del índice de refracción como una característica significativa de las partículas poliméricas preparadas puede llevarse a cabo tal como sigue: una dispersión de las partículas poliméricas se filtró y se secó en una estufa a aproximadamente 105°C. El polímero secado se disolvió en un disolvente, por ejemplo, acetona, y una gota de la solución del polímero disuelto se colocó sobre una placa de vidrio de un refractómetro (es decir, un refractómetro Abbe (véase el ejemplo 3)) y entonces se secó (por ejemplo, utilizando un secador de pelo) para formar una película continua sobre la superficie de la plaza. El índice de refracción de las partículas se midió entonces utilizando el refractómetro en esta película polimérica seca.

Puede llevarse a cabo un ajuste del índice de refracción particular de las perlas de partículas producidas cargando las perlas con una sustancia que tiene un índice de refracción bajo (véase el ejemplo 2). En general, en la carga de las partículas poliméricas, las partículas se hinchan, junto con un compuesto orgánico (es decir, un componente activo), en un disolvente para el polímero. Tras la evaporación del disolvente, el componente activo permanece dentro de la partícula polimérica. Los compuestos del componente que se puede cargar adecuados comprenden cualquier molécula orgánica con un índice de refracción inferior o igual a aproximadamente 1,45. Ejemplos de moléculas orgánicas adecuadas para la carga incluyen compuestos que contienen flúor, particularmente, monómeros que contienen flúor, tal como se describió anteriormente en el presente documento, que se polimerizan tal como se describió inmediatamente antes. Para evitar que la sustancia cargada se filtre de las perlas, pueden añadirse uno o varios monómeros de etileno insaturados que tienen un índice de refracción bajo, junto con un iniciador de radicales. La polimerización posterior inmoviliza la(s) molécula(s) orgánica(s) en las partículas. Una descripción de los métodos utilizados para cargar las partículas puede encontrarse en la patente de los EE.UU. número 5.270.354 concedida a J. T. Vermeersch et al.

También se engloba en la presente invención una mezcla de partículas que tienen intervalos diferentes de tamaño e índice de refracción, así como intervalos diferentes de absorción y concentración de colorante fluorescente, de manera que un instrumento dado puede calibrarse/normalizarse utilizando partículas que son representativas de todos los tipos diferentes de células sanguíneas reales que están presentes en la muestra de sangre de un sujeto.

La presente invención se puede aplicar particularmente para la normalización/calibración de los instrumentos de analizador de citometría de flujo que suponen una variedad de mecanismos de detección y tecnologías basadas en la dispersión de la luz como un parámetro medido, por ejemplo, las tecnologías de dispersión de la luz/absorción, dispersión de la luz/fluorescencia, dispersión de la luz/impedancia eléctrica, dispersión de la luz/radiofrecuencia (RF), dispersión de la luz/dispersión de la luz y similares. Tal como se usa en el presente documento, las tecnologías que suponen la citometría de flujo basada en la luz dispersada combinada con otro parámetro medido para la medición y determinación de partículas y células se denominan determinaciones de "dispersión/X". De manera ilustrativa, mediante la detección por dispersión/dispersión se quiere decir que el análisis de la partícula o célula se realiza midiendo la dispersión de la luz producida por las partículas en dos ángulos de dispersión diferentes. Otros sistemas, tales como la detección por dispersión/impedancia eléctrica o dispersión/RF, permiten que el análisis de la célula se realice midiendo la dispersión de la luz en al menos un ángulo y también midiendo un parámetro conocido diferente, tal como la impedancia eléctrica o la radiofrecuencia, respectivamente.

Generalmente, en los métodos de dispersión/X, las células en suspensión pasan de una en una a través de un sistema de detección óptico y también, para las mediciones de impedancia y RF, a través de un sistema de detección eléctrico. El sistema óptico comprende una fuente de luz, normalmente un haz láser colimado, un tubo cilíndrico estrecho a través del cual las células pasan e interceptan el haz de luz, y uno o varios detectores ópticos, tales como fotodiodos de silicio o tubos de fotomultiplicador, que se disponen para recoger la luz transmitida, dispersada, o que fluoresce de las células. El sistema eléctrico comprende un campo eléctrico, estático para la impedancia eléctrica y que oscila para la RF, aplicado a través de una pequeña abertura, denominada una apertura, a través de la cual pasan las células. En el método de dispersión/impedancia, por ejemplo, la celda de flujo puede ser una apertura cilíndrica adecuada tanto para las mediciones ópticas como para las eléctricas realizadas midiendo la dispersión de la luz en al menos un ángulo y también midiendo un parámetro conocido diferente, tal como la impedancia eléctrica o la radiofrecuencia, respectivamente.

Generalmente, en los métodos de dispersión/X, las células en suspensión pasan de una en una a través de un sistema de detección óptico y además, para las mediciones de impedancia y RF, a través de un sistema de detección eléctrico. El sistema óptico comprende una fuente de luz, normalmente un haz láser colimado, un tubo cilíndrico estrecho a través del cual las células pasan e interceptan el haz de luz, y uno o más detectores ópticos, tales como fotodiodos de silicio o tubos de fotomultiplicador, que se disponen para recoger la luz transmitida, dispersada, o que fluoresce de las células. El sistema eléctrico comprende un campo eléctrico, estático para la impedancia eléctrica y que oscila para la RF, aplicado a través de una pequeña abertura, denominada una apertura, a través de la cual pasan las células. En el método de dispersión/impedancia, por ejemplo, la celda de flujo puede ser una apertura cilíndrica adecuada tanto para las mediciones ópticas como para las eléctricas.

En consecuencia, en uno de sus aspectos, la presente invención proporciona un método para calibrar o normalizar un instrumento de citometría de flujo para el análisis de partículas utilizando partículas sintéticas sustancialmente esféricas como calibradores o patrones. Los valores de la columna y el índice de refracción de las partículas esféricas sintéticas de calibración o patrones están predeterminados, de manera que se obtengan valores conocidos del volumen y el índice de refracción. El instrumento de citometría de flujo generalmente proporciona al menos una señal relacionada con la dispersión de la luz procedente de las partículas que pasan a través del instrumento para su análisis.

El volumen de las partículas esféricas sintéticas se determina rutinariamente empleando mediciones de impedancia de apertura convencionales, por ejemplo, impedancia de apertura de canal único, para que las perlas sintéticas esféricas obtengan un volumen conocido de partículas sintéticas. El índice de refracción se determina mediante técnicas de correspondencia del índice empleadas convencionalmente para obtener un valor predeterminado o conocido del índice de refracción. Brevemente, la técnica de correspondencia del índice supone la preparación de una serie de medios o soluciones que tienen valores predeterminados (o conocidos) del índice de refracción que catalogan el índice de refracción de las partículas sintéticas de interés. Las partículas se suspenden en el medio o solución, por ejemplo, suero.

En consecuencia, en uno de sus aspectos, la presente invención proporciona un método para calibrar o normalizar un instrumento de citometría de flujo para el análisis de partículas utilizando partículas sintéticas sustancialmente esféricas como calibradores o patrones. Los valores del volumen y el índice de refracción de las partículas esféricas sintéticas de calibración o patrones están predeterminados, de manera que se obtengan valores conocidos del volumen y el índice de refracción. El instrumento de citometría de flujo generalmente proporciona al menos una señal relacionada con la dispersión de la luz procedente de las partículas que pasan a través del instrumento para su análisis.

El volumen de las partículas esféricas sintéticas se determina rutinariamente empleando mediciones de impedancia de apertura convencionales, por ejemplo, impedancia de apertura de canal único, para que las perlas sintéticas esféricas obtengan un volumen conocido de partículas sintéticas. El índice de refracción se determina mediante técnicas de correspondencia del índice empleadas convencionalmente para obtener un valor predeterminado o conocido del índice de refracción. Brevemente, la técnica de correspondencia del índice supone la preparación de una serie de medios o soluciones que tienen valores conocidos del índice de refracción que catalogan el índice de refracción de las partículas sintéticas de interés. Las partículas se suspenden en el medio o solución, por ejemplo, albúmina sérica o diatrizoato de sodio, y las partículas suspendidas se visualizan en un microscopio para determinar el punto en el que las partículas "desaparecen" en el medio, es decir, el punto en el que el índice de refracción de las partículas es en su mayor parte similar al del medio o solución.

El método de calibración o normalización según la presente invención generalmente supone hacer pasar las partículas sintéticas esféricas de calibración o patrones, que tienen diámetros de partícula promedios e índices de refracción esencialmente reproducibles de las partículas que van a someterse a ensayo o a analizarse, en una corriente de flujo líquida esencialmente una célula de una vez a través de un haz de luz incidente. Una señal medible primera y segunda se detectan a partir de las partículas sintéticas de calibración o patrones que pasan a través del haz de luz. O bien la primera o la segunda señal medible es la dispersión de la luz. Se determinan las cantidades o intensidades de las señales primera y segunda, produciendo así un par de intensidades de señal o un par de señales.

Utilizando los valores de volumen e índice de refracción predeterminados descritos anteriormente para las partículas esféricas sintéticas, junto con tablas numéricas convencionales para convertir el par de intensidades de señal, por ejemplo, por dispersión, el par de intensidades de señal se convierte en valores de volumen e índice de refracción para proporcionar ganancias de señales normalizadas para el citómetro de flujo.

Utilizando las ganancias de señales normalizadas, junto con las tablas de conversión mencionadas anteriormente, el citómetro de flujo se calibra para las mediciones de volumen e índice de refracción. Además, utilizando la concentración conocida de partículas para la suspensión de partículas esféricas de volumen e índice de refracción predeterminados, el citómetro de flujo está normalizado para el recuento de partículas analizables que tienen señales dentro de los intervalos apropiados de volumen e índice de refracción.

Debe entenderse que, en el método de calibración o normalización según la presente invención, pueden emplearse otras señales medibles, además de las señales de dispersión de la luz. Por tanto, en el método de calibración/normalización, o bien la primera o la segunda señal medible puede ser la dispersión de la luz y la otra de las dos señales medibles puede ser una de las enumeradas más adelante. Alternativamente, tanto la primera como la segunda señal puede ser la dispersión de la luz. Ejemplos no limitantes de señales medibles adecuadas, distintas a la dispersión de la luz, que pueden comprender o bien la primera o la segunda señal (la que no sea dispersión de la luz), o que pueden emplearse como señales además de la dispersión de la luz, incluyen la impedancia eléctrica, la absorción de la luz, la fluorescencia y la radiofrecuencia, en cualquier combinación. Como ejemplo, en el caso en el que o bien la primera o la segunda señal medible sea la dispersión de la luz, y la otra señal de no dispersión de la luz sea otro tipo de señal medible, las señales medidas se utilizan para proporcionar mediciones de volumen e índice de
refracción.

Si tanto la primera como la segunda señales medibles son dispersión de la luz, entonces las otras señales medibles, utilizadas además de las señales de dispersión de la luz, pueden proporcionar determinaciones o mediciones adicionales útiles para el método de calibración/normalización según la presente invención. Como ejemplo no limitativo, si se añade una medición de fluorescencia a las mediciones primera y segunda de dispersión de la luz, entonces puede proporcionarse una determinación de la intensidad de la fluorescencia, además de las mediciones de dispersión obtenidas a partir de los dos ángulos de dispersión. Como otro ejemplo, si se añade una medición de la absorbancia a las mediciones primera y segunda de la dispersión de la luz, entonces se proporciona una determinación de la cantidad de luz absorbida, por ejemplo, mediante ciertos colorantes dentro de las partículas que se están analizando, además de la medición de la dispersión obtenida a partir de los dos ángulos de dispersión.

En un análisis típico de dispersión/impedancia, una alícuota de sangre completa que contiene glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas se diluye y se suspende en un medio isotónico (que, por tanto, es eléctricamente conductor). El factor de dilución se ajusta de manera que las células pasan en una única fila a través del sistema de detección dual. La medición de la impedancia proporciona información sobre el tamaño de las células para todos los tipos celulares (es decir, glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) en la alícuota de la muestra de sangre completa. La medición de la dispersión puede proporcionar información acerca del índice de refracción de la célula y, por tanto, de la densidad de la célula, para las células que se comportan como esferas, ya que la teoría de la dispersión de Mie puede aplicarse a la señal de dispersión para determinar el índice de refracción. La información sobre el tamaño y/o el índice de refracción se utiliza para asignar señales a los tres tipos de células. El número de pulsos de cada tipo se utiliza para determinar los recuentos de células.

Para normalizar y calibrar un método de dispersión/X para el análisis de los glóbulos rojos, se preparan y se utilizan según la presente invención perlas esféricas cuyo volumen promedio es equivalente al de los glóbulos rojos normales (aproximadamente 90 fl), es decir, perlas que tienen diámetros promedio de aproximadamente 5,5 \mum y cuyo índice de refracción promedio es equivalente al de los glóbulos rojos normales (aproximadamente 1,41). Se preparan suspensiones de concentraciones conocidas de esas perlas y se hacen pasar a través del sistema de detección de dispersión/X. Las señales de dispersión/X generadas por estas perlas se utilizan para normalizar los detectores para las mediciones de glóbulos rojos, ya que las perlas de normalización determinan las posiciones de la señal ocupadas por las poblaciones normales de células.

Los valores de volumen e índice de refracción para las perlas también pueden utilizarse para calibrar el sistema de detección para las mediciones numéricas, tales como el volumen de glóbulo rojo medio (MCV) y la concentración de hemoglobina celular media (MCHC). Este último parámetro se puede obtener a partir de mediciones del índice de refracción, ya que el índice de refracción y la concentración de hemoglobina están relacionados linealmente. El número de señales generadas por las perlas por unidad de tiempo o por volumen unitario también puede utilizarse para calibrar el sistema para los recuentos de glóbulos rojos (RBC).

De una manera completamente análoga, las perlas sintéticas según la invención pueden prepararse y emplearse para normalizar y calibrar un instrumento para realizar análisis de plaquetas. Se hacen pasar partículas esféricas de aproximadamente 2,5 \mum de diámetro y de aproximadamente 1,38 de índice de refracción en una suspensión de dilución apropiada a través del sistema. Las señales de las partículas se utilizan para normalizar el sistema de detección para las mediciones de plaquetas. Las señales de las partículas también pueden utilizarse para calibrar el sistema para las mediciones del volumen de plaqueta medio (MPV), así como para las mediciones del índice de refracción de las plaquetas. El número de señales por unidad de tiempo o por volumen unitario puede utilizarse para calibrar el recuento de plaquetas (PLT).

De una manera análoga, las partículas sintéticas pueden utilizarse para normalizar y calibrar instrumentos para los análisis de glóbulos blancos. En este caso, puede prepararse un único conjunto de partículas que tienen, por ejemplo, un diámetro promedio de aproximadamente 8,0 \mum y un índice de refracción de aproximadamente 1,385, y apropiadamente diluidas, y seleccionarse para normalizar y calibrar el sistema de detección para los análisis de glóbulos blancos, en general. Alternativamente, pueden utilizarse múltiples conjuntos de partículas que tienen diámetros promedio, índices de refracción y concentraciones seleccionados, por separado o en combinación, para normalizar y calibrar el sistema de detección para los análisis de glóbulos blancos partiendo de una base de tipo por tipo de glóbulo blanco.

Tal como se describe para los análisis de glóbulos blancos, en lugar de normalizar y calibrar individualmente un sistema para el análisis de cada tipo de célula sanguínea, puede prepararse una combinación de perlas adecuadas para el análisis simultáneo de los glóbulos rojos, plaquetas y cada tipo de glóbulos blancos en una única suspensión de concentración apropiada. Esto es posible porque, para las muestras sanguíneas normales, todos los tipos de células sanguíneas ocupan posiciones únicas en el espacio de tamaño/índice de refracción.

Además, pueden prepararse y seleccionarse partículas para su uso en un método de la presente invención para normalizar y calibrar instrumentos para el análisis de reticulocitos en sangre completa. De manera similar a las que se utilizan para normalizar/calibrar glóbulos rojos, las partículas para normalizar/calibrar reticulocitos tienen diámetros de aproximadamente 5,5 \mum e índices de refracción de aproximadamente 1,41. Si los reticulocitos se distinguen de los glóbulos rojos maduros basándose en las características de absorción óptica de colorantes unidos selectivamente, por ejemplo, colorantes catiónicos, tales como Oxazina 750, entonces las partículas se preparan para que contengan colorantes a concentraciones que son representativas de las de los reticulocitos. Si reticulocitos se distinguen de glóbulos rojos partiendo de la base de la fluorescencia de colorantes unidos selectivamente, entonces las perlas contienen colorantes fluorescentes adecuados, tal como se conocen y emplean comúnmente por el experto en la técnica. La preparación de las partículas poliméricas para que contengan compuestos colorantes adecuados puede lograrse de una manera análoga a la descrita para cargar las partículas con compuestos que contienen flúor, tal como se describió anteriormente en la Descripción Detallada y en el ejemplo 2. En lugar de cargar las partículas con compuestos que contienen F, las partículas pueden cargarse con compuestos de pigmentos o colorantes hidrófobos, por ejemplo (véase también la patente de los EE.UU. número 5.270.354).

Para emplear las partículas esféricas como patrones/calibradores en la citometría de flujo, deben determinarse los valores de tamaño e índice de refracción de las partículas. El tamaño puede determinarse basándose en contadores de impedancia de apertura calibrados previamente simplemente haciendo pasar a las partículas a través de los contadores y registrando sus volúmenes (figuras 1A y 1B). Además de la medición del índice de refracción de las partículas descrita anteriormente, pueden determinarse valores del índice de refracción mediante una forma de correspondencia del índice de refracción, tal como se trató anteriormente y se describe adicionalmente en el presente documento: Las perlas se suspenden en una serie de medios fluidos cuyos índices de refracción abarcan el valor del índice de refracción de las perlas de partículas poliméricas. La suspensión se observa al microscopio. El índice de refracción de las perlas es el valor en el que las perlas son microscópicamente invisibles (ya que su índice de refracción "se corresponde" con el del medio). El índice de refracción del medio puede determinarse mediante mediciones en un refractómetro Abbe, por ejemplo. El medio seleccionado debe ser inmiscible con las perlas. En caso contrario, las perlas absorberán parte del medio y esto afectará a sus valores del índice de refracción. Los medios adecuados incluyen, pero no se limitan a, soluciones acuosas de azúcares, tales como dextrano. La resolución del índice de refracción se controla mediante la resolución de incrementos del índice de refracción de la solución de los medios preparada. Prácticamente, el índice de refracción puede incrementarse en tan sólo 0,0005 unidades.

El refractómetro Abbe permite el análisis refractométrico utilizando una gota o dos de muestra y permitiendo que se realice una medición del índice de refracción en aproximadamente 1-2 minutos con una precisión de 0,0001 (McGraw- Hill Concise Encyclopedia of Science and Technology, Segunda Edición, Editor en jefe: Sybil P. Parker, McGraw-Hill Publishing Company, pág. 1582, 1989).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos tal como se exponen en el presente documento pretenden servir de ejemplo a los diversos aspectos para llevar a cabo la invención y no pretenden limitar la invención en modo alguno.

Ejemplo 1 Preparación de perlas de partículas poliméricas fluoradas con un diámetro de tamaño de partícula de aproximadamente 5 \mum y un índice de refracción de 1,41 +/- 0,0

Se prepararon partículas sintéticas para su uso como patrones de calibración para glóbulos rojos. Las partículas eran homopolímeros comprendidos de unidades monoméricas polimerizadas de metacrilato de trifluoroetilo como monómero. El procedimiento utilizado para producir las partículas se describe en el ejemplo 1.

A temperatura ambiente, se disolvieron 6,64 g de poli-N-vinilpirrolidina que tenía un peso molecular de 40.000 junto con 665,0 g de metacrilato de trifluorometilo y 13,3 g de Arkopal N060 (véase más adelante) en 33,69 g de agua desmineralizada y 2670,53 g de metanol en un vaso de reacción de 5 litros equipado con un agitador y un condensador de reflujo. La solución se agitó constantemente a 55 rpm durante toda la reacción. La mezcla de reacción se calentó hasta 65°C. A esta temperatura, se añadieron 110,83 g de una solución al 30%, p/p de persulfato de sodio de una vez. La mezcla de reacción se mantuvo a 65°C y se agitó durante otras 16 horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y se filtró. El tamaño de diámetro final de las partículas (Dmv) fue de 5,13 y el índice de refracción fue de 1,413. El flúor estaba presente en una cantidad del 35%, en peso, con respecto a los monómeros, en las partículas finales que comprendían monómeros polimerizados que contenían flúor según la presente invención.

La polivinilpirrolidona (PVP) utilizada en la preparación descrita anteriormente de las perlas poliméricas fluoradas sirve como un agente de estabilización. La PVP es ventajosa para la monodistribución de las partículas. También, dado que no es tóxica, es un buen agente de unión para aplicaciones médicas. Arkopal N-060, un mono-isononilfenil éter de un polietilenglicol con unidades de óxido de etileno recurrentes, es un ejemplo de un agente humectante. Ejemplos de otros agentes humectantes adecuados incluyen Akyporox NP-40, un mono-isononilfenil éter de un polietilenglicol con cuatro unidades de óxido de etileno recurrentes y Antarox CO-630, un mono-isononilfenil éter de un polietilenglicol con de nueve a diez unidades de óxido de etileno recurrentes.

Ejemplo 2 Carga de partículas poliméricas sintéticas para lograr materiales de calibración que tienen un índice de refracción bajo

Se prepararon partículas poliméricas sintéticas según la presente invención y se cargaron para ajustar el índice de refracción para lograr productos de calibración que tienen índices de refracción bajos sin filtración del material cargado.

Se disolvieron 2 g de metacrilato de perfluoroalquiletilo en 45 ml de acetato de etilo a 25ºC. La solución resultante se dispersó durante 5 minutos con agitación a 12.000 rpm en 90 ml de agua desmineralizada a la que se habían añadido 9 ml de una solución acuosa al 10% de la sal de sodio del ácido n-dodecilbencenosulfónico. La dispersión resultante de perfluoromonómero se añadió a 97 g de una dispersión acuosa de perlas de flúor (20,6%, p/p; índice de refracción: 1,413). La mezcla obtenida se agitó durante 1 hora. Se eliminó el acetato de etilo a presión reducida. Se obtuvieron partículas poliméricas homodispersas cargadas con el perfluoromonómero hidrófobo (índice de refracción: 1,408). La dispersión no contenía conglomerados ni perfluoromonómero cristalizado o no disuelto.

Ejemplo 3 Normalización y calibración del analizador de hematología Bayer H*1 utilizando las partículas poliméricas sintéticas de la presente invención antes del análisis de las poblaciones de células en sangre completa

Se prepararon perlas sintéticas según el método descrito en el ejemplo 1 anteriormente. Las perlas se secaron entonces a 50°C y se resuspendieron en solución salina isotónica hasta una concentración final de 23.500 partículas por \mul de solución salina. Basándose en el recuento de partículas y en la distribución de tamaño proporcionada por el contador de impedancia de apertura (figuras 1A y 1B), la suspensión de perlas comprendía 7.888 partículas que tenían un diámetro de partícula promedio de 4,89 +/- 0,17 \mum y 15.612 partículas que tenían un diámetro de partícula promedio inferior a 2.0 \mum. El índice de refracción promedio de esas perlas fue de 1,417 +/- 0,003.

Muestras de esta suspensión de perlas se hicieron pasar por el analizador de hematología Bayer H*1 en el modo de citometría directa; es decir, la suspensión se diluyó adicionalmente antes de hacerla pasar a través del sistema de detección óptica por dispersión/dispersión. Esto se realizó para reducir el consumo de material de partículas de normalización/calibración. El sistema por dispersión/dispersión del instrumento Bayer H*1 contiene una fuente de luz láser de helio-neón que emite a una longitud de onda de 632,8 nanometros; una apertura cilíndrica a través de la cual pasa la suspensión (la apertura está cubierta en un medio cuyo índice de refracción se corresponde con el del medio de suspensión); y dos fotodetectores de silicio, uno colocado para recoger la luz dispersada por las partículas de 2°-3°, y el otro colocado para recoger la luz dispersada a partir de 5°-15°. Las señales se visualizaron en un citograma de dispersión/dispersión directo, en el que la señal del eje X corresponde a la dispersión de 5°-15° y la señal del eje Y corresponde a la dispersión de 2°-3° (figura 2). El tamaño de partícula se presentó como un volumen celular medio (MCV, fl) para corresponderse con el término relevante para los glóbulos rojos auténticos. De manera similar, la distribución de tamaño se presentó como la anchura de distribución de los glóbulos rojos (RDW, %, (DE de la distribución de glóbulos rojos/MCV)). El MCV está relacionado con el diámetro de la siguiente forma:

MCV = X \ x \ diámetro^{3}/6.

El índice de refracción se presentó como la media de la concentración de hemoglobina celular (CHCM, g/dl) y su distribución se presentó como la anchura de distribución de la hemoglobina (HDW, g/dl, (DE de la distribución)). La concentración de hemoglobina celular (HC) está relacionada con el índice de refracción de la siguiente forma: HC = (índice de refracción celular - 1,345)/0,001942, en la que 1,345 = el índice de refracción de la parte que no es hemoglobina en el citoplasma del glóbulo rojo y 0,001942 = incremento del índice de refracción por g/dl de hemoglobina.

Los valores de la señal de dispersión asociados (designados como Mediax y Mediay en la figura 2) se determinaron utilizando tablas basadas en la teoría de la dispersión de Mie, que predice el patrón de la intensidad de dispersión angular para esferas homogéneas como una función de la longitud de onda incidente, el índice de refracción de la partícula y el diámetro de la partícula. Los valores se ajustaron hasta que coincidieron con la predicción teórica: X = 19,0 e Y = 20,0. El recuento de partículas para las perlas dentro del "recuadro" de glóbulos rojos en la figura 2 es 625 veces superior que el recuento real (es decir, 7.888 x 625 = 4.930.000). Esto incluye el factor de dilución normal del sistema de 625/1.

El contenido de todas las patentes, solicitudes de patente, artículos publicados, libros, bibliografía, manuales y resúmenes citados en el presente documento se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad para describir más completamente el estado de la técnica a la que se refiere la invención.

Dado que pueden realizarse diversos cambios en el contenido descrito anteriormente sin apartarse del alcance y el espíritu de la invención, se pretende que todo el contenido de la descripción anterior o definido en las reivindicaciones adjuntas se interprete como descriptivo e ilustrativo, y no en un sentido limitativo. Son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por tanto, debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de otro modo que el descrito específicamente.

Claims (3)

1. Uso de partículas poliméricas fluoradas que están hechas a partir de polímeros seleccionados del grupo de polímeros que consiste en acrilato de 2-fluoroetilo, acrilato de 2,2,2-trifluoroetilo, acrilato de 2,2,3,3-tetrafluoropropilo, acrilato de 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutilo, acrilato de 1H,1H-heptafluorobutilo, acrilato de 1H,1H,5H-octafluoropentilo, acrilato de 1H,1H-pentadecafluorooctilo, metacrilato de 2-fluoroetilo, metacrilato de 2,2,2-trifluoroetilo, metacrilato de 2,2,3,3,3-pentafluoropropilo, metacrilato de 1H,1H-heptafluorobutilo, metacrilato de 2,2,3,4,4,4-hexafluorobutilo, metacrilato de 1H,1H,5H-octafluoropentilo y metacrilato de 1H,1H,11H-eicosafluoroundecilo y mezclas de los mismos y las partículas están en la forma de partículas esféricas que tienen un diámetro de partícula promedio de 1 \mum-10 \mum y un índice de refracción de 1,35-1,45 en un método para normalizar y/o calibrar un analizador de hematología.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que las partículas tienen un diámetro de partícula promedio de 2,5 \mum y un índice de refracción de 1,38 +/- 0,01 para normalizar y calibrar analizadores de hematología para el análisis de plaquetas.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que las partículas tienen un diámetro de partícula promedio de 5 \mum a 5,5 \mum +/- 0,1 y un índice de refracción de 1,41 +/- 0,005. para normalizar y calibrar analizadores de hematología para el análisis de glóbulos rojos.