CN103339489A - 用于流体中微粒子的多参数测量的设备和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于微粒子的表征的流的测量的电光设备，包括：要表征的流体的流在其中循环的测量室（CUM）、不相交光谱的至少两个光源（S1、S2）、用于测量电阻率（RES）的设备以及均允许光学参数的测量的至少三个其他检测器（D1、D2、D3），所述光学参数选自荧光（FL）、消光（EXT）、广角衍射（SSC）以及小角衍射（FSC）。

Description

用于流体中微粒子的多参数测量的设备和方法

技术领域

本发明涉及用于表征微粒子，特别是生物细胞的电光流测量设备的一般领域，该设备包括要表征的流体的流在其中循环并包含要表征的细胞的测量室。这一领域基于使用电气和光学测量来计数并区分包含在要分析的样本中的细胞的分析方法。本发明更具体地涉及用于细胞计数和表征的多参数电光设备。

要表征的流体优选是血液样本，但其也可以是诸如脑脊髓液、骨髓等的另一类生物流体。样本还可以包含要区分和计数的任何类型的粒子。

更具体地，本发明涉及设备，其包括至少两个光源、电阻率测量设备和允许光学参数的测量，通常是消光测量和侧向散射测量的几个检测器。

这些测量实现了包含在流体中的生物细胞的表征。

背景技术

关于造血细胞，本领域技术人员知晓由容量分析或衍射测量获得的、包括消光和吸收现象的细胞的形态分析允许分辨包括红血球或红细胞、凝血细胞或血小板的主要细胞系与白血球或白细胞。后一个群体自身细分为几个类别，例如淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞和嗜碱粒细胞。

在某种程度上，可以通过同时确定这些细胞在白光中的体积和表观吸收来评价这些细胞的成熟度，例如在申请人提交的专利US5,138,181中所描述的。例如在公布文本WO2006/053960中描述了为近单色光开发的设备的实施例。

细胞成熟的这一评价是重要的，因为其允许进行早期诊断。通常，在没有任何病理的情况下，存在于循环血液中的大部分细胞是成熟的细胞。

对于每一个前述细胞类型，不同成熟度是已知的。例如，首先以原成红细胞形式构成红细胞，其也称为红血球或红血细胞，随后是嗜碱性成红血细胞形式，随后是多染性成红细胞形式。多染性成红细胞发育为嗜酸性成红血细胞，随后发育为网状细胞。一旦网状细胞进入循环血液中，就将这些网状细胞最终区分为红血球。

以成髓细胞的第一形式从骨髓得到白细胞或白血球。这些成髓细胞随后产生未成熟粒细胞，其稍后将变为嗜碱、嗜曙红或中性粒性白细胞，首先是未分裂的，但随后随着它们成熟，它们的核日益分裂。

这些相同的成髓细胞还是单核细胞系的起源，其产生成单核细胞、前单核细胞，及随后将进入外周血液中的单核细胞。

成髓细胞所源自的多能干细胞还产生借助淋巴干细胞的形式加以区分的淋巴细胞系，其中的部分细胞系，T-淋巴细胞系将继续其在胸腺和腺体中的成熟，另一部分将保留在骨髓中以给出B-淋巴细胞系。这些B-淋巴细胞一旦以浆细胞的形式激活，就产生抗体以抗击致病抗原。

血小板或凝血细胞得自于成巨核细胞，其源自髓样前体细胞，成髓细胞源于髓样前体细胞，一旦它们达到其最终成熟阶段，即凝血细胞基因巨核细胞（thrombocytogenic megakaryocytes），它们就借助其细胞质的分裂产生血小板。年轻的血小板，网织血小板，具有RNA分量，它是其原始细胞的剩余物。

某些病理的诊断需要循环血液中造血细胞的更为精细调整的计数和表征。尤其重要的是能够发现特定的群体，例如网状细胞和成红细胞，它们是红血球（红细胞）的未成熟形式。类似地，未成熟细胞、白细胞的前体（称为未成熟的淋巴细胞、单核细胞或粒性白细胞）的发现变得日益重要。活化的淋巴细胞或网织血小板的分类和计数也使得在患者诊断中获得真正的改进成为可能。

发明内容

本发明涉及分析设备及相关方法的开发，其通过提出了一种用于微粒子的表征的流式测量电光设备而实现对包含在样本中的每一个特定群体的改进的区分以及从而更好地计数，所述流式测量电光设备包括要表征的流体的流在其中循环的测量室、不相交光谱的至少两个光源、用于测量电阻率的设备以及均允许光学参数的测量的至少三个其他检测器，所述光学参数选自荧光、消光、广角衍射（侧向散射）、以及小角衍射（前向散射），所述电光设备的特征在于：

-第一光源，最小相干并具有最长波长，限定出与粒子的所述流垂直的主光轴，所述主光轴具有位于所述室的任一侧的两个光学组件，一个光学组件是使由所述第一光源发射的束成形的发射枪，另一光学组件是收集由所述第一光源发射的信号且位于所述测量室之后的接收枪；

-第二光源，最大相干并具有最短波长，限定出与所述主光轴相交并且垂直于粒子的所述流的副光轴；

-第一检测器，面对所述第一光源布置在所述接收枪的末端，并因此具有光场操作；

-所述接收枪包括收集光学装置，收集由所述第一光源与所述流中的粒子之间的相互作用而朝向所述第一检测器发出的束，这些收集光学装置使得在其部分路径上，所传送的光束基本上是准直束；

-第一分色镜，布置在所述接收枪中的光束被基本准直的所述部分路径处，从而将由所述第二光源与所述流中的粒子之间的相互作用而发出的光束部分反射向第二检测器，所述第二检测器布置在被部分反射的束的路径上；

-所述发射枪包括束成形光学装置，用以使由所述第一光源发射的束成形，这些束成形光学装置使得在其部分路径上，光束基本上是准直束；以及

-第二分色镜，布置在所述第一光源与所述室之间的发射枪中的光束被基本准直的所述部分光路处，以便将由所述第二光源与所述流中的粒子之间的相互作用而发出的束部分反射向第三检测器，所述第三检测器布置在被部分反射的束的路径上。

因此，正如传统上的，该设备包括粒子通过的微孔，从而给出电阻率的第一测量。接下来，由于两个光源，其中一个光源具有短相干时间，该设备允许借助于至少三个额外的测量路径获得至少三个其他测量。

根据本发明的设备包括额外的测量路径，由于分色镜系统插入到发射枪中，而允许获得额外的测量。本发明使设备模块化并能够使用少量装置项在有限空间内进行多个测量。另外，如有必要，可以在保持相同结构元件的同时修改所测量的参数。所获得粒子分类结果明显优于以已知设备获得的。实际上，借助可用参数的多样性和模块性，根据本发明的设备提供了尤其良好的性能，其在分类结果方面是灵敏且多价的。

根据本发明的设备使用非常简单、成本低并允许获得多个测量，因此获得多个细胞特性。

根据本发明的设备通过实现了更大量的参数测量，实现包含在包括血液样本的生物样本中的细胞的表征、区分和绝对计数。

另外，光源是分离的，它们易于组合或不组合。具体地，这个特性允许在以荧光染料进行测量时克服了可能的补偿问题。

无需很大地修改所述光学组件，易于获得额外的测量。例如，可以获得小角衍射测量和荧光测量，至少与使用的相干光源的一样多，这可以提供与被检查粒子的性质有关的额外信息。

根据本发明的设备是模块化的，因为其允许获得多个参数，它们可以是极为不同的类型。例如，可以获得消光测量、广角衍射测量和荧光测量。测量的这一组合允许容易且迅速地获得在测量室中循环的粒子的极好表征。

通过适应性调整要进行的测量，本发明允许每一个红血球群体的细胞内血红蛋白含量的极为准确的测量。通过扩展，根据本发明的设备和方法可以允许样本中白细胞群体的改进的分析。

根据一个特定特性，将衍射/散射检测器面对第二光源设置在测量室的另一侧上。

在一些特定情况下，这一特性对帮助细胞分类是有用的，或者更普遍地，用以触发光学测量。

根据本发明的一个有利的特性，第一检测器具有可切换的增益，使得其能够执行两类测量，一个在消光中，另一个选自衍射和荧光。

利用这一特性，可以将单个检测器用于涉及光强度相差很大的两个参数测量，通常是消光测量和荧光测量。这个特性因此允许在发射枪中增加测量。根据本发明的设备于是更进一步地模块化，因为第一检测器可以用于消光测量或者用于另一个光学参数的测量。在相同光谱带内的这个双重测量的存在于是允许在无需改变测量设备的情况下增加用于细胞分类的参数，只要在这个光谱带中存在荧光，并可以有利地用于细胞的分类。这避免了必须为荧光测量安装明显不同的路径。根据一个特定应用，第一检测器执行消光测量，第二检测器执行广角衍射测量，第三检测器执行荧光测量。

取决于分析的样本和进行测量之后执行的结果的分析，如此获得的测量允许有核细胞的8个群体或免疫表型的计数和区分。

在根据本发明的另一个特定应用中，第一检测器执行消光测量，第二检测器执行荧光测量，第三检测器执行荧光测量。

与分析的样本和进行测量之后执行的结果的分析相关地，如此获得的测量允许一些特性的检测，例如借助荧光染料或免疫表型发现的。

根据优选特性，两个分色镜具有相同的光学特性，产生比第二光源的波长长，且比第一光源的波长短的波长的全反射。

利用这一特性，可以在不必修改根据本发明的设备的物理结构的情况下，随意修改与每一个检测器相关联的测量。

根据本发明的一个特定特性，至少一个其他的分色镜添加到发射枪和/或接收枪中。

适应性调整了特性的第二分色镜添加到至少一个枪中使得有可能在距主光轴90°处添加另一个测量。根据本发明的原理因此可以通过在每一个接收和/或发射枪中添加几个分色镜来完成。因此可以进一步增大测量的多样性，并且借助可能包括更多的类别，粒子的分类可以更精确。

附图说明

参考附图，依据以下的说明，本发明的其他特性和优点会变得明显，附图示出其实施例的一个示例，其是非限制性的。在附图中：

-图1示出根据本发明的设备；

-图2示出针对无病理的血液样本，借助于根据本发明的设备获得的并以电阻率RES和消光EXT参数获得的细胞分类；

-图3示出针对包含成红细胞的血液样本，借助于根据本发明的设备获得的并以电阻率RES、消光EXT及荧光FL1=TO参数获得的细胞分类；

-图4示出针对包含嗜碱粒细胞的血液样本，借助于根据本发明的设备获得的并以电阻率RES、消光EXT、荧光FL1=TO及侧向散射SSC参数获得的细胞分类；

-图5示出针对包含未成熟粒细胞的血液样本，借助于根据本发明的设备获得的并以电阻率RES、消光EXT、荧光FL1=TO及侧向散射SSC参数获得的细胞分类；

-图6示出针对包含未成熟细胞的血液样本，借助于根据本发明的设备获得的并以电阻率RES、消光EXT、及荧光FL1=TO参数获得的细胞分类；

-图7示出借助于根据本发明的设备获得的淋巴性白血病情况下的细胞分类，其以电阻率RES、消光EXT、荧光FL1=TO及侧向散射SSC参数获得；图8a和8b示出使用电阻率RES、消光EXT、及荧光FL1=TO参数的骨髓增生异常综合症血液的情况下，借助于根据本发明的设备和现有技术设备获得的常见矩阵；

-图8c示出使用侧向散射测量SSC的新参数的单独借助于根据本发明的设备获得的矩阵；

-图9示出具有极低折射率的中性粒细胞的血液，这个附图通过消光测量EXT获得；

-图10示出血液，其中性粒细胞具有基于消光测量EXT区分的两个不同折射率；

-图11示出基于侧向散射测量SSC的具有低分裂中性粒细胞的血液的情况；以及

-图12示出基于侧向散射测量SSC的血液中未成熟细胞的淋巴细胞性表征。

具体实施方式

图1示意性地示出根据本发明的设备的结构和功能原理。光学设备包括聚焦喷嘴（未示出）、至少两个光源S1和S2，它们可以在测量室中合并或不合并，并能够在不同光谱区中发光。

两个光源之一S1具有弱时间相干性，在650nm的中心波长具有相干长度Lc<100μm。它定义出第一光轴。

根据以下说明的选定结构中的一个，第二光源S2位于距光源S1的光轴90°处，包括一个或多个单色光源，诸如通常用于三参数光学荧光检测的，表示为FL1、FL2和/或广角衍射SSC（也称为侧向散射）。光源S2有利地包括激光二极管，具有488nm的波长，允许在以噻唑橙标记的细胞上产生荧光现象。

测量室CUM位于两个光源S1和S2的光轴的相交处。

在一个有利实施例中，毛细管将细胞悬液引导到包括微孔的聚焦喷嘴中。二次流体确保通过测量孔的交叉点的细胞悬液的集中。这个孔用于实现使用电气方法的体积测量，通常是电阻率测量。恒定电流通过这个孔。当细胞通过这个孔时，通道的电阻率被改变，并在计数孔的端点（terminal）产生电压变化。这个电压与细胞的体积成比例。这个测量方法称为“Coulter原理”，本文中将不说明用于实现其的电子装置。

随后将细胞输送到光学分析窗口中，通过投射光强度分划线获得该光学分析窗口，光强度分划线在测量室CUM中尽可能地均匀。由粒子衍射、反射或吸收的光干扰光传播，这由根据本发明的设备来检测。

根据本发明的一个实施例，两个光学元件布置在光源S1的光轴上：发射枪CE位于光源S1与测量室CUM之间，接收枪CR位于测量室CUM与检测器D1之间。

测量室可以具有圆形横截面。然而，这产生了增大制造根据本发明的设备的成本的实质性光学校正。在一个有利实施例中，测量室是多边形的，具有至少四个侧面，其中至少两个侧面彼此平行。这两个平行的侧面定位为与光源S1的光轴垂直。第二光源S2的光轴垂直于测量室CUM的另一侧面。

第二光源S2的轴与第一光源S1的轴垂直的优选实施例有利地使用四侧面测量室。这实现了根据本发明的设备的极为简单且低成本的制造。实际上，在此情况下，有利于针对穿过室壁而进行的光学校正，且光轴的取向是最优的。

发射枪CE包括束成形光学装置OM。这些光学装置OM将分划线成像到由喷嘴喷射的并存在于测量室CUM中的样本流上。束成形光学装置OM使得光束在表示为CM的一部分路径上准直。

接收枪包括收集光学装置OC，用以收集朝向检测器D1的分划线的图像。除非无需消光测量，检测器D1都执行消光测量EXT。根据本发明，收集光学装置OC使得光束在表示为CC的一部分路径上准直。

束成形光学装置OM使得，在测量室CUM处，会聚光束的数值孔径等于ON1=n*sin u，其中，n是空气的光学指数（因此n=1），u是在到束成形光学装置OM的输入的半孔径角。

通常通过

型组件来获得照明的均匀性。

照明的原理引起光源S1在收集光学装置OC中的成像。这使得有可能首先在收集光学装置OC的光瞳中具有光源S1的单个图像，其次在分划线图像中获得光的均匀分布。

光源S1有利地是具有谐振腔的发光二极管。这些二极管的优点是在由要表征的细胞所吸收的波长处展现出明确确定的光谱。因此对于消光测量，由具有谐振腔的发光二极管构成了有利的使用，发光二极管具有以650nm波长为中心和40nm带宽的光谱峰。然而，已知的，这样的二极管在红色谱中发光，但在绿色谱中具有谐波。因此必需在发射枪CE中设置带通滤光片，以通过产生背景噪声来避免这一绿色分量干扰其他测量，例如荧光测量。有利地，接收枪包括相同的滤光片，以便仅考虑消光信号。

照明系统可以基于按照以申请人名义的公布文件WO2006/053960中所指示的光纤的使用。

通常，光具座的尺寸规划基于所需光学窗口的尺寸和计数细胞或测量室中的束角。分划线的图像通常是矩形形状，其维度由两个约束条件来设定。最大维度由鞘流体（sheathing fluid）的尺寸来确定，这一直径基本上是用于体积测量的孔的直径。因此将其固定为约100μm。最小维度确定测量的空间分辨率，其是辨别两个极接近的细胞的能力。理想上，这一维度必须尽可能小。由于生物粒子以速度v通过照射窗口，窗口的最小维度限定了细胞对光通量的曝光时间，因此电脉冲的持续时间对应于沿轴的物理消光和衍射现象。实际上，这一维度在30μm数量级上。注意，分析窗口的长宽比于是在3的数量级上。还应注意，接收光学装置的束的数值孔径等于照射束的数值孔径。这给出ON2=ON1。

有利地，当设备连同检测器D1运行于消光模式EXT时，照明束具有在1°与60°之间的角度开度，并相关于体积的范围、折射率范围和检查的粒子的胞质内分量来选择。其具有选定的中心波长。其在平行六面体测量体积a×b×c中还具有大于10%的照明均匀性，在此，a×b是束的矩形横截面，其长宽比a/b低于4，c是景深，定义为测量点周围的几何间隔，对于测量点的光焦度变化不大于10%。这个间隔的值通常在500μm+/-250μm范围中。

关于第二光源S2，将其轴定位为这一光轴与第一光源S1的轴相交是尤其有利的。实际上，最小相干光源S1的光轴与通常为光电二极管的光检测器D1的轴对准，光源S1以650nm附近为中心的波长发光，并通常用于消光测量。同时，用于荧光的消光和/或衍射的光源S2的光轴垂直于检测器D1和另一个光源S1的光轴。注意，光轴以90°直角的相交还允许获得所述的优点。

如果将检测器D1用于消光、荧光和衍射参数之一的测量是重要的，这一特性进一步允许检测器D1对于消光、荧光和衍射的良好性能。当检测器D1运行于消光模式，从而检测器D1测量消光参数EXT，确保了检测器D1朝向光源良好定位。因此针对亮背景进行检测。有利地，滤光片F1可以用于由光源S1发出的波长的光谱滤光。

当将检测器D1用于荧光测量时，通过设置通常为激光器的最相干光源S2，在细胞通过垂直于检测器D1的光路时，引发存在于细胞上或中的标记或染料的荧光，根据本发明的设备的架构允许针对暗背景进行测量。这在消光频带中执行荧光检测时非常重要的。在此情况下，在消光频带中执行FL2的检测，并且关断光源S1。以90°定位无论如何都具有对称地提供根据本发明的设备的优点。另外，这允许极为方便地实施。在此注意，在此情况下，检测器D1有利地具有可切换的可变增益，使其能够测量变化极大的光强度，如申请人的专利FR2933192中指出的。

根据本发明，设备包括相关于希望测量的参数来适当地选择的两个分色镜MR和ME。第一分色镜MR在使光束准直的点处插入接收枪CR中。第二分色镜ME以初始方式插入发射枪CE中，利用光的反向返回原理。

在本发明的优选实施例中，两个分色镜MR和ME是相同的。它们使波长的总反射等于或长于以90°定位的光源或多个光源的波长中最短的，并短于第一光源S1的波长。由此限制了根据本发明的设备的制造成本。在所述示例中，这些分色镜MR和ME因此允许由第一光源S1发出的98%的红色分量通过，并反射荧光FL1的蓝色和绿色分量。

分色镜MR和ME有利地允许表示为SSC的广角衍射分量和/或由光源S2发出的光与被观测的细胞之间的相互作用而引起的荧光分量的分离。这样，这个光学组件特别允许细胞群体，例如整个血液样本中有核细胞的8个群体的容易分离，因为它在单个设备内提供了参数测量的迄今未知的多样性。

根据本发明，光学组件比现有技术设备简单。使用光的反向返回原理允许添加广角衍射测量或荧光测量，无需修改设备的总体结构，而是仅通过增加分色镜。

为了执行这些测量，启动光源S2。通过会聚透镜L2将光源S2发出的光聚焦在与消光测量的平面垂直平面中。由于在前给出的原因，在测量点获得的图像是椭圆形的，其尺寸约为100μm×30μm。由于光源S2是激光二极管，并因此具有椭圆束，预先选择具有1/3的输出率，不必如本领域技术人员公知的插入通常是非常昂贵的光学系统来对束成形。

由光源S2发出的光与细胞之间的相互作用而发出的光遵循发射枪中的反向路径。由设置在发射枪中的分色镜ME将衍射分量与消光分量分离。由设置在接收枪中的分色镜MR将由荧光发出的光与消光分量分离。

根据光的反向返回原理，发射枪CE的束成形光学装置OM收集广角衍射光SSC。插入束成形光学装置OM中的分色镜ME允许将这个分量从消光轴90°反射至检测器D3。

由于荧光是各向同性的，即它在空间中所有方向上均匀地发射光线，以光源S2的波长为中心的表示为F3的带通滤光片允许从检测器D3执行的广角衍射测量SSC中去除掉荧光分量。滤光片F3有利地是以488nm为中心的带通滤光片，对荧光分量具有10-6的阻挡。束成形光学装置OM、滤光片F3与检测器D3的关联允许执行广角衍射测量SSC。有利地，将表示为OE的附加的光学装置设置在分色镜ME之后，这一镜子与检测器D3之间。这些光学装置OE允许将来自分色镜ME的衍射束聚焦到检测器D3上。

荧光FL1由接收枪CR的收集光学装置OC收集。插入收集光学装置OC中的分色镜MR允许将这个分量从光源S1的光轴90°反射至检测器D2。为了分离衍射分量，将以FL1的预期荧光峰为中心的带通滤光片F2插入分色镜MR与检测器D2之间的光路中。有利地，滤光片F2是以530nm为中心的带通滤光片，其与双陷波滤光片相关联，其借助10-8的阻挡去除衍射分量，衍射分量比以噻唑橙标记的荧光分量和第一光源S1发出的红色分量平均大1,000倍。收集光学装置OC、滤光片F2与检测器D2的关联允许执行表示为FL1的荧光测量。有利地，将表示为OR的附加的光学装置设置在分色镜MR之后，这一镜子与检测器D2之间。这一光学装置OR允许将分色镜MR发出的荧光束聚焦到检测器D2上。

根据本发明的组件的结构使得荧光FL1和广角衍射SSC由同样打算用于消光测量EXT的一部分光学装置收集。借助这一方案，获得最优的集成水平，这是本发明的特点。因此制造成本的降低和实现的便利性是本发明的主要优点。

利用这样的设备，以四个参数，即电阻率、消光、荧光和广角衍射测量来测量每一个细胞。

根据本发明的设备因此包括与提供分划线图像的波长滤光的滤光片F1相关联的光学装置OC；光学装置OE，其与以光源S2的波长为中心的带通滤光片F3相关联，收集由光源S2发出的光与观测的细胞之间的相互作用而产生的广角衍射SSC；光学装置OR；带通滤光片F2，其以荧光峰为中心并收集由光源S2发出的光与细胞之间的相互作用而产生的荧光；两个分色镜MR和ME，允许首先分离衍射和消光分量，其次分离荧光和消光分量；以及最后的三个检测器D1、D2和D3，它们是三个光电二极管或优选地分别是两个光电二极管和一个可变增益雪崩光电二极管。

传统上，基于其光谱特性来分离荧光和衍射光。为此，通常使用多介质类型的干涉滤光片F1、F2、F3，即通过交替布置具有不同折射率的两个或多个透明材料而获得的滤光片。有利地，它们是离子轰击滤光片，其提供极好的带外阻挡和极好的透射。根据所需的测量，将这些滤光片F1、F2、F3安装在测量室CUM与检测器D1、D2、D3之间的光路上。可以与预期的荧光波长和所实现的照明波长相关联地使用多个滤光片。

因此，通过选择提取最相关的参数调节根据本发明的设备，以用于预期的应用：白细胞的计数和辨别、包含在样本中的细胞群体的某些特定特性的免疫表型或检测等等。实际上，消光很大程度上导致细胞折射/衍射现象的介入。如果使用噻唑橙，则荧光表征每一个细胞的RNA含量。最终，广角衍射SSC反映了细胞分叶性（lobularity）。这组测量允许获得足够量的可靠数据，给出了对被检查细胞群体灵敏且特定的结果。

调节可以包括例如：

·用于有核细胞的8个群体的计数和辨别的电阻率RES、消光EXT、广角衍射SSC和荧光FL1；

·用于例如以荧光证明的某些特性的检测的电阻率RES、消光EXT、两个荧光FL1和FL2；

·应用于免疫表型的电阻率RES、消光EXT或一个荧光FL2、广角衍射SSC和荧光FL1。

当以第二荧光FL2代替广角测量SSC时，由以荧光FL2的发射峰为中心的相同类型的滤光片来代替以光源S2的波长为中心的带通滤光片。注意，由S1和S2发出的束必须在测量点合并。仅在此情况下，使用由用于荧光测量的两个单色光源S2和S3发出的荧光FL1和FL2的测量的时间偏移才是明智的，后一光源S3设置在与光源S2相同的位置处。可以在位于发射枪CE一侧的检测器D3上执行第二荧光的测量，或者可以在同样用于消光测量的D1上执行。在此情况下，检测器D1具有可切换的增益，以便能够测量极为不同数量级量值的强度。

第二荧光有利地是CD45型的白细胞标记物上的荧光。这一标记物具有引起665nm左右的荧光的特点，其对应于形成第一光源S1的二极管的带宽。利用这一荧光，有可能避免必须改变朝向检测器D1的光路上的滤光片。实际上，为了得到检测器D1上的荧光测量，当以CD45标记时唯一的任务是关断第一光源S1。于是以切换到雪崩模式的检测器D1进行该第二荧光的测量。

在另一个配置中，可以由以荧光峰FL2为中心的相同类型的滤光片来代替带通滤光片F3。在此情况下，增加同样位于距光源S1的轴90°的第二单色光源实现了第二荧光的测量。注意，正是在此情况下，对于荧光测量优选的是时间偏移，以避免本领域技术人员已知的补偿现象。

在某些应用中，可以通过在激光器的轴中设置检测器来增加测量小角衍射（也称为前向散射FSC）的第五个参数。注意，这个检测器可以用于触发光学测量。电阻率测量于是有利地与此相关联，以获得除了绝对计数以外的体积数据。这些参数还允许使用相同设备来表征血小板（血液中的最小组成部分）。

前述设备用于成红细胞和7个白细胞群体，即淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱粒细胞、未成熟粒细胞、和未成熟细胞，的识别和表征。

用于分析生物流体的这一设备连接到接收装置，以接收对应于n=4个物理参数的测量数据：电阻率高度RES、高度SSC、消光高度EXT和高度FL1。有利地，用于噻唑橙的荧光参数FL1=TO对应于以噻唑橙标记之后的荧光。在其基本形式中，试剂“Fluowhite”（专利FR2821428的主题，由Horiba Médical制造）允许在以噻唑橙保存并标记包含在全部血液中的所有有核细胞的同时血红细胞的总裂解。这n个参数定义一个事件。

每一个事件随后分类到以上提出的8个细胞群体之一。观察手段是矩阵，即正交空间，每一个正交空间使用两个测量参数。

允许这一观察的四个常用矩阵通常为：RES×EXT、SSC×FL1、EXT×FL1和EXT×SSC。

在血液未表现出任何病理的情况下，测量RES和EXT足以用于淋巴细胞L、单核细胞M、中性粒细胞N和嗜曙红细胞E群体的完全识别。

图2示出用于未表现出任何病理的血液的细胞分类。

然而，这些测量不允许嗜碱粒细胞、成红细胞、未成熟粒细胞、和未成熟细胞的识别。由于这些群体常常与特定病理有关，能够识别这些并获得可能的最准确计数是重要的。

根据本发明的设备允许借助本发明允许的荧光测量FL1来准确识别成红细胞。成红细胞可以显示与淋巴细胞相同的电阻率高度、相同的消光高度和相同的SSC高度。然而，在以专用于核酸的噻唑橙培养样本之后，成红细胞具有弱于淋巴细胞的荧光响应。因此，荧光FL1的测量对于成红细胞的正确识别是重要的。图3示出对于包含由环绕的黑点ERB表示的成红细胞的血液的这一优势。在此注意并且对于本说明的剩余部分，仅有一些环绕的区域中所见的点表示识别的群体，这些是黑点。区域的环绕仅出于绘图的原因。

在以噻唑橙培养样本后，本设备允许借助荧光测量FL1和广角衍射测量SSC来精确识别嗜碱粒细胞。嗜碱粒细胞在RES×EXT矩阵中具有高散射位置，并且易于与淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞混淆。因此，在存在嗜碱粒细胞的情况下，单独借助测量RES和EXT识别这些群体是不可能的。另一方面，嗜碱粒细胞在图4所示的SSC×FL1矩阵中是易于识别的。嗜碱粒细胞由环绕的黑点BAS表示。

本设备允许借助矩阵EXT×FL1来精确识别未成熟粒细胞。同样利用噻唑橙，荧光测量FL1允许确定粒细胞、中性粒细胞、或未成熟粒细胞的成熟度。未成熟粒细胞可以具有与单核细胞相同的电阻率高度SSC和FL1。因此，为了完美识别，需要消光EXT和荧光FL1测量。矩阵SSC×FL1的辨别力较差；然而，它用于中性粒细胞和未成熟粒细胞的粒化障碍的情况下。

图5示出对于血液样本包含由环绕的黑点IG表示的未成熟粒细胞情况下的这一优势。

根据本发明的设备允许借助同样使用噻唑橙的荧光测量来精确识别未成熟细胞。由于未成熟细胞包含比成熟细胞更多的RNA，它们给出了更高的荧光响应。图6示出这一优势。可以见到，与在图（ABS,RES）中相比，在图（SSC,TO）中可以更好地辨别在环绕的微粒CIM中计数的由黑点表示的未成熟细胞。但两个附图结合在一起允许良好的区分。

本设备进一步允许借助测量SSC在淋巴病理情况下精确识别未成熟细胞。淋巴母细胞具有与单核细胞相同的电阻率、消光和FL1高度。因此，为了其精确识别，需要额外的测量SSC。图7示出在淋巴性白血病情况下的这一优势。淋巴母细胞在此由环绕的黑点CIM-L表示。

本设备有利地允许正常血液样本和病理血液样本中的7个白细胞群体和成红细胞的识别。另外，它还示出其对于成熟细胞上经常遭遇的病理的优越性。

图8a和8b示出在骨髓增生异常综合征血液样本中对于电阻率RES、消光EXT、荧光FL1=TO的参数使用根据本发明的设备和现有技术设备所获得的常见矩阵。在这些矩阵中，不可能识别脱粒的中性粒细胞NDG，其与单核细胞和淋巴细胞融合在一起。相反，图8c示出使用广角衍射SSC的新测量参数，仅以根据本发明的设备所获得的矩阵，其允许识别脱粒的中性粒细胞NDG。

根据本发明的设备进一步允许借助消光测量EXT来表征中性粒细胞的粒化。粒化的存在增大了消光高度EXT，这是中性粒细胞和嗜曙红细胞具有比没有粒化的淋巴细胞和单核细胞更高的消光EXT的原因。因此，有可能定义粒化指数。将其计算为中性粒细胞的折射率的平均值。图9示出血液样本，其中由环绕的黑点NEU表示的中性粒细胞具有极低的折射率。

根据本发明的设备还允许包含正常中性粒细胞的群体和脱粒的中性粒细胞的群体的血液样本的“报警”。这转化为具有两个不同折射率的中性粒细胞的存在。这可以通过使用消光测量EXT来检测。图10示出血液样本，由环绕的黑点NEU和NDG表示的其中性粒细胞具有两个不同的折射率。

根据本发明的设备允许借助测量SSC来表征中性粒细胞分叶性，测量SSC对细胞的内部结构非常敏感，因此反映了细胞核的形状。这样，核叶（nucleus lobe）的数量越高，SSC高度就越高，反之亦然。因此，可以将分叶性指数定义为中性粒细胞的SSC高度的平均值。图11示出具有由环绕的黑点NHY表示的分叶障碍的中性粒细胞的血液样本的情况。

根据本发明的设备允许借助测量SSC表征未成熟细胞的类型。未成熟细胞的SSC平均值越小，它们越有可能是淋巴母细胞。淋巴母细胞的SSC平均值在245的范围，对于单核细胞，约为644，对于HRC（高RNA含量）约为322。图12示出血液样本中未示出细胞的淋巴母细胞表征。淋巴母细胞由环绕的黑点LYM表示。

注意，本设备还可以允许发现不同形状和尺寸的红细胞。因此例如有可能发现具有内含物的红细胞、镰状细胞等。为此，根据本发明的设备包括在不同照明波长进行的两个荧光测量。随后使用特定的滤光片。

借助临床生物学的流式细胞测量法（FCM）的免疫表型的优点涉及许多领域，具体为：

·血液、骨髓、不同器官中正常群体的描述；

·白血球变异的抗原的分析；

·细胞出生、寿命和死亡的研究；

·细胞信号传输和不同细胞功能的机制的描述；

·免疫病理学课题的研究：免疫缺陷的诊断和监控，自身免疫性疾病的诊断和监控，移植和移植体的免疫学，淋巴增殖性疾病、超敏反应；

·对多种血液疾病的诊断的贡献；以及

·在癌学领域中针对肿瘤的受体反应和免疫疗法跟进的评价。

借助与核酸的研究有关的细胞抗原、细胞周期和倍数性的流式细胞测量法的可能的识别已经在多种疾病的病理生理学机制的研究中取得了很大的进展。

在将根据本发明的设备应用于免疫表型的情况下，允许检测消光的光电二极管由雪崩光电二极管代替，雪崩光电二极管连接到能够抑制内部雪崩增益的极化电路。借助这个实现方式，有可能将雪崩光电二极管的性能缩减到常规单一增益光电二极管的性能，例如通常用于消光测量EXT的。如果没有增益抑制，在以高光强度用于消光测量的情况下雪崩光电二极管将饱和。在申请人的专利FR2933192中说明了这个方法。

最后，应指出，多个实施例可以使用根据本发明的原理。具体地，可以将其它分色镜串联安装在根据本发明的设备的接收枪和发射枪中，用以将源自测量室的光束偏转朝向进行其它测量的检测器。所有分色镜于是将不同，以便将光流量的分量引导向每一个检测器。这个实施例进一步增加了可得到的测量的数量，但是缺点在于由于需要使用的镜子的多样性和精度，实现成本较高。还应注意，使用具有比所述示例更高数量的侧面的测量室，例如6或8个侧面，将允许增加遵守根据本发明的原理的测量。

Claims (7)

1.一种用于微粒子的表征的电光流式测量设备，包括：要表征的流体的流在其中循环的测量室（CUM）、不相交光谱的至少两个光源（S1、S2）、用于测量电阻率（RES）的设备、以及均允许光学参数的测量的至少三个其他检测器（D1、D2、D3），所述光学参数选自荧光（FL）、消光（EXT）、广角衍射（SSC）、以及小角衍射（FSC），

所述电光设备的特征在于：

-第一光源（S1），最小相干并具有最长波长，限定出与粒子的所述流垂直的主光轴，所述主光轴具有位于所述室的任一侧的两个光学组件，一个光学组件是使由所述第一光源（S1）发射的束成形的发射枪（CE），另一光学组件是收集由所述第一光源（S1）发射的信号且位于所述测量室（CUM）之后的接收枪（CR）；

-第二光源（S2），最大相干并具有最短波长，限定出与所述主光轴相交并且垂直于粒子的所述流的副光轴；

-第一检测器（D1），面对所述第一光源（S1）布置在所述接收枪（CR）的末端，并因此具有光场操作；

-所述接收枪（CR）包括收集光学装置（OC），收集由所述第一光源（S1）与所述流中的粒子之间的相互作用而朝向所述第一检测器（D1）发出的束，这些收集光学装置（OC）使得在其部分路径（CC）上，所传送的光束基本上是准直束；

-第一分色镜（MR），布置在所述接收枪（CR）中的光束被基本准直的所述部分路径处，从而将由所述第二光源（S2）与所述流中的粒子之间的相互作用而发出的光束部分反射向第二检测器（D2），所述第二检测器布置在被部分反射的束的路径上；

-所述发射枪（CE）包括束成形光学装置（OM），用以使由所述第一光源（S1）发射的束成形，这些束成形光学装置（OM）使得在其部分路径（CM）上，光束基本上是准直束；以及

-第二分色镜（ME），布置在所述第一光源（S1）与所述室（CUM）之间的发射枪（CE）中的光束被基本准直的所述部分光路（CM）处，以便将由所述第二光源（S2）与所述流中的粒子之间的相互作用而发出的束部分反射向第三检测器（D3），所述第三检测器布置在被部分反射的束的路径上。

2.根据权利要求1所述的设备，特征在于：衍射/散射检测器面对所述第二光源（S2）布置在所述测量室（CUM）的另一侧。

3.根据前述权利要求中的一项所述的设备，特征在于：所述第一检测器（D1）具有可切换的增益，使得其能够执行两类测量，一个是消光测量（EXT），另一个选自衍射（SSC、FSC）和荧光（FL）。

4.根据前述权利要求中的一项所述的设备，特征在于：所述第一检测器（D1）执行消光测量（EXT），所述第二检测器（D2）执行广角衍射测量（SSC），而所述第三检测器（D3）执行荧光测量（FL1）。

5.根据权利要求1至3中的一项所述的设备，特征在于：所述第一检测器（D1）执行消光测量（EXT），所述第二检测器（D2）执行荧光测量（FL2），而所述第三检测器（D3）执行荧光测量（FL1）。

6.根据前述权利要求中的一项所述的设备，特征在于：两个分色镜（MR、ME）具有相同的光学特性，产生比所述第二光源（S2）的波长长且比所述第一光源（S1）的波长短的波长的全反射。

7.根据前述权利要求中的一项所述的设备，特征在于：至少一个其他分色镜添加到所述发射枪（CE）和/或接收枪（CR）中。

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