CN108139309B - 用于光学地测量颗粒的稳定性和聚集的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于光学地测量液态的样品中的颗粒的至少稳定性和聚集的方法，所述样品处于样品容器中，其中所述方法具有下述步骤：用至少一个第一波长的光辐照所波长时述样品，以便荧光性地激发所述颗粒；用至少一个第二波长(20)的光辐照所述样品(10)，以便检验所述颗粒的分散；测量由所述样品(10)发射的荧光性光；以及在所述第二波长时测量消减光(22)，其中射入的、所述第二波长(20)的光穿过所述样品容器(30)，向回反射，沿着相反方向再次穿过所述样品容器并且作为消减光离开，其中基于所测量的荧光性光确定所述稳定性而基于所测量的消减光确定所述聚集。此外，本发明涉及一种相应的设备。

Description

用于光学地测量颗粒的稳定性和聚集的系统和方法

技术领域

本发明大体上涉及用于光学地测量颗粒的稳定性的设备或系统和方法。尤其是，本发明涉及一种系统和一种方法，借助于其不仅能够光学地测量颗粒的稳定性，而且能够光学地测量颗粒的聚集。根据本发明，优选能够借助于唯一的设备优选同时或几乎同时测量颗粒的稳定性和聚集。

背景技术

因为有效成分，例如抗体，已经被开发为，使得它们仅在其自然的形式中是有效的，所以变性的有效成分常常是不起作用的并且要避免。变性表示生物分子的结构改变，例如在蛋白质(蛋白)中，所述变性在大多数情况下伴随有这些分子的生物功能的丧失。变性要么可以归因于物理影响要么可以归因于化学影响。因此必须开发有效物质配方，所述有效物质配方防止药物变性，也就是说，例如使这些药物在热学上、在化学上和/或在时间上稳定。

有效物质的聚集或聚合会导致无效。此外，聚集的和/或变性的颗粒，例如聚集的抗体，会在身体中引发免疫系统的反应，并因此必须在药物中避免或将其在药物中的份额降低到最小。

颗粒的变性，例如抗体的变性，本身要避免，因为它们降低有效性。颗粒的聚集，例如抗体的聚集，本身要避免，因为它们引起免疫系统的反应并且也会导致有效性降低。

通常不清楚颗粒为什么聚集和/或变性：因为颗粒变性，也就是说，不以其自然的形式存在，所以颗粒聚集吗？或者颗粒在其自然的形式中聚集并且随后变性吗？因此，为了全面地表征颗粒，彼此分开地仅分析聚集或仅分析变性通常是不够的。

借助于根据本发明的系统和方法，不仅能够测量颗粒的变性而且能够测量颗粒的聚集。尤其是，能够借助于根据本发明的系统和方法近似同时(基本上同时)或者同时不仅测量颗粒的变性而且测量颗粒的聚集。

颗粒的变性是“颗粒内部的”过程并且能够在根据本发明的方法和系统中借助于测量固有颗粒来测量荧光(例如色氨酸荧光、络氨酸荧光)。同时，颗粒的聚集，即改变颗粒大小的“颗粒内部的”过程，能够借助于未被吸收的光的散射来测量。

因为光散射例如静态的光散射在瑞利散射的情况中与颗粒大小(半径)的六次方相关，所以所述光散射非常好地适合于测量颗粒的大小变化和从而测量颗粒的聚集。该光散射法是已知的并且被许多仪器和方法使用。尤其是，从现有技术中已知的仪器在特定的空间角下测量颗粒的散射光，即光的如下份额，所述份额被颗粒在特定的空间角下相对于入射光散射。颗粒越大并且波长越小，那么针对固定的、适当选择的角，该散射光的强度就越大(例如参见http://www.lsinstruments.ch/technology/static_light_scattering_sls/)。这种方法例如在申请US 2014/0234865A1中描述。

经由散射光的增加，例如在提高温度期间，该方法因此能够推断出颗粒的大小改变和从而推断出颗粒的聚集。对于光散射法领域的技术人员而言，已经意识到：应当避免射到待检验的颗粒上的激发光进入检测光学装置中。技术人员始终将相应的设备设计为，使得避免该激发光的直接检测或阻挡激发光，这需要极大的技术耗费。例如在专利DE 102007 031 244中所描述的：在散射光测量时反射是所不期望的并且在玻璃比色皿处的反射也会导致问题。

因此，存在对改进的或者替选的如下系统或改进的或替选的如下方法的需求，所述系统或方法用于测量颗粒的稳定性和聚集。

发明内容

根据本发明的设备以及根据本发明的方法通过实施例的特征限定。有利的设计方案从实施例中得出。

本发明涉及一种用于光学地测量或确定液态样本中的颗粒的稳定性和/或聚集的方法，所述样本处于样本容器中。根据本发明，能够与稳定性无关地测量所述聚集；然而优选地，不仅确定聚集而且确定稳定性。根据本发明的方法包括下述步骤中的至少一个：

借助于第一波长的光或光射束辐照样本，尤其以便荧光性地激发颗粒。第一波长的光由此是荧光激发光。为了确定样本的荧光，测量由样本发射的荧光性光。通常，荧光性光的波长与荧光激发光的第一波长不同。基于所测量的荧光性光的亮度或强度，能够说明颗粒的稳定性。优选地，检测器借助于波长范围从260nm至300nm、更优选波长范围从270nm至290nm的荧光激发光测量荧光并且测量波长范围从320nm至380nm的荧光发射光。

通过如下方式确定颗粒的聚集：借助于第二波长的光辐照样品，优选光具有第一强度I₀。根据本发明，第一波长或第二波长可以对应于精确的波长，如例如由激光器所提供的波长。但是，根据本发明，第一波长和第二波长的术语也可以是“中间的”波长或“中央的”波长，也就是说，就波长范围而言。例如，如果光源不是激光器，那么从光源发射出波长范围。根据本发明，优选使用LED，所述LED在窄的或者大的波长范围上发射光。为了对波长的范围限界，优选将带通滤波器＝“激发滤波器”装入射束路径中。相应的带通滤波器例如可以具有在30nm和1nm之间的带通宽度，以便获得所期望的激发波长范围。这尤其在荧光中是优选的，使得由LED发射的光被限制到如下波长范围，所述波长范围不位于荧光发射检测的波长范围中。此外，也优选的是，使用LED来进行消光测量。在此也能够类似地使用具有适当的带通宽度的带通滤波器，以便将被发射到样品上的波长范围限制到“第二波长”(第二波长范围)上。

借助于第二波长优选确定颗粒的分散。根据本发明，在第二波长时测量消减光，其中穿过样品容器的第二波长的被射入的或入射的光I₀与优选同样在第二波长时出射的光I(强度I)的比描述消光。优选地，入射的辐射I₀穿过样品容器，被反射，基本上与入射方向相反地穿过样品容器并且随后作为光I出射，所述光就本发明而言也称为消减光。基于出射的光(消减光)的所测量的亮度或强度I，尤其与入射光I₀的强度成有关地，可以说明颗粒的稳定性。根据本发明，纯粹的聚合测量即使在没有上文中所提到的荧光测量的情况下也能够执行。

优选地，第二波长被选择为，使得样品中的待检验的颗粒在该波长时不被吸收或者仅非常轻微地被吸收，优选小于10％，更优选小于5％，更优选小于4％、3％、2％或者1％。更优选小于0.1％。此外，优选的是，波长关于颗粒的吸收特性来选择，而不是关于整个“样品”或“样品液体”来选择，因为在样品或样品液体中可能存在添加物，所述添加物在所选择的液体中吸收。然而，因为本发明检验颗粒的稳定性和聚集，所以其余成分的吸收特性被认为是“恒定的”。

例如，从蛋白质中已知，蛋白质吸收在200nm至300nm的范围中的光，更确切地说，由于其肽键(在大约220nm中吸收最大)和其氨基酸(在大约280nm中吸收最大)。因此，根据本发明，优选使用波长大于300nm的光(参见图16)。优选地，第一波长和第二波长是不同的。替选地，第一波长和第二波长也可以是相同的。

对于荧光测量而言，使用至少一个第一波长。根据本发明也可行的是，除了第一波长之外，还使用另一波长用于荧光测量。因此，例如能够在280nm的波长中激发第一荧光而在632nm处在第二荧光通道中激发第二荧光。

相应地，根据本发明也能够使用至少一个第二波长来测量消光。消光例如能够在两个不同的波长时测量，例如在385nm和532nm处测量。于是例如可行的是，在这两个波长时形成和评估测量值的比，以便例如量化米氏散射。

换言之，根据本发明可行的是，使用两个或者更多个荧光通道和/或两个或更多个消光通道来进行确定。本发明的优选的实施方式或本发明的优选的特征组合在下述示例性的方面中予以描述：

1a.用于光学地测量液体样品中的颗粒、配位体和/或颗粒配位体复合物的尤其稳定性和/或聚集的方法，所述颗粒、配位体和/或颗粒配位体复合物处于样品容器中。优选地，样品容器设置在反射性的表面上，其中样品容器与表面至少部分地接触。

1b.根据上述方面中任一项所述的方法，优选包括下述步骤：借助于具有至少一个第一波长或至少一个第一波长范围的光辐照样品，以便荧光性地激发颗粒。

1c.根据上述方面中任一项所述的方法，优选包括下述步骤：借助于具有至少一个第二波长或至少一个第二波长范围的光辐照样品，以便检验颗粒的分散和/或配位体键合。

1d.根据上述方面中任一项所述的方法，优选包括下述步骤：测量由样品发射的荧光性光。

1e.根据上述方面中任一项所述的方法，优选包括下述步骤：在至少一个第二波长时或在至少一个第二波长范围中测量消减光。

1f.根据上述方面中任一项所述的方法，

其中被射入的至少一个第二波长或至少一个第二波长范围的光射入到样品容器中，使得所述光至少部分地穿过样品容器，从表面处向回反射，基本上沿着相反方向再次至少部分地穿过样品容器并且作为消减光出射。

1g.根据上述方面中任一项所述的方法，优选包括下述步骤：

基于所测量的荧光性光确定稳定性和/或基于所测量的消减光确定聚集和/或配位体键合。

2.根据方面1所述的方法，其中荧光性光和消减光借助于共同的光学系统来测量。

3.根据方面1或2所述的方法，其中并非同时借助于第一波长和第二波长辐照样品；或者持久地借助于第二波长进行辐照，而借助于第一波长的辐照间歇性地，优选周期地进行。

4.根据上述方面中任一项所述的方法，其中荧光性光和消减光顺序地、近似同时被测量和/或发射。近似同时优选是在至多4m、2ms或者1ms内。例如，第一波长的光可以仅接通1ms并且接着第二波长的光接通1ms，使得近似同时是在2ms之内。根据本发明，同时是优选的。同时测量例如能够借助于图8的配置来实现。同时测量尤其具有效率更高或性能更高的优点。因此，借助于图8的配置实现在测量聚集时例如为在图7中大约5倍的性能。

5.根据上述方面中任一项所述的方法，其中消减光和荧光性光由共同的检测器测量(例如参见图6)，消减光由第一检测器和/或第二检测器测量，并且第一荧光波长的荧光性光由第一检测器测量而第二荧光波长的荧光性光由第二检测器(51)测量(例如参见图7)；或者消减光由第一检测器测量，第一荧光波长的荧光性光由第二检测器测量并且第二荧光波长的荧光性光由第三检测器测量(例如参见图8)。

6.根据上述方面中任一项所述的方法，其中样品容器是毛细管。

7.根据上述方面中任一项所述的方法，其中样品容器被调温，优选靠置于调温元件上并且通过接触来调温，其中调温元件优选具有反射性的表面并且第二波长的被射入的光优选向回反射，沿着相反方向再次穿过样品容器(30)并且作为消减光出射。

8.根据方案7所述的方法，其中所述调温元件由具有小的固有荧光性的材料制造。优选地，所述材料具有小于最大荧光信号的5％、3％，更优选小于其1％，更优选小于其0.5％的固有荧光性。换言之，例如如果激发LED以最大功率发射光并且荧光检测器已经测量到最大100个信号(在所述荧光检测器进入饱和之前)，那么仅允许强度1的信号追溯到自发荧光的材料；所述信号于是可能是1％。此外有利的是，材料在第二波长的波长范围中具有高的反射率，优选>30％，优选>40％，更优选>50％。优选地，所述材料包含硅或者由纯硅构成。

根据另一优选的实施方式，表面具有至少一个留空部，例如呈沟道、槽或者微槽的形式，所述留空部在调温元件的表面的至少一个区域上延伸，毛细管在测量期间位于所述留空部上。优选地，毛细管在测量期间与调温元件的表面直接接触，而毛细管由于槽的深度位于槽上方并且不与槽底部直接接触。槽的宽优选在1mm至10mm之间，更优选在2mm至8mm之间，更优选在3mm至7mm之间，更优选为大约3mm，其中根据本发明的光向回反射优选在毛细管的如下部段中产生或测量，所述部段位于槽上方。优选地，槽具有大约10μm至30μm的深度。尤其是，槽具有大于所使用的光的半个相干长度的深度，以便进一步抑制向回散射中的干涉作用。因此，所使用的LED优选具有相干波长在大约15μm的范围中的光源，使得槽的深度优选>7.5μm。

为了确保光从槽的底部有效向回反射，槽优选被刻蚀。优选地，槽或槽底部具有中等的粗糙度，所述粗糙度优选在小于纳米范围的范围中，例如±5nm，更优选±1nm。根据一个优选的实施方式，槽能够在表面的主要部分上延伸，使得例如多个毛细管能够设置在槽上方。根据另一优选的实施方式，槽并不延伸至表面的边缘，使得围绕槽的硅具有均匀的厚度并且可更容易地加工，例如通过切割或者锯割来加工。

9.根据上述方面中任一项所述的方法，其中样品容器在测量周期期间相对于第一波长和/或第二波长的所射入的光和/或相对于检测器移动，优选多次(连续)往返移动，并且更优选更多个样品容器或更多个毛细管通过这种相对运动来扫描。

10.根据方面9所述的方法，其中通过如下方式确定荧光值：关于移动对荧光性光的强度进行积分，和/或通过关于移动对消减光的强度进行积分的方式确定消光值。

11.根据上述方面中任一项所述的方法，其中在用于确定热稳定性的测量周期期间改变样品的温度，优选提高样品的温度；为了确定化学稳定性，不同的液态样品中的变性剂的浓度不同地选择；和/或为了确定时间稳定性，样品在大于1小时的时间段内基本上保持在恒定的温度中。

12.根据方面11所述的方法，其中在测量周期期间更多个样品容器和/或光学系统多次连续往返移动，并且荧光性光和/或消减光的测量在所述运动期间进行。

13.根据上述方面中任一项所述的方法，其中第二波长被选择为，使得由样品或样品中的颗粒吸收小于1％、0.1％、0.05％，优选小于0.1％，以至于对消减光的测量是第二波长的光的散射的直接量度。

14.根据上述方面中任一项所述的方法，其中第一波长和第二波长的光合并为共线射束，所述共线射束射入到样品容器中。

15.根据上述方面中任一项所述的方法，其中第二波长的消减光与入射光偏差至多5°，优选小于2°，更优选小于1°，所述消减光向回反射并且沿着与入射方向相反的方向从样品容器中出射。

16.a尤其根据上述方面中任一项所述的用于光学测量，尤其光学测量液态样品中的颗粒和/或配位体和/或颗粒配位体复合物的稳定性和/或聚集的设备，所述液态样品处于样品容器中。

16.b根据上述方面中任一项所述的设备，其中所述设备具有至少一个用于将具有至少一个第一波长的光入射到样品容器中的第一光源，尤其用于荧光性地激发待检验的颗粒。

16.c根据上述方面中任一项所述的设备，其中所述设备具有至少一个用于将具有至少一个第二波长的光入射到样品容器中的第二光源，尤其用于测量散射或颗粒的聚集和/或配位体键合。

16.d根据上述方面中任一项所述的设备，其中所述设备具有至少一个第一检测器，所述第一检测器用于测量由样品放射的被激发的荧光性光。

16.e根据上述方面中任一项所述的设备，其中所述设备具有至少一个第二检测器，所述第二检测器用于测量在至少一个第二波长时的消减光，其中第二波长的所射入的光穿过样品容器，向回反射，沿着相反方向再次穿过样品容器并且作为消减光出射。

16.d根据上述方面中任一项所述的设备，其中所述设备具有评估装置，所述评估装置基于所测量的荧光性光确定颗粒的稳定性并且基于所测量的消减光确定颗粒的聚集和/或配位体键合。优选地，所述设备具有第一带通滤波器和/或第二带通滤波器，以便将第一光源或第二光源的被发射的光限制到第一波长或第二波长上。优选地，带通滤波器具有10nm、20nm或者30nm的带通宽度。

优选地，所述设备具有调温元件，所述调温元件具有反射性的表面，在所述表面上，第二波长的所射入的光向回反射。例如已经证明，硅是特别优选的，因为硅具有优选的反射特性并且适合于经由接触来调温。此外优选的是，所述设备设立用于在所述表面上设置至少一个样品容器以进行测量。例如，多个样品容器能够以可单独设置的毛细管形式或借助载体设置在表面上，所述载体包括多个毛细管。优选地，在调温元件的表面中构成有至少一个槽，其中样品容器能够在槽的上方设置为，使得第二波长的所射入的光优选至少从槽的底部向回反射。槽例如能够构成有在1mm至10mm之间的宽度和大于第二波长的光的半个相干长度的深度。

17.根据方面16所述的设备的应用，所述应用用于执行根据方面1至15中任一项所述的方法。

根据本发明的方法或根据本发明的系统相对于经典的光散射测量遵循完全不同的方法途径。根据本发明，优选测量如下光，所述光未被散射。优选地，此外使用如下波长的光，所述波长不被颗粒吸收。也就是说，如果散射因颗粒大小的提高而增加，那么所测量的信号减小。这种根据本发明的测量技术优选与具体的荧光光学装置组合，所述荧光光学装置优选以高的生产率实现更快地、更精确地并且更稳健地同时(通过消光)检测聚集并且(通过荧光)检测变性或蛋白质折叠。

根据本发明的方法优选实施为，使得用于聚集测量的激发光两次穿过样品容器并且向回反射到检测器中(参见图1)。根据本发明也可行的是，用于聚集测量的激发光仅横越样品容器一次并且随后测量单向透射。直接的透射和反射后的透射意味着：测量激发光的“残余份额”，也就是说，恰好是在已知的方法中无论如何应当避免的。

原则上，根据本发明测量消光(例如参见https://de.wikipedia.org/wiki/Extinktion_(Optik))。在光学装置中，消光或者光学密度是符合感觉地以对数的方式表述的不透明度O并由此是用于辐射(例如光)在横越介质之后减弱的量度。通过作为入射辐射的I₀和作为出射辐射的I，消光E作为对数量描述透射度τ：

一般而言，如下过程：吸收、散射、衍射和反射参与减弱/消光。因为根据本发明优选使用未被待检验的颗粒(例如生物分子)吸收的波长，并且其它影响变量如反射和衍射优选保持恒定，所以根据本发明基本上基于纯散射来测量减弱。

关于这种途径尤其有利的是，该“散射(Wegstreung)”测量原理可良好地集成到用于测量固有的颗粒荧光的(单一的)光学装置中。由此，能够借助于同一光学装置检测或测量颗粒纳米量级的变性和其纳米-微米量级的聚集。这两种测量能够根据实施方式顺序地、紧接着彼此或者甚至同时进行。

根据本发明，待检验的样品优选在毛细管中检验，这此外具有如下优选的优点：毛细管能够快速地进入所期望的测量位置中，由此实现：能够同时分析多个样品。这此外确保大的数据点密度，所述大的数据点密度允许甚至精确地检测和评估小的信号变化，这迄今为止通过现有方法是无法确保的。

根据本发明，多个毛细管能够直接置于测量设备的载体元件上。根据另一实施方式，多个毛细管也能够设置在一个单独的载体上，由此也实现半自动的或自动的填充和/或测量。

本发明的申请人，即NanoTemper技术有限公司，开发和销售如下测量仪器，在所述测量仪器中光学地检验毛细管之内的液体。此外已知的是，用手拿起单个的毛细管，将其浸入液体中并且随后单独放置到载体上并且随后推入到测量仪器中。用于填充各个毛细管的这种方法例如在NanoTemper技术有限公司的视频中示出，所述视频在http://www.youtube.com/watch？v＝rCot5Nfi_Og公开。个别的填充对于特定的单个样品是有利的，然而该方法对于较大数量的样品而言需要许多操作步骤，所述操作步骤无法简单地自动化。

在与本发明相同的申请人已经提交的申请EP 2 572 787中，描述了如下毛细管，所述毛细管借助于磁力保持在载体上。这尤其实现了各个毛细管在载体上的更简单和/或更精确的定位。换言之，单个毛细管的个别的填充是更优选的，然而紧随其后的操作步骤通过磁力辅助。

最后，在申请EP 2 848 310中描述了用于毛细管的单独的载体，由此也实现了半自动的或自动的填充和/或测量。尤其是，这些载体也能够用于根据本发明的方法，这提供了如下附加的优点：多个毛细管除了有效的填充还能够非常快地扫描。

在下文中定义一些术语，如其就本发明而言所理解的那样。

颗粒

本申请意义下的颗粒，不应限于此，优选是：有效物质；生物分子，一般而言例如蛋白质；抗体；膜蛋白；膜受体；肽；核苷酸；DNA；RNA；酶；分子片段；“小分子”；糖；有机化合物；无机化合物；囊泡；病毒；细菌；细胞；胶束；脂质体；组织样品；组织切片；膜制剂；微珠和/或纳米颗粒。

荧光测量

颗粒，优选蛋白质，会化学变性或热变性，并且内部的结构变化能够通过固有荧光性，例如色氨酸荧光性、酪氨酸荧光性、苯丙氨酸荧光测量，在蛋白质的情况下优选色氨酸荧光性。在此，颗粒的结构的/内部的变化能够经由荧光强度或者荧光最大值的移动或者荧光寿命的变化等来检测。待检验的颗粒例如蛋白质的所谓的熔点，因此也能够被确定。熔点在此限定为如下状态，在所述状态，待检验的颗粒，例如蛋白质一半折叠(例如天然构型中的蛋白质)而一半展开(例如未结构化的、变性形式的蛋白质)地存在。在此，荧光的强度的改变例如能够根据温度或者变性剂或者辅因子/配位体的添加来确定和/或能够记录时间上的变化曲线。

在检验蛋白质的情况下，例如能够在330nm+/-10nm和350nm+/-10nm的波长时同时但是在光谱上分开地测量色氨酸荧光性。在350nm处的荧光强度与在330nm处的荧光强度的商(F350/F330)是优选的测量变量，因为所述商与颗粒的内部的结构/构型改变相关。如果色氨酸因蛋白质的展开从疏水环境例如蛋白质内部进入到亲水环境例如水中，那么色氨酸的荧光发射最大值从短波波长(例如330nm+/-10nm)向长波波长(350nm+/-10nm)移动。例如，熔点能够由F350/F330曲线的一阶导数的最大值确定。

消光测量/散射测量

溶液中的颗粒能够散射所射入的光。在物理中通常将散射理解为一个对象因与本地的另一对象(散射中心)的相互作用而引起的偏转。颗粒处的光散射由此是所射入的(激发)光因与待检验的颗粒的相互作用引起的偏转。散射角θ定义为散射的光被偏转的角度。根据本发明，如果光，从所入射的(激发)光的射束曲线来测量，实际上被偏转，优选大于1°，优选大于2°、3°、4°并且优选小于179°、178°、177°、176°，那么称之为散射。

区分不同的散射类型，如示例性地区分瑞利散射(颗粒大小约等于光波长的1/10，也就是说，颗粒大小相比于光波长小)和米氏散射(颗粒大小在光波长的大小范围中并且更大)。溶液中散射的程度与颗粒大小和颗粒数量相关。因为瑞利散射的散射强度与波长的四次方成反比，所以所述散射强度在短的波长范围中与在较长波的波长范围中相比表现得更强，所述短的波长范围示例性地为300nm至400nm。散射的程度能够通过消光测量来量化，其方式是：所射入的光的强度与透射的光的强度比较。差对应于散射开的光的量，并且因此用作颗粒形成或颗粒聚集的量度。

对于生物分子示例性地为蛋白质而言，在大于300nm的波长时检测消光是有利的。尤其是，在300nm和400nm之间检测消光是有利的，并且在大约385nm处是特别有利的，因为在此基本上不再吸收光(在大约280nm处存在蛋白质的吸收最大值)，但是散射基于瑞利散射的波长相关性是非常大的。使用在385nm处的光例如是有利的，因为市场上的适当的LED在该波长时与具有明显更短波的波长的LED相比是功率更强的。尤其是，强的光功率是有利的，以便检测许多蛋白质。因此，例如消光的测量常常受光子噪声限制。光子噪声的信噪比遵循泊松统计，也就是说，所述信噪比通过根(光子的数量)变得更好。

此外，在上文中所提到的对用于消光的波长的选择也提供其它优点。因为光不被颗粒吸收，所以颗粒也未被破坏，使得能够在该波长范围中使用“强的”光功率。用于消光测量的LED的光功率优选在大于100μW的范围中，优选在大于1mW的范围中。优选地，用于消光测量的LED的光功率在0.1mW至5mW的范围中。

对于消光的测量而言，信号的小的噪声和激发光源的小的漂移是有利的。LED能够通过适当的LED散射部非常稳定并且低噪声地运行并从而对于消光测量是有利的。

因为生物分子，例如蛋白质，明显小于有利的波长范围，所以能够认为是瑞利散射。因为瑞利散射与颗粒直径的六次方相关，所以颗粒的大小变化导致散射的强烈改变，所述大小变化例如因颗粒的聚集引起。因为颗粒处的散射沿着所有空间方向进行，所以根据本发明提出，散射或者散射的量度经由消光来量化，因为与传统的光散射测量相反，在此整个散射的与散射角度无关的量化是可行的，在传统的光散射测量中，散射光仅在小的角度范围中被检测到。消光测量此外对测量伪差(Messartefakte)不那么敏感的，所述测量伪差示例性地是在限界面和污物处的反射，所述污物例如是灰尘颗粒。

用于消光测量的优选的波长或波长范围例如可从图16中推导出来，在图16中示出蛋白质的吸收光谱。例如能够从该光谱中推导出：大于280nm的，优选大于300nm的波长是特别优选的。

样品容器

根据本发明检验如下样品，所述样品以液体或流体的形式处于容器或样品容器中。原则上，根据本发明的方法不限于特定类型和形状的样品容器。然而优选使用毛细管作为样品容器，这具有更多优点。例如，使用薄的毛细管由于小的体积而引起小的材料消耗。此外，薄的毛细管提供大的毛细力，以便无源地仅通过毛细力抽吸液体。甚至高粘性的液体能够通过毛细力抽吸到毛细管中。例如也可行的是，将待抽吸的样品倒置，使得重力也沿着毛细力的方向起作用和从而辅助填充。一次性毛细管的使用防止各个样品之间的交叉污染。薄的毛细管意味着：穿过毛细管的光学路径长度是小的。这也有利于能够测量非常高地浓缩的溶液(高浓度的颗粒)。根据本发明，例如能够使用各个毛细管或者载体中的毛细管。因此例如可行的是，将具有多个毛细管的载体放置在反射性的表面上，其中多个毛细管优选与所述表面接触，而不必将毛细管从载体中移除。换言之，毛细管能够通过与表面的接触经由接触调温来调温，而毛细管保留在载体中。

例如在EP 2 848 310中描述优选的具有毛细管的载体，其通过参引并入本申请中。尤其是，EP 2 848 310涉及一种用于多个毛细管的载体，借助于所述载体实现同时填充来自微孔板的多个毛细管。此外，EP 2 848 310也涉及用于填充、运输和测量体积在微升范围中的液体的设备和方法。根据一个优选的实施方式，能够在载体中设置24个毛细管。

液态样品在测量期间优选以静态的即不流动的状态处于毛细管之内。优选地，在测量期间在毛细管内不存在流动，所述流动超出液体中自然的温度运动和/或可能的因蒸发引起的运动。

毛细管可以由玻璃和/或聚合物和/或下述元素中的至少一种制造：硅硼玻璃、硅硼酸盐-3.3-玻璃(例如Duran玻璃)、石英如Suprasil的、Infrasil的、合成制造的石英玻璃、钠钙玻璃、Bk-7玻璃、ASTM类型1等级A玻璃、ASTM类型1等级B玻璃。聚合物能够包含：PTFE、PMMA、Zeonor^TM、Zeonex^TM、特氟龙AF、PC、PE、PET、PPS、PVDF、PFA、FEP和/或丙烯酸玻璃。

尤其优选的是，毛细管的至少一个区域对于波长为200nm至1000nm的，优选250nm至900nm的光是透明的。尤其优选的是，但不限于此，毛细管的该区域对于下述波长范围的光也是透明的：940nm至1040nm(优选980nm+/-10nm)、1150nm至1210nm、1280nm至1600nm(优选1450nm+/-20nm和/或1480nm+/-20nm和/或1550nm+/-20nm)、1900nm至2000nm(优选1930nm+/-20nm)。本领域技术人员理解：一个或多个透明的区域也能够在整个毛细管上延伸。换言之，毛细管能够是透明的并且优选由上述材料中的一种一体式地制造。

优选地，所使用的毛细管具有0.1mm至0,8mm，优选0.2mm至0.6mm，更优选0.5mm的内直径。优选的毛细管的外直径优选在0.2mm和1.0mm之间，优选在0.3mm和0.65mm之间。

毛细管的几何形状不限于特定的形状。优选地，使用横截面为圆形或者横截面为椭圆形的管状的毛细管。然而也可以使用具有其它横截面的毛细管，例如三角形、四边形、五边形或者多边形。此外，也能够使用如下毛细管，在所述毛细管中，直径和/或横截面关于毛细管的长度不是恒定的或者是恒定的。

硅表面

根据本发明，样品容器置于硅表面上。优选地，使用如下毛细管作为样品容器，所述毛细管设置在硅表面之上。硅表面优选用作为镜面或者用于反射激发光的面。此外，根据本发明，样品容器或毛细管可以与硅表面直接接触，使得实现样品容器/毛细管和硅之间的直接的接触换热。硅提供一系列特性，所述特性对于本发明是特别有利的。

硅在优选的波长范围中不具有自发荧光。硅在根据本发明优选的波长范围中具有高的反射性(例如参见图9)。此外，硅具有高的导热能力，这对于多个毛细管的快速且均匀的调温是特别有利的。这三种特性对于根据本发明的设备或根据本发明的方法是特别有利的。

硅的其它优点例如是耐化学性、材料的简单的可获得性和简单的可加工性，此外其允许形成非常光滑或非常精确的形状/面。

然而本发明不限于硅的使用。因此，例如也能够替代硅使用其它材料用于镜面和/或调温。通常，如下物质是适合的，所述物质在优选的波长测量范围中显现出小的自发荧光或者不显现出自发荧光并且优选同时显现出所射入的光的反射性，例如>10％的反射性。根据本发明，例如也能够使用石英层或石英小板，所述石英层或石英小板优选设有反射性的覆层，例如干涉测量的覆层。

本发明在执行多个测量的效率、速度和成本方面提供一系列优点。由薄的毛细管构成的组合与固有荧光性(荧光、磷光、发光)的测量和散射(消光)的测量一起是优选的并且是尤其有利的，所述毛细管优选放置在硅上并且优选连续地相对于唯一的光学装置移动。尤其是，由于非常好的导热特性与硅的反射所应用的波长的光的固有特性的组合，硅是优选的材料。相对于常规方法，通过在各个毛细管上无停留时间地移出多个样品实现的对消光的快速且精确的检测也极大地提高了测量速度和数据点密度。

根据本发明的方法和根据本发明的设备在根本上与现有技术不同。尤其是，根据本发明，部件以如光散射领域的技术人员基于现有技术的教导尚未使用过的方式和方法组合。此外，根据本发明的测量也与已知的、如吸收测量领域的技术人员所可能执行的方法不同。原则上，虽然在用于吸收测量的光学系统和根据本发明的设备之间存在共同性。然而根据本发明，用于消光测量的波长有针对性地选择为，使得所述波长不被样品吸收。由此，根据本发明实现：光的与大小相关的散射能够被测量。

在现有技术中例如已知如下设备，所述设备以unCHAINED LABS的UNit^TM的名称来销售。在该设备中，微量比色池必须单独地接近，并且为了测量，微量比色池必须相对于测量光学装置精确地定向。根据本发明，毛细管持续地/连续地运动，而对于测量而言不停止；“扫遍”毛细管。由此，根据本发明实现稳健得多的、经济得多的实施方案并且主要实现高得非常多的数据密度。

通过根据现有技术记录整个光谱，对每个接近的微量比色池的测量持续时间为数秒。由此，在唯一的温度下例如48个样品的测量已经持续数分钟。具有常用的1℃/min的加热速率由此引起小的数据点密度。根据本发明，检测仅仅两个离散的波长(消光和荧光)已经足够，其中毛细管每个在<50ms内能够在经过时被曝光，使得根据本发明获得高了数个量级的数据点密度。

在现有技术中，如通常测量静态的光散射那样，也就是说，阻挡激发光，实际仅测量光的被散射的部分。然而，根据本发明，测量透射的份额或向回反射的部分，也就是说，未被散射的光或所射入的光的未被散射的份额。

此外，现有技术中的光散射的测量以样品的精确的控制为前提，这需要耗费的调节和定期的维护。这还引起差的复现性，因为在控制各个样品时小的错误就会导致光散射信号中的减弱。

根据本发明，在光由于反射而两次穿过毛细管之后测量消减光。在颗粒浓度高时并且在波长长(例如1cm)时，不再会有光穿过毛细管返回。因此，根据本发明，内直径例如为0.5mm的薄的毛细管是优选的。目前市场上的解决方案/方法/仪器具有如下问题：操作和测量高浓缩的溶液，例如高浓缩的抗体(例如在含水溶液中具有150mg/ml的抗体)。一方面因为它们无法将高粘性的液体填充到在其所使用的样品腔中，另一方面因为其光学路径长度过长。然而，这些高浓缩的溶液对于制药业，尤其制剂测量时令人非常感兴趣的。

使用薄的毛细管实现了大的动态测量范围，因为测量是高灵敏度的(在荧光检测的情况下毛细管材料和硅的自发荧光小/没有，在消光检测的情况下薄壁的毛细管的透射率大并且硅的反射特性/均匀性良好)，并且同时允许测量高浓缩的溶液(在高浓缩的溶液的消光测量时薄的光学层厚度是有利的)。根据本发明的方法相对于内过滤器效应是稳健的，因为每个单个样品参照本身。由此，能够在唯一的测量中分析大的物质量浓度范围，例如50mg/ml蛋白质至5μg/ml蛋白质。

在光学装置下毛细管连续往复运动的特性：

在测量期间毛细管相对于光学装置的优选的、连续的相对移动(参见图3和图4)提供了在效率和测量精度方面的其它优点。根据本发明，能够并行测量多个样品，例如通过将所有样品同时调温到相同的温度的方式。根据本发明的方法不需要在各个毛细管上长的停留时间；也不需要毛细管上有针对性地接近具体的测量点，由此所述方法是非常稳健并且非常快的。

根据本发明此外能够利用毛细管的对称性，因为优选垂直于毛细管的纵轴线进行测量。此外，圆形的或柱形的毛细管(圆形横截面)是有利的，因为这种毛细管不仅是有益的而且可以以非常好的质量和高的精度来制造。

通过根据本发明的快速的扫描过程，可实现非常高的数据点密度，这对数据评估有有利的影响。在下文中根据一个实例得出这些优点中的一些。

例如，将内直径为0.5mm并且外直径为0.65mm的48个单个毛细管以2.25mm的间距(毛细管中心距毛细管中心)平放地施加在被调温的硅上。具有毛细管的这整个调温体例如借助于线性轴连续地在位置固定地安装的光学装置下往复运动，所述线性轴例如借助于步进马达驱动。

例如，调温体和从而毛细管以例如45mm/s的速度在光学装置下运动。在该速度下，所有48个毛细管以2.25mm的间距在大约3秒内被移离。具体地，通过往复运动，平均每3秒对每个毛细管进行测量(“平均”因为例如最靠外的两个毛细管因行进方向颠倒两次所以实际上瞬间相继被测量并从而持续3秒(移走)+3秒(返回)＝6秒，直至毛细管又恰好在光学装置下)。

在一个示例性的应用中，调温体的温度和从而毛细管的温度在连续的往复运动期间连续地以每分钟1℃的速率提高。因此，在每分钟1℃的温度斜坡中实现了每个毛细管并且每分钟20个测量点的数据密度，这于是对应于平均0.05℃的温度分辨率。如果在毛细管的数量保持不变并且行进速度保持不变的情况下将每分钟1℃的温度提高速度减半到每分钟0.5℃，那么温度分辨率从0.05℃(每分钟1℃的情况)加倍到0.025℃(每分钟0.5℃的情况)。

因为连续地在毛细管的整个直径上进行扫描，即测量，所以根据本发明的方法对局部的污物(例如灰尘颗粒、气泡，尤其小于毛细管直径的污物)与在现有技术中普通的方法相比是更稳健的，在所述普通的方法中仅在毛细管的唯一的点处进行测量(例如参见unCHAINED LABS的UNit^TM)。尤其是，在现有技术中较小的局部污物就已经会引起测量伪差并且引起测量的作废。

毛细管的根据本发明的扫描的另一有利方面也在于：受借助“测量射束”扫过圆形的毛细管所决定，实际上自动地测量不同的层厚度。因此，图3例如示出：在毛细管的中部中，存在最大的样品厚度/层厚度。在边缘处，样品液体的较小的层厚度是对称的。这例如对于极其高浓缩的溶液是有利的，其中散射高至使得在毛细管的中部中(最大的层厚度)不再有信号穿过(整个光被散射开)。但是如果不再有信号，那么无法再测量信号的变化。因为根据本发明在毛细管的整个直径上进行扫描，所以在边缘区域中获得>0的测量值，在所述边缘区域中，被反射的光射束必须经过穿过毛细管的较短的路径长度。这是一种实际优点，因为因此能够测遍溶液中的样品的较大的浓度范围。

用于测量荧光和消光/散射的光学装置

本发明的另一优点可以在用于测量荧光和消光的更简单的所设计的光学装置中看到。优选地，对于这两种测量而言能够使用共同的光学装置来进行两种测量。相对于现有技术中的单独的光学装置，根据本发明的(共同的)光学装置的优点例如可以在调节、定位、材料消耗的领域中看到。此外，根据本发明的共同的光学装置也更节省空间。

根据本发明，荧光和消光测量能够相继、近似同时或者同时进行。测量的同时性意味着：颗粒内(＝分子内)过程能够借助于荧光执行，同时借助于“散射”/消光执行颗粒的大小变化(＝分子间)的测量。因此获得这两个过程的直接相关。因此能够识别出：是否同时或者在温度相同的情况下开始变性(荧光)和聚集(消光)，或者是否一个过程在另一过程之前开始。这也引起：测量本身是更稳健的。

此外，与在消光和荧光分开测量的情况相比，测量的同时性引起更高的或高的数据密度：每单位时间能够测量到两倍的数据。由此，提高了测量的精度，并且蛋白质的熔点以及蛋白质开始聚集的温度能够更精确地确定。

与静态散射光测量实施方案相比，消光测量(“散射”测量)的根据本发明的实施方案对在毛细管上并且在其中的沾污、污物、气泡是更稳健的。

颗粒例如蛋白质的优选的物质量浓度在0.001mg/ml和500mg/ml之间，所述蛋白质如抗体、酶、肽。有利的浓度在0.1mg/ml和100mg/ml之间。

根据本发明的实施方案和根据本发明的方法允许在唯一的实验中同时测量许多不同的浓度。也就是说，借助于同一测量设定能够同时测量如下浓度，所述浓度例如彼此间差1000倍。

借助于根据本发明的系统和方法，可以测量颗粒的热稳定性、颗粒的化学稳定性以及颗粒的时间稳定性。在下文中更具体地描述稳定性测量的实例。

热稳定性

在测量热稳定性时，颗粒优选在含水溶液中或液相中被送入位于具有硅的调温体上的毛细管中并且优选连续地测量固有荧光性并且(优选同时)测量散射/消光，而毛细管的温度从低的值例如15℃提高至高的值例如95℃(参见图13)。例如也能够使用-20℃至+130℃的温度和/或所述温度的子范围。

附加地，借助于布和无水乙醇通过多次擦拭来清洁硅表面。接着，配置至少10μl的待分析的样品，例如不同物质量浓度的抗体溶液，所述物质量浓度例如在5mg/ml和0.3mg/ml之间，或者不同的生物分子，或者不同的缓冲液中的相同的生物分子。每10μl的这些溶液随后通过利用因毛细管浸入溶液中引起的毛细力被填充到毛细管中。被填充的毛细管随后被转移到毛细管载体上并且接着借助于盖压紧在硅表面上。根据所执行的“发现扫描(Discovery Scans)”来调整光强度，这能够手动地或者自动地进行，以便避免检测器的曝光过度，其中在所述发现扫描中，在所有毛细管的330nm和350nm的发射波长时在3秒至5秒内在20℃的温度下检测到消光和荧光。接着，确定待测量的温度范围，例如20℃至95℃，并且温度斜坡，示例性为1℃/min。后者例如能够在0.1℃/min和100℃/min之间改变。在确定这些参数之后，开始测量并且同时测量和示出样品消光和荧光的温度相关性。在测量结束之后，温度自动回置到初始值。

热展开曲线的分析例如经由确定具体的展开温度(50％的颗粒展开的温度)来进行，这示例性地能够通过借助于分析原始数据的一阶导数或二阶导数来识别拐点或者通过其它数学处理进行。通过减光测量分析颗粒形成，优选以数学方式通过确定开始聚集的温度并且通过确定最大的减光来进行。

例如也能够借助于热稳定性测量来确定颗粒展开的可逆性或不可逆性。这例如能够通过如下方式执行：首先将20℃的温度以每分钟1℃的温度斜坡提高到95℃并且接着将95℃的温度再次以相同的或不同的温度斜坡降低到20℃。如果展开是可逆的，那么在执行加热和冷却之后350nm与330nm的荧光比又达到初始水平/相同的值，所述荧光比对于该过程而言已经具有所述初始水平/相同的值。在同时根据本发明测量聚集时例如能够发现：聚集是否引起展开的不可逆性。如果抗体在荧光信号中例如具有不同的热展开过程，所述热展开过程例如具有60℃和72℃的熔化温度，并且在消光中所述抗体同时在75℃时具有聚集，那么例如能够在第一实验中加热至60℃并且随后又冷却，而在第二实验中加热超过75℃，也就是说，超过聚集温度，并且又冷却。如果第一实验示出可逆的展开而第二实验示出不可逆的展开，那么由此能够推断出：聚集导致不可逆的展开或者妨碍回到自然状态的折回。

化学稳定性

在测量化学稳定性时，含水溶液中的颗粒被掺入浓度提高的变性剂，例如离液盐，如盐酸胍或尿素，被填充到毛细管中并且放置在调温体上。颗粒展开的程度在限定的温度情况下通过一次性移出毛细管和检测荧光来确定(参见图12)。

用于化学展开的应用领域例如是优化蛋白质的配制、颗粒的热动力学特征化以及有效物质检验，其中蛋白质例如为抗体和酶。

时间稳定性

在测量时间稳定性时，颗粒在含水溶液中被填充到毛细管中并且在温度恒定的情况下在限定的时长内测量消光和荧光。在测量>3小时的情况下有利的是，借助于适当的物质封闭毛细管端部，所述适当的物质例如为液态塑料、粘胶、蜡、油灰，或机械地通过挤压适当的材料封闭毛细管端部，以便防止因蒸发引起样品损失，所述适当的材料例如是硅酮、橡胶、塑料。时间稳定性的测量例如用于颗粒的特征化，尤其蛋白质和有效物质的特征化，并且用于优选这些颗粒的配制。

质量控制

在用于质量控制的测量中，颗粒溶液针对其可复现性被测试，或者执行贮存和压力测试。在后者的情况下，蛋白质例如经受如下条件，所述条件对蛋白质的折叠有潜在负面影响，例如提高的温度、剧烈的摇动/搅拌、冻融循环。在执行不同的程序之后，溶液被填充到毛细管中并且样品的荧光以及减光要么借助于唯一的毛细管扫描来检测要么在一个温度斜坡中，例如以1℃/min从20℃到95℃进行检测。通过与未处理的参考样品比较，因此能够确定展开的和聚集的蛋白质的份额。

配位体键合

这些测量也称为“热漂移检测(thermal shift assays)”。在测量配位体键合时，颗粒，例如酶，例如激酶，与配位体一起在含水溶液中培育，所述配位体例如是分子片段。如果配位体键合到颗粒上，那么这种配位体键合能够影响颗粒的稳定性，例如热稳定性和/或其聚合特性。配位体键合到颗粒上例如能够提高或降低其熔化温度，也就是说，稳定颗粒或使颗粒不稳定，所述熔化温度是50％的颗粒以自然形态存在而50％的颗粒以变性形态存在的温度。相对于不具有配位体的颗粒，颗粒配位体复合物的熔化温度的这种移动能够作为“ΔT”来测量并从而检测配位体到颗粒上的键合。根据本发明的方法和设备实现：可靠地并且可复现地检测和量化甚至ΔT>＝0.2℃的最小熔化温度移动。不同的配位体于是例如能够根据其熔化温度移动ΔT来分类和选择。在应用例如蛋白质的结晶学时寻找如下配位体，所述配位体在键合时使颗粒的熔化温度朝向特别高的熔化温度移动并从而稳定颗粒。

在这方面有利的是，不仅借助于荧光信号测量热稳定化，而且借助于根据本发明的消光测量来测量颗粒、配位体和/或颗粒配位体复合物的可能的聚集。这例如应实现挑出引起热稳定抑或也引起聚集的配位体。

附图说明

在下文中参照附图详细描述本发明的优选的实施方式。附图示出：

图1示出根据本发明通过测量光透射率的减弱来测量光的散射的运行方式；

图2示出根据现有技术借助于固定的散射光检测角直接测量散射光；

图3示出通过样品相对于光学系统的运动产生荧光信号和消光信号；

图4示出用于评估消光测量的一个实施方式；

图5示出用于评估荧光测量的一个实施方式；

图6示出用于同时测量荧光和消光的一个实施方式；

图7a示出用于近似同时测量荧光比和消光的一个实施方式，带有所绘出的荧光射束路径；

图7b示出图7a的实施方式，然而带有所绘出的消光射束路径；

图8a示出用于同时测量荧光比和消光的另一实施方式，带有所绘出的荧光射束路径；

图8b示出图8a的实施方式，然而带有所绘出的消光射束路径；

图9示出硅的反射性；

图10示出用于借助于荧光检测分子内展开并且借助于抗体的消光同时检测分子间聚集的一个测量实例；

图11示出对抗体在不同的缓冲液中聚集的与温度相关的提高进行消光测量的一个测量实例；

图12示出用于检测在因化学展开而引起的不同的温度下蛋白质稳定性的测量实例；

图13示出用于利用在50mg/ml和2μg/ml之间的不同的蛋白质浓度来演示荧光光学装置的动态范围的示例性测量；

图14示出用于通过强制降解测试对蛋白质进行质量控制的示例性测量；

图15示出用于缓冲液筛选的示例性测量，所述缓冲液筛选用于抗体的最佳的贮存条件；

图16示出蛋白质的示例性的吸收光谱；以及

图17a、17b示出根据本发明的调温体的俯视图和横截面视图。

具体实施方式

图2示出常规类型的通过在固定角度下的静态散射光测量来测量颗粒的方法。待检验的样品13是液体连带位于其中的很分散或强烈聚集的颗粒。样品液体处于毛细管30中，所述毛细管安放在面77上。对于消光测量而言，光20从上向下穿过毛细管30射入到样品液体中。所射入的光20的一部分直接地，即基本上相反于射入方向作为反射光22向回反射。为了测量散射光24，散射光检测器200以角度Φ位于入射的光射束20和样品之间，并且从而直接检测在样品中通过很分散的颗粒23散射的光24。

该系统的缺点可总结如下。对检测器200中的信号的助益仅通过围绕角度Φ的小的角度范围中的散射产生。由于在窄的角度范围下进行测量，所述系统易受所不期望的机械运动，例如沿着竖直方向的运动影响。在毛细管30的特定的位置中，在毛细管壁处朝向检测器200的反射(例如参见射束25)强于在待检验的颗粒处的光散射。散射光测量领域的技术人员知晓：重要的是避免反射或反射性的表面77(例如硅)，因为从那里例如所不期望的反射射束26同样能够进入到检测器200中。射到散射光检测器200中的被反射的射束26引起测量信号的歪曲，因为对于散射光测量而言根据惯常的教导仅允许测量围绕角度Φ的非常窄的角度范围。技术人员因此构造非常耗费的光学装置，以便阻挡所有所不期望的散射光，然而这使得光学装置易受影响并且昂贵。尤其是，技术人员将避免反射性表面。此外，检测器200的倾斜的设置使得集成到具有竖直的射束路径的现有光学装置中变得困难。

图1示意性地示出根据本发明的测量的运行方式。优选地，根据本发明并非像在图2中那样直接测量光的散射的份额，而是通过测量光透射率的减弱，即所谓的消光进行测量。换言之，消减光并非是散射光。根据光学装置的设计方案，相对于所射入的光20的射束轴线被散射小于±10°，优选小于±8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°的光优选解释为未散射的光。借助于大的接收角范围，能够实现高的信噪比，借助于小的范围，在浓度高时线性更好。

在所述实例中，待检验的样品再次处于毛细管30中，所述毛细管放于表面77上。即将到来的光射束20的光被样品溶液13中的颗粒部分地以不同的角度散射(参见散射光24)。入射光的光射束在表面77处反射并且作为光射束22相反于所射入的光射束20返回。已经在表面77处被反射并从而穿过样品体积13两次的光射束20、22的强度与样品中的光散射的强度相关。反射射束22的强度由检测器100测量，其接收范围与光射束20或光射束20、22共线。即将到来/射入的光射束20和反射的光射束22的波长优选被选择为，使得待测量的样品在该范围中尽可能少地吸收光。由此能够实现：光减弱主要因散射(消光)发生而不是因吸收发生。根据本发明的方法的另一优点也在于，在表面77处反射的射束26不干扰测量。

图17a示出根据本发明的调温体的表面77与多个设置在所述表面上的毛细管30的俯视图。表面77具有长度L和宽度B，其中表面层此外具有深度T，如从图17a和图17b中所看到的那样。优选地，长度L长于宽度B。此外优选的是，毛细管30为了测量在表面77的宽度B上延伸并且毛细管优选长于宽度B，使得毛细管的这两个端部突出于表面77。为了经由接触对毛细管30调温，优选的是，毛细管直接放于调温元件的表面77上，也就是说，直接与表面77接触。根据另一优选的实施方式，此外能够有利的是，将至少一个区域构成为，使得毛细管的部段不与表面直接接触，而该毛细管的其它区域与表面接触。尤其是，不具有直接接触的区域对于光学测量是有利的，如如下所讨论的那样。

根据一个优选的实施方式，在表面77中能够设置留空部90，例如呈沟道、槽、微槽或者“沟渠”90形式，使得在槽90的区域中不存在毛细管与表面77的直接接触。槽90优选在调温元件的至少一个区域上延伸，在测量期间毛细管位于所述区域上。优选地，槽90在相对于调温元件的宽度处于中部的区域中构成，使得每个毛细管在中部的测量区域90中不与表面77直接接触。然而，(相对于调温元件的宽度)在该区域90左侧和右侧，毛细管30与表面直接接触，以便保证接触调温。

槽90的宽(沿着宽度B)优选在1mm和10mm之间，优选在2mm和8mm之间，更优选在3mm和7mm之间，例如5mm，更优选大约3mm。根据本发明，根据本发明的光的向回反射优选在毛细管的该槽部段中产生或测量。

优选地，槽具有大约10μm至30μm的深度。尤其优选的是，槽90具有如下深度(参见图17b中的深度T的方向)，所述深度大于所使用的光的半个相干长度，以便进一步抑制向回散射中的干涉作用。干扰性的干涉作用例如通过牛顿环表现，所述牛顿环能够借助于根据本发明的槽抑制或者甚至能够被防止。根据本发明，作为光源能够使用激光光源或者LED。例如在本发明中所使用的LED光源通常具有在大约15μm的范围中的相干波长，使得槽的深度优选>7.5μm。尤其优选的是，深度在半个相干波长的1.5倍和半个相干波长的10倍之间。优选地，深度的上限为半个相干波长的5倍。尤其是，根据本发明，槽仅应深至可抑制干涉，但是作为回报，在毛细管下方不构成过大的气垫，因为要不然毛细管中的所期望的温度就会受气垫干扰。此外，槽具有如下更优选的优点：毛细管30的表面在测量区域中不直接与表面77接触，使得能够抑制或防止毛细管30的表面的刮擦和调温体的表面在测量区域(槽)中被毛细管刮擦。尤其是，根据本发明避免调温体的表面被刮擦，而毛细管的可能的刮擦会是可容忍的，因为毛细管优选作为一次性用品使用。根据本发明，例如能够使用如下毛细管，所述毛细管的材料与硅相比具有更小的硬度。

为了确保光从槽90的底部有效地向回反射，槽优选被刻蚀到调温元件的表面中。优选地，调温元件具有由硅构成的表面层，使得槽90直接在硅层中构成。根据本发明的一个优选的设计方案，槽刻蚀到硅中。此外，优选的刻蚀法具有如下优点：槽底部的表面非常光滑地构成，使得该面的反射特性总是很出色。优选地，底部的表面具有中等的、优选位于纳米范围中的粗糙度，优选<±10nm，优选<±5nm，例如<±1nm至2nm。

根据一个优选的实施方式，槽能够在表面的主要部分上延伸，使得位于表面77上的所有待测量的毛细管30能够设置在槽90上方。如在图17a中所示出的那样，槽90沿着长度L延伸，使得毛细管30能够横向地设置在槽90上方(参见图17b)。根据另一优选的实施方式，槽90不在整个长度L上延伸，使得优选在边缘区域91中不构成槽。这例如具有如下优点：围绕槽90的硅具有均匀的厚度并从而可容易地加工(例如切割或锯割)。

优选地，使用硅作为调温元件的表面。优选地，使用纯(晶体)硅，如将在下文中详细讨论的那样。优选地，根据本发明的槽90沿着晶体硅的优选的晶体方向构成，优选沿着[111]方向构成(米勒方向指数)。

槽例如也具有如下优点：位于毛细管的外侧处的液体不进入测量区域中，所述测量区域优选位于槽的区域中。因为在槽的区域中毛细管和条纹体之间的间距大于在槽的区域之外的间距，所以对于毛细管的外侧处的液体而言，由于毛细力而更有利地保留在槽之外。因此例如能够发生：在有时填充毛细管时液滴悬挂在毛细管外部。如果这些液滴进入到测量区域中，那么它们会有干扰。然而，毛细管距调温体的间距越小就越大的毛细力，将该液体保持在槽之外。这里，例如能够防止液滴的液体不进入槽中的测量区域中。

图3a)至3c)示出用于根据本发明的荧光测量和消光测量的信号的产生。类似于在图1中，待检验的样品位于毛细管中。待检验的样品包含分散的/聚集的颗粒(在下文中称为样品12)以及发荧光的颗粒(在下文中称为样品15)。为了测量样品，检测器优选在毛细管上方移动或毛细管在检测器下方移动。这种移动优选横向于毛细管的纵轴线进行。替选地，毛细管和检测器也能够都被移动。然而，优选地，毛细管30和检测器100之间的相对运动80在测量期间进行。

在用于荧光测量和消光测量的所射入的光射束20、21到达毛细管30之前，检测器没有测量到荧光性光23(上排；信号(荧光))并且没有测量到用于消光测量22的反射光22中的减弱(下排；信号(消光))。相应地，在图3a中的图表中示出水平线。

在毛细管30在光学系统的检测区域下方(相对)运动80期间，所测量的荧光强度23提高，并且反射射束22的强度因在毛细管处的折射并且因在样品12中的散射而下降(参见图3b)。

如果具有样品的毛细管离开光学装置的检测区域，那么优选获得如下信号，所述信号对应于进入到检测区域中。这是因为光学系统的对称的设置或在毛细管上方的对称运动。在样品和光学系统之间的运动的方向80由此不起作用。

根据本发明能够连续相继测量位于多个毛细管中的多个样品。多个毛细管优选能够设置在样品载体上。也就是说，通过优选连续地移动样品载体，能够以高的数据密度(每个样品每单位时间的数据点)记录大量样品。因此例如可行的是，获得直至超过100kHz的测量频率。此外，根据本发明的方法的另一优点是系统的小的调节耗费。此外，毛细管30作为样品腔形式提供了由借助毛细力自动地将样品吸取到毛细管中实现的简单填充，这例如也实现填充高粘性的溶液。毛细管优选直接以良好的热接触放置于表面77上。

图4a)示出贯穿毛细管30中的三个不同的样品11、12、13的横截面。第一样品11不散射由源发射的、所产生的光20，使得所射入的光辐射20的绝大部分22向回朝向物镜和检测器100反射。另外两个样品12和13沿着在检测器100的接收角度之外的其它方向散射入射光20的一部分。与通过样品12散射相比，通过样品13散射更多的入射光，这通过多个散射箭头24示出。

如已经关于图3所描述的那样，优选的是，样品在测量期间相对于光学系统运动。图4b)示出借助于检测器100所测量的光强度与样品的水平位置相关的典型的变化曲线(消光测量)。所测量的强度(亮度[I])一方面与毛细管壁30处的光衍射相关而另一方面与样品中的消光相关。毛细管壁处的光衍射在不同样品中可以良好地近似认为是相同的。然而因为样品12和13与样品11相比散射入射光20的更大的份额，所以较少的光22向回反射。由此，样品12和13中的亮度(强度)以更大的程度下降。

图4c)示出消光与样品的位置相关的可能的变化曲线。用于计算消光的公式通常具有如下形式：

/>

I₀(x)在最简单的情况下可以是常数，或者，在因温度引起的聚集形成而开始消光之前，是在毛细管由水填充的情况下的强度变化曲线，或者是开始测量时的强度变化曲线。

所寻找的测量变量“消光”(图4d))通过消光变化曲线E(x)的积分得出。积分极限优选关于相应的毛细管对称。为了补偿光源的亮度波动或检测器的灵敏性波动，所确定的消光仍能够以如下参考值修正，所述参考值通过在不具有毛细管的区域中的曲线E(x)的积分算出(参见图4c：“参考面”)。优选地，用于每个单个毛细管的这种校正单独借助于直接位于这些单个毛细管旁的不具有毛细管的区域执行。这根据本发明例如是可行的，因为与在现有技术中的测量方法中不同，样品优选相对于测量系统移动。

图5示例性地阐明以三个样品为例在图3中的测量数据的可能的处理，所述样品具有强的荧光14、中等的荧光15和小的荧光16。

从样品发射的荧光性光的强度与检测器100相对于毛细管的运动或位置相关地在图5b中示出。为了确定“荧光值”，对样品相对于光学系统的移动80的量值进行积分(参见图5c)。积分极限优选对称地包括唯一的毛细管。被积分的荧光强度优选对应于所寻求的样品荧光的测量变量。也可行的是，在两个或更多个不同的波长时测量荧光强度。在这种情况下，被积分的多个荧光强度的比优选是所寻求的测量变量“荧光比”。

图6示出根据本发明的用于测量荧光和消光的系统的一个示例性的实施方案。优选地，荧光和消光的这种测量能够相继、近似同时或者同时进行。(第一)光源40，例如LED，产生具有(第一)波长21的光辐射21，所述光辐射在样品体积10中激发荧光辐射的发射。激发滤波器70抑制光源40在不期望的波长范围中可能的辐射。(第二)光源41产生在(第二)波长范围中的光辐射20，在所述(第二)波长范围中，样品体积10仅具有小的吸收。这两个光源40、41的光优选通过光学透镜60、61准直并且通过二向色分束器71合并为共线的射束。

分束器72优选在(第一)波长范围40中具有高的反射率。此外有利的是，分束器72在样品的荧光发射的波长范围中具有高的透射。也更优选的是，分束器71在(第二)光源41的波长范围中具有部分的透射和部分的反射。如果41的波长与10的荧光发射一致，那么二向色分束器例如满足这些要求。在更一般的情况下，分束器72是三向色分束器。

第一和第二波长21、20的光从分束器72反射到毛细管30中的样品10上。物镜62将入射光聚焦到样品10上。第一光源40的光在样品10中产生荧光辐射，所述荧光辐射通过透镜62准直。由第二光源41产生的入射射束中的光穿过样品10和毛细管30到达表面77上，在该处反射或向回反射(英语是：backreflection)并且第二次穿过样品10和毛细管30。

表面77优选由固有荧光性小并且在第二光源41的波长范围中反射率高的材料构成，以进行消光测量。被反射的辐射通过透镜62再次准直。可能存在于样品体积中的颗粒散射入射光，使得仅原始射入的光的较小的部分由物镜62接收。朝向透镜62向回反射的光的强度由此主要与颗粒的浓度和大小相关并且从而与样品的消光相关。

滤波器73优选抑制(第一)光源40的荧光激发光。检测器53优选波长选择性地测量来自样品的光射束的强度。优选地，能够借助于检测器53不仅测量第二波长的光，即穿过样品并且向回反射的光，而且测量荧光性光，即样品的荧光性发射的光。此外，波长选择性是指：在不同的波长时强度优选能够分开地确定。

图7a)示出在荧光测量中具有所绘出的射束路径的系统的另一根据本发明的实施方式。然而，与图6不同，所述系统具有(至少)两个检测器。这两个检测器50、51用于在两个不同的波长时测量荧光强度。如果例如选择330nm和350nm作为被检测的波长，那么从这两个信号的比中获得关于大分子结构的信息，所述大分子位于样品体积10中。

在该实施方式中，用于消光测量的(第二)光源41的波长位于样品10的荧光发射的范围中。因此，在测量荧光期间应当关断光源41。顺序的测量或者近似同时的测量通过如下方式实现：快速交替地测量消光和荧光。一种测量类型的两个数据点之间的时间间隔在此必须小至使得两个测量值之间的差与测量值的测量不确定性相比是更小的。实例：高浓缩的样品的消光在高于80℃的温度下以大约0.2mAU/s(毫吸收单位/秒)改变。消光中的测量不确定性例如为大约0.2mAU。相应地，优选每秒测量消光至少一次并且也每秒测量荧光至少一次。在该实施方式中，带通73透射荧光辐射23的一部分，例如在320nm至360nm的范围中的部分。分束器74将荧光辐射分为具有如下波长范围的两个射束，所述波长范围例如是320nm至340nm和340nm至360nm。射束借助于聚光器63、64聚束到这两个检测器50、51上。这两个测量信号的商是所寻求的测量变量。

图7b)示出图7a)中的系统的示例性的实施方案，然而在消光测量时具有所绘制的射束路径。第二光源41发出光辐射20，所述光辐射在基板77处反射之后穿过样品10两次并且作为光射束22向上伸展。在样品10中通过从检测区域散射而减弱光辐射的强度。(第二)光源41的波长优选位于滤波器73的透射范围中。根据光源41的波长，光据此分布到这两个检测器50、51上。优选地，波长为大约350nm，使得光的绝大部分由唯一的检测器测量。

图8a)示出图6中的系统的一个示例性的实施方案，所述系统相较于图7中的实施方案扩展有附加的检测支路。用于荧光的射束路径被绘出，所述射束路径对应于图7a中的射束路径。附加的二向色分束器75在由检测器50、51所测量的波长范围中是透明的。

图8b)示出图8a)中的系统，具有所绘出的用于消光测量的射束路径。与图7中的系统相比，光源41的波长范围位于由检测器50、51所测量的波长范围之外，例如为380nm。由此，光源41能够在测量荧光期间保持接通而不必在测量类型荧光和消光之间进行切换。分束器72在源41的波长范围中是部分可穿过的。理想地，透射/反射比为1:1。

来自(第二)光源41的光在其因样品10中的消光而减弱之后由分束器75转向到检测器52上。带通76优选减少射到检测器52上的荧光性光的份额。

通过具有三个检测器51、52、53的该实施方式，消光和荧光比能够同时连续地测量。此外，检测器52的灵敏度能够单独地匹配于来自光源41的辐射的强度。该灵敏度针对消光的低噪音的测量例如能够明显更高地设置。在一个有利的实施方式中，检测器的信号借助于24位模数转换器(ADC)数字化，所述模数转换器能够同时读入所有三个检测器通道，例如以4kHz的速率读入。

图9是一个图表，在所述图表中反射率与用于硅的波长相关地示出。尤其是，图9示出硅在UV范围中良好的反射率。该反射率是特别优选的，以便使在消光测量时朝向反射器反射的光强度尽可能高。特别地，高的光强度实现具有低的噪音份额的测量。硅的其它有利的特性是在所使用的波长时固有荧光性的近似不存在、良好的机械可加工性和高的耐化学性。

图10示例性地示出如下测量，在所述测量中借助于在图6中所描述的根据本发明的系统进行。不仅示出与温度相关的蛋白质展开，而且示出抗体的与温度相关的聚集。在所示出的实例中，抗体的亚基中的一个亚基自60℃起就已经开始展开，这通过在350nm和330nm处的发射之间的荧光比的特征性的改变来表征。然而，聚集的提高和从而消光的提高从73℃起才被记录，这可推断出在热学上较不稳定的蛋白质域的展开对并抗体的聚集并无裨益。

图11示例性地示出在pH4和pH6之间的不同的pH值中对25mM的乙酸盐缓冲液中的抗体(利妥昔单抗)的消光的测量，所述抗体具有1mg/ml的物质量浓度。毛细管中的每10μl的溶液已经以1℃/min的加热速率从50℃加热至95℃。消光的提高在温度提高到>72℃时被记录，这归因于聚集。消光提高的程度与溶液的pH值相关，其中较低的pH值抵抗温度引起的聚集。这一方面通过随后开始的消光增加(“聚集起始温度”)来表征而另一方面通过整体上较低的最大消光来表征。

图12示例性地示出在不同的盐酸胍浓度中对pH4的10mM柠檬酸缓冲液中的蛋白质溶菌酶的化学稳定性的分析。1mg/ml的溶菌酶已经在48种溶液中随着盐酸胍浓度的增加而制备，并且每10μl的相应溶液被填充到毛细管中，这些毛细管放置在毛细管载体上并且被固定，并且接着在20℃、30℃、40℃执行毛细管扫描。接着，比照提高的胍浓度绘制所获得的荧光比。尤其是，在所有样品中荧光比示出随着盐酸胍浓度提高的S形增加，所述盐酸胍浓度直接与展开的蛋白质的份额成比例。随着温度提高，蛋白质越来越不稳定，这通过数据点朝向较低的胍浓度移动来表征。

图13示出在50mg/ml至7μg/ml的不同的物质量浓度中对位于pH7.3的PBS中的蛋白质链霉亲和素的示例性测量。毛细管扫描说明毛细管中的不同的荧光强度。上部的图表示出用于开始测量热展开的毛细管扫描。所有浓度已经作为副本测量。峰值的高度对应于在350nm的发射波长时毛细管中的荧光强度。在链霉亲和素浓度高时荧光的下降通过内滤波效应来阐明，所述内滤波效应通过激发光的强的吸收和由此减小的进入深度得以实现(由此更小的荧光)。下部的图表示出在350nm和330nm处荧光比的温度变化曲线。这些展开变化曲线示出：对于所有浓度记录展开简档。在所有浓度中，可以看到清楚的展开过程。在链霉亲和素浓度高时，熔化转变向更高的温度移动，这归因于蛋白质的分子内稳定化。

图14示出用于蛋白质MEK1激酶的强制降解测试的示例性数据。由蛋白质以50mM的pH7.4的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、150mM的NaCl和2mM的DTT制备浓度为1mg/ml的溶液，并且将其划分为50μl的5等分试样。一个等分试样已经在4℃中贮存并且用作为参照，而其余等分试样经受不同的条件——在温度提高时培育、冻融周期、强烈搅拌。接着，所有样品已经填充到毛细管中，转移到毛细管载体上并且被压紧，并且在加热速率为1℃/min时从25℃至90℃的热展开经由荧光来检测。上部的图表示出样品的展开变化曲线。根据以前的处理，展开变化曲线的起始水平是不同的，这指明已经展开的蛋白质的不同的份额。下部的图表以％示出未展开的蛋白质的份额的量化，其中4℃培育的样品作为0％展开，而在60℃时培育15分钟后的样品已经用作为参照。

图15示出用于识别对于贮存抗体而言最佳的条件的缓冲液筛选的示例性数据。单克隆抗体已经在具有不同的pH值的乙酸盐缓冲液中在浓度为5mg/ml的情况下以及在不存在和存在130mM的NaCl时贮存。每种抗体溶液的各10μl接着被填充到玻璃毛细管中，并且与温度相关的蛋白质展开经由荧光改变测量以及与温度相关的聚集经由在加热速率为1℃/分钟时的消光增加来测量。图15a)和b)示出聚集的与温度相关的增加。在所示出的情况中，总聚集随着pH值的增大而提高，这通过聚集信号中的较大的振幅来表征。添加生理盐浓度引起在所有pH值中聚集的进一步增加(b)。图c)和d)示例性地示出对聚集起始温度的确定，所述聚集起始温度对应于如下最低温度，在所述最低温度下记录消光相对于基线的显著提高。图d)示例性地示出聚集温度与pH值和盐浓度的不同的相关性。图e)和f)示出荧光数据，所述荧光数据根据本发明同时借助于在图15a)和b)中所示出的聚集数据来记录。抗体随着溶液的pH值增加而显示出更大的热稳定性。此外，NaCl对热稳定性有负面影响，这通过蛋白质展开在较低的温度中开始而可见。通过类似的实验能够确定如下条件，在所述条件下，蛋白质例如抗体的热稳定性最大而聚集最小。

图16示出蛋白质的示例性的吸收光谱。

本发明同样包括精确的或确切地表述、特征、数值或范围等，如果在上文或者下文中这些表述、特征、数值或者范围已经结合表述例如“大约、大概、左右、基本上、一般、至少、最少”等等所提及的话(也就是说，“大约3个”同样应当包括“3个”，或者“基本上径向地也应当包括“径向地”)。此外，表述“或”意味着“和/或”。

附图标记列表

10： 样品

11： 不具有分散的/聚集的颗粒的样品

12： 具有一些分散的/聚集的颗粒的样品

13： 具有强烈分散的/聚集的颗粒的样品

14： 具有许多发荧光的颗粒的样品

15： 具有一些发荧光的颗粒的样品

16： 具有少量发荧光的颗粒的样品

20： 用于消光测量的射入的光

21： 用于荧光的激发光

22： 被反射的光

23： 荧光发射光

24： 在具体的散射角Q中的散射光

25： “所不期望的”散射光

26： “所不期望的”被反射的光

30： 毛细管

40： 用于荧光激发的光源

41： 用于消光的光源

50： 检测器1(荧光和消光)

51： 检测器2(荧光和消光)

52： 检测器3(消光)

53： 检测器系统

60： 用于40的准直透镜

61： 用于41的准直透镜

62： 物镜

63： 用于50的聚光镜

64： 用于51的聚光镜

65： 用于52的聚光镜

70： 用于40的激发滤波器

71： 用于40+41的组合的分束器

72： 用于分开激发和荧光的分束器

73： 荧光发射滤波器

74： 用于分开荧光的分束器

75： 用于分开荧光和消光的分束器

76： 消光滤波器

77： 反射性的、不发荧光的表面，例如硅表面

80： 毛细管载体的行进方向

90： 槽、沟道、沟渠、留空部

91： 边缘区域

100： 根据本发明的用于检测的变型形式

200： 根据目前的科学现状的用于散射光的检测光学装置

Claims (33)

1.一种用于光学地测量液态的样品(10)中的颗粒的至少稳定性和聚集的方法，所述样品位于样品容器(30)中，其中所述方法具有下述步骤：

将所述样品容器置于调温元件(77)上，其中所述样品容器(30)借助所述调温元件(77)调温，和所述调温元件(77)由包含硅或者由纯硅构成的材料制成，

用至少一个第一波长(21)的光辐照所述样品(10)，以便荧光性地激发所述颗粒，

用至少一个第二波长(20)的光辐照所述样品(10)，以便检验所述颗粒的分散，

测量由所述样品(10)发射的荧光性光；以及

在所述第二波长时测量消减光(22)，其中射入的、所述第二波长(20)的光穿过所述样品容器(30)，向回反射，沿着相反方向再次穿过所述样品容器并且作为消减光出射，

其中基于所测量的荧光性光确定所述稳定性而基于所测量的消减光确定所述聚集，

其中所述样品容器(30)在测量周期期间相对于射入的所述第一波长和/或所述第二波长的光和/或检测器多次往复运动。

2.根据权利要求1所述的方法，其中借助于共同的光学系统测量所述荧光性光和所述消减光。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中

i)不同时用所述第一波长和所述第二波长辐照所述样品；或者

ii)用所述第二波长持久地进行辐照，而用所述第一波长间歇地进行辐照。

4.根据权利要求3所述的方法，其中

用所述第一波长周期地进行辐照。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中同时测量所述荧光性光和所述消减光。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中

i)由共同检测器(53)测量所述消减光和所述荧光性光；

ii)由第一检测器(50)和/或第二检测器(51)测量所述消减光，并且由所述第一检测器(50)测量第一荧光波长的荧光性光而由所述第二检测器(51)测量第二荧光波长的荧光性光；或者

iii)由第一检测器(52)测量所述消减光，由第二检测器(51)测量第一荧光波长的荧光性光，并且由第三检测器(50)测量第二荧光波长的荧光性光。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品容器(30)是毛细管(30)。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述样品容器(30)调温。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将所述样品容器(30)通过接触调温。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述调温元件向回反射所述第二波长的射入的光，使其沿着相反方向再次穿过所述样品容器(30)并且作为消减光出射。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述调温元件(77)由如下材料制造：

i)所述材料具有<1％的、低的固有荧光性，和/或

ii)所述材料在所述第二波长的波长范围中具有>30％的、高的反射率。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述调温元件的表面上构成至少一个槽(90)，所述样品容器设置在所述槽上方，并且射入的、所述第二波长(20)的光由所述槽(90)的底部向回反射。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述槽(90)具有在1mm和10mm之间的宽度和大于所述第二波长的光的半个相干长度的深度。

14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品容器(30)在测量周期期间相对于射入的所述第一波长和/或所述第二波长的光和/或检测器移动。

15.根据权利要求1或2所述的方法，其中多个样品容器或多个毛细管(30)通过所述相对运动扫描。

16.根据权利要求14所述的方法，其中

i)确定荧光值，其方式是：关于所述移动对所述荧光性光的强度积分，和/或

ii)确定消光值，其方式是：关于所述移动对所述消减光的强度积分。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中在测量周期期间

i)改变所述样品的温度，以确定热稳定性；

ii)不同地选择不同的液态的样品中的变性剂的浓度，以确定化学稳定性；和/或

iii)在大于一小时的时长内基本上在恒定的温度下保持所述样品，以确定时间稳定性。

18.根据权利要求17所述的方法，其中在测量周期期间提高所述样品的温度，以确定热稳定性。

19.根据权利要求14所述的方法，其中在所述测量周期期间多个样品容器和/或所述光学系统多次连续地往复运动，并且在所述运动期间进行所述荧光性光和/或所述消减光的测量。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述第二波长(20)选择为，使得由所述样品或所述样品中的颗粒吸收小于1％、0.1％、0.05％。

21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一波长和第二波长的光合并为共线的射束，所述射束射入所述样品容器中。

22.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二波长的消减光与射入方向偏离最高5°，其中所述第二波长的消减光向回反射并且沿着与射入方向相反的方向从所述样品容器出射。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述第二波长的消减光与射入方向偏离最高小于2°。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第二波长的消减光与射入方向偏离小于1°。

25.一种根据权利要求1至24中任一项所述的用于光学地测量液态的样品(10)中的颗粒的稳定性和聚集的设备，所述样品位于样品容器(30)中，其中所述设备具有：

第一光源(40)，用于将第一波长的光射入到所述样品容器中，以便荧光性地激发待检验的所述颗粒，

第二光源(41)，用于将第二波长的光射入到所述样品容器中，以便测量所述颗粒的分散，

用于测量被激发的荧光性光的第一检测器，所述荧光性光从所述样品中放射，

用于在所述第二波长时测量消减光(22)的第二检测器，其中射入的、所述第二波长(20)的光穿过所述样品容器(30)，向回反射，沿着相反方向再次穿过所述样品容器并且作为消减光出射，并且

评估装置，所述评估装置基于所测量的所述荧光性光确定所述颗粒的稳定性并且基于所测量的所述消减光确定所述颗粒的聚集，和所述样品容器置于调温元件(77)上，其中所述样品容器(30)借助所述调温元件(77)调温。

26.根据权利要求25所述的设备，其具有调温元件，所述调温元件具有反射性的表面，射入的所述第二波长的光在所述表面处向回反射。

27.根据权利要求26所述的设备，其中所述设备设立用于将至少一个样品容器(30)设置在所述表面上以进行测量。

28.根据权利要求27所述的设备，其中至少一个所述样品容器(30)是毛细管(30)。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的设备，其中反射性的所述表面由硅构成。

30.根据权利要求29所述的设备，其中反射性的所述表面由晶体硅构成。

31.根据权利要求26至28中任一项所述的设备，其中在所述调温元件的所述表面上构成有至少一个槽(90)，所述样品容器设置在所述槽上方，并且射入的、所述第二波长(20)的光从所述槽(90)的底部向回反射。

32.根据权利要求31所述的设备，其中所述槽(90)具有在1mm至10mm之间的宽度和大于所述第二波长的光的半个相干长度的深度。

33.一种将根据权利要求25至32中任一项所述的设备用于执行根据权利要求1至24中任一项所述的方法的应用。