ES2904490T3 - Sistema y método para la medición óptica de la estabilidad y la agregación de partículas - Google Patents

Abstract

Método para la medición óptica de al menos la estabilidad y la agregación de partículas en una muestra líquida (10) que se encuentra en un recipiente de muestra (30), presentando el método las siguientes etapas: irradiar la muestra (10) con luz de al menos una primera longitud de onda (21) para excitar las partículas fluorescentes, irradiar la muestra (10) con luz de al menos una segunda longitud de onda (20) para examinar la dispersión de las partículas, medir la luz de fluorescencia que es emitida por la muestra (10); y medir la luz de extinción (22) a la segunda longitud de onda, de modo que la luz irradiada de la segunda longitud de onda (20) atraviesa el recipiente de muestra (30), es retrorreflejada, atraviesa el recipiente de muestra nuevamente en la dirección opuesta y sale como luz de extinción, en el que son determinadas la estabilidad basándose en la luz de fluorescencia medida y la agregación basándose en la luz de extinción medida.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema y método para la medición óptica de la estabilidad y la agregación de partículas

La invención se refiere en general a un aparato o a un sistema y a un método para la medición óptica de la estabilidad de partículas. En particular, la invención se refiere a un sistema y a un método con los que se puede medir ópticamente no solo la estabilidad de partículas, sino también la agregación de partículas. Según la invención, la estabilidad y la agregación de partículas se pueden medir preferiblemente con un único dispositivo, con preferencia simultáneamente o casi simultáneamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Dado que los agentes activos, como por ejemplo los anticuerpos, fueron desarrollados de tal manera que solo están activos en su forma nativa, los agentes activos desnaturalizados a menudo no son efectivos y deben evitarse. La desnaturalización denota una modificación estructural de las biomoléculas, como por ejemplo las proteínas (albumina), que en la mayoría de los casos se asocia con una pérdida de la función biológica de estas moléculas. Una desnaturalización puede deberse a influencias físicas o químicas. Por tanto, es necesario desarrollar formulaciones de agentes activos que eviten la desnaturalización de los medicamentos, es decir, que los estabilicen por ejemplo térmica, químicamente y/o con respecto al tiempo.

También una agregación o agregado de agentes activos puede conducir a una ineficacia. Además, las partículas agregadas y/o desnaturalizadas, por ejemplo anticuerpos agregados, pueden desencadenar en el cuerpo una reacción del sistema inmunológico y por tanto deben evitarse en los medicamentos o debe minimizarse su proporción en el medicamento.

La desnaturalización de partículas, por ejemplo anticuerpos, debe ser evitada en sí porque reduce la eficacia. La agregación de partículas, por ejemplo anticuerpos, debe evitarse en sí ya que provoca una reacción del sistema inmunológico y también puede conducir a una reducción de la eficacia.

A menudo no está claro por qué una partícula se agrega y/o se desnaturaliza: ¿se agrega una partícula porque se desnaturaliza, es decir porque no está presente en su forma nativa, o se agrega en su forma nativa y luego se desnaturaliza? Por tanto, para una caracterización completa de las partículas, a menudo no es suficiente analizar solo la agregación o solo la desnaturalización por separado una de otra.

Con el sistema y el método según la invención se pueden medir tanto la desnaturalización como la agregación de partículas. En particular, con el sistema y el método según la invención se pueden medir tanto la desnaturalización como la agregación de partículas casi simultáneamente (esencialmente al mismo tiempo) o simultáneamente.

La desnaturalización de las partículas es un proceso "dentro de la partícula" y puede ser medido en el método y el sistema según la invención midiendo la fluorescencia intrínseca de las partículas (por ejemplo, fluorescencia de triptófano, fluorescencia de tirosina). Al mismo tiempo, la agregación de las partículas, un proceso "entre partículas" que cambia el tamaño de las partículas, puede ser medido mediante la dispersión de luz no absorbida.

Dado que la dispersión de la luz, por ejemplo la dispersión de la luz estática en el caso de la dispersión de Rayleigh, depende de la sexta potencia del tamaño de partícula (radio), es muy adecuada para medir cambios en el tamaño de partículas y por tanto la agregación de partículas. Este método de dispersión de la luz es conocido y utilizado por muchos aparatos y métodos. En particular, los aparatos conocidos por el estado de la técnica miden la luz dispersa de las partículas en determinados ángulos sólidos, es decir, la proporción de luz que se dispersa de una partícula en un cierto ángulo sólido con respecto a la luz incidente. Cuanto mayor sea la partícula y menor la longitud de onda, mayor será la intensidad de esta luz dispersa para un ángulo fijo adecuadamente elegido Tal método se describe, por ejemplo, en la solicitud de EE.UU. 2014/0234865 A1.

Por tanto, de un aumento de la luz dispersa, por ejemplo durante el aumento de temperatura, estos métodos pueden inferir un cambio de tamaño y por consiguiente la agregación de las partículas. Un experto en el campo de los métodos de dispersión de la luz sabe que debe evitarse que la luz de excitación, que es irradiada sobre las partículas que van a ser examinadas, entre en la óptica de detección. Un experto en la técnica construirá siempre dispositivos correspondientes de manera que se evite una detección directa de esta luz de excitación o se bloquee la luz de excitación, lo que requiere un esfuerzo técnico considerable. Por ejemplo, en el documento de patente DE 10 2007 031 244 está descrito que en las mediciones de luz dispersa las reflexiones son indeseables y que las reflexiones en cubetas de vidrio también pueden dar lugar a problemas.

Por tanto, existe la necesidad de un sistema mejorado o alternativo o un método mejorado o alternativo para medir la estabilidad y la agregación de partículas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El aparato según la invención, así como el método según la invención son definidos por las características de las reivindicaciones independientes. Realizaciones ventajosas resultan de las reivindicaciones dependientes.

La invención se refiere a un método para la medición óptica o la determinación de la estabilidad y/o la agregación de partículas en una muestra líquida que se encuentra en un recipiente de muestra. Según la invención, la agregación se puede medir independientemente de la estabilidad; sin embargo, preferentemente son determinadas tanto la agregación como la estabilidad. El método según la invención comprende al menos una de las siguientes etapas.

La muestra es irradiada con luz o con un rayo de luz de una primera longitud de onda, en particular para estimular la fluorescencia de las partículas. La luz de la primera longitud de onda es, por tanto, una luz de excitación de fluorescencia. Para determinar la fluorescencia de la muestra se mide la luz de fluorescencia que es emitida por la muestra. Típicamente, la longitud de onda de la luz fluorescente difiere de la primera longitud de onda de la luz de excitación de fluorescencia. Basándose en el brillo o la intensidad de la luz de fluorescencia medidos se puede llegar a una conclusión sobre la estabilidad de las partículas. Preferiblemente, el detector mide la fluorescencia con luz de excitación de fluorescencia en un rango de longitud de onda de 260 nm a 300 nm, más preferiblemente en un rango de longitud de onda de 270 nm a 290 nm y la luz de emisión de fluorescencia en un rango de longitud de onda de 320 nm a 380 nm.

La agregación de partículas se determina irradiando la muestra con luz de una segunda longitud de onda, preferiblemente con una primera intensidad I0. Según la invención, una primera o una segunda longitud de onda puede corresponder a una longitud de onda exacta, como es suministrada por ejemplo por un láser. Según la invención, el término de primera y segunda longitud de onda también puede ser una longitud de onda "media" o una longitud de onda "central", es decir, en el sentido de un rango de longitud de onda. Por ejemplo, rangos de longitud de onda son emitidos por una fuente de luz cuando no se trata de un láser. Según la invención, se utilizan preferiblemente LED que emiten luz en un rango de longitud de onda estrecho o grande. Para limitar el rango de longitud de onda, preferiblemente se incorpora en la trayectoria de los rayos un filtro de paso de banda = "filtro de excitación". Por ejemplo, un filtro de paso de banda correspondiente puede tener una anchura de paso de banda entre 30 nm y 1 nm para obtener el rango de longitud de onda de excitación deseado. Esto es preferible en particular en el caso de la fluorescencia, de modo que la luz que es emitida por el LED se restringe a un rango de longitud de onda que no está en el rango de longitud de onda de la detección de emisión de fluorescencia. Además, también es preferible utilizar un LED para la medición de la extinción. También aquí un filtro de paso de banda con una anchura de paso de banda adecuado puede ser usado de manera análoga para limitar el rango de longitud de onda que es emitido sobre la muestra a una "segunda longitud de onda" (segundo rango de longitud de onda).

La dispersión de las partículas es determinada preferiblemente con la segunda longitud de onda. Según la invención, la luz de extinción es medida a la segunda longitud de onda, de modo que la relación de la luz incidente o irradiada I0 de la segunda longitud de onda que atraviesa el recipiente de muestra y la luz que sale I (intensidad I), igualmente a la segunda longitud de onda, describe la extinción. Preferiblemente la radiación entrante I0 atraviesa el recipiente de muestra, se refleja, pasa a través del recipiente de muestra en la dirección opuesta a la dirección de incidencia y luego sale como luz I, también denominada luz de extinción en el contexto de la presente invención. Basándose en el brillo o la intensidad I medidos de la luz que sale (luz de extinción), en particular en relación con la intensidad de la luz incidente I0, se puede sacar una conclusión sobre la estabilidad de las partículas. Según la invención también se puede realizar una medición de la agregación pura sin una medición de la fluorescencia mencionada anteriormente.

Preferiblemente la segunda longitud de onda es seleccionada de modo que las partículas que van a ser examinadas en la muestra no sean absorbidas a esta longitud de onda o solo sean absorbidas muy ligeramente, preferiblemente menos del 10 %, más preferiblemente menos del 5 %, aún más preferiblemente menos del 4 %, 3 %, 2 % o 1 %. Todavía más preferiblemente menos del 0,1 %. Además, es preferible que la longitud de onda sea seleccionada con referencia al comportamiento de absorción de las partículas, y no con referencia a la "muestra" completa o "líquido de muestra", ya que eventualmente pueden estar presentes aditivos en la muestra o líquido de muestra que sean absorbidos en el líquido seleccionado. Sin embargo, dado que la invención investiga la estabilidad y la agregación de las partículas, se puede suponer que el comportamiento de absorción de los componentes restantes es "constante".

Por ejemplo, se sabe que las proteínas absorben luz en el rango de 200 nm a 300 nm y concretamente debido a sus enlaces peptídicos (máximo de la absorción a aprox. 220 nm) y sus aminoácidos (máximo de la absorción a aprox.

280 nm). Por tanto, de acuerdo con la invención, se utiliza preferiblemente luz de una longitud de onda superior a 300 nm (véase la figura 16). Preferiblemente, la primera y la segunda longitudes de onda son diferentes. Alternativamente, la primera y la segunda longitudes de onda también pueden ser iguales.

Para la medición de la fluorescencia se utiliza al menos una primera longitud de onda. Según la invención, también es posible utilizar para la medición de fluorescencia además de la primera longitud de onda también otra longitud de onda. Así, por ejemplo se puede excitar una primera fluorescencia a una longitud de onda de 280 nm y se puede excitar una segunda fluorescencia en un segundo canal de fluorescencia a 632 nm.

De manera correspondiente según la invención también se puede utilizar al menos una segunda longitud de onda para la medición de la extinción. Por ejemplo, se puede medir una extinción a dos longitudes de onda diferentes; por ejemplo a 385 nm y 532 nm. Entonces es posible, por ejemplo, formar y evaluar una relación de los valores medidos en las dos longitudes de onda para por ejemplo cuantificar la dispersión de Mie.

En otras palabras, según la invención es posible utilizar dos o más canales de fluorescencia y/o dos o más canales de extinción para la determinación.

El método según la invención o el sistema según la invención siguen un enfoque completamente diferente en comparación con las mediciones clásicas de dispersión de la luz. De acuerdo con la invención, preferiblemente se mide la luz que no se dispersa. Además, se utiliza preferiblemente luz de una longitud de onda que no sea absorbida por las partículas. Es decir, la señal medida disminuye cuando aumenta la dispersión debido a un aumento del tamaño de las partículas. Esta técnica de medición según la invención se combina preferiblemente con una óptica de fluorescencia especial, que preferiblemente permite una detección simultánea más rápida, más precisa y más robusta de la agregación (por extinción) y la detección de la desnaturalización o desplegamiento de proteínas (por fluorescencia) con alto rendimiento.

El método según la invención se lleva a cabo preferiblemente de tal manera que la luz de excitación para la medición de la agregación atraviese el recipiente de muestra dos veces y se retrorrefleje en el detector (véase la Figura 1). Según la invención también es posible que la luz de excitación para la medición de la agregación pase a través del recipiente de muestra solo una vez y luego se mida la transmisión simple. Tanto la transmisión directa como la transmisión después de la reflexión significan que se mide una “porción residual” de la luz de excitación, es decir exactamente lo que debería evitarse en los métodos conocidos.

En principio, según la invención se mide una extinción. En óptica, la extinción o densidad óptica es la opacidad O formulada por percepción logarítmicamente y, por tanto, es una medida de la atenuación de una radiación (por ejemplo, luz) después de que ha pasado a través de un medio. Con I0 como radiación incidente e I como radiación saliente, la extinción E describe el grado de transmisión r como magnitud logarítmica:

1

logio “ - logio 0A

rA

En la atenuación/extinción generalmente están involucrados los procesos de absorción, dispersión, difracción y reflexión. Dado que según la invención se utilizan preferiblemente longitudes de onda que no son absorbidas por las partículas a examinar (por ejemplo por biomoléculas), y otras variables que influyen, como la reflexión y la difracción, se mantienen preferiblemente constantes, según la invención la atenuación se mide esencialmente basándose en la dispersión pura.

La ventaja de este modo de proceder en particular es que este principio de medición de "dispersión" se puede integrar fácilmente en una óptica (individual) para medir la fluorescencia intrínseca de las partículas. Por tanto, con solo una óptica se puede detectar o medir tanto la desnaturalización de las partículas en la escala de los nm como también su agregación en la escala de nm-pm. Dependiendo de la forma de realización, las dos mediciones pueden realizarse secuencialmente, en seguida una tras otra o incluso simultáneamente.

Según la invención las muestras a examinar son examinadas preferiblemente en capilares, lo que además tiene la ventaja preferida de que los capilares se pueden llevar rápidamente a la posición de medición deseada, lo que permite que se pueda analizar una pluralidad de muestras en paralelo. Esto garantiza además una alta densidad de puntos de datos que permite registrar y evaluar con precisión incluso pequeñas variaciones de señal, lo que hasta ahora no ha sido garantizado por los métodos existentes.

Según la invención se pueden colocar varios capilares directamente sobre un elemento de soporte del dispositivo de medición. Según otra forma de realización, también pueden estar dispuestos varios capilares en un soporte separado, lo que también permite el llenado y/o la medición semiautomáticos o automáticos.

La solicitante de la presente invención, NanoTemper Technologies GmbH, desarrolla y comercializa aparatos de medición con los que son examinados ópticamente líquidos dentro de un capilar. Es conocido además que se toma un capilar individual con la mano, se sumerge en un líquido y luego se deposita individualmente en un soporte y después es empujado dentro del aparato de medición. Este método para llenar capilares individuales se muestra por ejemplo en un video de NanoTemper Technologies GmbH que está publicado en http://www.youtube.com con el título "NanoTemper Technology: Aprenda sobre el manejo de NT.115". El llenado individual es ventajoso para determinadas muestras individuales, pero para grandes cantidades de muestras, este método requiere muchas etapas de manipulación que no pueden ser automatizadas fácilmente.

En la solicitud EP 2 572 787, que fue presentada por la misma solicitante que la presente invención, se describen capilares que se sujetan en un soporte con la ayuda de fuerzas magnéticas. Esto permite, entre otras cosas, un posicionamiento más simple y/o más preciso de los capilares individuales en el soporte. En otras palabras, es más preferible el llenado individual de los capilares individuales, pero la etapa de manipulación siguiente es favorecida por las fuerzas magnéticas.

Finalmente, en la solicitud EP 2 848 310 se describe un soporte separado para capilares, que también permite el llenado y/o medición semiautomáticos o automáticos. En particular, estos soportes también se pueden utilizar para el método según la invención, lo que ofrece la ventaja adicional de que los diversos capilares no solo pueden ser llenados de manera eficiente, sino que también pueden ser barridos muy rápidamente.

A continuación se definen algunos términos, tal como deben entenderse en el contexto de la presente solicitud.

Partículas

Partículas en el sentido de la presente solicitud son preferiblemente, sin limitarse a ello: agentes activos, biomoléculas en general, por ejemplo proteínas, anticuerpos, proteínas de membrana, receptores de membrana, péptidos, nucleótidos, ADN, ARN, enzimas; fragmentos moleculares, “moléculas pequeñas”, azúcares, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos; vesículas, virus, bacterias, células, micelas, liposomas, preparaciones de membrana, microperlas y/o nanopartículas.

Medida de la fluorescencia

La partícula, preferiblemente proteína, puede desnaturalizarse química o térmicamente y los cambios estructurales internos pueden medirse mediante fluorescencia intrínseca, por ejemplo fluorescencia de triptófano, fluorescencia de tirosina, fluorescencia de fenilalanina, preferiblemente fluorescencia de triptófano en el caso de las proteínas. Asimismo, los cambios estructurales/internos de la partícula se pueden detectar mediante cambios de la intensidad de fluorescencia o desplazamiento de los máximos de fluorescencia, o cambios de la duración de la fluorescencia, etc. También el llamado punto de fusión de la partícula a ser examinada, por ejemplo de la proteína, puede ser determinado de esta manera. El punto de fusión se define como el estado en el que la partícula que se va a examinar, por ejemplo la proteína, está la mitad plegada (por ejemplo, proteína: en conformación nativa) y la mitad desplegada (por ejemplo, proteína: forma desestructurada, desnaturalizada). Asimismo, el cambio en la intensidad de la fluorescencia puede ser determinado por ejemplo en función de la temperatura o de la adición de un desnaturalizante o cofactor/ligando y/o se puede registrar un perfil de tiempo.

En el caso del examen de proteínas, por ejemplo la fluorescencia de triptófano puede ser medida a una longitud de onda de 330 nm /- 10 nm y 350 nm /- 10 nm al mismo tiempo pero espectralmente por separado. El cociente entre la intensidad de la fluorescencia a 350 nm y la intensidad de la fluorescencia a 330 nm (F350/F330) es una variable de medición preferida, ya que depende de la estructura interna/cambios de conformación de las partículas. Por ejemplo, el máximo de emisión de fluorescencia del triptófano se desplaza de longitudes de onda de onda corta (por ejemplo, 330 nm /- 10 nm) a longitudes de onda de onda larga (por ejemplo, 350 nm /- 10 nm), cuando debido al desplegamiento de una proteína el triptófano sale de un entorno hidrófobo, por ejemplo el interior de una proteína, y entra en un entorno hidrófilo, por ejemplo agua. Por ejemplo, el punto de fusión puede ser determinado a partir del máximo de la primera derivada de la curva F350/F330.

Medición de la extinción/dispersión

Las partículas en las soluciones pueden dispersar la luz irradiada. En física, por dispersión se entiende generalmente la desviación de un objeto por la interacción con otro objeto local (centro de dispersión). La dispersión de la luz en las partículas es, por tanto, la desviación de la luz irradiada (de excitación) por la interacción con una partícula que se va a examinar. El ángulo de dispersión 0 se define como el ángulo con el que se desvía la luz dispersa. Según la invención, se habla de dispersión cuando la luz se desvía en concreto, preferiblemente más de 1°, preferiblemente más de 2°, 3°, 4° y preferiblemente menos de 179°, 178°, 177°, 176° medido a partir del curso del rayo de luz irradiado (de excitación).

Se distinguen diferentes tipos de dispersión, como por ejemplo la dispersión de Rayleigh (tamaños de partículas — 1 /10 de la longitud de onda de la luz, es decir, tamaños de partículas que son pequeños en comparación con la longitud de onda de la luz) y la dispersión de Mie (tamaños de partículas en el rango de tamaño de la longitud de onda de la luz y superiores). La extensión de la dispersión en una solución depende del tamaño y el número de partículas. Dado que la intensidad de dispersión de la dispersión de Rayleigh depende del inverso de la cuarta potencia de la longitud de onda, es más pronunciada en rangos de longitudes de onda corta, por ejemplo de 300-400 nm, que en rangos de longitud de onda larga. La extensión de la dispersión se puede cuantificar midiendo la extinción, comparando la intensidad de la luz irradiada con la intensidad de la luz transmitida. La diferencia corresponde a la cantidad de luz dispersada y por tanto sirve como medida para la formación de partículas o la agregación de partículas.

Para biomoléculas, por ejemplo proteínas, la detección de la extinción a una longitud de onda superior a 300 nm es ventajosa. En particular, la detección de la extensión entre 300 y 400 nm es ventajosa, y a aproximadamente 385 nm es especialmente ventajosa, dado que aquí esencialmente ya no se absorbe luz (el máximo de la absorción de las proteínas se sitúa a aproximadamente 280 nm), pero la dispersión debida a la dependencia de la longitud de onda de la dispersión de Rayleigh es muy grande. Por ejemplo, la utilización de luz a 385 nm es ventajoso, ya que los LED adecuados en el mercado son más potentes a esta longitud de onda que los LED con una longitud de onda significativamente más corta. En particular, una potencia de luz intensa es ventajosa para detectar muchos fotones. Así, por ejemplo la medición de la extinción a menudo está limitada por el ruido de los fotones. La relación señal-ruido del ruido de fotones sigue una distribución estadística de Poisson, es decir mejora con la raíz (número de fotones).

Además, la selección antes mencionada de la longitud de onda para la extinción también ofrece otras ventajas. Dado que la luz no es absorbida por las partículas, las partículas tampoco se destruyen, por lo que se puede utilizar una potencia de luz "fuerte" en este rango de longitud de onda. La potencia de luz del LED para la medición de la extinción está preferiblemente en el rango de más de 100 gW, preferiblemente en el rango superior a 1 mW. Preferiblemente la potencia de luz del LED para la medida de la extinción está en el rango de 0,1 mW a 5 mW.

Para la medida de la extinción es ventajoso un ruido bajo de la señal y una deriva baja de la fuente de luz de excitación. Los LED pueden ser operados con controles LED adecuados, de una manera muy estable y con poco ruido y por tanto son ventajosos para las mediciones de la extinción.

Dado que las biomoléculas, por ejemplo las proteínas, son significativamente más pequeñas que los rangos de longitud de onda ventajosos, se puede suponer la dispersión de Rayleigh. Dado que la dispersión de Rayleigh depende de la sexta potencia del diámetro de partícula, los cambios en el tamaño de las partículas, por ejemplo provocados por una agregación de partículas, conducen a un fuerte cambio en la dispersión. Dado que la dispersión de partículas tiene lugar en todas las direcciones espaciales, según la invención se propone cuantificar la dispersión o una medida de la dispersión a través de la extinción, ya que aquí es posible una cuantificación de la dispersión total independiente del ángulo de dispersión, al contrario que las mediciones de dispersión de luz convencionales en las que se detecta la luz dispersa solo en un rango angular pequeño. Las mediciones de extinción además son menos sensibles a los artefactos de medición, por ejemplo reflexiones en las superficies límite y suciedades, tales como por ejemplo partículas de polvo.

Longitudes de onda o rangos de longitud de onda preferidos para las mediciones de la extinción pueden derivarse por ejemplo de la figura 16, en la que está representado un espectro de absorción para proteínas. Por ejemplo, a partir de este espectro se puede deducir que son preferidas longitudes de onda superiores a 280 nm, más preferiblemente superiores a 300 nm.

Recipiente de muestra

Según la invención se examinan muestras que se encuentran en forma de líquidos o fluidos en recipientes o recipientes de muestras. En principio, el método según la invención no se limita a un tipo y forma determinados de recipientes de muestra. Sin embargo, preferiblemente se utilizan capilares como recipientes de muestra, lo que tiene varias ventajas. Por ejemplo, la utilización de capilares finos conduce a un bajo consumo de material debido al pequeño volumen. Además, los capilares finos ofrecen altas fuerzas capilares para succionar pasivamente el líquido solo por las fuerzas capilares. Incluso líquidos altamente viscosos pueden ser succionados a través de los capilares por las fuerzas capilares. Por ejemplo, también es posible dar la vuelta a la muestra a succionar, de modo que también las fuerzas gravitacionales actúen en la dirección de las fuerzas capilares y así favorezcan el llenado. La utilización de capilares desechables evita la contaminación cruzada entre las muestras individuales. Capilar fino significa que la longitud de la trayectoria óptica a través del capilar es pequeña. Esto es ventajoso para poder medir también soluciones altamente concentradas (alta concentración de partículas). De acuerdo con la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, capilares individuales o capilares en soportes. Así pues, es posible colocar, por ejemplo, un soporte con múltiples capilares sobre la superficie reflectante, preferentemente con los múltiples capilares en contacto con la superficie, sin tener que retirar los capilares del soporte. En otras palabras, los capilares se pueden templar por contacto con la superficie a través del templado por contacto, mientras que los capilares permanecen en el soporte.

Los soportes preferidos con capilares son descritos, por ejemplo, en el documento EP 2 848 310. En particular, el documento EP 2848 310 se refiere a un soporte para varios capilares, con el que es posible el llenado simultáneo de varios capilares desde una placa microtituladora. Además, el documento EP 2 848 310 también se refiere a un aparato y a un método para llenar, transportar y medir líquidos con volúmenes en el rango de microlitros. De acuerdo con una realización preferida, se pueden disponer 24 capilares en un soporte.

La muestra líquida está preferiblemente en un estado estático, es decir, sin flujo dentro de los capilares durante la medición. Durante la medición, preferiblemente no hay corrientes dentro de los capilares que vayan más allá del movimiento de temperatura natural y/o cualquier movimiento inducido por evaporación en el líquido.

Los capilares pueden ser de fabricados vidrio y/o de un polímero y/o de al menos uno de los elementos: vidrio de borosilicato, vidrio de borosilicato 3.3 (por ejemplo, vidrio de Duran), vidrio de cuarzo fabricado sintéticamente, como de Suprasil, Infrasil, vidrio común, Bk-7, vidrio ASTM clase A tipo 1, vidrio ASTM Clase B tipo 1. Los polímeros pueden contener: PTFE, p Mm A, Zeonor™, Zeonex™, teflón AF, PC, PE, PeT, PPS, PVDF, PFA, FEP y/o vidrio acrílico.

En particular es preferible que al menos una zona de los capilares sea transparente a la luz con una longitud de onda de 200 nm a 1000 nm, preferiblemente de 250 nm a 900 nm. Particularmente preferida, pero no limitada a ello, esta zona del capilar también es transparente para la luz de los siguientes rangos de longitud de onda: de 940 nm a 1040 nm (preferiblemente 980 nm /- 10 nm), de 1150 nm a 1210 nm, de 1280 nm a 1600 nm (preferiblemente 1450 nm /-20 nm y/o 1480 nm /- 20 nm y/o 1550 nm /- 20 nm), de 1900 nm a 2000 nm (preferiblemente 1930 nm /- 20 nm). El experto en la materia comprenderá que la zona o zonas transparentes también pueden extenderse a través de todo el capilar. En otras palabras, los capilares pueden ser transparentes y preferiblemente están hechos de una pieza a partir de uno de los materiales mencionados anteriormente.

Los capilares utilizados tienen preferiblemente un diámetro interior de 0,1 mm a 0,8 mm, preferiblemente de 0,2 mm a 0,6 mm, más preferiblemente de 0,5 mm. El diámetro exterior de los capilares preferidos se sitúa preferiblemente entre 0,2 mm y 1,0 mm, mas preferiblemente entre 0,3 mm y 0,65 mm.

La geometría de los capilares no se limita a una forma determinada. Preferentemente se utilizan capilares con forma de tubo con una sección transversal redonda o una sección transversal ovalada. Sin embargo, también es posible utilizar capilares con una sección transversal diferente, por ejemplo triangular, cuadrada, pentagonal o poligonal. Además, también se pueden utilizar capilares en los que el diámetro y/o la sección transversal a través de la longitud de los capilares no sea constante o sí sea constante.

Superficie de silicio

Según la invención los recipientes de muestra se sitúan sobre una superficie de silicio. Preferentemente se utilizan como recipientes de muestra capilares que están dispuestos sobre una superficie de silicio. La superficie de silicio sirve preferiblemente como superficie de espejo o superficie para la reflexión de la luz de excitación. Además, según la invención los recipientes de muestra o capilares se pueden poner en contacto directo con la superficie de silicio, de modo que se consigue un intercambio de calor por contacto directo entre el recipiente de muestra/capilar y el silicio. El silicio ofrece una serie de propiedades que son particularmente ventajosas para la presente invención.

El silicio no tiene autofluorescencia en el rango de longitud de onda preferido. El silicio tiene una alta reflexión en el rango de longitud de onda preferido según la invención (véase por ejemplo la figura 9). Además, el silicio tiene una alta conductividad térmica, lo que es especialmente ventajoso para la regulación de la temperatura rápida y homogénea de una pluralidad de capilares. Estas tres propiedades son particularmente ventajosas para el aparato según la invención o el método según la invención.

Otras ventajas del silicio son por ejemplo la resistencia química, la fácil disponibilidad del material y el procesamiento simple, que permite además formar superficies/formas muy lisas o muy precisas.

Sin embargo, la invención no está limitada a su utilización en silicio. En lugar de silicio, también se pueden utilizar otros materiales para la superficie de espejo y/o la regulación de la temperatura. En general, son adecuados materiales que muestran poca o ninguna autofluorescencia en el rango de medición de longitud de onda preferido y preferiblemente muestran al mismo tiempo una reflexión de la luz irradiada, por ejemplo > 10 % de reflexión. De acuerdo con la invención por ejemplo también se puede utilizar una capa de cuarzo o una placa de cuarzo, que preferiblemente está dotada de un revestimiento reflectante, por ejemplo un revestimiento interferométrico.

La presente invención ofrece una serie de ventajas en cuanto a eficiencia, velocidad y coste para la realización de varias mediciones. La combinación de capilares finos, que preferiblemente se apoyan sobre silicio y preferiblemente son desplazados continuamente con respecto a una única óptica, junto con la medición de la fluorescencia intrínseca (fluorescencia, fosforescencia, luminiscencia) y la medición de la dispersión (extinción) es preferida y particularmente ventajosa. En particular, debido a la combinación de las muy buenas propiedades de conductividad térmica, con su propiedad de reflejar la luz de la longitud de onda utilizada, el silicio es un material preferido. También la detección rápida y precisa de la extinción mediante el recorrido de una pluralidad de muestras sin tiempo de permanencia en capilares individuales aumenta drásticamente la velocidad de medición y la densidad de puntos de datos en comparación con los métodos convencionales.

El método según la invención y el aparato según la invención difieren fundamentalmente del estado de la técnica. En particular, de acuerdo con la invención los componentes son combinados de una manera que un experto en el campo de la dispersión de luz basada en las enseñanzas del estado de la técnica no utilizaría. Además, la medición según la invención también se diferencia de los métodos conocidos, como serían llevados a cabo por un experto en la materia en el campo de las mediciones de absorción. En principio, existen puntos en común entre el sistema óptico para una medición de la absorción y un aparato según la invención. Sin embargo, según la invención la longitud de onda para la medición de la extinción es seleccionada específicamente para que no sea absorbida por la muestra. Esto se consigue según la invención ya que puede ser medida la dispersión de la luz dependiendo de la dimensión.

Por el estado de la técnica es conocido por ejemplo un dispositivo que es vendido con el nombre UNit™ por unCHAINED LABS. En este dispositivo, las microcubetas tienen que ser llevadas individualmente y para la medición las microcubetas deben ser alineadas con precisión con respecto a la óptica de medición. Según la invención, los capilares se mueven constantemente/continuamente sin detenerse para la medición; los capilares son "barridos por completo". De este modo según la invención se consigue una realización mucho más robusta, más económica y, sobre todo, una densidad de datos mucho mayor.

Por el registro de espectros completos según el estado de la técnica, el tiempo de medición por microcubeta controlada es de varios segundos. Por tanto, la medición de por ejemplo 48 muestras a una única temperatura dura ya varios minutos. Una velocidad de calentamiento con el habitual 1° C /min conduce por tanto a una baja densidad de puntos de datos. Según la invención, ya es suficiente que únicamente se detecten dos longitudes de onda discretas (extinción y fluorescencia), por lo que los capilares pueden ser iluminados durante < 50 ms cada uno mientras pasan, de modo que según la invención se obtiene una densidad de puntos de datos que es de órdenes de magnitud mayor.

En el estado de la técnica se mide como es habitual una dispersión de luz estática, es decir, la luz de excitación es bloqueada para medir realmente solo una parte de la luz que es dispersada. Sin embargo, según la invención se mide la parte transmitida o la parte retrorreflejada, es decir, la luz o la parte de la luz irradiada que no se dispersa.

Además, la medición de la dispersión de la luz del estado de la técnica presupone un control preciso de las muestras, lo que supone un ajuste complejo y un mantenimiento regular. Esto tiene también como consecuencia una mala reproducibilidad, ya que incluso pequeños errores en el control de muestras individuales pueden provocar fluctuaciones en la señal de dispersión de la luz.

Según la invención la luz de extinción es medida después de que la luz haya pasado dos veces a través del capilar debido a la reflexión. En el caso de una alta concentración de partículas y de una trayectoria larga (por ejemplo, 1 cm), no retornaría más luz a través del capilar. Por tanto, según la invención son preferibles capilares finos con un diámetro interior de por ejemplo 0,5 mm. Las soluciones /métodos/aparatos que se encuentran actualmente en el mercado tienen problemas para manipular y medir soluciones altamente concentradas, por ejemplo anticuerpos altamente concentrados (por ejemplo, con 150 mg/ml de anticuerpo en solución acuosa). Por un lado, porque no pueden llenar líquidos muy viscosos en las cámaras de muestra utilizadas y, por otro lado, porque las longitudes de sus trayectorias ópticas son demasiado largas. Sin embargo, estas soluciones altamente concentradas son muy interesantes para la industria farmacéutica, en particular para la medición de la formulación.

La utilización de capilares fines permite un amplio rango de medición dinámica, ya que las mediciones son muy sensibles (poca /nula autofluorescencia del material capilar y del silicio en el caso de detección de la fluorescencia, alta transmisión de los capilares de pared delgada y buenas propiedades de reflexión/homogeneidad del silicio en caso de detección de la extinción) y al mismo tiempo permiten la medición de soluciones altamente concentradas (espesor de capa óptica delgada ventajosa para mediciones de la extinción de soluciones altamente concentradas). El método según la invención es robusto frente a los efectos del filtro interior ya que cada muestra individual es referenciada a sí misma. Por ello se pueden analizar grandes rangos de concentración de cantidades de sustancias, por ejemplo de 50 mg/ml de proteína a 5 gg/ml de proteína, en una única medición.

Propiedad del desplazamiento continuo hacia adelante y hacia atrás de los capilares por debajo de la óptica:

El desplazamiento relativo continuo preferido de los capilares con respecto a la óptica durante una medición (véanse las figuras 3 y 4) ofrece otras ventajas con respecto a la eficiencia y la precisión de la medición. Según la invención se pueden medir varias muestras en paralelo, por ejemplo regulando todas las muestras simultáneamente a la misma temperatura. El método según la invención no requiere un tiempo de permanencia prolongado en los capilares individuales; tampoco es necesario un desplazamiento dirigido a un punto de medición especial en el capilar, lo que hace que el proceso sea muy robusto y muy rápido.

Según la invención también se puede aprovechar la simetría del capilar, ya que las mediciones se realizan preferentemente perpendiculares al eje longitudinal del capilar. Además, son ventajosos los capilares redondos o cilíndricos (sección transversal redonda), ya que tales capilares se pueden fabricar no solo de forma barata, sino también con muy buena calidad y con alta precisión.

Por el proceso de barrido rápido según la invención se pueden alcanzar densidades de puntos de datos muy altas, lo que tiene un efecto ventajoso sobre la evaluación de datos. A continuación son calculadas algunas de estas ventajas mediante un ejemplo.

Por ejemplo, 48 capilares individuales con un diámetro interior de 0,5 mm y un diámetro exterior de 0,65 mm están dispuestos horizontalmente sobre el silicio con la temperatura regulada a una distancia de 2,25 mm (de centro de capilar a centro de capilar). Este cuerpo de regulación de la temperatura completo con los capilares es movido hacia adelante y hacia atrás continuamente por debajo una óptica montada de forma fija, por ejemplo por medio de un eje lineal que es accionado por ejemplo por un motor paso a paso.

Por ejemplo, el cuerpo de regulación de la temperatura, y por tanto los capilares, son desplazados por debajo de la óptica a una velocidad de por ejemplo 45 mm/s. A esta velocidad, los 48 capilares a una distancia de 2,25 mm son recorridos en aproximadamente 3 segundos. En especial, al moverse hacia adelante y hacia atrás, cada capilar es medido en promedio cada 3 segundos ("promedio" porque por ejemplo los dos capilares más externos se miden prácticamente de forma instantánea dos veces al invertirse la dirección de marcha y luego dura 3 segundos (alejarse) 3 segundos (volver) = 6 segundos hasta que el capilar está de nuevo exactamente por debajo de la óptica.)

En una aplicación a modo de ejemplo, la temperatura del cuerpo de regulación de la temperatura, y por tanto la temperatura de los capilares durante el movimiento continuo hacia adelante y hacia atrás, es aumentada continuamente a una velocidad de 1° C por minuto. Así, con una rampa de temperatura de 1° C por minuto se logra una densidad de datos de 20 puntos de medición por capilar y por minuto, que corresponde a una resolución de temperatura de 0,05° C en promedio. Reduciendo a la mitad la velocidad de aumento de la temperatura de 1° C por minuto a 0,5° C por minuto con el número de capilares constante y la velocidad de desplazamiento constante, entonces la resolución de temperatura se duplica de 0,05° C (caso de 1° C por minuto) a 0,025° C (caso de 0,5° C por minuto).

Dado que todo el diámetro de los capilares es continuamente barrido, es decir medido, el método según la invención es más robusto frente a suciedades locales (por ejemplo, partículas de polvo, burbujas de aire, en particular suciedades que son más pequeñas que el diámetro del capilar) que con los métodos habituales del estado de la técnica, en los que solo se mide en un único punto del capilar (véase, por ejemplo, UNit™ de unCHAINED LABS). En particular, en el estado de la técnica incluso pequeñas impurezas locales pueden llegar a un artefacto de medición y conducir a un rechazo de la medición.

Otro aspecto ventajoso del barrido de los capilares según la invención consiste en que se miden de forma prácticamente automática diferentes espesores de capa debido al barrido de los capilares redondos con el "rayo de medición". Así, por ejemplo la Figura 3 muestra que en el centro del capilar existe el máximo espesor de la muestra/espesor de capa. En los bordes existe simétricamente un espesor de capa más pequeño del líquido de muestra. Esto es ventajoso por ejemplo para soluciones altamente concentradas en las que la dispersión es tan alta que en el centro del capilar (mayor espesor de capa) ya no pasa ninguna señal (toda la luz es dispersada). Sin embargo, si ya no llega ninguna señal, ya no se pueden medir variaciones en la señal. Dado que según la invención es barrido todo el diámetro de los capilares, se obtienen valores medidos > 0 en las zonas de borde en las que el rayo de luz reflejado tuvo que cubrir una longitud de trayectoria más corta a través de los capilares. Esta es una ventaja práctica ya que así se puede medir un mayor intervalo de concentración de muestras en la solución.

Óptica para medir la fluorescencia y la extinción/dispersión

Otra ventaja de la presente invención se puede ver en que la óptica para medir la fluorescencia y la extinción se construye muy fácilmente. Ventajosamente se puede utilizar una óptica común para ambas mediciones. Las ventajas de la óptica (común) según la invención se manifiestan por ejemplo en el campo del ajuste, el posicionamiento y el consumo de material, en comparación con las ópticas separadas del estado de la técnica. Además, la óptica común según la invención también ahorra espacio.

Según la invención las medidas de fluorescencia y extinción pueden tener lugar una tras otra, casi simultánea o simultáneamente. Simultaneidad de la medición significa: los procesos dentro de las partículas (= intramoleculares) pueden ser realizados mediante fluorescencia simultáneamente con la medición del cambio de tamaño de las partículas (= intermolecular) mediante “dispersión”/extinción. Se obtiene así una correlación directa entre los dos procesos. Así se puede reconocer si la desnaturalización (fluorescencia) y la agregación (extinción) comienzan al mismo tiempo o a la misma temperatura, o si un proceso comienza antes que el otro. Esto también implica que la medición en sí es más robusta.

La simultaneidad de la medición conduce además a una densidad de datos más alta o alta: se pueden medir el doble de datos por unidad de tiempo que si se miden la extinción y la fluorescencia por separado. Esto aumenta la precisión de la medición y el punto de fusión de una proteína y la temperatura a la que comienza la agregación de la proteína pueden determinarse con mayor precisión.

La realización de la medición de la extinción según la invención (medición de "dispersión") es más robusta con respecto a las suciedades, impurezas, burbujas de aire sobre y dentro del capilar que las realizaciones de medición de luz dispersa estática.

Las concentraciones de cantidades preferidas de materiales de partículas, por ejemplo proteínas tales como anticuerpos, enzimas, péptidos, se sitúan entre 0,001 y 500 mg/ml. Las concentraciones ventajosas se sitúan entre 0,1 y 100 mg/ml.

La realización según la invención y el método según la invención permiten medir simultáneamente muchas concentraciones diferentes en un único experimento. Es decir, con el mismo ajuste de medición pueden ser medidas simultáneamente concentraciones que se diferencian por ejemplo en un factor de 1000.

Con el sistema y el método según la invención son posibles mediciones de la estabilidad térmica de las partículas, de la estabilidad química de las partículas, así como de la estabilidad de las partículas a lo largo del tiempo. A continuación se describen ejemplos de mediciones de la estabilidad en términos más concretos.

Estabilidad térmica

En la medición de la estabilidad térmica, los capilares con las partículas, preferiblemente en una solución acuosa o fase líquida, se disponen sobre el cuerpo de regulación de la temperatura con silicio y son medidas preferiblemente de forma continua la fluorescencia intrínseca y (preferiblemente al mismo tiempo) la dispersión/extinción, mientras que la temperatura de los capilares se eleva desde un valor bajo, por ejemplo 15° C, a un valor alto, por ejemplo 95° C (véase la Figura 13). También se pueden utilizar temperaturas, por ejemplo, de -20 °C a 130 °C y/o rangos parciales de las mismas.

En primer lugar, la superficie de silicio se limpia con un paño y etanol absoluto frotándola varias veces. A continuación se preparan al menos 10 gl de las muestras a analizar, por ejemplo soluciones de anticuerpos en diferentes concentraciones de cantidades de sustancia, por ejemplo entre 5 mg/ml y 0,3 mg/ml, o diferentes biomoléculas, o biomoléculas idénticas en diferentes tampones. Cada10 gl de estas soluciones son llenados en los capilares aprovechando las fuerzas capilares por inmersión de los capilares en las soluciones. Los capilares llenos son transferidos luego a un soporte de capilares y a continuación son presionados sobre la superficie de silicio por medio de una tapa. En virtud de un "barrido de descubrimiento" realizado, en el que se detecta tanto la extinción como la fluorescencia a 330 y 350 nm de longitud de onda de emisión de todos los capilares dentro de 3-5 segundos a una temperatura de 20° C, se ajustan las intensidades de luz, lo que se puede hacer de forma manual o automática para evitar la sobreexposición de los detectores. A continuación se fija el intervalo de temperatura a medir, por ejemplo de 20° C-95° C, y la rampa de temperatura, por ejemplo 1 ° C/min. Esta última puede variar por ejemplo entre 0,1° C/min y 100° C/min. Después de la fijación de estos parámetros se inicia la medición y al mismo tiempo se mide y representa la dependencia de la temperatura de la extinción y la fluorescencia de la muestra. Después de terminar la medición, la temperatura se restablece automáticamente al valor inicial.

El análisis de las curvas de desplegamiento térmico se realiza por ejemplo mediante la determinación de la temperatura de desplegamiento específica (la temperatura a la que está desplegado el 50 % de las partículas), lo que se puede hacer por ejemplo por identificación de los puntos de inflexión analizando la primera o la segunda derivada de los datos brutos, o por procesos matemáticos de otro tipo. El análisis de la formación de partículas por medición de la extinción se realiza con preferencia matemáticamente determinando la temperatura a la que comienza la agregación y determinando el máximo de la extinción.

Por ejemplo, la reversibilidad o irreversibilidad del desplegamiento de una partícula también se puede determinar mediante una medición de estabilidad térmica. Esto se puede hacer por ejemplo aumentando en primer lugar la temperatura de 20° C a 95° C con una rampa de temperatura de 1° C por minuto y luego la temperatura se reduce de nuevo de 95° C a 20° C con la misma rampa de temperatura o una diferente. Si un desplegamiento es reversible, entonces por ejemplo la relación de fluorescencia de 350 nm a 330 nm después de que se hayan realizado el calentamiento y enfriamiento alcanza de nuevo el nivel de partida/el mismo valor que tenía para este proceso. En el caso de la medición simultánea de la agregación según la invención se puede averiguar si la agregación conduce a una irreversibilidad del desplegamiento. Por ejemplo, si un anticuerpo presenta diferentes procesos de desplegamiento térmico en la señal de fluorescencia, por ejemplo con temperaturas de fusión de 60° C y 72° C y al mismo tiempo presenta una agregación a 75° C en la extinción, en un primer experimento se puede calentar por ejemplo hasta 60° C y luego enfriar nuevamente y en un segundo experimento se calienta por encima de 75° C, es decir por encima de la temperatura de agregación, y luego se enfría nuevamente. Si el primer experimento muestra un desplegamiento reversible y el segundo experimento muestra un desplegamiento irreversible, se puede concluir de ello que la agregación conduce a un desplegamiento irreversible o impide un replegamiento al estado nativo.

Estabilidad química:

En la medición de la estabilidad química, las partículas son mezcladas en soluciones acuosas con concentraciones crecientes de desnaturalizantes, por ejemplo sales caotrópicas, tales como clorhidrato de guanidinio o urea, introducidas en capilares y colocadas sobre el cuerpo de regulación de la temperatura. La extensión del desplegamiento de las partículas es determinado a una temperatura definida recorriendo los capilares una vez y detectando la fluorescencia (véase la Figura 12).

Las áreas de aplicación para el desplegamiento químico son por ejemplo la optimización de formulaciones de proteínas, por ejemplo anticuerpos y enzimas, la caracterización termodinámica de partículas, así como la investigación de agentes activos.

Estabilidad con respecto al tiempo

En la medición de la estabilidad con respecto al tiempo, las partículas en solución acuosa se introducen en capilares y se miden la extinción y la fluorescencia a temperatura constante durante un período de tiempo definido. Es ventajoso para mediciones > 3 horas cerrar los extremos de los capilares con sustancias adecuadas, por ejemplo plástico líquido, adhesivo, cera, pegamento, o mecánicamente por compresión de materiales adecuados, por ejemplo silicona, caucho, plásti

Control de calidad

Cuando se realizan mediciones para el control de calidad, las soluciones de partículas son probadas con respecto a su reproducibilidad, o se realizan pruebas de almacenamiento y estrés. En estas últimas por ejemplo las proteínas son sometidas a condiciones que tienen una influencia potencialmente negativa sobre su plegamiento, por ejemplo temperatura aumentada, agitación/sacudidas intensivas, ciclos de congelación-descongelación. Una vez realizados los distintos métodos, las soluciones se introducen en capilares y la fluorescencia, así como la extinción de las muestras son detectadas con un único barrido de capilar o en una rampa de temperatura, por ejemplo con 1° C/min, de 20° C a 95° C. Por comparación con una muestra de referencia sin tratar se puede determinar la proporción de proteína desplegada y agregada.

Enlace de ligando

Estas medidas se denominan también “termal shift assays” (ensayos de cambio térmico). Cuando se mide el enlace de ligando, partículas, por ejemplo enzimas tales como quinasas, son incubadas en solución acuosa junto con ligandos, por ejemplo fragmentos moleculares. Si un ligando enlaza con una partícula, entonces este enlace de ligando puede influir en la estabilidad, por ejemplo la estabilidad térmica, de la partícula y/o su comportamiento de agregación. Por ejemplo un enlace de ligando en una partícula puede aumentar o disminuir su temperatura de fusión, la temperatura a la que el 50 % de la partícula está en forma nativa y el 50 % en forma desnaturalizada, es decir estabilizan o desestabilizan la partícula. Ese desplazamiento de la temperatura de fusión del complejo ligandopartícula con respecto a la partícula sin ligando puede ser medido como “delta T” y así puede ser detectado el enlace del ligando a la partícula. El método y los aparatos según la invención permiten detectar y cuantificar de forma fiable y reproducible incluso los cambios más pequeños en la temperatura de fusión de delta T > = 0,2° C. Diferentes ligandos pueden ser clasificados y seleccionados por ejemplo en función de su desplazamiento de la temperatura de fusión delta T. En aplicaciones tales como por ejemplo la cristalografía de proteínas, se buscan ligandos que cambien la temperatura de fusión de la partícula en el caso de un enlace a temperaturas de fusión particularmente altas y estabilicen así la partícula.

Aquí es ventajoso medir no solo la estabilización térmica mediante una señal de fluorescencia, sino también una posible agregación de las partículas, ligandos y/o complejos de partícula-ligando mediante la medición de la extinción según la invención. Esto debería permitir por ejemplo clasificar los ligandos que conducen a una estabilización térmica, así como a una agregación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

A continuación, se describen en detalle formas de realización preferidas de la presente invención con referencia a las figuras. Muestran:

La Figura 1: el modo de proceder para la medición según la invención de la dispersión de la luz por medición de la atenuación de la transmisión de la luz;

la Figura 2: la medición directa de la luz dispersa con un ángulo de detección de luz dispersa fijo según el estado de la técnica;

la Figura 3: la formación de señales de fluorescencia y extinción por movimiento de las muestras con respecto al sistema óptico;

la Figura 4: una forma de realización para evaluar la medición de la extinción;

la Figura 5: una forma de realización para evaluar la medición de la fluorescencia;

la Figura 6: una forma de realización para la medición simultánea de la fluorescencia y la extinción;

la Figura 7a: una forma de realización para la medición casi simultánea de la relación de fluorescencia y la extinción con la trayectoria de los rayos de fluorescencia dibujada;

la Figura 7b: la forma de realización de la Figura 7a, pero con la trayectoria de los rayos de extinción dibujada; la Figura 8a: otra forma de realización para la medición simultánea de la relación de fluorescencia y la extinción con la trayectoria de los rayos de fluorescencia dibujada;

la Figura 8b: la forma de realización de la Figura 8a, pero con la trayectoria de los rayos de extinción dibujada; la Figura 9: la reflectividad del silicio;

la Figura 10: un ejemplo de medida para la detección simultánea del desplegamiento intramolecular mediante la fluorescencia y de la agregación intermolecular mediante la extinción de un anticuerpo;

la Figura 11: un ejemplo de medida de la extinción en el aumento de la agregación de un anticuerpo dependiente de la temperatura en diferentes tampones;

la Figura12: ejemplo de medición para la detección de la estabilidad de la proteína a diferentes temperaturas por desplegamiento químico;

la Figura 13: un ejemplo de medición para la demostración del rango dinámico de la óptica de fluorescencia utilizando diferentes concentraciones de proteína entre 50 mg/ml y 2 gg/ml;

la Figura14: una medición a modo de ejemplo para el control de calidad de proteínas mediante pruebas de degradación forzada;

la Figura 15: datos de medición a modo de ejemplo para la selección de tampón para condiciones de almacenamiento óptimas de un anticuerpo;

la Figura 16: un ejemplo del espectro de absorción de una proteína; y

las Figuras 17a, b: una vista en planta y en sección transversal de un cuerpo de regulación de la temperatura según la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

La Figura 2 muestra un tipo común de un método para medir partículas por medición de la luz dispersa estática con un ángulo fijo. La muestra 13 que se va a examinar es un líquido con partículas que se encuentran en su interior que se dispersan fuertemente o que se agregan fuertemente. El líquido de muestra se encuentra en un capilar 30 que está dispuesto en la superficie 77. Para una medición de la extinción es irradiada luz 20 desde arriba hacia abajo a través del capilar 30 en el líquido de muestra. Una parte de la luz irradiada 20 es retrorreflejada directamente, es decir esencialmente en la dirección opuesta a la dirección de irradiación, como luz reflejada 22. Para la medición de la luz dispersa 24 se encuentra un detector de luz dispersa 200 con un ángulo O entre el rayo de luz incidente 20 y la muestra y se detecta así directamente la luz dispersada 24 en la muestra con partículas que se dispersan fuertemente 13.

Las desventajas de este sistema se pueden resumir como sigue. La contribución a la señal en el detector 200 se produce solo por la dispersión en un pequeño rango angular alrededor del ángulo O. Por la medición en un rango angular estrecho, el sistema es propenso a movimientos mecánicos no deseados, por ejemplo movimientos en la dirección vertical. En determinadas posiciones del capilar 30, las reflexiones en las paredes del capilar (véase, por ejemplo, el rayo 25) en la dirección del detector 200 son más fuertes que la dispersión de la luz en las partículas que se van a examinar. Un experto en el campo de las mediciones de luz dispersa sabe que es importante evitar las reflexiones o superficies reflectantes 77 (por ejemplo silicio), ya que desde allí por ejemplo un rayo reflejado 26 no deseado puede penetrar igualmente en el detector 200. Este rayo reflejado 26, que incide en el detector de luz dispersa 200, conduce a falsear la señal de medición, ya que para mediciones de luz dispersa solo puede medirse un rango angular muy estrecho alrededor del ángulo O según las teorías convencionales. Por tanto, el experto en la materia construirá una óptica muy compleja para bloquear toda la luz dispersa no deseada, lo que sin embargo hace que la óptica sea frágil y cara. En particular, un experto en la materia evitará superficies reflectantes. Además, la disposición oblicua del detector 200 dificulta la integración en las ópticas existentes con una trayectoria de rayos vertical.

La Figura 1 muestra esquemáticamente el modo de funcionamiento de una medición según la invención. Preferiblemente, según la invención la porción de luz dispersada no se mide directamente, como en la figura 2, sino midiendo la atenuación de la transmisión de luz, la denominada extinción. En otras palabras, la luz de extinción no es luz dispersada. Dependiendo del diseño de la óptica, la luz que es dispersada menos de ± 10°, preferiblemente menos de ± 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2°, 1° desde el eje del rayo A de la luz irradiada 20, es preferiblemente interpretada como luz no dispersa. Con un amplio rango de ángulos de aceptación se puede lograr una alta relación señal/ruido; con un rango pequeño, es mejor la linealidad a altas concentraciones.

De nuevo en el ejemplo la muestra a examinar se encuentra en un capilar 30 que se sitúa sobre una superficie 77. La luz de un rayo de luz entrante 20 es dispersada parcialmente en diferentes ángulos (véase luz dispersa 24) por partículas en la solución de muestra 13. El rayo de la luz incidente se refleja en la superficie 77 y vuelve como un rayo de luz 22 opuesto al rayo de luz incidente 20. La intensidad del rayo de luz 20, 22 que se reflejó en la superficie 77 y por tanto ha atravesado el volumen de muestra 13 dos veces, depende de la intensidad de la dispersión de la luz en la muestra. La intensidad del rayo reflejado 22 es medida por un detector 100, cuyo rango de aceptación es colineal con el rayo de luz 20 o con los rayos de luz 20, 22. La longitud de onda de los rayos de luz incidentes/irradiados 20 y los rayos de luz reflejados 22 es seleccionada preferiblemente de modo que la muestra a medir absorba la menor cantidad de luz posible en este rango. Por tanto, se puede conseguir que la atenuación de la luz tenga lugar principalmente por dispersión (extinción) y no por absorción. Otra ventaja de este método según la invención consiste en que los rayos 26 que se reflejan en la superficie 77 no interfieren con la medición.

La figura 17a muestra la superficie 77 del cuerpo de termorregulación según la invención con varios capilares 30 dispuestos sobre ella en una vista desde arriba. La superficie 77 tiene una longitud L y una anchura B, y la capa superficial también tiene una profundidad T, como se muestra en las figuras 17a y 17b. Preferiblemente, la longitud L es más larga que la anchura B. También se prefiere que los capilares 30 se extiendan a lo largo de la anchura B de la superficie 77 para la medición, y los capilares son preferiblemente más largos que la anchura B de modo que los dos extremos de los capilares sobresalen de la superficie 77. Para regular la temperatura de los capilares 30 por contacto, se prefiere que los capilares se encuentren directamente sobre la superficie 77 del elemento de regulación de la temperatura, es decir, que estén en contacto directo con la superficie 77. De acuerdo con otra realización preferida, también puede ser ventajoso formar al menos un área de tal manera que una sección de un capilar no esté en contacto directo con la superficie, mientras que otras áreas de este capilar estén en contacto con la superficie. En particular, un área sin contacto es ventajosa para la medición óptica, como se analiza a continuación.

De acuerdo con una realización preferida, se puede proporcionar un rebaje 90 en la superficie 77, por ejemplo en forma de ranura, surco, microranura o “zanja” 90, de manera que no haya contacto directo entre el capilar y la superficie 77 en la zona del rebaje 90. El rebaje 90 se extiende preferentemente sobre al menos una zona del elemento de regulación de la temperatura sobre la que se encuentran los capilares durante la medición. El rebaje 90 se forma preferentemente en la zona central con respecto a la anchura del elemento de regulación de la temperatura, de modo que cada capilar en una zona de medición central 90 no tenga contacto directo con la superficie 77. Sin embargo, a la derecha ya la izquierda de esta zona 90 (con respecto a la anchura del elemento de regulación de la temperatura), el capilar 30 está en contacto directo con la superficie para asegurar la regulación de la temperatura por contacto.

El rebaje 90 tiene preferiblemente entre 1 y 10 mm, más preferiblemente entre 2 y 8 mm, más preferiblemente entre 3 y 7 mm, por ejemplo 5 mm, más preferiblemente alrededor de 3 mm de ancho (a lo largo de la anchura B). De acuerdo con la invención, la retrorreflexión de la luz de acuerdo con la invención se genera o se mide preferiblemente en esta sección de ranura de los capilares.

El surco tiene preferiblemente una profundidad de aproximadamente 10-30 gm. En particular, se prefiere que el rebaje 90 tenga una profundidad (véase la dirección de la profundidad T en la figura 17b) de más de la mitad de la longitud de coherencia de la luz utilizada para suprimir aún más los efectos de interferencia en la retrodispersión. Los efectos perturbadores de interferencia se muestran, por ejemplo, mediante anillos de Newton, que pueden suprimirse o incluso evitarse con una ranura según la invención. Según la invención, como fuente de luz se puede utilizar una fuente de luz láser o un LED. Las fuentes de luz LED, como las que se usan en la presente invención, tienen típicamente una longitud de onda de coherencia en el rango de aproximadamente 15 pm, por lo que se prefiere una profundidad de surco de > 7,5 pm. En particular, es preferible que la profundidad esté entre 1,5 veces la mitad de la longitud de onda de coherencia y 10 veces la mitad de la longitud de onda de coherencia. Preferiblemente, el límite superior de la profundidad es 5 veces la mitad de la longitud de onda de coherencia. En particular, de acuerdo con la invención, la ranura solo debe ser lo suficientemente profunda como para suprimir la interferencia, pero a cambio, el colchón de aire no debe ser demasiado grande debajo del capilar, ya que, de lo contrario, el colchón de aire podría alterar la temperatura deseada en el capilar. La ranura también tiene la ventaja preferida adicional de que la superficie del capilar 30 en el área de medición no entra en contacto directo con la superficie 77, de modo que se pueda suprimir o evitar el rayado de la superficie del capilar 30 y el rayado de la superficie del cuerpo de regulación de la temperatura por el capilar en la zona de medición (ranura). En particular, de acuerdo con la invención se puede evitar que se raye la superficie del cuerpo de regulación de la temperatura, mientras que un posible rayado de los capilares puede ser tolerable ya que los capilares se utilizan preferentemente como artículos desechables. Por ejemplo, se pueden utilizar capilares según la invención, cuyo material tiene una dureza inferior a la del silicio.

Con el fin de garantizar una retrorreflexión eficiente de la luz desde el fondo del rebaje 90, la ranura está preferiblemente grabada en la superficie del elemento de regulación de la temperatura. El elemento de regulación de la temperatura tiene preferiblemente una capa superficial hecha de silicio, de manera que el rebaje 90 se forma directamente en la capa de silicio. Según una realización preferida de la invención, la ranura está grabada en el silicio. El método de grabado preferido también tiene la ventaja de que la superficie del fondo de la ranura está diseñada para ser muy suave, de modo que el comportamiento de reflexión de esta superficie sigue siendo excelente. La superficie del fondo tiene preferiblemente una rugosidad promedio que está preferiblemente en el rango nanométrico, preferiblemente <±10 nm, preferiblemente <±5 nm, por ejemplo ±1-2 nm.

Según una realización preferida, la ranura puede extenderse sobre una parte sustancial de la superficie, de modo que, por ejemplo, todos los capilares 30 a medir que se encuentran sobre la superficie 77 pueden disponerse sobre el rebaje 90. Como se muestra en la Figura 17a, el rebaje 90 se extiende a lo largo de la longitud L de modo que los capilares 30 puedan colocarse a través del rebaje 90 (ver Figura 17b). Según otra forma de realización preferida, el rebaje 90 no se extiende por toda la longitud L, de modo que en las zonas 91 marginales no se forma preferentemente ninguna ranura. Esto tiene la ventaja, por ejemplo, de que el silicio alrededor del rebaje 90 tiene un grosor uniforme y, por lo tanto, es más fácil de procesar (por ejemplo, corte o aserrado).

Preferiblemente se utiliza silicio como superficie del elemento de regulación de la temperatura. Preferiblemente, se usa silicio puro (cristalino), como se analiza con más detalle a continuación. Preferiblemente, el rebaje 90 de la presente invención se forma a lo largo de una dirección cristalina preferida del silicio cristalino, preferiblemente a lo largo de la dirección [111] (índices de dirección de Miller).

La ranura también tiene la ventaja, por ejemplo, de que el líquido que se encuentra en el exterior del capilar no llega a la zona de medición, que se encuentra preferentemente en la zona de la ranura. Dado que la distancia entre el capilar y el cuerpo de regulación de la temperatura es mayor en el área de la ranura que fuera del área de la ranura, es mejor que el líquido en el exterior del capilar permanezca fuera de la ranura debido a las fuerzas capilares. Por ejemplo, cuando se llenan los capilares, puede suceder que las gotas cuelguen del exterior de los capilares. Estas gotas pueden interferir si entran en el área de medición. Sin embargo, las fuerzas capilares, que son mayores cuanto menor es la distancia entre el capilar y el cuerpo de regulación de la temperatura, mantienen este líquido fuera de la ranura. De esta manera, por ejemplo, se puede evitar que el líquido en las gotitas no entre en el área de medición en la ranura.

Las figuras 3a) -3c) muestran la formación de las señales para una medición de fluorescencia y extinción según la invención. De un modo similar a la figura 1, la muestra a examinar se encuentra en un capilar. La muestra a examinar contiene partículas que se dispersan/que se agregan (en lo sucesivo, designadas como muestra 12), así como partículas fluorescentes (en lo sucesivo, designadas como muestra 15). Para medir la muestra, preferiblemente el detector es desplazado sobre el capilar o el capilar es desplazado por debajo del detector. Este desplazamiento se realiza preferentemente de forma perpendicular al eje longitudinal del capilar. Alternativamente, tanto el capilar como el detector pueden ser desplazados. Preferiblemente, sin embargo, debería tener lugar un movimiento relativo 80 entre el capilar 30 y el detector 100 durante una medición.

Antes de que un capilar 30 sea alcanzado por los rayos de luz irradiados para la medición de la fluorescencia y la extinción 20, 21, el detector no mide ninguna luz de fluorescencia 23 (fila superior; señal (fluorescencia)) y ninguna atenuación en la luz reflejada 22 para la medida de extinción 22 (fila inferior; señal (extinción)). En consecuencia está representada una línea horizontal en los diagramas de la figura 3a.

Durante el movimiento (relativo) 80 del capilar 30 por debajo del rango de detección del sistema óptico, la intensidad de fluorescencia 23 medida aumenta y la intensidad del rayo reflejado 22 disminuye debido a la refracción en el capilar y debido a la dispersión en la muestra 12 (véase la Figura 3b).

Cuando el capilar con la muestra abandona la zona de detección de la óptica se obtienen preferentemente señales que corresponden a la entrada en la zona de detección. Esto se debe a la disposición simétrica del sistema óptico o al movimiento simétrico sobre el capilar. Por tanto, la dirección 80 del movimiento entre la muestra y el sistema óptico no juega ningún papel.

Según la invención varias muestras que se encuentran en varios capilares pueden ser medidas de forma continua una tras otra. Preferiblemente, la pluralidad de capilares puede estar dispuesta sobre un soporte de muestras. Es decir, por un movimiento preferiblemente continuo de un soporte de muestras puede ser registrada una pluralidad de muestras con alta densidad de datos (puntos de datos por muestra por unidad de tiempo). Así por ejemplo es posible obtener frecuencias de medición superiores a 100 kHz. Otra ventaja de este método según la invención es además el bajo esfuerzo de ajuste del sistema. Además, como formato de cámara de muestra, los capilares 30 permiten un llenado sencillo por introducción automática de la muestra en el capilar mediante fuerzas capilares, lo que por ejemplo también permite el llenado de soluciones altamente viscosas. Los capilares se sitúan con preferencia directamente con buen contacto térmico sobre la superficie 77.

La figura 4a) muestra una sección transversal a través de tres muestras 11, 12, 13 diferentes en los capilares 30. La primera muestra 11 no dispersa la luz 20 generada que es emitida por una fuente, por lo que la mayor parte 22 de la radiación luminosa irradiada 20 es retrorreflejada en la dirección de la lente del objetivo y del detector 100. Las otras dos muestras 12 y 13 dispersan una parte de la luz incidente 20 en otras direcciones fuera del ángulo de aceptación del detector 100. A través de la muestra 13 se dispersa más de la luz incidente que a través de la muestra 12, lo que está representado por las varias flechas de dispersión 24.

Como ya se ha descrito con referencia a la Figura 3, es preferible que durante una medición las muestras sean movidas con respecto al sistema óptico. La figura 4 b) muestra un curso típico de la intensidad de luz medida con el detector 100 en función de la posición horizontal de las muestras (medición de la extinción). La intensidad medida (brillo [I]) depende por un lado de la difracción de la luz en las paredes 30 del capilar y por otro lado de la extinción en la muestra. Se puede suponer que la difracción de la luz en las paredes del capilar es idéntica para diferentes muestras en una buena aproximación. Sin embargo, dado que las muestras 12 y 13 dispersan una mayor proporción de la luz incidente 20 que la muestra 11, es retrorreflejada menos luz 22. Por tanto, el brillo (intensidad) en las muestras 12 y 13 disminuye en mayor medida.

La figura 4 c) muestra un posible curso de la extinción en función de la posición de las muestras. La fórmula para el cálculo de la extinción tiene en general la forma:

En el caso más simple Iü(x) puede ser una constante, o el curso de la intensidad para un capilar lleno de agua o el curso de la intensidad al inicio de una medición, antes de que haya comenzado la extinción debido a la formación de agregados inducida por la temperatura.

La magnitud buscada "extinción" (Figura 4 d)) se obtiene por integración de la curva de extinción E(x). Los límites de integración se sitúan preferiblemente simétricos en torno a cada capilar. Para compensar fluctuaciones en el brillo de la fuente de luz o en la sensibilidad del detector, la extinción determinada aún puede corregirse mediante un valor de referencia que es calculado por integración de la curva E(x) en una zona sin capilar (véase Figura 4c: "superficie de referencia"). Esta corrección se lleva a cabo preferiblemente para cada capilar individual con una zona sin capilar directamente al lado de este capilar individual. Según la invención, esto es posible por ejemplo porque la muestra, a diferencia del método de medición del estado de la técnica, es preferiblemente movida con respecto al sistema de medición.

La Figura 5 explica a modo de ejemplo un posible procesamiento de los datos de medición de la Figura 3 usando el ejemplo de tres muestras con fluorescencia fuerte 14, media 15 y baja 16.

La intensidad de la luz de fluorescencia emitida por las muestras está representada en la Figura 5b en función del movimiento o la posición del detector 100 con respecto al capilar. Para la determinación de un "valor de fluorescencia" se integra sobre el valor del desplazamiento 80 de las muestras con respecto al sistema óptico (véase la Figura 5c). Preferiblemente los límites de integración comprenden simétricamente un único capilar. La intensidad de fluorescencia integrada corresponde preferiblemente al valor de medición buscado de la fluorescencia de una muestra. También es posible la medición de intensidades de fluorescencia a dos o más longitudes de onda diferentes. En este caso, la relación de las intensidades de fluorescencia integradas es preferiblemente el valor de medición buscado "relación de fluorescencia".

La Figura 6 muestra un ejemplo de realización de un sistema según la invención para medir la fluorescencia y la extinción. Esta medida de la fluorescencia y la extinción puede realizarse preferiblemente una tras otra, casi simultánea o simultáneamente. Una (primera) fuente de luz 40, por ejemplo un LED, genera radiación luminosa 21 con una (primera) longitud de onda 21 que excita la emisión de radiación de fluorescencia en el volumen de muestra 10. El filtro de excitación 70 suprime cualquier eventual radiación de la fuente de luz 40 en rangos de longitud de onda no deseados. Una (segunda) fuente de luz 41 genera radiación luminosa 20 en un (segundo) rango de longitud de onda en el que el volumen de muestra 10 tiene solo una baja absorción. La luz de las dos fuentes de luz 40, 41 es preferiblemente colimada con las lentes ópticas 60, 61 y combinada por un divisor de haz dicroico 71 para formar un rayo colineal.

El divisor de haz 72 tiene preferiblemente una alta reflectividad en el (primer) rango de longitud de onda 40. Además, es ventajoso que el divisor de haz 72 tenga una alta transmisión en el rango de longitud de onda de la emisión de fluorescencia de la muestra. También es más preferible que el divisor de haz 72 presente una transmisión parcial y una reflexión parcial en el rango de longitud de onda de la (segunda) fuente de luz 41. Un divisor de haz dicroico por ejemplo cumple estos requisitos si la longitud de onda de 41 coincide con la emisión de fluorescencia de 10. En el caso más general, el divisor de haz 72 es un divisor de haz tricroico.

La luz de la primera y segunda longitud de onda 21,20 es reflejada por el divisor de haz 72 sobre la muestra 10 en el capilar 30. La lente de objetivo 62 focaliza la luz incidente sobre la muestra 10. La luz de la primera fuente de luz 40 genera radiación de fluorescencia en la muestra 10, que es colimada por la lente 62. La luz en el rayo incidente, que es generado por la segunda fuente de luz 41, pasa a través de la muestra 10 y el capilar 30 a la superficie 77, allí es reflejada o retrorreflejada (en inglés backreflection) y pasa a través de la muestra 10 y el capilar 30 una segunda vez.

La superficie 77 está hecha preferiblemente de un material con baja fluorescencia propia y alta reflectividad en el rango de longitud de onda de la segunda fuente 41 para la medición de la extinción. La radiación reflejada es colimada de nuevo por la lente 62. Partículas eventualmente presentes en el volumen de muestra dispersan la luz incidente, de modo que solo una pequeña parte de la luz irradiada originalmente es captada por la lente de objetivo 62. La intensidad de la luz retrorreflejada a la lente 62 depende así esencialmente de la concentración y el tamaño de las partículas y, por tanto, de la extinción de la muestra.

El filtro 73 suprime preferiblemente la luz de excitación de fluorescencia de la (primera) fuente de luz 40. El detector 53 mide preferiblemente la intensidad del rayo de luz procedente de la muestra de una manera selectiva en longitud de onda. Preferentemente con el detector 53 se puede medir tanto la luz de la segunda longitud de onda, es decir la luz que pasa a través de la muestra y es retrorreflejada, como la luz de fluorescencia, es decir la luz de la emisión de fluorescencia de la muestra. Además, selectivo en longitud de onda significa que las intensidades a las diferentes longitudes de onda pueden ser determinadas preferiblemente por separado.

La Figura 7a) muestra otra forma de realización del sistema según la invención con la trayectoria de rayos dibujada durante la medición de la fluorescencia. Sin embargo, a diferencia de la Figura 6, el sistema tiene (al menos) dos detectores. Los dos detectores 50, 51 se utilizan para medir una intensidad de fluorescencia a dos longitudes de onda diferentes. Si por ejemplo se seleccionan 330 nm y 350 nm como las longitudes de onda detectadas, a partir de la relación de las dos señales se obtienen informaciones sobre la estructura de las macromoléculas que se encuentran en el volumen de muestra 10.

En esta forma de realización la longitud de onda de la (segunda) fuente de luz 41 para la medición de la extinción está situada en el rango de la emisión de fluorescencia de la muestra 10. Por tanto, durante la medición de la fluorescencia la fuente de luz 41 debería estar desconectada. Una medición secuencial o casi simultánea se produce porque la extinción y la fluorescencia son medidas alternando rápidamente. El intervalo de tiempo entre dos puntos de datos de un tipo de medición debe ser tan pequeño que la diferencia entre dos valores de medición sea menor que la incertidumbre de medición de un valor de medición. Ejemplo: la extinción de una muestra altamente concentrada cambia a temperaturas superiores a 80° C con aproximadamente 0,2 mAU/s (mili unidades de absorción/segundos). La incertidumbre de medición para la extinción es por ejemplo de aproximadamente 0,2 mAU. Por consiguiente, la extinción es medida preferiblemente al menos 1 vez por segundo y la fluorescencia también es medida al menos 1 vez por segundo. En esta forma de realización, el paso de banda 73 transmite una parte de la radiación de fluorescencia 23, por ejemplo en el rango de 320 nm a 360 nm. El divisor de haz 74 separa la radiación de fluorescencia en dos rayos con rangos de longitud de onda, por ejemplo de 320 nm-340 nm y de 340 nm-360 nm. Los rayos son concentrados con las lentes de concentrador 63, 64 sobre los dos detectores 50, 51. El cociente de las dos señales de medición es el valor de medición buscado.

La figura 7b) muestra el ejemplo de realización del sistema de la figura 7a), pero con la trayectoria de rayos dibujada durante la medición de la extinción. La segunda fuente de luz 41 emite radiación luminosa 20 que, después de la reflexión en la placa de base 77, atraviesa la muestra 10 dos veces y discurre hacia arriba como rayo de luz 22. En la muestra 10, la intensidad de la radiación luminosa se atenúa al dispersarse fuera del área de detección. La longitud de onda de la (segunda) fuente de luz 41 se sitúa preferiblemente en el rango de transmisión del filtro 73. Dependiendo de la longitud de onda de la fuente de luz 41, la luz se distribuye luego a los dos detectores 50, 51. Preferentemente, la longitud de onda se sitúa a aproximadamente 350 nm, de modo que la mayor parte de la luz es medida por un único detector.

La figura 8a) muestra un ejemplo de realización del sistema de la Figura 6 que, en comparación con la realización de la Figura 7, se ha ampliado con una rama de detección adicional. Está dibujada la trayectoria de los rayos para la fluorescencia que corresponde a la trayectoria de los rayos en la figura 7a. El divisor de haz dicroico 75 adicional es transparente en el rango de longitud de onda que es medido por los detectores 50, 51.

La figura 8b) muestra el sistema de la figura 8a) con una trayectoria de rayos dibujada para la medición de la extinción. En comparación con el sistema de la figura 7, el rango de longitud de onda de la fuente de luz 41 se encuentra fuera del rango de longitud de onda medido por los detectores 50, 51, por ejemplo 380 nm. Como resultado, la fuente de luz 41 puede permanecer conectada durante la medición de la fluorescencia y no es necesario cambiar entre los tipos de medición de fluorescencia y extinción. El divisor de haz 72 es parcialmente transparente en el rango de longitud de onda de la fuente 41. La relación de transmisión/reflexión ideal es 1:1.

El divisor de haz 75 dirige la luz desde la (segunda) fuente de luz 41 hacia el detector 52 después de que ha sido atenuada por extinción en la muestra 10. El paso de banda 76 preferiblemente reduce la proporción de luz de fluorescencia en el detector 52.

Por esta forma de realización con tres detectores 51,52, 53, la relación de extinción y fluorescencia se puede medir continuamente al mismo tiempo. Además, la sensibilidad del detector 52 a la intensidad de la radiación de la fuente de luz 41 puede ser adaptada individualmente. Esta puede ser ajustada por ejemplo significativamente más alta para una medición de bajo ruido de la extinción. En una forma de realización ventajosa, las señales de los detectores son digitalizadas con un convertidor analógico-digital (CAD) de 24 bits que puede leer en los tres canales del detector al mismo tiempo, por ejemplo a una velocidad de 4 kHz.

La Figura 9 es un diagrama en el que se muestra la reflectividad en función de la longitud de onda para el silicio. En particular, la Figura 9 muestra la buena reflectividad del silicio en el rango UV. Esto es particularmente preferido para que la intensidad de la luz reflejada en el detector sea lo más alta posible durante la medición de la extinción. En particular, una alta intensidad de luz permite una medición con una proporción de ruido baja. Otras propiedades ventajosas del silicio son la casi ausencia de autofluorescencia en las longitudes de onda utilizadas, la buena procesabilidad mecánica y la alta resistencia química.

La Figura 10 muestra a modo de ejemplo una medición en el sistema según la invención descrito en la Figura 6. Se muestran tanto el desplegamiento de proteínas dependiente de la temperatura, como la agregación dependiente de la temperatura de un anticuerpo. En el ejemplo mostrado, una de las subunidades del anticuerpo comienza a desplegarse ya a 60°C, lo que se caracteriza por un cambio característico en la relación de fluorescencia entre la emisión a 350 y 330 nm. Sin embargo, un aumento de la agregación, y por tanto de la extinción, solo se registra a partir de 73° C, lo que permite sugerir que el desplegamiento del dominio proteico térmicamente más inestable no contribuye a la agregación del anticuerpo.

La Figura 11 muestra a modo de ejemplo la medición de la extinción de un anticuerpo (rituximab) con una concentración de sustancias de 1 mg/ml en 25 mM de tampón de acetato con diferentes valores de pH entre pH 4 y pH 6. Cada 10 pl de la solución en los capilares fue calentada de 50 a 95° C a una velocidad de calentamiento de 1 ° C/min. Se observa un aumento de la extinción a temperaturas elevadas > 72 ° C, lo que se puede atribuir a la agregación. El grado de aumento de la extinción depende del valor de pH de la solución, de modo que valores de pH bajos contrarrestan la agregación inducida por la temperatura. Esto se caracteriza, por un lado, por un inicio tardío del aumento de la extinción ("temperatura de comienzo de la agregación") y por otro lado por una extinción máxima total más baja.

La Figura 12 muestra a modo de ejemplo el análisis de la estabilidad química de la proteína lisozima en 10 mM de tampón citrato pH 4 a diferentes concentraciones de clorhidrato de guanidinio. Se preparó 1 mg/ml de lisozima en 48 soluciones con concentración creciente de clorhidrato de guanidinio, y se llenaron 10 pl de las respectivas soluciones en capilares, estos fueron colocados y fijados sobre el soporte de capilares, y a continuación se realizó un barrido de capilar a 20° C, 30° C y 40° C. Después las relaciones de fluorescencia obtenidas fueron representadas con respecto a las concentraciones crecientes de guanidinio. En particular, la relación de fluorescencia en todas las muestras presenta un aumento sigmoideo con el aumento de la concentración de guanidinio, que es directamente proporcional a la proporción de proteína desplegada. A medida que aumenta la temperatura, la proteína se desestabiliza cada vez más, lo que está caracterizado por un desplazamiento de los puntos de datos a concentraciones de guanidinio menores.

La Figura 13 muestra la medición a modo de ejemplo de la proteína estreptavidina en PBS, pH 7,3, a diferentes concentraciones de sustancia desde 50 mg/ml hasta 7 pg/ml. El barrido de capilar ilustra las diferentes intensidades de fluorescencia en los capilares. El diagrama superior muestra el barrido de capilar al comienzo de la medición del desplegamiento térmico. Todas las concentraciones se midieron por duplicado. La altura de los picos corresponde a la intensidad de la fluorescencia en los capilares a una longitud de onda de emisión de 350 nm. La disminución de la fluorescencia en caso de una concentración alta de estreptavidina se puede explicar por el efecto de filtro interno, que es causado por la fuerte absorción de la luz de excitación y una profundidad de penetración reducida que resulta de ello (por tanto, una menor fluorescencia). El diagrama inferior muestra el perfil de temperatura de la relación de fluorescencia a 350 y 330 nm Estas curvas de desplegamiento muestran que se registraron perfiles de desplegamiento para todas las concentraciones. Se puede reconocer un claro proceso de desplegamiento en todas las concentraciones. A concentraciones elevadas de estreptavidina, la transición de fusión se desplaza a temperaturas más altas, lo que se puede atribuir a una estabilización intramolecular de la proteína.

La Figura 14 muestra a modo de ejemplo datos de una prueba de degradación forzada para la proteína quinasa MEK 1. Se preparó una solución con una concentración de 1 mg/ml en 50 mM de Hepes pH 7,4, 150 nM de NaCl y 2 mM de DTT a partir de la proteína y se dividió en 5 alícuotas de 50 pl cada una. Mientras que una alícuota fue almacenada a 4° C y sirvió como referencia, las restantes alícuotas fueron sometidas a diferentes condiciones: incubación a temperatura elevada, ciclos de congelación-descongelación, agitación fuerte. A continuación, todas las muestras fueron introducidas en capilares, transferidas al soporte de capilares y presionadas, y se detectó el desplegamiento térmico a una velocidad de calentamiento de 1° C/min desde 25°C a 90°C a través de la fluorescencia. El diagrama superior muestra las curvas de desplegamiento de las muestras. Dependiendo del tratamiento previo, los niveles iniciales de las curvas de desplegamiento son diferentes, lo que indica diferentes proporciones de proteína ya desplegada. El diagrama inferior muestra una cuantificación de la proporción de proteína desplegada en %, en el que la muestra de la incubación a 4°C se despliega como 0 % y la muestra después de 15 minutos de incubación a 60° C se utiliza como referencia.

La Figura15 muestra a modo de ejemplo datos de una selección de tampón para la identificación de las condiciones óptimas para el almacenamiento de anticuerpos. Se almacenó un anticuerpo monoclonal con una concentración de 5 mg/ml en tampón de acetato con diferentes valores de pH, así como en ausencia y presencia de 130 mM de NaCl. A continuación, cada 10 pl de cada solución de anticuerpo fue introducida en capilares de vidrio y se midió el desplegamiento de la proteína dependiente de la temperatura mediante el cambio de la fluorescencia, así como la agregación dependiente de la temperatura mediante el aumento de la extinción a una velocidad de calentamiento de 1°C/minuto. Las Figura 15 a) y b) muestran el aumento de la agregación dependiente de la temperatura. En el caso que se muestra, la agregación total aumenta al aumentar el pH, lo que se caracteriza por mayores amplitudes en la señal de agregación. La adición de concentración de sal fisiológica conduce a un aumento adicional de la agregación para todos los valores de pH (b). Las figuras c) y d) muestran a modo de ejemplo la determinación de la temperatura de comienzo de la agregación, que corresponde a la temperatura más baja a la que se registra un aumento significativo de la extinción con respecto a la línea base. La figura d) muestra a modo de ejemplo la diferente dependencia de la temperatura de agregación del valor del pH y la concentración de sal. Las figuras e) y f) muestran datos de fluorescencia que según la invención son registrados simultáneamente con los datos de agregación mostrados en las figuras 15 a) y b). El anticuerpo muestra una mayor estabilidad térmica a medida que aumenta el valor de pH de la solución. Además, el NaCl tiene un efecto negativo sobre la estabilidad térmica, lo que se puede ver por un comienzo del desplegamiento de la proteína a temperaturas inferiores. Mediante experimentos comparables se pueden determinar las condiciones en las que la estabilidad térmica de una proteína, por ejemplo de un anticuerpo, es máxima y la agregación es mínima.

La Figura16 muestra un ejemplo de espectro de absorción de una proteína.

La invención comprende igualmente las expresiones, características, valores numéricos o rangos, etc. precisos o exactos, cuando estos son citados antes o después de estas expresiones, características, valores numéricos o rangos en relación con expresiones tales como por ejemplo "aproximadamente, alrededor de, en torno a, sustancialmente, en general, al menos, por lo menos” etc. (es decir, "aproximadamente 3" también incluye "3" o "sustancialmente radial" también incluye "radial"). La expresión "o" también significa "y/o".

LISTA DE SÍMBOLOS DE REFERENCIA

10: muestra

11: muestra sin partículas que se dispersan/que se agregan

12: muestra con algunas partículas que se dispersan/que se agregan

13: muestra con partículas que se dispersan/que se agregan fuertemente

14: muestra con muchas partículas fluorescentes

15: muestra con algunas partículas fluorescentes

16: muestra con pocas partículas fluorescentes

20: luz irradiada para la medición de la extinción

21: luz de excitación para fluorescencia

22: luz reflejada

23: fluorescencia de luz de emisión

24: luz dispersa con un ángulo de dispersión específico Q

25: luz dispersa "no deseada"

26: luz dispersa reflejada "no deseada"

30: capilar

40: fuente de luz para la excitación de fluorescencia

41: fuente de luz para la extinción

50: detector 1 (fluorescencia y extinción)

51: detector 2 (fluorescencia y extinción)

: detector 3 (extinción)

: sistema de detección

: lente de colimador para 40

: lente de colimador para 41

: lente de objetivo

: lente de concentrador para 50

: lente de concentrador para 51

: lente de concentrador para 52

: filtro de excitación para 40

: divisor de haz para la combinación de 40 41

: divisor de haz para la separación de la excitación y la fluorescencia : filtro de emisión de fluorescencia

: divisor de haz para separar la fluorescencia

: divisor de haz para separar la fluorescencia y la extinción

: filtro de extinción

: superficie reflectante, no fluorescente, por ejemplo superficie de silicio : direcciones de desplazamiento del soporte de capilar

: surco, zanja, rebaje, ranura

: zona marginal

0: variante según la invención para la detección

0: óptica de detección para la luz dispersa según el estado actual de la ciencia

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método para la medición óptica de al menos la estabilidad y la agregación de partículas en una muestra líquida (10) que se encuentra en un recipiente de muestra (30), presentando el método las siguientes etapas:

irradiar la muestra (10) con luz de al menos una primera longitud de onda (21) para excitar las partículas fluorescentes,

irradiar la muestra (10) con luz de al menos una segunda longitud de onda (20) para examinar la dispersión de las partículas,

medir la luz de fluorescencia que es emitida por la muestra (10); y

medir la luz de extinción (22) a la segunda longitud de onda, de modo que la luz irradiada de la segunda longitud de onda (20) atraviesa el recipiente de muestra (30), es retrorreflejada, atraviesa el recipiente de muestra nuevamente en la dirección opuesta y sale como luz de extinción,

en el que son determinadas la estabilidad basándose en la luz de fluorescencia medida y la agregación basándose en la luz de extinción medida.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la luz de fluorescencia y la luz de extinción son medidas con un sistema óptico común y/o se miden de manera simultánea.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la irradiación de la muestra

i) no se realiza simultáneamente con la primera y la segunda longitud de onda; o

ii) la irradiación con la segunda longitud de onda se realiza continuamente, mientras que la irradiación con la primera longitud de onda se realiza de forma intermitente, con preferencia periódicamente.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

i) la luz de extinción y la luz de fluorescencia son medidas por un detector común (53);

ii) la luz de extinción es medida por un primer detector (50) y/o un segundo detector (51), y la luz de fluorescencia de una primera longitud de onda de fluorescencia es medida por el primer detector (50) y la luz de fluorescencia de una segunda longitud de onda de fluorescencia es medida por el segundo detector (51); o iii) la luz de extinción es medida por un primer detector (52), la luz de fluorescencia de una primera longitud de onda de fluorescencia es medida por un segundo detector (51) y la luz de fluorescencia de una segunda longitud de onda de fluorescencia es medida por un tercer detector (50).

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, en el que el recipiente de muestra (30) es un capilar (30).

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el recipiente de muestra (30) está templado, preferiblemente se encuentra sobre un elemento de regulación de la temperatura (77) y se templa por contacto, en el que -más preferentemente- la luz irradiada de la segunda longitud de onda es retrorreflejada por el elemento de regulación de la temperatura (77), atraviesa el recipiente de muestra (30) otra vez en la dirección opuesta y sale como luz de extinción.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el elemento de regulación de la temperatura (77) está fabricado de un material

i) con una autofluorescencia baja < 1 %, y/o

ii) que presenta una alta reflectividad > 30 % en el rango de longitud de onda de la segunda longitud de onda y preferiblemente presenta silicio o está hecho de silicio puro.

8. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que durante un período de medición el recipiente de muestra (30) es desplazado con respecto a la luz irradiada de la primera y/o la segunda longitud de onda y/o respecto al detector, preferiblemente es desplazado hacia atrás y hacia adelante varias veces y más preferiblemente varios recipientes de muestra o varios capilares (30) son barridos por este movimiento relativo, en el que durante el período de medición, preferentemente una pluralidad de recipientes de muestra y/o el sistema óptico son impulsados continuamente hacia adelante y hacia atrás varias veces y las mediciones de la luz de fluorescencia y/o de la luz de extinción se realizan durante el movimiento.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que

i) se determina un valor de fluorescencia mediante la integración de la intensidad de la luz de fluorescencia sobre el desplazamiento y/o

ii) se determina un valor de extinción mediante la integración de la intensidad de la luz de extinción sobre el desplazamiento.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que durante un período de medición

i) para la determinación de la estabilidad térmica se modifica la temperatura de las muestras, preferiblemente se aumenta;

ii) para la determinación de la estabilidad química se eligen valores diferentes de concentración de desnaturalizantes en diferentes muestras líquidas; y/o

iii) para la determinación de la estabilidad en el tiempo la muestra se mantiene esencialmente a una temperatura constante durante un período de más de una hora.

11. Método de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, en el que

i) la segunda longitud de onda (20) es seleccionada de manera que sea absorbido menos del 1 %, 0,1 %, 0,05 % de la muestra o de las partículas en la muestra;

ii) l a luz de la segunda longitud de onda y la luz de la primera longitud son combinadas utilizando lentes para formar un rayo colineal que es irradiado dentro del recipiente de muestra; y/o

iii) la luz de extinción de la segunda longitud de onda, que es retrorreflejada y sale del recipiente de muestra en la dirección opuesta a la dirección de irradiación, se desvía de la dirección de irradiación como máximo 5°, preferiblemente menos de 2°, más preferiblemente menos de 1°.

12. Aparato para la medición óptica de la estabilidad y la agregación de partículas en una muestra líquida (10) que se encuentra en un recipiente de muestra (30), en particular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el aparato comprende:

un elemento de soporte que tiene una superficie reflectante (77) sobre la que se disponen los recipientes de muestra (30),

una primera fuente de luz (40) para irradiar luz de una primera longitud de onda en el recipiente de muestra para excitar la fluorescencia de las partículas que se van a examinar,

una segunda fuente de luz (41) para irradiar luz de una segunda longitud de onda en el recipiente de muestra para medir la dispersión de las partículas,

un primer detector para medir la luz de fluorescencia excitada que es irradiada por la muestra,

un segundo detector para medir la luz de extinción (22) a la segunda longitud de onda, en el que la luz irradiada de la segunda longitud de onda (20) atraviesa el recipiente de muestra (30), se retrorrefleja desde la superficie reflectante (77), vuelve a atravesar el contenedor de muestra en dirección opuesta y sale como luz de extinción, y

un medio de evaluación que está configurado para determinar la estabilidad de las partículas en base a la luz de fluorescencia medida y para determinar la agregación de las partículas en base a la luz de extinción medida.

13. El aparato de acuerdo con la reivindicación 12, que tiene un elemento de regulación de la temperatura que tiene una superficie reflectante en la que se retrorrefleja la luz irradiada de la segunda longitud de onda, en el que la superficie reflectante consta preferiblemente de silicio, preferiblemente silicio cristalino, y en el que el aparato está configurado preferiblemente de tal manera que al menos un contenedor de muestra (30) está dispuesto en la superficie para medir, en el que el contenedor de muestra (30) es preferiblemente un capilar (30).

14. El aparato según la reivindicación 12 ó 13 o el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se forma al menos una ranura (90) en la superficie del elemento de regulación de la temperatura y la luz irradiada de la segunda longitud de onda (20) es retrorreflejada por el fondo de la ranura (90), en el que la ranura (90) tiene preferiblemente una anchura de 1 a 10 mm y una profundidad de más de la mitad de la longitud de coherencia de la luz de la segunda longitud de onda.

15. Utilización de un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 para la realización de un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11.