JP7461078B2 - 溶液中の粒子の特徴付け - Google Patents
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Description
本発明は、溶液中の粒子の特徴を測定する方法に関し、前記方法は、溶液中の前記粒子のサンプルを含む容器を提供するステップを含む。サンプルは、好ましくは、たとえば0.1μL~15μLの小さい体積を有する。この方法は、好ましくは、実質的に単色の光を放出する光源を提供するステップと、光検出器を提供するステップと、単色光源からの光を、サンプルを含む容器へ伝送するステップとを含む。言い換えれば、容器内の粒子は、光源からの光で照射され、粒子からの散乱光が、光検出器によって検出される。さらに言い換えれば、容器からくる光、すなわち容器から擬似放出された光が、光検出器によって検出され、動的光散乱(DLS)測定に基づいて、サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の特徴を判定することができる。本明細書に、容器から放出される/来る光は、「放出光」とも呼ばれ、サンプルと相互作用した後のサンプルからの「散乱光」または「後方散乱光」という用語と交換可能に使用される。
好ましくは、DLS測定は、たとえば測定の速度を向上させるために、1つのサンプルにつき1度だけ特有の温度で実行される。しかし、DLS測定は、たとえば測定の手段(たとえば、同じ温度)を計算するために、かつ/または粒子の異なる条件(たとえば、異なる温度)を考慮に入れるために、1つのサンプル/容器につき複数回、同じ温度および/または異なる温度で実行することができる。
好ましくは、DLS測定は、光検出器から取得されたアナログ出力信号を取得するステップと、取得されたアナログ出力信号を処理するステップとを含む。好ましくは、取得されたアナログ出力信号を処理するステップは、取得されたアナログ出力信号を、デジタル化された出力信号にデジタル化するステップを含む。検出器からのアナログ出力信号(全体)をデジタル化することで、以下でさらに詳細に論じるように、従来技術に対して特定の利点を提供する。特に、結果として得られるデジタル化された出力データは、デジタル化された生信号であると見なすことができるが、デジタル化された生信号は、検出器によって検出される光の強度に応じて、後により容易に取り扱うことができる。要約すると、デジタル化された出力データは、たとえば個々の光子に対する個々のピークを区別するために、後にアナログ処理手段によって処理することができ、またはデジタル処理手段によるように処理することができる。
(a)溶液中の粒子を含むサンプルを提供するステップと、
(b)接触加熱および/または冷却によって、前記サンプルプローブの画定された温度を生じさせるための温度制御システムを提供するステップと、
(c)粒子を第1の温度で測定するステップと、
(d)温度制御システムによってサンプル内に第2の温度を生じさせるステップと、
(e)この第2の温度でサンプル中の粒子を測定するステップと、
(f)前記2つの測定に基づいて、粒子を特徴付けるステップとを含む。
好ましくは、この方法は、さらなる光検出器を提供するステップと、さらなる光検出器を使用して、好ましくは容器の長手方向軸に対して角度φで、サンプルを含む容器の静的散乱光を測定するステップとをさらに含み、φは、好ましくは10度~150度、より好ましくは10度~60度である。
本発明はさらに、好ましくは本発明の方法によって、溶液中の粒子の特徴を測定するためのデバイスに関し、前記デバイスは、溶液中の前記粒子のサンプルを含む少なくとも1つの容器、好ましくは0.1~15μLの前記粒子を収容する手段と、単色光源および光検出器と、DLS測定を実行する手段と、制御手段とを備え、制御手段は、少なくとも1つの容器を収容する手段を制御し、単色光源からの光を少なくとも1つの容器へ伝送するように単色光源を制御し、少なくとも1つの容器からの信号を検出するように光検出器を制御し、DLS測定を実行する前記手段を制御するように適合される。
特に、本発明は、第1の態様において、溶液中の粒子の特徴を測定する方法に関し、前記方法は、溶液中の前記粒子のサンプルを含む容器を提供するステップであり、サンプルが、好ましくは0.1μL~15μLの体積を有する、容器を提供するステップと、単色光源および光検出器を提供するステップと、単色光源からの光を、サンプルを含む容器へ伝送するステップと、光検出器によって、容器から放出された光を検出するステップと、動的光散乱(DLS)測定に基づいて、サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の特徴を判定するステップとを含む。本発明により、知られているDLS測定はここで、非常に小さいサンプル体積で実行され、たとえば従来技術によって開示も提案もされなかった毛細管内のサンプルのDLS測定が実行されるという利点を提供する。逆に、従来技術は、DLS測定が、好ましくは上述したサンプルプローブより大きい体積を必要とすることを教示する。さらに、本発明の方法には、精密な測定結果を高い処理量で取得することができるという利点がある。
溶液中の粒子は、好ましくは溶液中のタンパク質である。以下の表1(異なる質量のタンパク質に対するRmin;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3055910/)および図12に示すように、ほとんどのタンパク質は、たとえば500kDaの分子量より小さく、したがって5nm未満の半径および/または10nm未満の直径を有する。したがって、好ましいタンパク質は、5nm未満の半径および/または10nm未満の直径を有する。さらに、いくつかの好ましい例が、図13に示されている。
好ましい実施形態の例
好ましくは、本発明による方法は、容器の蛍光信号を検出するステップ、容器の厳密な位置を判定するステップ、任意選択で光源および/または光学系に対して容器を位置決め(移動)するステップ、DLS測定、好ましくはさらにナノDSF測定を第1の温度で実行するステップ、容器を調温するステップ、容器の蛍光信号を検出するステップ、容器の厳密な位置を判定するステップ、任意選択で容器を相対的に位置決め(移動)するステップ、DLS測定、好ましくはさらにナノDSF測定を第2の温度で実行するステップなど、少なくとも詳細に上述したステップを含む。したがって、粒子の3次元構造、粒径分布、および凝集、ならびに温度などのパラメータに対する依存性を、比較的安く、速く、ならびに高い再現性および精度で評価することができる。さらに、少なくとも前記ステップを含む本発明による方法は、好ましくは、2つ以上の容器を使用して実行される。これには、精密な測定結果を高い処理量で取得するという利点がある。
本発明によるデバイスは、DLS測定を実行する手段をさらに備える。前記手段は、たとえば、FPGA、パルス弁別器、相関器、ADC、ならびに平行化レンズおよび/または対物レンズ(または対物鏡)などのレンズを備えることができる。
1.溶液中の粒子の特徴を測定する方法であって、
- 溶液中の前記粒子のサンプルを含む容器を提供するステップであり、サンプルが好ましくは0.1μL~15μLの体積を有する、ステップと、
- 単色光源および光検出器を提供するステップと、
- 単色光源からの光をサンプルを含む容器へ伝送するステップと、
- 容器から放出された光を光検出器によって検出するステップと、
- 動的光散乱(DLS)測定に基づいて、サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の特徴を判定するステップとを含む。
3.単色光源からの光がコヒーレントであり、好ましくは350nm~500nm、好ましくは405nm、445nm、または488nmの波長を有する、態様1または2に記載の方法。
好ましくは周波数安定化ダイオードレーザ、DPSSレーザ、PPLN2重ダイオードレーザ、周波数多重DPSSレーザ、ダイオード励起ファイバレーザ、多重ダイオード励起ファイバレーザ、およびダイオード励起アップコンバージョンファイバレーザからなる群から選択されるダイオードレーザである、態様1から3のいずれかに記載の方法。
6.レーザが、1mW~200mW、好ましくは10mW~180mW、より好ましくは50mW~150mW、さらに好ましくは70mW~120mW、たとえば100mWの電力を有し、レーザが、好ましくは、連続波(CW)レーザであり、好ましくはパルスレーザでない、態様4または5に記載の方法。
9.光検出器によって検出される光が、容器の長手方向軸に対して角度φDで、容器から放出され、φDが0度~45度であり、φLの値が、好ましくはφDの値と同一である、態様8に記載の方法。
14.DLS測定が、1つのサンプルにつき1度だけ実行される、態様1から13のいずれかに記載の方法。
16.DLS測定が、
- 光検出器から取得されたアナログ出力信号を取得するステップと、
- 取得されたアナログ出力信号を処理するステップとを含む、
態様1から15のいずれかに記載の方法。
i)好ましくは容器から放出された検出光の強度が、1秒当たりの検出光子2百万個を下回る場合、デジタル化された出力信号を、デジタル化された単一光子パルス信号として処理するステップ、
および/または
ii)好ましくは検出光の強度が、1秒当たりの検出光子2百万個を上回る場合、デジタル化された出力信号を、アナログ信号の離散値として処理するステップによってさらに処理される、態様17に記載の方法。
- 出力信号を処理するステップが、ステップi)もしくはステップii)を含み、ステップi)もしくはii)に従って、デジタル化された出力信号を、デジタル化された信号として処理するべきかどうかを決定するための時間が、好ましくはFPGAを使用することによって、1秒未満、好ましくは最大0.05秒であり、または
- 光子計数および離散値出力信号を同時に処理することができ、したがってステップi)もしくはステップii)に従って処理するべきかどうかの決定を、測定後に行うことができる、
態様18に記載の方法。
- ステップi)もしくはステップii)から取得される処理されたデジタル化出力信号を記憶するステップ、または
- ステップi)およびステップii)から取得される処理されたデジタル化出力信号を記憶するステップと、
- 記憶された出力信号のうちの1つをさらに処理するステップとをさらに含む、態様18または19に記載の方法。
- 好ましくはサンプルに含まれる溶液中の前記粒子および/もしくは容器の材料の蛍光を測定するステップであり、前記蛍光が、好ましくは前記粒子および/もしくは容器の材料の自家蛍光である、ステップ、ならびに/または
サンプルを含む容器の後方反射を測定するステップ
をさらに含む、態様1から20のいずれかに記載の方法。
22.
- 測定された蛍光および/または測定された後方反射に基づいて、容器の位置を判定するステップと、
- 任意選択で、測定された蛍光/後方反射および判定された容器位置に基づいて、容器を位置決めするステップと
をさらに含む、態様21に記載の方法。
- 少なくとも第1の時点の第1の温度および第2の時点の第2の温度で、容器を時間とともに調温するステップ
をさらに含む、態様1または22のいずれかに記載の方法。
- ナノ示差走査蛍光定量法(ナノDSF)測定を実行するステップ、および/または
- サンプルを含む容器の後方反射を測定するステップ
をさらに含む、態様1から24のいずれかに記載の方法。
- さらなる光検出器を提供するステップと、
- さらなる光検出器を使用して、好ましくは容器の長手方向軸に対して角度φで、サンプルを含む容器の静的散乱光を測定するステップとをさらに含み、φが、好ましくは10度~150度、より好ましくは10度~60度である、
態様1から25のいずれかに記載の方法。
各容器に対する蛍光測定に続いて、各容器に対するDLS測定が行われ、
各容器に対するDLS測定に続いて、各容器に対する蛍光測定が行われ、または
複数の容器のうちの1つの容器に対して蛍光測定およびDLS測定が実行されるのに続いて、複数の容器のうちの別の容器に対して蛍光測定およびDLS測定が実行される、
態様28に記載の方法。
- 溶液中の前記粒子のサンプルを含む少なくとも1つの容器を収容する、好ましくは0.1~15μLの前記粒子を収容する手段と、
- 単色光源および光検出器と、
- DSL測定を実行する手段と、
- 制御手段とを備え、制御手段が、
少なくとも1つの容器を収容する手段を制御し、
単色光源からの光を少なくとも1つの容器へ伝送するように単色光源を制御し、
少なくとも1つの容器からの信号を検出するように光検出器を制御し、
DSL測定を実行する前記手段を制御するように適合される、デバイス。
- 相関演算、好ましくは自己相関演算を実行する手段をさらに備え、前記自己相関演算が、好ましくは、ハードウェアおよび/またはソフトウェアで実施される自己相関論理である、
態様31に記載のデバイス
33.
- 光検出器から取得された信号をデジタル化する手段をさらに備え、前記手段が、好ましくは、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)を備え、制御手段が、光検出器から取得された信号をデジタル化する前記手段を制御するようにさらに適合される、
態様31または32に記載のデバイス。
- サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の蛍光を測定する手段をさらに備え、制御手段が、サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の蛍光を測定する前記手段を制御するようにさらに適合される、
態様31から33のいずれかに記載のデバイス。
- 溶液中の前記粒子のサンプルを収容する手段を位置決めする位置決め手段をさらに備え、制御手段が、サンプルを収容する位置決め手段を制御するようにさらに適合される、
態様31から34のいずれかに記載のデバイス。
- 少なくとも第1の時点の第1の温度および第2の時点の第2の温度で、容器を時間とともに調温するための温度制御システムをさらに備え、制御手段が、少なくとも第1の時点の第1の温度および第2の時点の第2の温度で、容器を時間とともに調温するための前記温度制御システムを制御するようにさらに適合される、
態様31から35のいずれかに記載のデバイス。
- ナノDSF測定を実行する手段および/または後方反射を測定する手段をさらに備え、制御手段が、ナノDSF測定を実行する前記手段および/または後方反射を測定する前記手段を制御するようにさらに適合される、
態様31から36のいずれかに記載のデバイス。
- さらなる光検出器と、
- 静的散乱光測定を実行する手段とをさらに備え、制御手段が、静的散乱光測定を実行する前記手段を制御するようにさらに適合される、
態様31から37のいずれかに記載のデバイス。
- 単一モードファイバと、
- 前記単一モードファイバを介して単色光源からの単色光を送達する手段とをさらに備え、制御手段が、前記単一モードファイバを介して単色光源からの単色光を送達する前記手段を制御するようにさらに適合される、
態様31から38のいずれかに記載のデバイス。
11 容器、たとえば毛細管
12 調査対象の溶液中の粒子を含むサンプル
13 調温要素、たとえば加熱パッド/ベッド
14 蛍光光学系
15 DLS光学系
16 蛍光焦点
17 DLS焦点
18 蛍光焦点とDLS焦点との間のx距離
19 反射ビーム
20 毛細管軸と検出光ビームとの間の角度(φD)
30 光検出器、たとえばDLS検出器
31 ADC(アナログデジタル変換器)
32 パルス弁別器
33 相関器
34 FPGA
35 PC
36 光子計数閾値
38 デジタル光子パルス信号としてデジタル化された出力信号
39 PMTのデジタル化された出力信号
50 励起ビーム
51 検出ビーム
52 対物レンズ(または対物鏡)
53 毛細管軸と励起光ビームとの間の角度(φL)
53’ φL-90度として示されている毛細管軸と励起光ビームとの間の角度(φL)
54 励起光ビームと検出光ビームとの間の角度(φS)
55 単色光源、たとえばレーザ
56 平行化レンズ
57 光ファイバ(単一モード、別法として偏光維持、またはマルチモード)
58 ビームスプリッタ電力、たとえば50:50
59 ビームスプリッタ波長、たとえば低域通過620nm
60 ダイクロイックフィルタ、たとえば蛍光を阻止するために帯域通過405/5nm
61 偏光フィルタ
62 レーザのビーム品質を改善するための光学系
63 迷光を低減させるためのアパーチャ
64 毛細管の非点収差を補正するための円柱レンズ
Claims (21)
- 溶液中の粒子の特徴を測定する方法であって、
- 溶液中の前記粒子のサンプルを含む少なくとも1つの容器を提供するステップ、
- 単色光源および光検出器を提供するステップと、
- 前記単色光源からの光を前記サンプルを含む前記容器へ伝送するステップと、
- 前記容器から放出された光を前記光検出器によって検出するステップと、
- 動的光散乱(DLS)測定に基づいて、前記サンプルに含まれる溶液中の前記粒子の特徴を判定するステップとを含み、前記DLS測定が、5秒未満で取得されるステップ、
前記DLS測定が、
- 前記光検出器から取得されたアナログ出力信号を取得するステップと、
- 前記取得されたアナログ出力信号を処理するステップとを含み、
前記取得されたアナログ出力信号を処理する前記ステップが、前記取得されたアナログ出力信号を、デジタル化された出力信号にデジタル化するステップを含む、
前記デジタル化された出力信号が、
i)前記光検出器により検出された光の強度が、1秒当たりの検出光子の所定数を下回る場合、前記デジタル化された出力信号を、デジタル化された単一光子パルス信号として処理するステップ、
および/または
ii)前記光検出器により検出された光の強度が、1秒当たりの検出光子の所定数を上回る場合、前記デジタル化された出力信号を、アナログ信号の離散値として処理するステップ
によってさらに処理される、
方法。 - 前記容器がガラス毛細管であり、そして前記サンプルが0.1μL~15μLの体積を有する、請求項1に記載の方法。
- - 前記サンプルに含まれる溶液中の前記粒子および/もしくは前記容器の材料の蛍光を測定するステップであり、前記蛍光が、前記粒子および/もしくは前記容器の前記材料の自家蛍光である、ステップ、ならびに/または
- 前記サンプルを含む前記容器の後方反射を測定するステップ
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記単色光が、レーザ波長単一モードファイバを介して、前記単色光源から送達される、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ファイバがレーザ波長偏光維持単一モードファイバである、請求項4に記載の方法。
- 前記単色光源からの光が、前記容器の長手方向軸に対して角度φLで、前記容器へ伝送され、φLが0度~45度であり、
前記光検出器によって検出される光が、前記容器の長手方向軸に対して角度φDで、前記容器から放出され、φDが0度~45度である、
請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記単色光源から前記容器へ伝送される前記光と、前記容器から放出されて前記光検出器によって検出される前記光との間の角度φSが、0度~150度である、請求項6に記載の方法。
- 前記伝送単色光が、対物レンズを使用して、前記サンプルを含む前記容器内で集束させられ、前記容器から放出される前記光がまた、前記対物レンズによって集束させられる、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対物レンズが、10mm~200mmの焦点距離を有し、および/または
前記伝送単色光が、3μm~30μmの半値全幅(FWHM)を有する焦点によって、前記容器内で集束させられる、請求項8に記載の方法。 - 0.01nl~0.1nlの測定体積が得られる、請求項9に記載の方法。
- 前記光検出器が、光電子増倍管(PMT)、シリコン光電子増倍管(SiPM)、またはアバランシェフォトダイオード(APD)光子計数検出器である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DLS測定が1秒未満で取得される、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- - 少なくとも第1の時点の第1の温度および第2の時点の第2の温度で、前記容器を時間とともに調温するステップ
をさらに含み、
少なくとも第1の時点の第1の温度および第2の時点の第2の温度で、前記容器を時間とともに調温する前記ステップが、1分当たり0.01℃~1分当たり30℃の焼戻し速度で、前記容器を調温するステップを含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記容器がホルダに配置された複数の毛細管であり、各毛細管が、溶液中の粒子のサンプルを含み、溶液中の粒子の特徴が各毛細管に対して測定される、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記特徴が、粒径分布、凝集温度、融解温度、転移温度、アンフォールディング開始温度、液-液相分離温度(TLLPS)、自由フォールディングエネルギー、第2ビリアル係数(B22)、粒子の自己相互作用、コロイド安定性、流体力学半径、粒子間の斥力または引力相互作用(KD)、可溶性、長期のタンパク質安定性、および臨界変性剤濃度からなる群から選択される、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から15のいずれか1項に記載の方法に従って、溶液中の粒子の特徴を検出するためのデバイスであって、
- 溶液中の前記粒子のサンプルを含む少なくとも1つの容器を収容する手段と、
- 単色光源および光検出器と、
- DSL測定を実行する手段と、
- 制御手段とを備え、前記制御手段が、
少なくとも1つの容器を収容する前記手段を制御し、
前記単色光源からの光を前記少なくとも1つの容器へ伝送するように前記単色光源を制御し、
前記少なくとも1つの容器からの信号を検出するように前記光検出器を制御し、
DSL測定を実行する前記手段を制御する
ように適合される、
前記DSL測定を実行する前記手段は、
- 前記光検出器から取得されたアナログ出力信号を取得する手段と、
- 前記取得されたアナログ出力信号を処理する手段とを含み、
前記取得されたアナログ出力信号を処理する前記手段が、前記取得されたアナログ出力信号を、デジタル化された出力信号にデジタル化する手段を含む、
前記デジタル化された出力信号が、
i)前記光検出器により検出された光の強度が、1秒当たりの検出光子の所定数を下回る場合、前記デジタル化された出力信号を、デジタル化された単一光子パルス信号として処理する手段、
および/または
ii)前記光検出器により検出された光の強度が、1秒当たりの検出光子の所定数を上回る場合、前記デジタル化された出力信号を、アナログ信号の離散値として処理する手段
によってさらに処理される、
デバイス。 - - 前記光検出器から取得された信号をデジタル化する手段をさらに備え、前記制御手段が、前記光検出器から取得された信号をデジタル化する前記手段を制御するようにさらに適合される、
請求項16に記載のデバイス。 - 前記光検出器から取得された信号をデジタル化する手段が、フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)を備える、請求項17に記載のデバイス。
- - ナノDSF測定を実行する手段および/または後方反射を測定する手段をさらに備え、前記制御手段が、ナノDSF測定を実行する前記手段および/または後方反射を測定する前記手段を制御するようにさらに適合される、
請求項16から18のいずれか1項に記載のデバイス。 - - さらなる光検出器と、
- 静的散乱光測定を実行する手段とをさらに備え、前記制御手段が、静的散乱光測定を実行する前記手段を制御するようにさらに適合される、
請求項16から19のいずれか1項に記載のデバイス。 - - 単一モードファイバと、
- 前記単一モードファイバを介して前記単色光源からの単色光を送達する手段とをさらに備え、前記制御手段が、前記単一モードファイバを介して前記単色光源からの単色光を送達する前記手段を制御するようにさらに適合される、
請求項16から20のいずれか1項に記載のデバイス。
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