CN114930152A - 溶液中颗粒的特征化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测量溶液中多个颗粒特性的方法和执行所述方法的装置，其中所述方法包括以下步骤：提供包含所述溶液中所述多个颗粒的一样品的一容器，其中所述样品具有一体积优选地在0.1微升和15微升之间；提供一单色光源和一光检测器；将来自所述单色光源的光传输到包含所述样品的所述容器中；用所述光检测器检测从所述容器发出的光；以及基于动态光散射(DLS)测量来确定所述样品中所含溶液中所述多个颗粒的特性。
Description
技术领域
一般而言，本发明涉及一种基于动态光散射来表征溶液中多个颗粒的方法。具体而言，本发明涉及一种方法，所述方法允许表征多种蛋白质的三维结构和溶液中多种蛋白质的三维结构的变化(优选地包括其稳定性)，例如温度依赖性，尤其是在使用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)的多种小样品体积的情况下，优选地(例如，结合差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，DSF))测量时间小于1秒；以及用于执行相同操作的装置。本发明优选地提供一种方法和系统，所述方法和系统提供在短时间内和单个系统内对聚集和固有特性(例如，(例如，蛋白质)颗粒的折叠)的增强准确测量。
背景技术
快速准确地方式确定产品特性对于许多应用至关重要。例如，在制药或生物技术领域以及食品工业和材料科学领域，重要的是确保产品在生产和潜在存储期间具有高纯度和/或稳定的质量。质量控制通常是基于产品样品和/或包含产品的样品(例如，溶液中的多个颗粒(例如，蛋白质))来进行。这些控制通常很耗时，可能会造成相当大的延迟，直到获得结果。因此，为了降低因杂质和/或不期望的产品特性而产生的成本，希望手头有高精度且优选地实时评估产品特性(例如，溶液中颗粒的特性)的解决方案。
这种颗粒的一个示例是蛋白质。蛋白质几乎参与所有细胞过程，因此对包括人类在内的细胞有机体的功能至关重要。取决其功能，蛋白质可分类为决定细胞和组织结构的结构蛋白质；具有催化功能的蛋白质，即酶；离子通道调节细胞离子浓度，从而调节渗透稳态和信号转导；转运蛋白；调节蛋白，包括激素；以及参与免疫反应的蛋白质，如抗体。蛋白质的数量和/或活性可能会受到影响，例如在暴露于生理压力条件下，包括高温和/或在遗传性疾病的情况下。
由于其普遍性及其对细胞过程的影响，蛋白质数量和/或活性的变化可能对生物体的生存和健康产生重大影响。
由于其相关性，鉴于其结构、功能、分布、水平以及在包括医学在内的各种应用中的潜在用途，蛋白质已经被进行了深入的研究。蛋白质是由肽键连接的氨基酸组成的大分子化合物。特定的氨基酸序列，也称为蛋白质的一级结构，是由基因决定的。由于蛋白质氨基酸残基之间的氢键，氨基酸序列可以被折叠，从而形成构形，也称为二级结构，其中氨基酸序列的空间排列称为三级结构。蛋白质的三级结构和三维折叠是一个特别有趣的问题，因为它的研究不仅提供了有关蛋白质分子结构的信息。它可以进一步提供关于活性氨基酸残基的空间排列的详细信息，例如在酶的催化活性中心或抗体的抗原结合位点中，从而提供关于其活性的详细信息。此外，一些蛋白质具有四级结构，这是指蛋白质的聚集和/或结合，从而形成稳定的(低聚)蛋白质，单个蛋白质被称为(低聚的)蛋白质的亚单位。由于蛋白质的(多个)天然构形的偏差通常与其功效的降低有关，尤其是蛋白质的三维结构可以被认为是其生物效应的关键。
例如，优化蛋白质的可利用性(尤其是在生物活性构形中)代表了治疗环境中的一种有希望的方法。如果一名对象的蛋白质水平与其他对象(如对照组)中可观察到的水平相比呈现降低水平，则获得预定量的所述蛋白质对所述对象是有益的。特别是在治疗应用中，需要在给定构形中获得高纯度的感兴趣蛋白质，以避免给药时出现不期望的免疫反应。出于同样的原因，活性物质(如以蛋白质为基础的生物制药的活性成分)在存储期间必须保持稳定，即在生物制药中所含的感兴趣蛋白质应保持完整且处于预期构形中，因此在存储期间不得降解、改变其三维结构和/或形成聚集体。
由于活性物质(如抗体)的开发方式使其仅以天然形式具有活性，因此变性活性物质通常是无效的，必须避免使用。变性是指生物分子(如蛋白质)的结构变化，在大多数情况下涉及这些分子生物功能的丧失。变性可能是由于物理或化学原因造成的影响。
应避免颗粒(如抗体)变性，因为它会降低疗效。因此，必须开发活性成分配方，以防止药物变性，即在热、化学和/或时间上稳定药物。此外，活性物质的聚集也可能导致无效。此外，聚集的和/或变性的颗粒(例如施用的聚集抗体)可引发体内免疫系统的反应，因此必须避免在药物中，或应将其在药物中的比例降至最低。因此，应避免颗粒聚集，例如抗体疗法中的颗粒聚集，因为它会引起免疫系统的反应，也会导致疗效降低。
然而，通常不清楚为什么颗粒会聚集和/或变性：颗粒聚集是因为其变性，即不以其天然形式存在，还是以其天然形式聚集然后变性？
已经开发了不同的方法，旨在特征化在不同环境条件下(低聚物)蛋白质的三维结构，包括天然和化学和/或热变性条件。研究蛋白质的三维折叠的稳定性，例如依赖于温度、pH和/或其他化学成分的存在，对于优化存储条件(例如以蛋白质为基础的生物制药)非常有利。为了确定蛋白质的稳定性，可以应用差示扫描荧光法(DSF)方法，例如包括纳米差分扫描荧光法。例如，可以使用包括背向反射在内的定性方法来分析较大颗粒(如不需要的蛋白质聚集体)的存在，而可以使用基于动态光散射(DLS)的分析来研究溶液中蛋白质的尺寸分布。
对于颗粒的综合表征，仅单独地分析聚集或变性往往是不够的。然而，现有的系统不能以高灵敏度同时测量蛋白质的聚集和(未)折叠，尽管在大多数情况下这两个参数的相互作用也是令人感兴趣的。例如，PrometheusTM装置(微量热公司)可以测量蛋白质在溶液中的聚集和(未)折叠，但在聚集的情况下，灵敏度受到限制，因此无法将一些小聚集的存在与少数大聚集的存在区分开来。例如，后者可以通过将装置与另一个装置(如
读板器(怀雅特科技公司))相结合来实现。然而，当使用后者时，包括较低加热速率在内的附加技术限制会导致在颗粒暴露于热时是否首先发生展开(unfolding)或聚集的信息丢失。
因此，仍然需要手头上有替代解决方案，以便在高处理量下全面地且有效地特征化像溶液中的蛋白质这样的颗粒，确保即使在颗粒低含量的情况下也能获得可重复的定量结果。
发明内容
除其他外，本发明基于以下发现：通过执行动态光散射(DLS)测量，可以在高处理量下以高灵敏度和再现性分析溶液中颗粒的三维结构，优选地结合基于包含在溶液中多个颗粒的相同样品的纳米差分扫描荧光法(nano-DSF)测量，即使在短时间内样品体积很小的情况下。基于所述测量，可以以快速准确的方式确定蛋白质折叠的聚集和自由能，优选地在单个装置内。此外，使用本发明的方法和系统，可以例如在两秒钟甚至更短的时间内从约48个样品获得关于溶液中是否存在颗粒聚集体和/或预期粒径分布偏差的信息，从而大大加快质量控制。为了进行比较，使用动态光散射的现有方法对于一个样品至少需要12秒钟。因此，甚至可以使用本发明的方法和装置进行实时测量，例如液体流动的量测，以表征溶液中的颗粒。
具体而言，使用根据本发明的系统和方法，“颗粒内”作用和“颗粒间”作用可以被测量，例如，可以测量溶液中颗粒的变性和聚集，而且，甚至可以近似同时地(即基本上同时地)或同时地测量。
例如，“颗粒内”作用优选地与折叠/展开相关，并且通常与颗粒的3D结构(一级、二级、三级、四级结构)相关。颗粒的变性也是一种“颗粒内”作用，并且可以在根据本发明的程序和系统中通过测量固有的颗粒荧光(例如色氨酸荧光、酪氨酸荧光)来进行测量。同时，颗粒聚集是一种改变颗粒大小的“颗粒间”作用，可以通过散射未被吸收的光来测量。
同时测量颗粒/分子的热诱导变性和聚集是有益的，例如，确定颗粒的变性是由聚集引起的，还是颗粒的聚集是由变性引起的。换言之：了解颗粒是以其天然构形聚集还是以未折叠或部分未折叠的构形聚集是有益的。这些知识有助于更好地理解聚集机制，从而改进所研究的颗粒的稳定配方(例如，包含含有稳定成分的缓冲液)的开发过程。由于上述过程可能以不同的时间尺度(例如，约1秒至数小时)以不同的顺序发生，因此随着时间的推移，同时测量纳米差分扫描荧光法和动态光散射以监测这些相互依赖的过程的动力学尤其有益。
本发明由独立权利要求的特征来定义。本发明的优选实施例由从属权利要求来定义。
本发明涉及一种测量溶液中多个颗粒特性的方法，所述方法包括提供一容器的步骤，所述容器包括溶液中多个颗粒的一样品。所述样品具有一个小的体积，例如在0.1微升至15微升之间。所述方法优选地包括以下步骤：提供基本上发射单色光的一光源，提供一光检测器，及将光从单色光源发射到包含所述样品的所述容器。换句话说，容器中的多个颗粒被来自所述光源的光照射，其中所述多个颗粒的散射光被所述光检测器检测出来。也就是说，来自容器的光，即就是说(quasi)容器发射的光，由光检测器检测出来，其中可基于动态光散射(DLS)的测量来确定样品中所含溶液中多个颗粒的特性。本文中，从容器发射/发出的光也被称为“发射光”，并在其与样品相互作用后，与来自样品的术语“散射光”或“背向散射光”互换使用。
优选地，样品具有一体积在0.1微升和15微升之间，更优选地在1微升和15微升之间，甚至更优选地在8微升和12微升之间。样品优选地提供在较小体积的容器中，例如在多孔板的孔中或毛细管中，这提供了可通过毛细力轻松填充毛细管的进一步优势。例如，可以将单个毛细管或甚至安装在阵列(支架)上的多个毛细管与样品一起浸入溶液中，这样，由于毛细力的作用，每个毛细管可以在几秒钟内完全浸泡。
优选地，来自所述单色光源的光是相干的，并且优选地波长在350纳米至500纳米之间，优选地为405纳米、445纳米或488纳米。本领域技术人员理解，真实光源当然永远不可能是完全单色的，即具有零光带宽。因此，术语单色光源是指如上所述具有非常有限的波长范围或带宽的光源。换句话说，在本申请中，术语单色光和准单色光可以互换使用。
例如，激光源通常是单色或准单色的，即光带宽足够小，以至于光的某些行为很难与真正的单色光的某些行为区分开来。
优选地，(准)单色光源是相干的(coherent)光源，例如，一激光，优选地是二极管激光，优选地是选自由以下组成的群组的二极管激光：稳频二极管激光、DPSS激光、PPLN频率倍频二极管激光、倍频DPSS激光、二极管泵浦光纤激光、倍频二极管泵浦光纤激光和二极管泵浦上转换光纤激光。优选地，所述激光具有一相干长度为至少0.1毫米。所述激光优选地具有一相干长度为至少0.1毫米、优选地为至少1毫米。
优选地，所述激光具有一功率在1毫瓦和200毫瓦之间，优选地在10毫瓦和100毫瓦之间，更优选地在45毫瓦和80毫瓦之间，甚至更优选地在50毫瓦和70毫瓦之间。所述激光也可具有一功率在1毫瓦至200毫瓦之间，优选地在10毫瓦至180毫瓦之间，更优选地在50毫瓦至150毫瓦之间，甚至更优选地在70毫瓦至120毫瓦之间，例如在10O毫瓦。优选地，可以使用具有电子/数字可变/可控输出的动态光散射激光。
优选地，单色光从单色光源通过激光波长单模光纤传输到容器/样品。优选地，使用偏振保持(PM)光纤，例如，激光波长偏振保持单模光纤。根据另一个实施例，使用不保持偏振的光纤可能是有利的。优选地进一步将光随后(例如，通过物镜的方式)聚焦在容器中的一焦点上。
优选地，单色光源发出的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度传送至所述容器，其中
优选地在0度和45度之间，优选地在容器内具有一焦点。优选地，使用光检测器所检测到的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度(或散射、背向散射)从所述容器发出，其中
为在0度至45度之间，其中
的值优选地与
的值相同。优选地，从所述单色光源传送到所述容器的光和从所述容器发出并使用所述光检测器检测到的光之间的一角度
是在0度至150度之间，优选地在10度至150度之间，更优选地在10度至60度之间。由于可以在装置内确定容器的位置，因此优选地针对容器测量上述发射或散射光的角度。然而，本领域技术人员理解，从容器内的颗粒散射或发射的光是包含颗粒信息的光，所述信息可用于其表征。例如，本发明的方法可用于执行基于溶液中颗粒散射光的动态光散射测量。此外，本发明的方法还可用于执行基于颗粒发射的荧光的差分扫描荧光法(DSF)测量。从宏观上看，散射光和荧光是从容器中发出/射出的。
优选地，传送的单色光是使用一物镜来聚焦在包含所述样品的所述容器中，其中从所述容器发射的光优选地也被所述物镜聚焦。优选地，所述物镜具有一焦距在10毫米和200毫米之间。优选地，所传送的单色光在所述容器中聚焦，具有一焦斑的半峰全宽(FWHM)在3微米和30微米之间，优选地导致一测量体积在0.01纳升和0.1纳升之间，优选地在0.01纳升和0.02纳升之间，更优选地为约0.016纳升。
优选地，光检测器是光电倍增管(PMT)、硅光电倍增管(SiPM)或雪崩式光电二极管(APD)光子计数检测器，更优选地是光电倍增管或硅光电倍增管。
优选地，动态光散射测量是在小于5秒、优选地在小于1秒、优选地在200毫秒到800毫秒之间、更优选地在约500毫秒内获得。
优选地，在特定温度下，每个样品仅执行一次动态光散射测量，例如，为了提高测量速度。然而，每个样品/容器可在相同温度和/或不同温度下多次进行动态光散射测量，例如，以计算测量的平均(例如，在相同温度下)和/或考虑颗粒的不同条件(例如，在不同温度下)。
优选地，动态光散射测量包括执行至少一个相关性操作的步骤，优选地是至少一个自相关性操作。
优选地，所述动态光散射测量包括以下步骤：获取从所述光检测器获得的一模拟输出信号；以及处理所获得的模拟输出信号。优选地，其中处理所获得的模拟输出信号的步骤包括以下步骤：将所获得的模拟输出信号进行数字化以转化为一数字化输出信号。
将从检测器(整个)模拟输出信号数字化比现有技术具有某些优势，下文将对此进行详细讨论。具体而言，所得的数字化输出数据可被视为数字化的原始信号，然而，根据检测器检测到的光的强度，后续更容易处理。简而言之，数字化的输出数据可随后用模拟处理装置处理或用数字处理装置处理，例如，以区分单个光子的单个峰值。
因此，处理输出信号的步骤还包括以下步骤：i)将所述数字化输出信号处理为一数字化单光子脉冲信号，优选地是在从所述容器发射的检测光到的强度低于每秒检测到200万个光子的情况下；和/或ii)将所述数字化输出信号处理为一模拟信号的多个离散值，优选地是在检测到的光强度高于每秒检测到200万个光子的情况下。-所述处理所获得的输出信号的步骤包括步骤i)或步骤ii)，并且其中决定是否根据步骤i)或步骤ii)将所述数字化输出信号处理为一数字化信号的时间小于1秒，优选地为最大0.05秒，优选地使用FPGA(现场可编程门阵列)。此外，两种信号(即光子计数信号和离散值信号)可以同时处理。这样，在测量后是否按照步骤i)或ii)进行处理的决定可以得到满足。
优选地，处理所获得的输出信号的步骤还包括以下步骤：存储从步骤i)或步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号；或存储从步骤i)和步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号；以及进一步处理所存储的多个输出信号中的一个。
作为一个示例，如果信号被处理为光子计数信号和/或模拟信号，则信号的处理方式不是由检测光子的检测器预先决定的，例如在使用专用光子计数检测器时，而是在后面阶段由例如FPGA(现场可编程门阵列)、ASIC(特定专用集成电路)或其他可编程方式中的算法预先决定的。优选地，可以在不改变硬件的情况下改变(例如改进)这些算法。例如，可以通过固件和/或软件方式更新和/或更改200万光子的限制，在这个限制下，算法从将信号标记为光子计数信号更改为将其标记为模拟信号。例如，可以将限制从每秒200万个检测光子切换到每秒100万个检测光子或每秒400万个检测光子。对于现有解决方案，这是优选的，其中硬件(例如，光子计数器)，必须交换以改变上述限制。
优选地，所述方法还包括测量荧光的步骤。优选地，测量荧光是样品中所含溶液中所述多个颗粒的荧光和/或容器本身材料的荧光，其中所述荧光优选地为所述多个颗粒/容器材料的自发荧光。优选地，所述方法还包括以下步骤：基于所测量的荧光来确定所述容器的位置，以及可选地基于测量的荧光和确定的容器位置，相对于光源重新定位容器(即，重新定位容器和/或光源)。优选地，确定容器位置的步骤也适用于没有(自发)荧光颗粒的样品，通过使用自身显示足够自发荧光的容器。换句话说，本发明的方法优选地通过荧光测量来确定容器(例如毛细管)的位置，其中检测到的荧光可基于颗粒和/或容器的材料。例如，由玻璃或石英玻璃制成的容器已经产生足够的自发荧光辐射，以便基于所述荧光测量来确定容器的位置，即使容器中没有样品或存在不会(自发)荧光的颗粒的样品。
替代地或另外地，根据本发明的方法优选地还包括以下步骤：测量包含所述样品的所述容器的背向反射，所述步骤可用于样品颗粒的特征化和/或可用于确定容器的位置。
优选地，所述方法还包括以下步骤：至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以不同的一第二温度随时间对所述容器进行回火。因此，如果在两个不同的温度下确定颗粒的特性，则可以测量特性的变化。因此，本发明的方法可以通过在第一温度T1下进行本发明的方法，然后在不同的第二温度T2或多个不同的温度Txy下进行本发明的方法，以测量溶液中颗粒特性的变化，并通过比较T1与T2或温度Txy来确定颗粒特征的变化。
优选地，本发明涉及一种测量溶液中多个颗粒特性的方法，所述方法具有以下步骤：
(a)提供包含在溶液中的多个颗粒的一样品；
(b)提供一温度控制系统，用于通过接触加热和/或冷却来产生样品探查的定义温度；
(c)在一第一温度下测量所述多个颗粒；
(d)通过所述温度控制系统的方式在所述样品内产生一第二温度；
(e)在所述第二温度下测量所述样品中的所述多个颗粒，以及
(f)根据上述两个测量值对所述多个颗粒进行表征。
根据本发明，测量步骤c)和e)是本申请公开的动态光散射测量步骤和/或本申请公开的纳米差分扫描荧光法测量步骤。根据优选实施例，测量步骤c)和e)均包括动态光散射测量步骤、附加的第一荧光读数和第二荧光读数。
优选地，至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火的步骤包括以0.01℃/分钟和30℃/分钟之间的一回火速率对所述容器进行回火，优选地在0.1℃/分钟和10℃/分钟之间，和/或其中所述第一温度和所述第二温度介于-20℃和160℃之间。
优选地，特定温度，优选在上述范围内，并将所述温度保持特定时间，例如超过10秒、超过1分钟或更长时间，例如等温模式，具有特定准确度优选地在+/-0.01℃至+/-1.5℃之间，优选地在+/-0.01℃至+/-0.5℃之间，提供了关于均匀性、再现性和精密度的测量的某些优势：
优选地，所述方法还包括以下(多个)步骤：执行纳米差分扫描荧光法(nano-DSF)测量；和/或测量包含样品的容器的背向反射。
优选地，所述方法还包括以下步骤：提供另一光检测器，及使用所述另一光检测器测量包含所述样品的所述容器的静态散射光，优选地与所述容器的一纵轴成一角度
其中
优选地在10度和150度之间，更优选地在10度和60度之间。
优选地，用于容纳小样品体积的容器是小容器，例如毛细管和/或多孔板。优选地，毛细管(capillary)是毛细试管(capillary tube)样品容器或只是毛细试管或毛细管。优选地，本发明的毛细管包括在毛细管的整个长度上基本上恒定的内径和/或基本上恒定的外径。
优选地，所述毛细管由玻璃制成，优选地不具有或仅具有轻微自发荧光特性的玻璃，例如硼硅酸盐玻璃和/或石英玻璃和/或合成熔融石英。
所述毛细管优选具有圆形横截面，优选地内径在0.1毫米至1毫米之间，优选地在0.15毫米至0.5毫米之间，优选地外径在0.2毫米至1.2毫米之间，优选地在0.65毫米至1毫米之间，长度在5毫米至70毫米之间，优选地在32毫米至50毫米之间，更优选地在约50毫米左右。基于所述直径，进一步优选地在毛细管壁厚度之间选择一个折衷方案，使其足够大，从而能够稳定地手动操作，并且足够薄，以在所需范围内使光学折射最小化。因此，毛细管壁的首选厚度可根据个人需求进行选择，例如手动处理、自动处理等。
此外，根据应用情况，更短或更长的毛细管可能是有利的。基于毛细管长度的效果优选地取决于所需的应用。例如，非常短的毛细管具有体积非常小的优点，这对于所需的材料量很小是有利的(效率)。非常短的毛细管可以通过毛细力(当它们具有相应的适配直径时)完全填充。如果它们足够短，毛细管甚至不必相对于重力(g)倾斜，因为毛细力本身完全地填充与g反平行的毛细管。短毛细管在空间方面也有优势；因此，可以在有限的表面上放置更多的毛细管。
较长的毛细管提供的优点是，不需要对一端或两端进行密封，例如，根据本发明，相对于测量时间而言，溶液蒸发的影响很小。例如，长度大于32毫米的毛细管在本发明测量的优选的持续时间内提供低蒸发率。
优选地，多个容器被提供，其中每个容器包含溶液中多个颗粒的一样品，及其中根据本发明的方法对每个容器测量溶液中多个颗粒的多个特性。优选地，对每个容器的一荧光测量之后是对每个容器的一动态光散射测量；或对每个容器的一动态光散射测量之后是对每个容器的一荧光测量；或对多个容器中的一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量，然后对所述多个容器中的另一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量。更优选地，对多个容器中的每个容器同时进行荧光测量和动态光散射测量。
优选地，所述多个特性是选自由以下组成的群组：粒径分布、聚集温度、熔解温度、转变温度、展开温度、液-液相分离温度(TLLPS)、展开自由f能的变化、第二维里系数(B22/A2)、颗粒自相互作用、胶体稳定性、流体动力半径、颗粒间的排斥或吸引的相互作用(kD)、溶解度、长期蛋白质稳定性和临界变性剂浓度。
例如，与聚集的开始相比，确定尺寸增加的起始时间(从半径随温度变化的测量)，可以推导出有关展开(unfolding)/低聚物/聚集的特征。
展开的活化能可以推导出来，例如，从不同加热速率的后续实验中推导出来，并且可以作为评估胶体稳定性的应用。
本发明还涉及一种测量溶液中多个颗粒特性的装置，优选地根据本发明的方法，其中所述装置包括用于容纳至少一个容器的一装置，所述至少一个容器包含溶液中所述多个颗粒的一样品，优选地所述至少一个容器用于容纳0.1至15微升的所述多个颗粒；一单色光源和一光检测器；用于执行一动态光散射测量的装置；以及控制装置，适用于控制用于容纳至少一个容器的装置，控制所述单色光源，以用于将光从所述单色光源传送到所述至少一个容器，控制所述光检测器，以检测来自所述至少一个容器的多个信号，以及控制用于执行所述动态光散射测量的所述装置。
优选地，所述装置还包括用于执行一相关性操作的一装置，所述相关性操作优选地是一自相关性操作，其中所述自相关性操作优选地是实施在硬件和/或软件中的一自相关性逻辑。
优选地，所述装置还包括用于将从所述光检测器获得的信号数字化的装置，其中所述装置优选地包括一现场可编程门阵列，及所述控制装置优选地进一步适用于：控制所述装置，以用于将从所述光检测器获得的多个信号进行数字化。
优选地，所述装置还包括用于测量所述样品的溶液中所述多个颗粒的荧光的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以用于测量所述样品中所含溶液中所述多个颗粒的荧光。
优选地，所述装置还包括一定位装置，用于定位容纳溶液中所述多个颗粒的所述样品的装置，其中所述控制装置进一步适用于：控制用于容纳所述样品的装置的定位。
优选地，所述装置还包括一温度控制系统，用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火，其中所述控制装置还适用于：控制所述温度控制系统，以用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
优选地，所述装置还包括用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的一装置和/或用于测量背向反射的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的所述装置和/或用于测量背向反射的所述装置。
优选地，所述装置还包括另一个光检测器；以及用于执行一静态散射光测量的装置，其中所述控制装置进一步适用于控制用于执行所述静态散射光测量的所述装置。
优选地，所述装置还包括一单模光纤；以及用于通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光。
附图说明
在下文中，将结合说明书附图对本发明的优选实施方案进行详细描述。。说明书附图中示出：
图1：A)主光束与毛细管轴线的角度。B)动态光散射光学元件倾斜地放置在毛细管的轴线上，以避免检测到反射。
图2：脉冲鉴相器的功能。
图3：光子计数信号的信号强度与一模拟信号的信号强度的对比图(虚线表示线性范围的外推拟合)。
图4：A)具有一相关器的信号布局图，其输入在光子计数和模拟数据之间切换。B)具有两个并行运行的相关器的信号布局图，一个处于模拟模式，另一个处于光子计数模式。
图5：根据本发明的测量系统的方案。
图6：A)动态光散射光学元件的方案。B)具有两个准直透镜的动态光散射光学元件的CAD模型(剖面图)的一部分。
图7：A)具有一个激发和两个检测器的动态光散射光学元件的方案，例如具有多模光纤的光电二极管和具有单模光纤的光电倍增管。B)动态光散射光学元件的共焦版本。C)组合的荧光光学元件和动态光散射光学元件共焦(x-距离＝0)。D)自由空间耦合光源的动态光散射光学元件的设计。E)具有透镜罩、散光校正、荧光阻挡滤光器和偏振滤光器的动态光散射光学元件的设计。F)具有两个动态光散射臂和一个共焦荧光光学元件的动态光散射光学元件的设计，用于在一个点上同时测量。G)无物镜的双臂动态光散射光学元件的设计。
图8：A)醋酸钠缓冲液中IgG的荧光偏移和粒径分布随温度变化的结合测量。B)醋酸钠缓冲液中IgG的荧光偏移和平均粒径随温度变化的结合测量。C)HEPES缓冲液中IgG的荧光偏移和粒径分布随温度变化的结合测量。D)HEPES缓冲液中IgG的荧光偏移和平均粒径随温度变化的结合测量。
图9：不同样品的动态光散射质量参数的示例性总结。
图10：衰减率(与颗粒半径成反比)表示为测量位置的函数。白色圆圈表示分析的测量位置。
图11：本发明的优选实施例的方案。
图12：示例性的蛋白质分子量分布(UniProt数据库，人类；https：//smith.chem.wisc.edu/content/proteomics-technologies)。
图13：可以使用根据本发明的方法和装置表征的示例性蛋白质的方案
(http：//book.bionumbers.orq/how-biq-is-the-averaqe-protein/)。
图14：说明了容器内不同位置处动态光散射测量的信号质量，以确定容器内的最佳测量点。
图15：抗体缓冲液筛选和抗体候选选择的测量。
图16：抗体缓冲筛选和抗体候选选择的进一步测量。
图17：抗体缓冲筛选和抗体候选选择的进一步测量。
图18：基于具有随机聚集的示例，了解聚集路径的测量。
图19：基于结构化聚合的示例，了解聚合路径的进一步测量。
具体实施方式
在下文中，将进一步详细讨论本发明的一般原理，并根据本发明的说明性实例或优选的实施方案进行讨论。
具体而言，本发明在第一方面涉及一种测量溶液中多个颗粒特性的方法，所述方法包括提供一容器的步骤，所述容器包括溶液中多个颗粒的一样品，其中所述样品具有一体积优选地在0.1微升至15微升之间；提供一单色光源和一光检测器；将光从所述单色光源传送到包含所述样品的所述容器；及使用所述光检测器来检测从所述容器发出的光；以及基于一动态光散射测量来确定所述样品中所含溶液中的所述多个颗粒的多个特性。本发明的优点是，现在可以在非常小的样品体积中进行已知的动态光散射测量，例如，对毛细管内的样品进行动态光散射测量，这是现有技术从未公开或建议的。相反地，现有技术告诉我们，动态光散射测量需要的体积最好大于上述样品探查(probe)。此外，本发明的方法的优点是可以以高处理量获得精确的测量结果。
优选地，所述方法还包括以下步骤：执行一纳米差分扫描荧光法测量，所述步骤的优点是，基于通过所述方法获得的动态光散射和纳米差分扫描荧光法测量结果，可以快速、准确地评估粒径分布和潜在的颗粒聚集，优选地在单个装置内。为了提高根据本发明的方法进行的测量的精度，例如动态光散射测量，优选地以及纳米差分扫描荧光法测量，所述方法优选地还包括以下步骤：测量荧光以确定容器位置。例如，可以使用溶液中颗粒的(自发)荧光和/或容器本身的自发荧光，其中通过使用由此获得的荧光信号，可以确定容器的位置。因此，可以准确地确定包含所研究的溶液中具有多个颗粒的样品的容器的位置，并且可选地能够(重新)定位容器以优化各自的(多个)测量的准确度。
因此，本发明的方法对于测量溶液中多个颗粒特性是非常有利，即使是在小样品体积的情况下，使用发射的单色光和散射光进行动态光散射测量，也具有高灵敏度。优选地，根据本发明的方法是自动执行的。
动态光散射是一种用于分析颗粒扩散系数的方法，扩散系数是颗粒在溶液中迁移的测量。在动态光散射测量中，用单色光照射包含颗粒的溶液的容器中的样品，并以预定角度检测散射光的强度。单色光到颗粒的路径长度和散射光到检测器的路径长度是不同的，取决于容器内各个颗粒的位置。通过叠加包含在样品中不同颗粒的散射光的光波，可以基于检测到的光获得样品的特定干涉图。因此，检测信号的强度取决于容器内颗粒的位置及其运动，即布朗分子移动/运动，从而改变光路的长度，从而改变获得的干涉图案。例如，颗粒移动越快，信号强度变化越快，导致扩散系数越高。基于动态光散射测量确定样品中所含溶液中颗粒的扩散系数是有利的，因为它可用于确定颗粒的流体动力学半径，例如，包括其水合膜。因此，通过应用根据本发明的方法，即使小颗粒，例如流体动力学半径在0.1纳米至3000纳米范围内、优选地在0.5纳米至1000纳米、2至3000纳米范围内的颗粒，都可以以高灵敏度和准确度进行检测和表征。
颗粒，可以使用根据本发明的方法测量其特性的，可以是天然存在的、生物化学和/或合成改性的颗粒以及合成颗粒或其组合。优选地，颗粒是具有1000纳米或更小纳米的平均直径(优选地是0.1纳米至700纳米、更优选地约1纳米至500纳米。颗粒可以至少部分或全部是生物的颗粒(biological particle)(也称为生物颗粒(bioparticle))，因此，本文中使用的术语“颗粒”优选地不是指例如烟尘、黄金颗粒等。包括黄金颗粒的后一示例优选地不包含在所研究的样品中，也不添加到所研究的样品中，例如不包含在根据本发明的方法之前的样品处理和/或制备步骤中。它们在样品中的存在不是有利的，因为它们相对生物颗粒而言将光散射较强，因此可能会掩盖所研究的(生物)颗粒的散射光信号。优选地，不要在样品中加入所谓的“探查颗粒(probe particle)”，因为样品优选地以其原始成分进行研究。
在本发明的上下文中，特别是在权利要求书中，应该注意的是，术语“颗粒”或“多个颗粒”还涉及多种珠(beads)，特别是多种微球(microbeads)、多种囊泡(vesicles)、多种分子团(micelles)、多种纳米颗粒或多种分子，特别是多种生物分子，例如多种核酸(例如DNA、RNA、LNA、PNA)、多种蛋白质、以及其他生物聚合物及其组合以及多种生物细胞(例如细菌、原核或真核细胞)或多种亚细胞片段、多种病毒颗粒、多种病毒样颗粒或多种病毒和多种细胞器等。分子的示例包括但不限于荧光染料、肽，特别是多肽、糖，特别是多糖、化合物、小分子、片段或表面活性剂。
术语“改性颗粒”或“改性珠”特别是涉及到包括或连接到分子、优选地是生物分子或荧光染料的珠或颗粒。这也包括用这些(生物)分子涂覆这些珠或颗粒。
根据本发明的颗粒的进一步示例为多种病毒颗粒、多种病毒样颗粒、多种细胞(尤其是直径小于20000纳米的细胞)、多种DNA分子、多种RNA分子、DNA折纸(DNA Origami)、多种小分子(例如分子量小于900道尔顿的分子)、多种脂质体、多种蛋白质、多种蛋白质复合物，例如在多种寡聚蛋白质的情况下，和/或多种蛋白质聚集体，其中颗粒的类型，例如包含在待研究的溶液中的蛋白质，可以是相同的或不同的。优选地，溶液中的颗粒是相同类型的，例如蛋白质或复合物和/或其形成的聚集体。
优选地，所研究的样品是直接获得的，例如在产品生产过程中或之后。因此，在应用根据本发明的方法之前，优选地不修饰(modified)和/或修正(amended)样品。如果将例如黄金颗粒添加到样品中，则在处理和/或解释所执行动态光散射(优选地另外的(多个)荧光测量)的所得结果时，必须考虑所产生的影响。因此，在直接获得且未进一步修正的样品中调查所研究的颗粒是有利的，因为可以获得关于所述溶液中颗粒特性的信息，而无需潜在的耗时和/或成本的预处理和/或后处理。
本文中，术语“蛋白质”和“低聚蛋白质”如果没有具体规定，则可以互换使用。具体而言，本文使用的术语“蛋白质”包括任何种类的氨基酸序列，即两个或更多个氨基酸的链，每个氨基酸通过肽键连接。更具体地说，本文中使用的术语“蛋白质”是指任何感兴趣的氨基酸序列。优选地，氨基酸序列为至少5个氨基酸长，更优选地为至少10个氨基酸，甚至更优选地为至少50、100、200或500个氨基酸。因此，术语“蛋白质”包括短肽，例如寡肽、多肽、蛋白质、蛋白质片段，即已知蛋白质的部分，例如生物活性部分或抗原部分，包括表位。至于蛋白质的功能，没有任何限制。
颗粒的浓度范围优选地在单个颗粒(例如纳米颗粒，对于黄金纳米颗粒)至500mM之间(例如小分子的情况下)。
溶液中的颗粒优选地为溶液中的蛋白质。如下表1(R最小对于不同质量的蛋白质；https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3055910/)和图12所示，大多数蛋白质是例如小于500kDa分子量，因此其具有半径小于5纳米和/或直径小于10纳米。
因此，优选的蛋白质的半径小于5纳米和/或直径小于10纳米。此外，图13中示出了一些优选的示例。
表1
低浓度蛋白质的示例为溶菌酶为0.5毫克/毫升，胰岛素为0.4毫克/毫升，IgG为0.06毫克/毫升。蛋白质的优选浓度范围为0.001毫克/毫升至250毫克/毫升，更优选地为0.01毫克/毫升至200毫克/毫升。
蛋白质等颗粒可以是从生物材料中分离出来的颗粒，例如用于试管内(in vitro)蛋白质生产的细胞培养物，和/或以人工合成方式生产。后者有几个优点，因为它具有时间和/或成本效益，并确保感兴趣的蛋白质的高纯度。优选地，溶液中的颗粒是相同的蛋白质或复合物和/或其构建的聚集体，其中蛋白质是人工合成生产的。因此，可以获得高准确度和高灵敏度的测量，以表征溶液中的多个颗粒。
溶液中颗粒的一些特性具有商业和学术意义。例如，溶液中粒径分布有利于评估溶液中的颗粒组成，包括非期望的颗粒的存在和/或数量，例如由于特定条件下蛋白质的不稳定性而导致的降解和/或聚集的蛋白质。由于不同的颗粒可能在不同的条件下聚集，因此可以评估给定颗粒的聚集条件，以表征所述颗粒，例如，在给定比例(如一半)的颗粒被聚集的情况下，颗粒可暴露的温度。因此，聚集温度可用于定义聚集的开始(Tagg)。同样的道理也可以鉴于颗粒的折叠和展开取决于温度被应用，通过颗粒特定的展开温度开始。熔解温度/点(Tm)是更令人感兴趣的，它定义了一颗粒(如蛋白质)的潜在折叠状态在热力学上不比另一温度更有利的温度。因此，所述颗粒以可比较的量存在于任何一个构形中，即自然折叠的构形和未折叠因而变性构形。因此，熔解温度可以作为颗粒热稳定性的指标。此外，可以研究与蛋白质稳定性直接相关且取决于蛋白质氨基酸组成的自由折叠能。第二维里系数(B22，也称为A2)是指颗粒胶体稳定性的指标，可进一步用于预测蛋白质聚集，正值是指蛋白质与蛋白质之间的胶体相互作用主要为负，负值表示蛋白质与蛋白质之间的净吸引相互作用(kD；扩散相互作用参数)。
因此，可使用根据本发明的方法测量的溶液中颗粒的特性，溶液中颗粒的特性优选地选自由以下组成的群组：粒径分布、聚集温度、熔解温度、展开温度开始、自由折叠能量、第二维里系数(B22/A2)、颗粒的自相互作用、胶体稳定性、流体动力学半径、颗粒间的排斥或吸引的相互作用(kD)和临界变性剂浓度。
再者，与聚集的开始相比，通过确定尺寸增加的起始时间(例如从半径随温度变化的测量推导)，可以推导出有关展开/低聚物/聚集的特征。此外，展开的活化能可以被推导出来，例如，从不同加热速率的后续实验中，这是例如评估胶体稳定性的一个有用应用。
根据本发明的方法可通过提供包含溶液中多个颗粒的样品的容器，用于测量溶液中(优选地，水溶液)所述多个颗粒的特性，其中所述样品具有一体积优选地在0.1微升至15微升之间。
因此，分析包含待研究的溶液中部分或全部颗粒的样品，其中所述样品被包含在容器中。在所述容器例如为毛细管的情况下，则优选地样品具有一体积在0.1微升至15微升之间，优选地在1微升至15微升之间，及更优选地在8微升至12微升之间。在所述容器例如为多孔板的情况下，在所述容器为384孔板的情况下，则优选地样品具有一体积在5微升至40微升之间，在所述容器为96孔板的情况下，则优选地在50微升至200微升之间，在所述容器为1536孔板的情况下，则优选地在1微升至15微升之间。当可用的颗粒数量有限和/或所研究的颗粒成本较高时，这样小的样品体积是有利的。此外，使用根据本发明的方法分析小样品体积至少具有以下另外的优点：i)更好地掩蔽容器壁上的散射，即可以将光散射对容器壁(例如毛细管壁)的影响降至最低，ii)来自所研究的溶液中所含颗粒的样品的散射信号更强，从而减少测量时间；iii)降低高浓度下的多重散射的概率，这取决于样品中溶液中颗粒的数量；iv)较便宜的单色光源(例如相干长度较短的激光)可用于获得高质量的测量结果，从而准确的对所研究的颗粒进行表征。
所研究的溶液中含有颗粒的样品被包含在容器中，优选为毛细管或多孔板的孔中。在毛细管的情况下，所述毛细管可由树脂、塑料、陶瓷、聚合物或玻璃制成。优选地，毛细管在毛细管的纵向两端具有开口端部。优选地，所述毛细管是玻璃毛细管。对于根据本发明的方法的准确度和再现性，其有利于减少可能影响动态光散射测量的伪假象和信号噪声，动态光散射测量是基于从包含溶液中的多个颗粒的样品的容器发射的光信号。因此，玻璃制成的容器是有利的，因为玻璃对光的透射和散射的影响比树脂等其他材料小，同时即使在高温和极端的溶液条件下(如酸性条件下)，玻璃也是稳定和惰性的。因此，毛细管优选地为具有一圆形截面的玻璃毛细管，具有一内径在0.1毫米至1毫米之间，优选地在0.15毫米至0.5毫米之间，和优选地具有一外径在0.2毫米至1.2毫米之间，优选地在0.65毫米至1毫米之间，和优选地，具有一长度在5毫米至70毫米之间，优选地在32毫米至50毫米之间，更优选地为约50毫米。优选地，内径和/或外径在毛细管的整个长度上是恒定的，优选地两者都是恒定的。这种毛细管通常被称为管状毛细管(tube capillary)，以进一步强调毛细管的形式。毛细管壁的作用类似于透镜，因此具有光学效应。因此，毛细管壁的厚度会影响测量的精度和灵敏度。使用内径在0.1毫米至1毫米之间、优选在0.15毫米至0.5毫米之间、外径在0.2毫米至2毫米之间、优选在0.3毫米至0.7毫米之间的毛细管已被发现是获得精确和灵敏测量的首选。具体而言，如上所述的内径有利于确保所研究样品内光束为短的路径长度；此外，在小直径的情况下，容器材料(以及样品)和加热元件(优选地由硅制成)之间的热传导更好。然而，在动态光散射测量的情况下，直径被认为是越大越好。
根据本发明的方法，单色光源被提供，优选地是相干光源，例如激光。单色光描述了包含单一光学频率的光辐射。如本领域所知，没有真正的激光是真正的单色的，并且所有激光都可以在一些频率范围内发光，这些频率范围被称为激光跃迁的线宽。在大多数激光中，线宽很窄。因此，为简单起见，本发明称为单色光。单色光对于表征溶液中的颗粒尤其有利，因为它的使用确保了定义的、恒定的测量条件，从而确保了精确和高度准确的分析。
优选地，来自单色光源的光具有一波长小于500纳米、更优选地在350纳米至500纳米之间、甚至更优选地为405纳米、445纳米或488纳米的波长。在小于500纳米(例如，445纳米、405纳米或488纳米)的波长下进行测量对于降低成本，同时保持高质量的结果尤其有利，因为可以使用更便宜的激光和更不复杂的激光。此外，使用波长小于500纳米(如445纳米、405纳米或488纳米)的单色光源的光，与使用波长为500纳米或以上的单色光源的光相比，具有导致更强的散射光信号和大多数颗粒(包括大多数蛋白质)为低吸收的优点。
单色光可以由激光提供，其中所述激光优选地是二极管激光，甚至更优选地是选自由以下组成的群组的二极管激光：稳频二极管激光、DPSS激光、PPLN倍频二极管激光、倍频DPSS激光、二极管泵浦光纤激光、倍频二极管泵浦光纤激光和二极管泵浦上转换光纤激光。优选地，所述激光具有一功率在1毫瓦和200毫瓦之间，优选地在10毫瓦和100毫瓦之间，更优选地在45毫瓦和80毫瓦之间，甚至更优选地在50毫瓦和70毫瓦之间。
单色光源可以通过其相干长度来表征。相干长度是来自同一单色光源的两个光束在路径长度或飞越时间上的最大差异，以便在其叠加时产生稳定的干涉图案。干涉图案可由干涉效应引起，干涉效应可由到达检测器的光波由于不同的路径长度和/或飞越时间而产生的相位差引起。单色光源(优选地，激光)优选地具有至少0.1毫米的相干长度。
根据本发明的方法，来自单色光源(优选地是激光)的光被传输到包含样品(包括所研究的溶液中的颗粒)的容器中。因此，光优选地是以光束的形式从激光器传输到包含所研究的样品的容器，以表征所述样品中包含的溶液中的颗粒。本文中，术语“光”、“光束(light beam)”和“光束(beam)”互换使用。
光可以通过多种方式传递。优选地，单色光经由单模光纤从单色光源传递。更优选地，单色光是通过在激光波长的一单模光纤(例如通过一激光波长的偏振保持单模光纤)从激光器传递。
从单色光源传输到容器的单色光，即传输的单色光，优选地使用一物镜在包含样品的容器中聚焦。此外，从容器发射的光优选地也是通过所述物镜来收集。优选地，所述物镜具有一焦距在10毫米至200毫米之间。替代地或另外地，所传送的单色光优选地在所述容器中聚焦，具有一焦斑的半峰全宽(FWHM)在3微米至30微米之间，优选地导致测量体积小于样品体积。特别是，使用根据本发明的方法可以调查的测量体积优选地在0.01纳升至0.1纳升之间，更优选在0.01纳升至0.02纳升之间，甚至更优选地在约0.016纳升。
因此，特别优选的是，单色光是由一个强力的激光器通过一个宽的孔径提供的，例如，孔径具有一宽度在0.5毫米至10毫米之间、优选地在1毫米至5毫米之间，光具有一波长为405纳米、445纳米或488纳米，并使用一个物镜聚焦在包含样品的容器中。因此，例如，每秒约有100万个被检测的光子传输到所述容器。对于这种情况，测量溶液中颗粒特性的方法是本领域已知的。为了确保准确的结果，所述方法使用，例如，位于光源和容器之间的光学滤光器，以减少传输到容器的光量，和/或包括以下步骤：稀释样品，以减少溶液中的颗粒浓度，以减少发射的光量。相反地，根据本发明的方法可以在不稀释样品或使用这种滤光器的情况下应用，通过提供至少两种不同的分析模式，如下文所述(对获得和处理输出信号的详细描述)。
为了高质量地表征溶液中的颗粒，如何将光准确地传输到包含样品的容器中也是很有意义的。更具体地说，将光学元件倾斜地放置于毛细管轴线上以避免检测到来自容器的反射是有利的。因此，来自单色光源的光优选地以一预定角度传输到容器(例如，毛细管)。具体地，来自单色光源的光优选地是以与所述容器的一纵轴(例如，毛细管的纵轴)成
的一角度传输到所述容器。其中
优选地为在0度至45度之间。
根据本发明的方法，还提供了一光检测器，用于检测从容器发出的光，其中从容器的所发射的光是指来自容器(例如毛细管)的散射光。此外，优选地以一预定角度检测所发射的光。因此，使用光检测器所检测到的光优选地是以与所述容器(例如，毛细管)的一纵轴成
的一角度从所述容器(例如，毛细管)发出，其中
优选地为在0度至45度之间。优选地，
的值与
的值相同。此外，从所述单色光源传送到所述容器(例如，毛细管)的光和从所述容器(例如，毛细管)发出或散射并使用所述光检测器检测到的光之间的一角度
优选地是在0度至150度之间，优选地在10度至150度之间，更优选地在10度至60度之间。
如图1A)中示例所示，来自单色光源的光(如激光)可以作为激发光束50以与容器11的纵轴10成
53的一角度传输到容器11(例如，毛细管11)，包括所研究的溶液中含有颗粒的样品12。激发光束50的光被包含在样品12中所研究的溶液中的多个颗粒散射，因此从容器11发射出来。发射的光或散射光可作为检测光束51被检测，与容器11的纵轴10成一角度
20。激发(光)光束50和检测(光)光束51之间的角度称为
54，也可以描述为从单色光源传输到容器11的光与从容器发出由光检测器检测的光之间的角度。
如图1B)中的示例所示，有利的是将动态光散射光学元件15定位，以便使激发光束50以一角度
53传输到容器11的纵轴10(例如，倾斜于毛细管轴线)，以避免检测到反射光束19(由毛细管11的壁反射)。图1B)显示了角度53’是90°-
的。本发明的优点是，通过使用适当的动态光散射光学器件15，将激发光束50聚焦到位于容器内的焦点17。因此，通过使用适当的聚焦光学元件并以相对于毛细管纵轴10的适当角度发射光，可以避免来自毛细管壁的干扰反射。优选地，在光学器件15和毛细管11之间的光纤不是必要的，使得光学器件15和毛细管之间的有一个小的空气距离，可以允许光学器件15和毛细管11之间的相对运动更加容易，这在短时间内测量多个毛细管的情况下是有利的。将焦点17放置在毛细管内可以通过小焦距的强力聚焦来实现。
具体而言，为了确保焦点17位于小毛细管内，本发明提供了一种用于增强测量毛细管位置的方法，以及可选的反馈控制，以重新定位毛细管和/或用于测量和/或后续测量的位置。此外，根据本发明，不仅可以确保测量在容器内(某处)，还优选的在容器内的最佳地点处进行测量。
例如，如果容器是毛细管，则此类毛细管通常具有一内径为500微米，但优选的地点的尺寸(例如直径)仅为约50微米。利用上述聚焦手段，可实现10微米的准确度。基于所述的高准确度，不仅可以精确确定容器/毛细管的位置，还可以确定容器内的测量体积，例如位于容器“中间”的某个位置的体积，其与(多个)容器壁相距一些距离。
可以找到这个位置或地点，例如，使用弱散射样品在容器/毛细管内的多个不同位置处执行多个动态光散射测量。优选的地点是自相关函数具有最高信噪比的地点(信噪比(SNR)＝(acf振幅)/(拟合残差平方和))。例如，图14示出了不同颜色的不同SNR值的毛细管的扫描，其允许例如将包围区域识别为测量的地点。例如，当使用浓度为2毫克/毫升且测量持续时间为200毫秒的溶酶酶样品时，SNR的典型值为50。
所提供的光检测器优选地为光电倍增管(PMT)、硅光电倍增管(SiPM)或雪崩式光电二极管(APD)光子计数检测器。这种检测器的原始输出信号通常是模拟输出信号，例如可变电流或电压，其可分别转换为可变电压或电流。根据本发明，所述可变输出信号优选地如下文进一步详细讨论的那样被进一步处理。相反地，传统上，动态光散射测量仅限于使用雪崩式光电二极管光子计数检测器。然而，雪崩式光电二极管光子计数检测器的缺点是，为了能够被检测到，检测到的光的强度必须很弱。一些最先进的装置试图克服这一缺点，例如使用另外的滤光器来降低光的强度，这需要时间，从而降低处理量。因此，为了克服这些缺点，本发明的光检测器优选地是光电倍增管或硅光电倍增管，它们提供了进一步的优势，下文将进一步详细讨论。
根据本发明的方法，通过光检测器检测到的光可用于动态光散射测量，因此，
可基于动态光散射测量来确定样品中所含溶液中多个颗粒的特性。对于给定样品，动态光散射测量优选地是在小于5秒、优选地在小于1秒、优选地在200毫秒到800毫秒之间、更优选地在约500毫秒内获得。因此，即使在所研究的样品体积较小的情况下，也可以确保高处理量，同时确保分析的高准确度和灵敏度。
所述动态光散射测量优选地包括执行至少一个相关性操作的步骤，优选地是至少一个自相关性操作。自相关运算(或函数)评估在一给定时间的信号与特定延迟时间后的信号的相似性，其中大颗粒的强度波动慢于小颗粒的强度波动。因此，自相关器计算描述特定延迟时间后的信号的相似性的归一化自相关函数，并因此将散射光的强度波动与时间相关联，以确定强度波动的速度，这与颗粒的扩散行为有关。因此，执行至少一个相关操作、优选地至少一个自相关操作的步骤对于基于到达检测器的光强度的波动来确定溶液中颗粒的扩散系数是有利的。优选地，将各自的相关(优选地自相关)函数传输到个人计算机以进行进一步分析和/或存储在如硬盘的存储介质上。
动态光散射测量优选地包括以下步骤：获取从所述光检测器获得的一模拟输出信号；以及处理所获得的模拟输出信号。优选地，其中处理所获得的模拟输出信号的步骤包括以下步骤：将所获得的模拟输出信号进行数字化以转化为一数字化输出信号。具体而言，所获得的模拟输出信号可以被数字化为具有不同数据速率的数字化输出信号，优选地具有至少40MS/s的高数据速率。这在所提供的光检测器是光电倍增管或硅光电倍增管的情况下尤其有利，因此根据本发明的方法，它甚至可以用于连续操作。
优选地，将获得的模拟输出信号处理为数字化的输出信号的步骤还包括以下步骤：i)将所述数字化输出信号处理为一数字化单光子脉冲信号，优选地是在从所述容器发射的检测光到的强度低于每秒检测到200万个光子的情况下；和/或ii)将所述数字化输出信号处理为一模拟信号的多个离散值，优选地是在检测到的光强度高于每秒检测到200万个光子的情况下。这样做的好处是，获得的模拟输出信号可以根据样品的信号强度和/或信号强度波动进行处理，从而确保对获得的模拟输出信号进行最佳处理，并对所研究的样品中包含的溶液中的颗粒进行优化特征化。
具体而言，可以通过光检测器(例如光电倍增管)检测从所研究的包含样品的容器发射的光子，并且优选地将获得的模拟输出信号数字化。
因此，如果从容器发射的检测光的强度低于每秒200万个检测光子，则优选地将所述低散射样品的数字化信号处理为离散化的信号，从而处理为数字化信号。因此，可以以高精度检测从容器发射的单个光子。在低亮度范围内对单个光子进行计数的优势是基于所有光子具有相同的能量含量的知识，因此(所有)其他信号部分可以被推断为噪声或是由其他随机因素引起的，如偏移漂移和/或增益波动。
例如，可以使用脉冲鉴相器对单个光子进行计数。如关于图4A和4B的进一步详细讨论，优选的是，(直接)来自检测器30的模拟输出信号被数字化，优选地通过一模数转换器(ADC)。图2的左侧示出了所产生的数字化输出信号39的示例。
具体地，所示信号39是光电倍增管的数字化输出信号。如图2中示例性地所示，脉冲鉴相器32可用于通过应用如光子计数阈值36之类的阈值来将(例如，在数字化之后从光检测器获得的)数字化输出信号39离散化。因此，在数字化输出信号超过阈值36的情况下，就会创见一个离散化的信号，表明例如光子的存在。换句话说，数字化的输出信号39被处理为数字(单一)光子脉冲信号。如果信号39没有超过阈值，则相应的离散化信号指示例如光子的不存在。
然而，当获得的信号变得太亮，因此有太多光子信号重叠，例如，单光子计数几乎难以进行或不可能进行。在这种情况下，数字化的输出信号优选地被处理为“模拟信号”，例如，作为模拟信号的多个离散值。也就是说，所述数字化的信号提供了一个连续信号，可以像原始模拟信号一样进行类似的处理。在本申请中，还涉及将数字化的输出信号处理为一模拟信号的多个离散值的步骤，所述模拟信号具有多个离散值。后一种方案优选地在检测到的光的强度高于某个阈值的情况下使用(例如，高于每秒200万个检测到的光子)或例如根据数字化后的量化深度的相应亮度值的情况下使用。在光检测器是硅光电倍增管的情况下，在中间亮度水平的情况下(例如，检测到的光的强度在每秒200万个检测到的光子和每秒600万个检测到的光子之间)，甚至可以将数字化的输出信号作为数字化的信号来进行处理，通过对光子峰值面积的离散化，从而可以估计出实际检测到的光子的数量。
处理所获得的模拟输出信号和随后产生的数字化的输出信号的步骤优选地包括步骤i)或步骤ii)。因此，数字化的输出信号优选地被处理为数字化的单一光子脉冲信号或一模拟信号的多个离散值。为了决定是否根据i)或ii)处理数字化的输出信号，优选地使用现场可编程门阵列(FPGA)。使用例如现场可编程门阵列，可以在微秒内完成光子计数和模拟操作之间的切换。因此，决定是否根据步骤i)(例如使用现场可编程门阵列)将数字化的输出信号处理为数字化的信号的时间优选地小于1秒，更优选地最大为0.05秒。现场可编程门阵列的算法优选地作为某种“软件”在现场可编程门阵列上运行。用于处理数据的所述算法(软件)可以被改变，例如通过更新。换句话说，通过软件更新改变信号处理的规范/算法是很容易实现的。因此，无需更改硬件/检测器，这提供了很大的优势。
根据本发明，还可以根据i)和ii)同时处理数字化的输出信号。这样，在测量后是否按照步骤i)或ii)进行处理的决定可以得到满足。
图3示例性地示出了决定是否根据i)或ii)处理数字化输出信号的优点，其描绘了光子计数信号的信号强度与一模拟信号的信号强度的对比图，其中虚线表示线性范围的外推拟合。简单地说，使用功率非常低的LED照射光电倍增管，并在几毫秒内测量信号。图3中所示的“模拟信号”表示所述信号的平均值，而所示的“检测光子/秒”信号是通过计算各个测量间隔中光子峰值的数量并将其缩放到1秒来获得的。然后，增加LED功率并重复测量。
因此，如图3所示，在一定的辐射功率下，越来越多的光子峰值重叠，不再被识别为单独的峰值。更具体地说，在某个点处，光子信号不再与LED功率成比例地增加。传统的动态光散射仪器在光子计数范围内进行测量，因此，在信号太强(即检测到的光子计数太多)的情况下包括放置在光束路径中的滤光器。
相反地，根据本发明的动态光散射测量包括在线性误差低于例如5％的情况下将数字化输出信号分析为“光子计数信号”，即在图3所示的示例中，高于约每秒3×106个光子或20个计数的平均模拟信号，而在更高的功率下，将数字化输出信号分析为模拟信号。因此，使用根据本发明的方法和装置具有减少动态光散射测量的时间的优点，并且因此，由于如上所述的强度相关的信号处理而增加了处理量。
或者，两个处理选项也可以并行应用，其中术语“并行”旨在理解为“具有小于1纳秒的时间偏移”。这优选地通过使用例如并行的两个处理器(优选地在同一现场可编程门阵列中合成)来实现。因此，数字化输出信号也可以被处理为数字化和模拟的信号，并将所获得的数据存储。这具有两个经过处理的数字化输出信号都可以在随后的阶段进行存储和处理的优点。因此，处理所获得的模拟输出信号的步骤还可以包括以下步骤：存储从步骤i)和步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号，以及进一步处理所存储的多个输出信号中的一个。
从发射光到处理信号的步骤可简要总结如下。光纤发出的激光可通过准直透镜平行定向，并通过物镜聚焦到容器(如毛细管)中。散射光的光束以及因此来自容器的发射光可以通过相同或另一个物镜(优选地是相同的物镜)，通过另一个准直透镜聚焦到作为光检测器的动态光散射检测器的光纤上，然后可以由光电倍增管检测。由于光电倍增管在大多数情况下具有电流输出，而对于模数转换器(ADC)，通常需要电压信号，因此可以在光电倍增管和模数转换器之间放置放大器，以便使光电倍增管的电流可以转换为电压信号并放大。模数转换器可以进一步将采样率为例如40MS/s(每秒4000万次采样)的放大电压信号转换为例如16位分辨率的数字信号。优选地，使用现场可编程门阵列编程的自相关器可以实时用于计算强度信号的自相关函数，然后可以例如使用计算机进行评估。
更详细地说，处理获得的模拟输出信号的步骤将参照图4A)和B)进行示例性描述。因此，用于动态光散射测量的光检测器，即动态光散射检测器30，可以检测从包含所研究样品的容器发射或散射的光。优选地，由动态光散射检测器获得的模拟信号被转换为数字信号，即数字化成数字化的输出信号，例如使用模数转换器(ADC；31)，并进一步传输到现场可编程门阵列(FPGA；34)。现场可编程门阵列34可以包括一个或多个相关器，其执行至少一个相关性操作，优选地至少一个自相关性操作。现场可编程门阵列34可以包括一个相关器33，如图4a)中示例性地所示。在这种情况下，现场可编程门阵列优选地进一步包括脉冲鉴相器32，并且相关器33的输入信号可以在从脉冲鉴相器32获得的光子计数数据和作为模拟数据处理的数字化数据之间切换。替代地，现场可编程门阵列可以包括两个并行运行的相关器33，一个在模拟模式下，另一个在基于由脉冲鉴相器32转换信号的光子计数模式下，如图4b中示例性地所示。在所有情况下，包括在现场可编程门阵列34中的一个或多个相关器33的输出优选地被传输到个人计算机35，以便进一步分析和/或存储在如硬盘的存储介质上。
因此，处理所获得的模拟输出信号的步骤优选地还包括以下步骤：将模拟输出信号数字化为数字化输出信号，并将从步骤i)或步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号存储在优选地存储介质(例如硬盘)上。
根据本发明的方法优选地包括另一步骤：测量荧光。优选的，样品中所含溶液中的颗粒的荧光用于荧光测量，其中所述荧光优选地为所述颗粒的自发荧光。测量溶液中颗粒的荧光(优选地是自发荧光)可以是有利的。没有任何自发荧光表明容器缺失或无荧光或无自发荧光的空容器。如果是这种情况，则可省略任何(进一步)测量，即动态光散射测量和优选地进一步荧光测量，例如纳米差分扫描荧光法测量。因此，使用关于是否存在自发荧光的信息可能有利于减少使用根据本发明的方法表征溶液中颗粒所需的时间。此外，可以获得关于检测到的自发荧光信号的信号强度和/或信号强度模式的信息。这种类型的信息是尤其有利，因为由此获得的信息可以例如用于确定包含溶液颗粒的样品的容器的位置，其在光激发和/或纳米差分扫描荧光法测量时可以发出荧光，和/或用于检测包含没有自发荧光的污染物(例如金颗粒)的样品。优选地，荧光的测量是通过提供另一光源，如LED，从所述另一光源向包含样品的容器透射光，从而激发颗粒的自发荧光，并检测从容器中发出的光。
优选地，另一光源提供具有波长为约280纳米的光，用于激发溶液中颗粒(优选地溶液中蛋白质)的自发荧光。
本文中，术语“荧光”是指电磁辐射，包括以发射电磁辐射的形式释放能量，例如在颗粒通过光子吸收而被激发的情况下。更具体地说，蛋白质等颗粒可以表现出自发荧光，也被称为内在荧光，如果它们包括例如三种特定芳香族氨基酸中的至少一种的情况下，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。蛋白质的自发荧光以色氨酸为主，与酪氨酸和苯丙氨酸相比，色氨酸具有更高的消光系数。消光系数，也称为摩尔吸收系数，是指测量介质对电磁辐射的衰减，即消光，并受到通过介质的路径长度和溶液中颗粒浓度的影响，其中散射和吸收可导致削弱。酪氨酸和色氨酸的最大吸收波长约为280纳米，与色氨酸相比，酪氨酸的发射波长对其在如蛋白质等颗粒中的位置的依赖性较低。因此，如蛋白质等颗粒的自发荧光的激发优选地用波长为约280纳米或278纳米的光(优选地来自另一光源)来完成。例如，最大强度为约270纳米至290纳米的LED，但例如278纳米、280纳米或285纳米更适合提高功效。
参考图5的上图更详细地示例性地描述了测量溶液中颗粒的荧光的步骤。如图5的上图中的示例所示，可以例如使用具有预定荧光焦点16的荧光光学元件14来测量容器(例如毛细管11)中样品12中所含溶液中颗粒的荧光。容器和/或光学元件14的位置可以使荧光焦点16位于容器内，用于测量包含溶液12中颗粒的样品的荧光。测量荧光后，可将容器转移到另一个位置，以便使动态光散射光学元件15的动态光散射焦点17位于容器内，以执行动态光散射测量，其中荧光焦点和动态光散射焦点彼此位于预定的x距离18中。替代地，在荧光和动态光散射测量期间，包含样品的容器的位置可以保持不变，并且荧光光学元件14和动态光散射光学元件15分别与容器相关来定位。
因此，容器(例如毛细管)优选地相对于光学元件14和15移动。作为另一替代，可同时进行两者的测量。
由于容器要相对于光学元件(如动态光散射光学元件)进行专门定位，以实现准确和可重复的测量，因此，即使在测量之间的容器移动时，也要确保精确的定位。因此，根据本发明的方法优选地包括进一步的(多个)步骤：基于测量的荧光确定容器位置，以及可选地基于测量的荧光和确定的容器位置定位容器。因此，可以基于测得的荧光(例如基于容器和/或所研究样品中所含溶液中颗粒的荧光)来准确地确定样品的位置。如果要以高处理量测量多个样品，这尤其有利。在这种情况下，具有毛细管的装置的手动填充是不可能的，毛细管通常放置在毛细管支架中。此外，为了获得高质量测量的可再现结果，必须快速定位各毛细管中的测量位置。这可以通过基于荧光扫描确定毛细管位置来实现，荧光扫描优选地在动态光散射测量之前或与动态光散射测量并行执行，优选地并行于动态光散射测量执行。因此，例如可以使用根据本发明的方法在大约2秒内测量48个毛细管。传统的解决方案是基于对样品容器(如毛细管支架)的散射光信号的检测。然而，从荧光测量获得的信号通常比从散射光获得的信号强。因此，使用这种荧光扫描是更有利的，因为与所述的常规解决方案相比，它允许更准确的定位和可选地(重新)定位毛细管。
可以使用熔解曲线(melting curve)来分析如蛋白质等颗粒的热稳定性，熔解曲线表示荧光随温度函数的变化。更具体地说，通过形成熔解曲线的一阶导数，可以确定熔点Tm，即一半颗粒变性的温度。因此，可以通过施加温度斜坡(temperature ramp)(例如从15℃到95℃，优选地20℃到90℃)来加热样品，加热速率在0.1℃/分钟到7℃/分钟之间。
因此，根据本发明的方法优选地包括以下步骤：至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以的一第二温度随时间对所述容器进行回火。优选地，随时间对所述容器进行回火的步骤包括以0.01℃/分钟和30℃/分钟之间的一回火速率对所述容器进行回火，优选地在0.1℃/分钟和10℃/分钟之间，和/或其中所述第一温度和所述第二温度介于-20℃和160℃之间。
根据本发明的方法优选地还包括以下步骤：执行纳米差分扫描荧光法(nano-DSF)测量。执行纳米差分扫描荧光法测量有利于分析颗粒(优选地蛋白质)的构形变化。纳米差分扫描荧光法优选地通过提供另一光源(如LED)来测量，将光从所述另一光源传输到包含样品的容器，并检测容器发出的光。优选地，另一光源提供具有波长为约280纳米的光，用于激发溶液中的颗粒(优选地溶液中蛋白质)。用于将光传输至容器以执行荧光测量(例如，分别用于确定容器的位置和执行纳米差分扫描荧光法测量)的另一光源可以是相同的另一光源或不同的另一光源。
纳米差分扫描荧光法是以蛋白质发射光谱的依赖性和色氨酸在蛋白质中的位置为基础。色氨酸是一种芳香族氨基酸，其天然构形主要位于蛋白质的内部。然而，如果蛋白质因变性等原因失去其天然构形，则蛋白质的内部部分会暴露在更为极性的环境中。由于色氨酸的发射光谱取决于其环境，蛋白质天然构形的丧失可导致色氨酸暴露于更极性的环境中，从而导致非极性环境中约325纳米的发射最大值偏移至约350纳米的更长波长范围。因此，色氨酸的环境特定发射光谱信息可用于分析蛋白质的构形变化。因此，可以用约280纳米的波长激发蛋白质的荧光，在约350纳米和330纳米处检测到产生的发射，以及基于约350纳米和330纳米处荧光强度形成一商数，商数通常由于变性而增加。蛋白质变性可能是由于化学和/或热变性条件(包括温度升高)引起的。
纳米差分扫描荧光法测量优选地在将溶液中的颗粒暴露于不同的温度时进行，例如使用温度斜坡，从而在将包含所研究溶液中颗粒的容器随时间进行回火时，至少在第一时间点具有第一温度，至少在第二时间点具有第二温度。这对获得有关所研究的溶液中的颗粒的构形变化的信息特别有利，这取决于颗粒所暴露的温度。
参考图5更详细地示例性地描述了将纳米差分扫描荧光法测量并入本发明的方法中。如图5的上图中的示例所示，可以例如使用具有预定荧光焦点16的荧光光学元件14A(例如纳米差分扫描荧光法光学元件)来测量容器(例如毛细管11)中样品12中所含溶液中颗粒的荧光。可使用可加热和/或冷却容器(例如毛细管)的回火元件(例如加热垫/床)对容器进行回火，并使用动态光散射和荧光测量(例如纳米差分扫描荧光法)在给定温度下测量溶液中颗粒的发射荧光。因此，将在第一温度下回火(tempered)的容器定位，以使荧光焦点16位于容器内，用于测量包含溶液12中颗粒的样品的荧光。测量荧光后，可将容器转移到另一个位置，以便使动态光散射光学元件15的动态光散射焦点17位于容器内，以执行动态光散射测量，其中荧光焦点和动态光散射焦点优选地彼此位于预定的x距离18中。替代地，在荧光和动态光散射测量期间，包含样品的容器的位置可以保持不变，并且荧光光学元件14和动态光散射光学元件15分别与容器相关来定位。作为另一替代，可同时进行两者的测量。在给定的温度下进行动态光散射和荧光测量后(如图5的中间和下部图所示)，例如，通过提高位于紧靠近容器的回火元件13的温度来提高样品的温度。
一旦样品在第二温度下回火，可如上所述进行另一轮的动态光散射和/或荧光测量。因此，容器中所含溶液中的颗粒可根据温度进行表征，通过随时间至少在第一时间点以第一温度和在第二时间点以第二温度回火包含样品的容器，并在每个时间点执行至少动态光散射和荧光(优选地是纳米差分扫描荧光法)测量。
替代地，或者另外地，根据本发明的方法优选地包括以下步骤：测量包含样品的容器的背向反射(back-reflection)。背向反射优选地通过提供另一光源(如LED)来测量，传输来自所述另一光源的光通过包含样品的容器，并检测反射的光，例如通过位于容器下方的镜子反射的光(参见图11)。因此，根据测量的背向反射光的强度，可以推断是否存在容器和/或样品，和/或可以获得关于所述容器和/或样品位置的信息。更具体地说，在没有提供容器的情况下，被测光的背向散射强度(例如通过预期容器位置下方的镜子)比在提供容器的情况下更强。此外，一旦提供了容器，则分别在空容器、包含流体但没有所研究的颗粒的容器和/或包含污染物的容器和包含根据本发明的样品的容器之间，背向反射光的强度不同。因此，测量背向反射对于检测容器和/或样品和/或获取相应的确切位置的信息是有利的。此外，如果样品被提供并至少部分聚集，包含在样品中的聚集颗粒会将部分光散射到光检测器接收锥以外的方向。聚集越强，检测到的信号越弱。因此，可以通过测量背向反射来获得关于颗粒聚集的存在和/或强度的信息，这有利于减少执行根据本发明的方法所需的时间并提高其准确度。
优选地，另一光源提供具有波长为约385纳米的光，用于激发溶液中的颗粒(优选地溶液中蛋白质)。优选地，进一步检测波长约为385纳米的光，以进行背向反射测量。优选的发射所需波长的光的LED是例如具有最大强度在约为385纳米的LED。用于将光传输至容器以分别执行荧光测量、纳米差分扫描荧光法测量和/或背向反射测量的另一光源可以是相同的另一光源或不同的另一光源。测量背反射对于研究溶液中的颗粒(如蛋白质)的胶体稳定性是有利的。
对于使用背向反射的分析，使用光束(例如具有波长为385纳米)照射溶液中包含颗粒并由样品夹持器夹持的样品，以便在光源位于容器上方并再次穿过样品时，光束会被容器下方回火元件的材料反射。例如，由硅制成的回火元件可用于回火和提供反射表面。由于较大的颗粒(包括颗粒聚集体)散射光的能力比较小的颗粒强，因此在较大颗粒的情况下，反射光的衰减更强。因此，反射光的强度提供了有关所研究的样品中存在较大颗粒(包括颗粒聚集体)的定性信息。
根据优选实施例，回火元件由硅(Si)制成，其提供某些优点，例如，硅提供了光滑的表面、良好的导热性、良好的机械和化学稳定性以及良好的反射率。优选地，待回火的容器与所述回火元件直接接触。硅也没有自发荧光，因为自发荧光会干扰通过荧光确定容器的位置，如本发明优选地完成的。硅回火元件可以例如由硅片的一部分形成。根据另一个实施例，可以使用回火元件，其中与容器接触的表面以这样的方式进行修改，例如使用干扰涂层，使其反射用于背向反射和/或荧光测量的波长的光，并且不反射(例如，吸收和/或透射)用于动态光散射测量的光。例如，优选的在约405纳米(优选地在400纳米±10纳米)处降低反射率。
此外，通过测量反射光强度的变化，例如在温度斜坡期间，可以确定聚集的开始(Tagg)，其表明溶液中颗粒的大小由于聚集的开始而增加的温度。因此，如前所述，优选地在随时间对容器进行回火的同时测量背向反射，以获得有关胶体稳定性和溶液中颗粒的温度诱导聚集的信息。
此外，如以下部分中更详细地阐述的，由于背向反射技术和动态光散射的组合而产生的有利效果。动态光散射和背向反射可以很好地互补，并且可以极大地扩展根据本发明的装置和方法的测量范围。特别是，动态光散射对于“脏的”样品(例如，混浊的样品(cloudy ones))的用途有限，而背向反射技术对于此类样品效果良好。另一方面，背向反射技术的灵敏度不足以以高质量检测出小颗粒，而可以从动态光散射中获得此类样品的高质量测量。此外，有时药物配方中有许多PEG分子用于稳定真实的活性物质，但这些分子会产生如此强烈的散射信号，导致动态光散射变得饱和，因此“失明(blind)”。因此，背向反射测量可与“浊度”测量相比较，并且非常稳健：如果聚集的颗粒较大和/或频繁(例如，样品失效和/或看起来“乳白色”)，则动态光散射光学元件可能会饱和，因此用处不大，而背向反射光学元件仍可以以高质量进行测量。这在任何其他装置上都是不可能的，而且允许非常大的测量范围。
作为一个示例：如果使用毛细管研究抗体，并从20℃开始，则可以高质量地测量动态光散射、纳米差分扫描荧光法和背向反射，即使以每分钟1℃的速度将样品加热至特定抗体结构域的“拐点温度(inflection temperature)”(即“熔解温度”)时。一旦达到熔解温度，抗体开始聚集。然而，直到“拐点温度”+5℃，动态光散射、纳米差分扫描荧光法和背向反射仍然可以高质量地测量。然而，从“拐点温度”+5℃开始，抗体如此强烈聚集并开始沉淀，以至于动态光散射光学元件可能会饱和/失明，而纳米差分扫描荧光法和背向反射产生可解释的数据。然而，背向反射光学元件可能会给出散射光信号，因为它的灵敏度较低，但仍然可以高质量地测量样品的浊度。因此，在基本上同一时间对同一样品进行这些测量的组合，可以提供增强的样品特性测定。
溶液中的颗粒(如蛋白质)的大小可以进一步使用例如静态散射光测量来确定，它的优点是测量范围广。对于静态散射光测量，来自单色光源(如激光)的光被传输到包含所研究样品的容器中，并且由样品中包含的溶液中的颗粒散射光通过至少两个以不同角度的光检测器进行测量。因此，根据本发明的方法优选地还包括以下步骤：提供另一光检测器及使用所述另一光检测器测量包含所述样品的所述容器的静态散射光，优选地与所述容器的一纵轴成一角度
其中
优选地在10度和150度之间，更优选地在10度和60度之间。
根据本发明的方法优选地应用于所研究包含颗粒的溶液的多个样品，以高处理量测量溶液中颗粒的特性。因此，优选的提供多个容器，其中每个容器包含溶液中多个颗粒的一样品，及如本文所述对每个容器测量溶液中多个颗粒的多个特性。因此，根据本发明的方法可用于使用多个容器以高处理量表征溶液中的多个颗粒，其中，通过在另一个实验条件下，如不同的洗涤剂浓度，但每个容器中都包含相同的溶液颗粒。替代地或另外地，根据本发明的方法可以通过提供多个容器，使所述多个容器中每个包含在溶液中的不同颗粒的样品，从而以高通量来表征溶液中的不同颗粒。
此外，在如上所述根据本发明的方法应用于多个容器的情况下，其优选的i)每个容器的荧光测量之后是每个容器的动态光散射测量；或者ii)每个容器的动态光散射测量之后是每个容器的荧光测量；或iii)对所述多个容器中的一个容器进行荧光测量和动态光散射测量，然后对所述多个容器中的另一个容器进行荧光测量和动态光散射测量。优选地，进行荧光测量，然后再进行DLS测量。这是特别有利的，因为来自荧光测量的信息可用于准确地定位和可选地(重新)定位动态光散射测量的各个容器，从而确保动态光散射测量的可再现性的高质量结果。更优选地，对多个容器中的每个容器同时进行荧光测量和动态光散射测量。
优选实施例的示例
优选地，根据本发明的方法至少包括上述详细描述的多个步骤：检测一容器的一荧光信号，确定所述容器的确切位置，可选地相对于光源和/或光学元件(重新)定位所述容器，在一第一温度下执行一动态光散射测量，优选地进一步执行一纳米差分扫描荧光法测量，将所述容器回火，检测所述容器的一荧光信号，确定所述容器的确切位置，可选地相对的(重新)定位所述容器，在一第二温度下执行一动态光散射测量，优选地进一步执行一纳米差分扫描荧光法测量等。因此，三维结构、颗粒的粒径分布和颗粒的聚集以及它们对如温度等参数的依赖性，可以以相对便宜、快速且再现性高和准确度高的方式进行评估。此外，根据本发明的方法包括的至少所述的多个步骤，优选地使用一个以上的容器执行。这具有以高处理量获得精确测量结果的优势。
下文将参考图11更详细地描述根据本发明的测量循环的优选示例。具体而言，以使用毛细管作为容器进行测量作为示例，其中通过毛细力将包含所研究颗粒的样品吸入容器中。然后将毛细管放置在样品载体/支架上。根据另一个实施例，多个毛细管被安装在支架上，并且可以通过将每个毛细管的一端插入以不同样品同时填充所述多个毛细管，例如，将所述多个毛细管同时插入多孔板的相应孔中。根据优选实施例，在样品载体/支架上提供1到48个毛细管。进一步优选的是，这些毛细管/容器(参见图11)的温度可以非常精确地控制到特定温度。例如，可以提供一回火装置，使例如在温度为75℃的所有毛细管都在75℃+/-0.2℃的温度范围内“同质(homogeneity)”。这意味着所有的，每一根毛细管都有几乎相同的温度，因此这些毛细管可以相互比较。多个毛细管/容器的这种精确控制的温度允许，例如，等温测量或温度斜坡测量。例如，在等温模式下，所有样品都保持在精度为+/-0.5℃的单一温度下[请列明，特定时间(例如，1分钟以上、2分钟以上、1小时以上、1天以上、最多7天)的精度为+/-0.2℃。精准控制的温度还允许温度斜坡模式，例如，以每分钟1℃的加热速率将多个毛细管中的样品从20℃回火至95℃。在环境温度下，所有毛细管的温度基本上相同。然而，通过本发明，可以在温度斜坡的所有温度下，所有毛细管能够保持在规定的精度的温度下。
优选地，测量以这样的方式执行，即样品载体在x方向上移动，以便可以通过相应的光学元件连续地检测所有容器的信号，例如，用于动态光散射和/或纳米差分扫描荧光法测量。替代地，光源、检测器和/或相应的光学元件可以相对于样品载体移动。根据另一实施例，可以移动载体和光源、检测器和相应的光学元件。换句话说，优选地是在容器和检测系统之间有一个相对的运动。当样品载体沿正x方向移动时，可以执行纳米差分扫描荧光法和背向反射测量，在这些测量中，在不停止样品载体的情况下扫描所有毛细管。当样品载体撤回时，即在负x方向移动时，可以执行相应的动态光散射测量，在此期间，样品载体停止以用于进行相应的测量。如果不是放置在样品架上的所有毛细管都要被测量的情况下，可以选择毛细管的一个子集，然后将其视为光学器件可以检测毛细管中各自样品的散射强度。
对于各自的测量，为了获得高质量的结果，容器的定位至关重要。此外，确定容器内的测量地点也可以提高测量的质量和灵敏度。如上所述，可以通过不同的方法测量容器的位置，其中优选的是使用来自颗粒和/或容器的自发荧光信号。参考图10进一步详细说明优选方法。例如，为了测定颗粒(例如溶液中的蛋白质)的热稳定性，可将溶液中包含蛋白质的样品从20℃加热至95℃(“温度斜坡”)。尤其是在包含样品的容器一个以上待分析的情况下，可将所述样品放置在样品平台上的样品架中，所述样品架可在每个测量循环内移动，即在温度斜坡的至少一个预定温度下进行测量，以便可以测量所有样品。在这样的温度斜坡期间，由于样品架由温度引起的膨胀，包含样品的容器的位置可能轻微地偏移。因此，优选地基于荧光信号(例如，检测到的荧光信号的最大值和/或先前荧光测量的最大值)来确定容器在x方向上的中心和可选地(重新)定位，以进行测量和/或每个测量循环(例如动态散射光(DSL)和/或纳米差分扫描荧光法测量)。然而，由于测量不准确和/或弱荧光样品，容器(优选地毛细管)的测量位置可能因测量不同而会有所不同。另一方面，z位置优选地在测量之前设置，并且在温度从20℃上升到90℃期间，由于样品架的膨胀，z位置通常仅变化约±20微米。如果x方向上的测量位置偏离容器中心超过预定值，测量可能会受到容器壁散射信号的影响。此外，根据测量位置的不同，光可能会因容器壁的曲率而发生不同的折射，因此测量位置的偏离可能会影响测量角度，从而影响待测定的颗粒特性(例如颗粒的衰减率)。因此，可以在容器内的某些测量点，即所谓的“容器的可测量区域”(在图10中表示为绿色区域；白色圆圈象征着分析的测量位置)，正确地确定样品的衰减率。这个区域取决于样品的正确聚焦。如果光被容器壁的曲率强烈折射，以至于检测器无法再检测照明的区域，则同一样品可以被观察到不同的衰减率。在这种情况下记录的自相关函数主要包含干扰信号(例如环境光或电子噪声)。此外，毛细管顶部的毛细管壁会对散射信号产生强烈影响(低z值下的紫色点)，这可能会导致伪假象，从而产生无意义的数据。因此，如图10所示，容器上部的z位置(低z值)最有利于获得准确的结果。因此，使用荧光扫描对于精确定位和可选地(重新)定位容器以获得可再现的和准确的测量结果是有利的。
除所述确定外，还优选的在容器内找到最佳地点，即容器内可获得最佳信噪比的点。例如，靠近容器壁的测量地点可能会增强噪声。
例如，使用内径为500微米的优选毛细管，但最佳测量点的尺寸(例如直径)优选地只有约50微米。通过自发荧光测量和强聚焦透镜的使用，达到了10微米的精度。
通过在毛细管内不同位置处执行多个动态光散射测量，例如使用弱散射样品，可以找到具有最佳信噪比(SNR)的首选地点。优选地，最优选的地点是自相关函数具有最高信噪比的地点(信噪比(SNR)＝(acf振幅)/(拟合残差平方和))。例如，使用含有2毫克/毫升溶菌酶的溶液，在测量持续时间为200毫秒内获得SNR＝50的典型值。例如，当使用溶酶酶时，信噪比的典型值为50。
在优选实施例中，根据本发明的方法包括以下步骤：i)提供包含所研究溶液颗粒样品的容器；ii)将光从第一提供的光源传输到容器；测量容器和/或其中所含样品发出的荧光；基于检测到的发射光，确定容器相对于包含所述第一光源的第一光学元件的位置；基于检测到的发射光，确定所述容器相对于所述第一光学元件的可测量区域的位置；可选地(重新)定位所述容器相对于所述第一光学元件的位置；以及如果从检测到的发射光获得的信息(例如信号强度)表明存在研究中的颗粒，则执行荧光测量；iii)从一第二提供的光源向所述容器传输光；及如果在步骤ii)中从检测到的发射光获得的信息(例如信号强度)表示存在所研究的颗粒时，则执行动态光散射测量；以及iv)基于从步骤ii)和iii)中执行的荧光和动态光散射测量中获得的信息，来确定所研究溶液中颗粒的特性，例如粒径分布和/或颗粒存在和/或颗粒聚集量。所述方法还可包括(例如，在步骤ii)之前)在步骤iv)的对容器回火。此外，测量荧光的步骤优选地是指通过执行纳米差分扫描荧光法测量来测量自发荧光的步骤。此外，可以通过交替地执行步骤ii)与iii)和/或步骤iv)、ii)与iii)来重复地执行所述方法。替代地或另外地，(例如使用第一光学元件)测量背向反射和/或静态光散射的步骤可进一步被包括在根据本发明的方法中。值得注意的是，第一和第二光学元件可以是相同或不同的。
本发明在第二方面涉及一种用于测量溶液中颗粒特性的装置，其中溶液中的颗粒特性优选地根据上述本发明的方法进行测量。因此，根据本发明的装置优选地用于执行根据本发明的方法和/或根据本发明的方法优选地使用本发明的装置来执行。
根据本发明的装置包括用于容纳至少一个容器的一装置，所述至少一个容器包含溶液中所述多个颗粒的一样品，优选地所述至少一个容器用于容纳0.1至15微升的所述多个颗粒，更优选用于容纳1微升至15微升的所述多个颗粒，甚至更优选地用于容纳8微升至12微升的所述多个颗粒。所述装置可包括例如样品架，例如毛细管架或微孔板架。
根据本发明的装置还包括单色光源(优选地激光)和光检测器(优选光电倍增管、硅光电倍增管或雪崩式光电二极管光子计数检测器)。
根据本发明的装置还包括用于执行动态光散射测量的装置。所述装置可包括例如现场可编程门阵列、脉冲鉴相器、相关器、模数转换器和透镜，例如准直透镜和/或物镜(或反射物镜)。
根据本发明的装置的方式，例如用于执行动态光散射测量的装置，可以被包括在动态光散射光学元件中。所述动态光散射光学元件可进一步包括一单色光源、一光检测器和/或部分或全部的控制手段。因此，所述装置可以包括如图6中示例性描绘的动态光散射光学元件。动态光散射光学元件15包括单色光源55，例如激光器、动态光散射检测器30，优选地是物镜或反射物镜52，如图6A)所示。因此，激发光束50可由单色光源55提供，单色光源55可由物镜52聚焦，优选地使得产生的荧光焦点17位于所研究的样品内。在使用根据本发明的装置和方法分析样品的情况下，样品中包含的溶液中的颗粒会散射从动态光散射光学元件15发射的光。由此获得的发射光/散射光可由动态光散射检测器50检测51。具体而言，检测到的光束51可以由动态光散射光学元件15中包含的相同或另一物镜(或反射物镜)52来聚焦和定位，从而可以被通过动态光散射检测器30(例如光电倍增管或硅光电倍增管)检测到。动态光散射光学元件15的CAD模型(剖面图)的一部分如图6B)所示，其中动态光散射光学元件15包括两个准直透镜56和一个物镜52。准直透镜56可用于从发散光源(例如研究中样品的散射光或发射光)产生具有近似平行光束路径的光。准直透镜对于来自单色光源55(未示出)的激发光束被物镜52聚焦和/或被动态光散射检测器30(未示出)检测的检测光束也很有利。
根据本发明的装置还包括控制装置，适用于控制用于容纳至少一个容器的装置，控制所述单色光源，以用于将光从所述单色光源传送到所述至少一个容器，控制所述光检测器，以检测来自所述至少一个容器的多个信号，以及控制用于执行所述动态光散射测量的所述装置。
优选地，根据本发明的装置还包括用于执行一相关性操作的一装置，所述相关性操作优选地是一自相关性操作。此外，自相关性操作优选地是实施在硬件和/或软件中的一自相关性逻辑。
优选地，根据本发明的装置还包括用于执行数据处理操作的装置。所述数据处理操作优选地包括数据处理逻辑，至少用于执行以下步骤：如上所述的根据本发明的方法处理获得的模拟输出信号。此外，所述数据处理操作优选地是实施在硬件和/或软件中的数据处理逻辑。
优选地，根据本发明的装置还包括用于将从所述光检测器获得的信号数字化的装置，其中所述控制装置适用于：控制所述装置，以用于将从所述光检测器获得的多个信号进行数字化。用于对从光检测器获得的信号进行数字化的所述装置优选地包括现场可编程门阵列(FPGA)。
优选地，根据本发明的装置还包括一单模光纤，以及用于通过所述单模光纤从所述单色光源传送单色光的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光。
因此，所述装置可包括动态光散射光学元件和光纤，优选地是单模光纤、保偏光纤或多模光纤，更优选地是单模光纤。如图7A)中的示例所示，单色光源55(例如激光)与上述图6A)中的示例所示的动态光散射光学元件相比，不直接位于所示的动态光散射光学元件15中，尽管通过光纤57与之相连接，光纤57将单色光从单色光源55传送到位于动态光散射光学元件15中的准直透镜56。动态光散射光学元件15包括一个或多个(此处为两个)另一准直透镜56，每个用于聚焦检测光束51，所述检测光束51通过另一光纤57传输到光检测器(在本示例中，不直接位于动态光散射光学元件中；30)。因此，图7A)描绘了具有一个激发和两个光检测器的动态光散射光学元件的的示例性方案，例如具有多模光纤的光电二极管和具有单模光纤的光电倍增管。
图7B)示例性地示出了装置的另一示例，图7B)示出了动态光散射光学元件的共焦版本。与上面描述的图7A)相比，动态光散射光学元件15还包括分束器58，用于将光束(例如以相等比率)分为两个光束，每个光束可由准直透镜56聚焦。这样做的优点是需要的空间更少。
优选地，根据本发明的装置还包括用于测量所述样品的溶液中所述多个颗粒的荧光的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以用于测量所述样品中所含溶液中所述多个颗粒的荧光。
因此，在图7C)中示例性地示出了装置的另一示例，图7C)描绘了组合的荧光光学和动态光散射光学共焦(x距离＝0)。与上述图7B)相比，动态光散射光学元件包括荧光光学元件14，且分束器58具有预定的分束器波长59，例如低通620纳米。因此，检测到的光束51被分成两个光束，其中只有波长为620纳米或更小的光通过到荧光光学元件14。这种装置的优点是需要较少的空间，并且可以使用相同的样品同时测量荧光和散射。
优选地，根据本发明的装置还包括一定位装置，用于定位容纳溶液中所述多个颗粒的所述样品的装置，其中所述控制装置进一步适用于：控制用于容纳所述样品的装置的定位。
优选地，根据本发明的装置还包括一温度控制系统，用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火，其中所述控制装置还适用于：控制所述温度控制系统，以用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
优选地，根据本发明的装置还包括用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的一装置和/或用于测量背向反射的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的所述装置和/或用于测量背向反射的所述装置。
优选地，根据本发明的装置还包括另一光检测器；以及用于执行静态散射光测量的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以执行一静态散射光测量。
根据本发明的装置还可以包括用于改善激光光束质量的装置。因此，根据本发明的装置可以包括改善激光光束质量的光学元件，例如包括在动态光散射光学元件中。
作为根据本发明的装置的另一示例，图7D)中示例性地示出了装置，其中与上述图7A)所示的装置相比，激光在没有单模光纤的情况下耦合。这具有减少成本和耦合到光纤时的功率损失的好处。在图7D)所示的示例中，单色光源例如位于动态光散射光学元件15中。因此，示出了具有自由空间耦合光源的动态光散射光学元件的设计示例。
根据本发明的装置可以包括有利于提高测量质量的另一装置，例如二色性滤光器、偏振滤光器、减少杂散光的孔径和/或用于毛细管散光校正的柱面透镜。因此，在图7E)中示例性地示出了装置的另一示例，其中用于毛细管散光校正的柱面透镜64位于用于减少杂散光的孔径63和物镜52之间。因此，从单色光源55发射的光束可以在例如被样品散射之前通过准直透镜56，然后通过物镜52、柱面透镜64，然后通过孔径63。散射光在通过动态光散射光学元件15，特别是孔径63、柱面透镜64、物镜52，然后至少再通过另一，例如两个准直透镜56后，可以被光检测器30检测出来。
如图7E)中进一步示例性地示出的，如动态光散射检测器的光检测器30可以包括二色性滤光器60，例如以带通405/5纳米以阻挡荧光，和/或偏振滤光片61。这对于显示自发荧光(带通)或具有高纵横比的颗粒(偏振滤光器)的弱散射样品尤其有利。
图7F)中描绘了装置的另一示例，示出了一个动态光散射光学元件具有两个动态光散射臂(检测和激发)和一个共焦荧光光学元件的的设计，以用于在一个点上同时测量。在此设计中，动态光散射光学元件15包括荧光光学元件14和准直透镜56，例如，两个串联的准直透镜56，没有物镜，分别用于将光从单色光源55传输到样品和将发射光从样品传输到光检测器(3)。在此设计中，在各自光束通过串联的两个准直透镜56的方向上，第二准直透镜56聚焦激发。动态光散射光学元件的这种设计是有利的，因为可以通过这种方式实现较大的散射角，即激光和检测器之间的角度，并且还可以减少光散射。
图7G)中描绘了装置的另一优选示例，图7G)示出了具有双臂(检测和激发)的动态光散射光学元件的设计，没有像图5F)中的物镜，也没有荧光光学元件14。这尤其有利，因为可以同时获得相同样品的荧光和散射测量。
关于容器、样品、颗粒及其特性、样品、容器、单色光源、光检测器、随时间回火、(自)相关操作、现场可编程门阵列，及光的传递、传输、发射和检测，以及测量，包括动态光散射测量、荧光测量、纳米差分扫描荧光法测量，背向反射测量和静态散射光测量，如上所述同样适用于根据本发明的方法。此外，这种测量的其他特征也可以如上所述。因此，本发明第一方面的有利特征和特性将被视为本发明第二方面的有利特征，反之亦然。
本发明的其他方面和优点将在下面的示例中描述，这些示例是为了说明的目的，而不是为了限制。
在此通过引用将本申请中引用的每份出版物、专利、专利申请或其他文件的全部内容并入本文。
示例
本文描述了用于本公开内容的方法和材料；还可以使用本领域已知的其他合适方法和材料。所述材料、方法和示例仅为说明性的，并不旨在必要的限制。
免疫系统可以通过体液和/或细胞介导的免疫反应识别和抵御病原体(如细菌、病毒、毒素)。体液免疫反应涉及特定蛋白质的产生，包括针对病原体特异性抗原的病原体特异性抗体。抗体可作为可溶性蛋白质在血浆和淋巴液中循环，并与致病性抗原的识别、中和、凝集和沉淀相关。由于它们对病原体抗原的特异性以及它们在免疫方面的基本作用，抗体在疾病的诊断和治疗领域具有高度相关性。
然而，就抗体的功能和稳定性而言，研究抗体和开发基于抗体的疗法和药物组合物是一项复杂的任务。例如，抗体的不稳定性可由化学修饰、构形的热稳定性的变化(尤其是降低)以及胶体稳定性的变化(尤其是降低)引起。这些方面中的任何一个都会影响治疗性和/或诊断性抗体的效率和/或安全性。因此，为了全面表征和优化抗体的稳定性，进行了广泛的分析。
在这种情况下，为了模拟一个典型的实验来分析和优化蛋白质在溶液中(例如由IgG和缓冲液组成的(药物或诊断)抗体组合物)的稳定性，进行了一项实验。
起始材料是一种市售的免疫球蛋白G类(缩写：IgG)的治疗性抗体制剂(HyQvia，Baxalta Innovations GmbH公司，维也纳，奥地利)。使用不同的缓冲液(醋酸钠和HEPES)来稀释IgG抗体。HyQvia产品的初始质量浓度为100毫克蛋白质每1毫升注射溶液。使用乙酸钠或HEPES缓冲液将抗体组合物稀释50倍，最终质量浓度为2毫克蛋白质每1毫升缓冲液。稀释后的制剂在以14000倍的重力加速度下离心15分钟，以去除不溶性宏观和微观颗粒。将毛细管装入稀释和离心后的抗体溶液，方法是将每个毛细管放在蛋白质溶液中，通过毛细力使其自身充满蛋白质溶液。进行了一项结合热反褶积(thermal deconvolution)实验，包括几乎同时测量荧光偏移和颗粒大小。诱导热反褶积的加热速率为1℃/分钟。动态光散射测量时间为每根毛细管500毫秒。
图8示出了旨在确定IgG在哪个温度下显示荧光偏移(总是上部子图)以及所检测颗粒的分布或其大小(总是下部子图)如何随温度变化的实验结果。通过测量蛋白质溶液中的大小或尺寸分布(总是下部子图)，组合测定蛋白质构形的稳定性(总是上部子图)和蛋白质颗粒的胶体稳定性，可以精确分析这两个关键参数。由于组合测定也可以在多达48个样品上并行进行，因此可以测试和有效评估许多不同的条件，例如研究中的蛋白质溶解在不同的缓冲液中。因此，动态光散射和纳米差分扫描荧光法测量相结合的优点是，通过结合蛋白质构形和胶体稳定性对蛋白质进行组合表征，可以加速诊断性或治疗性蛋白质的开发。
图9示出了动态光散射可确定颗粒参数的概述，包括平均累积半径、平均累积多分散指数和颗粒参数下的自相关函数的数学参数。示出了来自图8所述的缓冲液的总样品、牛球蛋白(BGG)和IgG的数据。测量期间，温度保持在25℃不变。每根毛细管记录五次测量，每次为5000毫秒的动态光散射测量时间。图中的点表示累加器法确定的平均半径。灰色区域表示相应的毛细管中检测到的粒径分布。可以看出，BGG和IgG的某些颗粒参数之间的差异可以被识别。这种实验设置有利于评估给定样品的均匀性，例如，粒度分布越窄，平均累积多分散指数越小，所研究的样品越均匀。
图15示出了通过使用NISTmAb参考材料RM 8671进行抗体缓冲液筛选和抗体候选选择的应用示例，其旨在用于评估确定单克隆抗体的物理化学和生物物理属性的方法的性能。它还为开发治疗性蛋白质表征的新技术提供了一种具有代表性的测试分子。
测试样品包括1毫克/毫升的NISTmAb在生理盐水(Saline)中。横轴代表温度，温度范围大约在环境温度和超过100℃之间。第一张图(从上面开始)显示了350纳米处随温度变化的一阶导数。60℃至75℃之间的峰值表示第一个转变，75℃至90℃之间的峰值表示第二个转变，90℃至100℃之间的峰值表示第三个转变(此抗体在此通道中更明显)。每个转变对应于单个蛋白质结构域的展开。第二张图显示了来自反向散射的浊度，其中起点标记为垂直直线。第三张图显示了来自动态光散射的散射(平均散射强度)，其中起点再次标记为直线。第四张图(最下面的图)显示了累积量半径，单位为纳米，其中起点也标记为直线。
IgG/抗体(NIST mAb为代表)包含3个蛋白质结构域。CH2，Fab段，CH3。尤其是，Y形IgG分子的“臂”包含可变抗原结合位点，因此通常称为Fab区(段，抗原结合)。Y的“脚”负责抗体的免疫特性，称为Fc区(段，可结晶)。Fc区域可细分为CH2和CH3结构域(分别为重链恒定部分的结构域2和3)。在热展开实验中，在展开曲线中通常可以看到三个独立的展开事件，分别代表CH2区、Fab区和CH3区的三个展开事件。特别是，CH2区域首先展开(在最低温度下)，然后是Fab和CH3。根据IgG的确切分子结构，并非所有三个区域都可显示为单独的展开事件。在某些情况下，两个展开事件可能会重叠，甚至同时发生，从而导致无法进行明确的分离。对应于第二个转变的大Fab的展开，通常会导致尺寸增大，这被解释为协同展开(累积量半径开始，最低图)，但没有聚集。CH3的展开，对应于第三个转变，导致聚集，在可见的进一步在尺寸增加，但也会导致散射(来自动态光散射的平均强度)和浊度(来自背向反射)的开始。图16与图15相似，但样品包括1毫克/毫升的NISTmAb在25mM的乙酸钠pH4中。
第一个曲线图(上面)显示了350纳米处随温度的一阶导数。50至60℃之间的峰值表示第一个转变，70至80之间的峰值表示第二个转变(此抗体在此通道中更明显)。
每个转变对应于单个蛋白质结构域的展开。第二个曲线图显示了来自反向散射的浊度。第三个曲线图显示来自动态光散射的散射(平均散射强度)。第四个曲线图(最下面的图)显示了以纳米为单位的累积半径，其中起始点被标记为直线。Fab的展开导致尺寸增加，这被解释为协同展开。未发生聚合。特别是，这是一个很好的示例，其中动态光散射中的开始不是聚合的开始。因此，在未观察到聚集的情况下，这种开始应与开始温度(Tonset)相匹配(对于单域蛋白质)，但对于多域蛋白质可能更高，并对应于导致Rh最大变化的域的展开。在这个示例中，通过监测动态光散射与nDSF的结合，可以获得关于蛋白质展开机制的更多细节。
图17类似于图15，但样品包含1毫克/毫升的NIST单克隆抗体在25mM pH 4的醋酸钠+130mM NaCl中。第一个曲线图(上面)显示了350纳米处随温度的一阶导数。45℃至60℃之间的峰值表示第一个转变，60℃至75℃之间的峰值表示第二个转变，75℃至90℃之间的峰值表示第三个转变(此抗体在此通道中更明显)。每个转变对应于单个蛋白质结构域的展开。第二个曲线图显示了来自反向散射的浊度。第三个曲线图显示来自动态光散射的散射(平均散射强度)，其中开始点被标记为直线。第四个曲线图(最低的图)显示了累积量半径。
Fab的展开，其对应于第二个转变，导致尺寸增加，这被解释为协同展开。CH3的展开，其对应于第三个转变，导致轻微的聚集，这在散射开始可见和在浊度中找不到开始。
这三个示例表明，相应的结果可用于识别候选分子的问题域，并为从何处开始进一步优化结构提供指导。替代地，这些结果可用于识别有前景的缓冲条件。
图18是用于理解聚集路径的示例。样品与图15示例中的样品相同，测试样品包含1毫克/毫升的NISTmAb在生理盐水中。应注意的是，图15中的上限温度高于100℃，而图19中的上限温度约为110℃。因此，图15中的第一个曲线图(从上面)显示了350纳米处随温度的一阶导数。图18的第二个曲线图也类似于图15的最后一个曲线图，其显示了累积量半径(cumulant radius)。图18的第三个曲线图显示了随温度的尺寸分布。在第三个曲线图中，CH3结构域展开后，随机聚集显示为斑点图案。Fab的展开只会导致尺寸增加(累积量半径的开始与纳米差分扫描荧光法中的第二个转变相匹配)。
图18是用于理解聚集路径的又一示例。测试样品含有2毫克/毫升的BSA(PierceTM安瓿(牛血清白蛋白标准安瓿，赛默飞世尔科技公司，美国罗克福德州))。从那里显示的图中可以推导出有序的聚集情况。特别是，在显示ta累积量半径的第二个(中间)曲线图中，在展开时可以看到尺寸分布的稳定增加，这可以从显示比率信号的第一个(上面)曲线图中推导出来。第二个曲线图仅显示所有颗粒的平均大小(累积量半径)，而第三个曲线图显示尺寸分布(半径分布)。在第三个曲线图中，展开后可以看到尺寸的稳定增加。与图18的尺寸分布中的散斑图案相反，尺寸分布中的稳定增加表示以有序方式聚集
因此，将荧光读数与动态光散射相结合有助于了解聚集途径(随机或结构化聚集)。以类似的方式，通过比较荧光信号中的展开转变和温度下的尺寸分布，可以区分天然聚集和非天然聚集。在转变中点之前的斑点图案将表明来自天然状态的聚集。
本发明的进一步优选实施方案在以下方面作了进一步说明。
1.一种测量溶液中多个颗粒特性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提供包含在溶液中的所述多个颗粒的一样品的一容器，其中所述样品具有一体积优选地在0.1微升至15微升之间；
提供一单色光源和一光检测器；将光从所述单色光源传送到包含所述样品的所述容器；及
使用所述光检测器来检测从所述容器发出的光；以及基于一动态光散射测量来确定所述样品中所含溶液中的所述多个颗粒的多个特性。
例如，优选地为动态光散射测量提供单色光源。优选地使用激光进行动态光散射测量。进一步优选地为荧光测量提供一额外光源。例如，优选地提供以约280纳米发光的LED。进一步优选地为背向反射测量提供一额外光源。
例如，可以使用发光波长为385纳米的LED。
根据提供的光源和执行的测量，优选地使用光检测器进行动态光散射测量。还优选提供用于背向反射测量的附加光检测器，优选地用于检测用于背向反射测量的光源的波长的检测器，例如，用于检测约385纳米处的光。还优选的为一(多个)荧光测量提供至少一个、优选地两个另外的光检测器。优选地，用于荧光测量的检测光包括比用于激发荧光的光更长的波长。例如，可以使用一个或两个光检测器来检测330纳米和/或350纳米处的光。例如，图11中示出了光源和光检测器的优选的示例。
2.如权利要求1所述的方法，样品具有一体积在0.1微升和15微升之间，优选地在1微升和15微升之间，更优选地在8微升和12微升之间。
3.如方面1或2所述的方法，其中来自所述单色光源的光是相干的，并且优选地波长在350纳米至500纳米之间，优选地为405纳米、445纳米或488纳米。
4.如方面1至3任一方面所述的方法，其中所述单色光源是一激光，优选地是二极管激光，优选地是选自由以下组成的群组的二极管激光：稳频二极管激光、DPSS激光、PPLN倍频二极管激光、倍频DPSS激光、二极管泵浦光纤激光、倍频二极管泵浦光纤激光和二极管泵浦上转换光纤激光。
5.如方面4所述的方法，其中所述激光的相干长度为至少0.1毫米。
6.如方面4或5所述的方法，其中所述激光的功率在1毫瓦至200毫瓦之间，优选地在10毫瓦至180毫瓦之间，更优选地在50毫瓦至150毫瓦之间，甚至更优选地在70毫瓦至120毫瓦之间，例如在100毫瓦，所述激光优选地为连续波(CW)激光，优选地不是脉冲激光。
7.如方面4至6任一方面所述的方法，其中所述单色光通过在激光波长的一单模光纤和优选地通过一激光波长偏振保持单模光纤来从所述单色光源进行传输。
8.如方面1至7任一方面所述的方法，其中所述单色光源发出的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度传送至所述容器，其中
为在0度至45度之间。
9.如方面8所述的方法，其中使用光检测器所检测到的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度从所述容器发出，其中
为在0度至45度之间，其中
的值优选地与
的值相同。
10.如方面9所述的方法，其中从所述单色光源传送到所述容器的光和从所述容器发出并使用所述光检测器检测到的光之间的一角度
是在0度至150度之间，优选地在10度至150度之间，更优选地在10度至60度之间。
11.如方面1至10任一方面所述的方法，其中所传送的单色光是使用一物镜来聚焦在包含所述样品的所述容器中，其中从所述容器发出的光优选地也是由所述物镜来聚焦，优选地，其中所述物镜具有一焦距在10毫米和200毫米之间，和/或其中所传送的单色光在所述容器中聚焦，具有一焦斑的半峰全宽(FWHM)在3微米和30微米之间，优选地导致一测量体积在0.01纳升和0.1纳升之间，优选地在0.01纳升和0.02纳升之间，更优选地为约0.016纳升。
12.如方面1至11任一方面所述的方法，其中所述光检测器是光电倍增管、硅光电倍增管或雪崩式光电二极管光子计数检测器，优选地是光电倍增管或硅光电倍增管。
13.如方面1至12任一方面所述的方法，其中所述动态光散射测量是在5秒内获得，优选地在少于1秒内获得。
14.如方面1至13任一方面所述的方法，其中每个样品仅进行一次动态光散射测量。
15.如方面1至14任一方面所述的方法，其中所述动态光散射测量包括执行至少一个相关性操作的步骤，优选地是至少一个自相关性操作。
16.如方面1至15任一方面所述的方法，其中所述动态光散射测量包括以下步骤：
获取从所述光检测器获得的一模拟输出信号；以及处理所获得的模拟输出信号。
17.如方面16所述的方法，其中处理所获得的模拟输出信号的步骤包括以下步骤：将所获得的模拟输出信号进行数字化以转化为一数字化输出信号，优选地通过模数转换器(analog-to-digital converter，ADC)的方式。
18.如方面17所述的方法，其中所述数字化输出信号使用以下步骤进一步处理：
i)将所述数字化输出信号处理为一数字化单光子脉冲信号，优选地是在从所述容器发射的检测光到的强度低于每秒检测到200万个光子的情况下；和/或
ii)将所述数字化输出信号处理为一模拟信号的多个离散值，优选地是在检测到的光强度高于每秒检测到200万个光子的情况下。
19.如方面18所述的方法，其中：
-所述处理所获得的模拟输出信号的步骤包括步骤i)或步骤ii)，并且其中决定是否根据步骤i)或步骤ii)将所述数字化输出信号处理为一数字化信号的时间小于1秒，优选地为最大0.05秒，优选地使用现场可编程门阵列，或
-可以同时处理光子计数和离散值输出信号，以便满足在测量后是否根据步骤i)或步骤ii)进行处理的决定。
20.如方面18或19所述的方法，其中所述处理所获得的输出信号的步骤还包括步骤：
将从步骤i)或步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号存储；或
将从步骤i)和步骤ii)获得的多个经处理的数字化输出信号存储；及
进一步处理所存储的多个输出信号中的一个。
21.如方面1至20任一方面所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
测量荧光，优选地测量在所述样品和/或所述容器的材料所含的溶液中所述多个颗粒的荧光，其中所述荧光优选地为所述多个颗粒和/或所述容器的材料的自发荧光，和/或测量包含所述样品的所述容器的背向反射。
如上所述，对于所述荧光和/或背向反射测量，可使用附加的(多个)光源和/或附加的(多个)光检测器。
22.如方面21所述的方法，所述方法还包括以下步骤：基于所测量的荧光和/或基于所测量的背向反射来确定所述容器的位置，以及
基于所测量的荧光/背向反射以及确定的容器位置，选择性地定位所述容器。
23.如方面1或22任一方面所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
24.如方面23所述的方法，其中至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火的步骤包括以0.01℃/分钟和30℃/分钟之间的一回火速率对所述容器进行回火，优选地在0.1℃/分钟和10℃/分钟之间，和/或其中所述第一温度和所述第二温度介于-20℃和160℃之间。
25.如方面1至24任一方面所述的方法，所述方法进一步包括以下(多个)步骤：
进行一纳米差分扫描荧光法测量；和/或
测量包含所述样品的所述容器的背向反射。
26.如方面1至25任一方面所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤：提供另一光检测器，以及
使用所述另一光检测器测量包含所述样品的所述容器的静态散射光，优选地与所述容器的一纵轴成一角度
其中
优选地在10度和150度之间，更优选地在10度和60度之间。
27.如方面1至26任一方面所述的方法，其中所述容器为一毛细管和/或一多孔板，优选地为具有一圆形截面的玻璃毛细管，具有一内径在0.1毫米至1毫米之间，优选地在0.15毫米至0.5毫米之间，和优选地具有一外径在0.2毫米至1.2毫米之间，优选地在0.65毫米至1毫米之间，和优选地具有一长度在5毫米至70毫米之间，优选地在32毫米至50毫米之间，更优选地为约50毫米。
28.如方面1至27任一方面所述的方法，其中多个容器被提供，其中每个容器包含溶液中多个颗粒的一样品，及其中根据方面1至27中的任一方面对每个容器测量溶液中多个颗粒的多个特性。
29.如方面28所述的方法，其中：
对每个容器的一荧光测量之后是对每个容器的一动态光散射测量；或
对每个容器的一动态光散射测量之后是对每个容器的一荧光测量；或
对多个容器中的一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量，然后对所述多个容器中的另一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量。
30.如方面1至29任一方面所述的方法，其中所述多个特性是选自由以下组成的群组：粒径分布、聚集温度、熔解温度、转变温度、展开温度、液-液相分离温度(TLLPS)自由折叠能、第二维里系数(B22)、颗粒自相互作用、胶体稳定性、流体动力半径、颗粒间的排斥或吸引的相互作用(KD)、溶解度、长期蛋白质稳定性和临界变性剂浓度。
31.一种用于检测溶液中多个颗粒的多个特性的装置，优选地根据方面1至30任一方面，所述装置包括：
用于容纳至少一个容器的一装置，所述至少一个容器包含溶液中所述多个颗粒的一样品，优选地所述至少一个容器用于容纳0.1至15微升的所述多个颗粒；
一单色光源和一光检测器；
用于执行一DSL测量的一装置；及
一控制装置适用于：
控制用于容纳所述至少一个容器的所述装置；
控制所述单色光源，以用于将光从所述单色光源传送到所述至少一个容器；
控制所述光检测器，以检测来自所述至少一个容器的多个信号；以及
控制用于执行所述DSL测量的所述装置。
32.如方面31所述的装置，所述装置还包括：
用于执行一相关性操作的一装置，所述相关性操作优选地是一自相关性操作，其中所述自相关性操作优选地是实施在硬件和/或软件中的一自相关性逻辑；及
33.如方面31或32所述的装置，所述装置还包括：
用于对从所述光检测器获得的多个信号进行数字化的一装置，其中所述装置优选地包括一现场可编程门阵列，及所述控制装置进一步适用于：控制所述装置，以用于将从所述光检测器获得的多个信号进行数字化。
34.如方面31至33任一方面所述的装置，所述装置还包括：
用于测量所述样品的溶液中所述多个颗粒的荧光的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以用于测量所述样品中所含溶液中所述多个颗粒的荧光。
如上所述，优选的提供用于荧光测量的一附加光源，例如，提供具有(短或更短的)激发波长(例如280纳米)的LED。对于荧光测量，还优选的提供一附加的光检测器，优选地为两个附加的光检测器以用于荧光测量，例如，用于检测(相对于激发波长)长或更长波长的光，例如，一个或两个检测器用于检测约330纳米和350纳米的光。
35.如方面31至34任一方面所述的装置，所述装置还包括：
一定位装置，用于定位容纳溶液中所述多个颗粒的所述样品的装置，其中所述控制装置进一步适用于：控制用于容纳所述样品的装置的定位。
36.如方面31至35任一方面所述的装置，所述装置还包括：
一温度控制系统，用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火，其中所述控制装置还适用于：控制所述温度控制系统，以用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
37.如方面31至36任一方面所述的装置，所述装置还包括：
用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的一装置和/或用于测量背向反射的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的所述装置和/或用于测量背向反射的所述装置。
如上所述，优选的提供用于背向反射测量的一附加光源，例如，提供具有激发波长为385纳米的LED。对于背向反射测量，进一步优选的提供额外的光检测器，例如，用于检测385纳米处的背向反射光。
38.如方面31至37任一方面所述的装置，所述装置还包括：
另一个光检测器；及
用于进行一静态散射光测量的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以执行一静态散射光测量。
39.如方面31至38任一方面所述的装置，所述装置还包括：
一单模光纤；及
用于通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光。
附图标记列表
10：容器的纵轴，例如毛细管的纵轴
11：容器，例如毛细管
12：所研究溶液中包含颗粒的样品
13：回火元件，例如加热垫/床
14：荧光光学元件
15：动态光散射光学元件
16：荧光焦点
17：动态光散射焦点
18：荧光焦点和动态光散射焦点之间的x距离
19：反射光束
20：毛细管轴线与被检测的光束的夹角
30：光检测器，例如动态光散射检测器
31：ADC(模数转换器)
32：脉冲鉴相器
33：相关器
34：现场可编程门阵列(FPGA)
35：个人计算机
36：光子计数阈值
38：作为数字光子脉冲信号的数字化输出信号
39：光电倍增管的数字化输出信号
50：激发光束
51：检测到的光束
52：物镜(或反射物镜)
53：毛细管轴线与激发光束之间的角度
53’：毛细管轴线和激发光束之间的角度
表示为
度
54：激发光束和检测到的光束之间的角度
55：单色光源，如激光
56：准直透镜
57：光纤(单模、替代地保偏或多模)
58：分束器功率，例如50：50
59：分束器波长，例如低通620纳米
60：二色性滤光器，例如带通405/5纳米，以阻挡荧光
61：偏振滤光器
62：提高激光光束质量的光学元件
63：减少杂散光的孔径
64：用于毛细管散光校正的柱面透镜
Claims (39)
1.一种测量溶液中多个颗粒特性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提供包含在溶液中的所述多个颗粒的一样品的一容器，其中所述样品具有一体积优选地在0.1微升至15微升之间；
提供一单色光源和一光检测器；将光从所述单色光源传送到包含所述样品的所述容器；及
使用所述光检测器来检测从所述容器发出的光；以及基于一动态光散射测量来确定所述样品中所含溶液中的所述多个颗粒的多个特性，其中所述动态光散射测量优选地是在少于1秒内获得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述容器为一毛细管和/或一多孔板，优选地为具有一圆形截面的玻璃毛细管，具有一内径在0.1毫米至1毫米之间，具有一外径在0.2毫米至1.2毫米之间，及具有一长度在5毫米至70毫米之间。
3.如权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：测量荧光，优选地测量在所述样品和/或所述容器的材料所含的溶液中所述多个颗粒的荧光，其中所述荧光优选地为所述多个颗粒和/或所述容器的材料的自发荧光，和/或测量包含所述样品的所述容器的背向反射。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：基于所测量的荧光和/或基于所测量的背向反射来确定所述容器的位置，以及基于所测量的荧光和/或背向反射以及确定的容器位置，选择性地定位所述容器。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，其中来自所述单色光源的光是相干的，并且优选地波长在350纳米至500纳米之间，优选地为405纳米、445纳米或488纳米。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，其中所述单色光源是一激光，优选地是二极管激光，优选地是选自由以下组成的群组的二极管激光：稳频二极管激光、DPSS激光、PPLN倍频二极管激光、倍频DPSS激光、二极管泵浦光纤激光、倍频二极管泵浦光纤激光和二极管泵浦上转换光纤激光。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述激光的相干长度为至少0.1毫米。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，其中所述激光的功率在1毫瓦至200毫瓦之间，优选地在10毫瓦至180毫瓦之间，更优选地在50毫瓦至150毫瓦之间，甚至更优选地在75毫瓦至120毫瓦之间，例如在10O毫瓦。
9.如权利要求6至8任一项所述的方法，其特征在于，其中所述单色光通过在激光波长的一单模光纤和优选地通过一激光波长偏振保持单模光纤来从所述单色光源进行传输。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，其中所述单色光源发出的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度传送至所述容器，其中
为在0度至45度之间。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，其中使用光检测器所检测到的光是以与所述容器的一纵轴成
的一角度从所述容器发出，其中
为在0度至45度之间，其中
的值优选地与
的值相同。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，其中从所述单色光源传送到所述容器的光和从所述容器发出并使用所述光检测器检测到的光之间的一角度
是在0度至150度之间，优选地在10度至150度之间，更优选地在10度至60度之间。
13.如权利要求1至12任一项所述的方法，其特征在于，其中所传送的单色光是使用一物镜来聚焦在包含所述样品的所述容器中，其中从所述容器发出的光优选地也是由所述物镜来聚焦，优选地，其中所述物镜具有一焦距在10毫米至200毫米之间，和/或其中所传送的单色光在所述容器中聚焦，具有一焦斑的半峰全宽(FWHM)在3微米至30微米之间，优选地导致一测量体积在0.01纳升至0.1纳升之间，优选地在0.01纳升至0.02纳升之间，更优选地为约0.016纳升。
14.如权利要求1至13任一项所述的方法，其特征在于，其中所述光检测器是光电倍增管、硅光电倍增管或雪崩式光电二极管光子计数检测器，优选地是光电倍增管或硅光电倍增管。
15.如权利要求1至14任一项所述的方法，其特征在于，其中所述动态光散射测量是在5秒内获得，优选地在少于1秒内获得。
16.如权利要求1至15任一项所述的方法，其特征在于，其中每个样品仅进行一次动态光散射测量。
17.如权利要求1至16任一项所述的方法，其特征在于，其中所述动态光散射测量包括执行至少一个相关性操作的步骤，优选地是至少一个自相关性操作。
18.如权利要求1至1175任一项所述的方法，其特征在于，其中所述动态光散射测量包括以下步骤：
获取从所述光检测器获得的一模拟输出信号；以及处理所获得的模拟输出信号。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，其中处理所获得的模拟输出信号的步骤包括以下步骤：将所获得的模拟输出信号进行数字化以转化为一数字化输出信号。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，其中所述数字化输出信号使用以下步骤进一步处理：
i)将所述数字化输出信号处理为一数字化单光子脉冲信号，优选地是在从所述容器发射的检测光到的强度低于每秒检测到200万个光子的情况下；和/或
ii)将所述数字化输出信号处理为一模拟信号的多个离散值，优选地是在检测到的光强度高于每秒检测到200万个光子的情况下。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，其中所述处理所获得的模拟输出信号的步骤包括步骤i)或步骤ii)，并且其中决定是否根据步骤i)或步骤ii)将所述数字化输出信号处理为一数字化信号的时间小于1秒，优选地为最大0.05秒，优选地使用现场可编程门阵列，或
可以同时处理光子计数和模拟输出信号，以便满足在测量后是否根据步骤i)或步骤ii)进行处理的决定。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，其中所述处理所获得的模拟输出信号的步骤还包括以下步骤：
将从步骤i)或步骤ii)获得的经处理的数字化输出信号存储；或
将从步骤i)和步骤ii)获得的多个经处理的数字化输出信号存储；及
进一步处理所存储的多个输出信号中的一个。
23.如权利要求1或22所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
至少在一第一时间点以一第一温度和在一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，其中至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火的步骤包括以0.01℃/分钟至30℃/分钟之间的一回火速率对所述容器进行回火，优选地在0.1℃/分钟至10℃/分钟之间，和/或其中所述第一温度和所述第二温度介于-20℃至160℃之间。
25.如权利要求1至24任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：
进行一纳米差分扫描荧光法测量；和/或
测量包含所述样品的所述容器的背向反射。
26.如权利要求1至25任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：提供另一光检测器，以及
使用所述另一光检测器测量包含所述样品的所述容器的静态散射光，优选地与所述容器的一纵轴成一角度
其中
优选地在10度至150度之间，更优选地在10度至60度之间。
27.如权利要求1至26任一项所述的方法，其特征在于，其中所述容器为一毛细管和/或一多孔板，优选地为具有一圆形截面的玻璃毛细管，具有一内径在0.1毫米至1毫米之间，优选地在0.15毫米至0.5毫米之间，和优选地具有一外径在0.2毫米至1.2毫米之间，优选地在0.65毫米至1毫米之间，和优选地具有一长度在5毫米至70毫米之间，优选地在32毫米至50毫米之间，更优选地为约50毫米。
28.如权利要求1至27任一项所述的方法，其特征在于，其中多个容器被提供，其中每个容器包含溶液中多个颗粒的一样品，及其中根据权利要求1至27任一项对每个容器测量中溶液中多个颗粒的多个特性。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，其中：
对每个容器的一荧光测量之后是对每个容器的一动态光散射测量；或
对每个容器的一动态光散射测量之后是对每个容器的一荧光测量；或
对多个容器中的一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量，然后对所述多个容器中的另一个容器进行一荧光测量和一动态光散射测量。
30.如权利要求1至29任一项所述的方法，其特征在于，其中所述多个特性是选自由以下组成的群组：粒径分布、聚集温度、熔解温度、转变温度、展开温度、液-液相分离温度自由折叠能、第二维里系数、颗粒自相互作用、胶体稳定性、流体动力半径、颗粒间的排斥或吸引的相互作用、溶解度、长期蛋白质稳定性和临界变性剂浓度。
31.一种用于检测溶液中多个颗粒的多个特性的装置，优选地根据权利要求1至30任一项，其特征在于，所述装置包括：
用于容纳至少一个容器的一装置，所述至少一个容器包含溶液中所述多个颗粒的一样品，优选地所述至少一个容器用于容纳0.1至15微升的所述多个颗粒；
一单色光源和一光检测器；
用于执行一DSL测量的一装置；及
一控制装置适用于：
控制用于容纳所述至少一个容器的所述装置；
控制所述单色光源，以用于将光从所述单色光源传送到所述至少一个容器；
控制所述光检测器，以检测来自所述至少一个容器的多个信号；以及
控制用于执行所述DSL测量的所述装置。
32.如权利要求31所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
用于执行一相关性操作的一装置，所述相关性操作优选地是一自相关性操作，其中所述自相关性操作优选地是实施在硬件和/或软件中的一自相关性逻辑；及
33.如权利要求31或32所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
用于对从所述光检测器获得的多个信号进行数字化的一装置，其中所述装置优选地包括一现场可编程门阵列，及所述控制装置进一步适用于：控制所述装置，以用于将从所述光检测器获得的多个信号进行数字化。
34.如权利要求31至33任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
用于测量所述样品的溶液中所述多个颗粒的荧光的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以用于测量所述样品中所含溶液中所述多个颗粒的荧光。
35.如权利要求31至34任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
一定位装置，用于定位容纳溶液中所述多个颗粒的所述样品的装置，其中所述控制装置进一步适用于：控制用于容纳所述样品的装置的定位。
36.如权利要求31至35任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
一温度控制系统，用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火，其中所述控制装置还适用于：控制所述温度控制系统，以用于至少在一第一时间点以一第一温度和一第二时间点以一第二温度随时间对所述容器进行回火。
37.如权利要求31至36任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的一装置和/或用于测量背向反射的一装置，其中所述控制装置还适用于：控制用于进行一纳米差分扫描荧光法测量的所述装置和/或用于测量背向反射的所述装置。
38.如权利要求31至37任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：
另一个光检测器；及
用于进行一静态散射光测量的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以执行一静态散射光测量。
39.如权利要求31至38任一项所述的装置，其特征在于，所述装置还包括：一单模光纤；及
用于通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光的装置，其中所述控制装置还适用于：控制所述装置，以通过所述单模光纤从所述单色光源传输单色光。
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