KR20220093215A - 용해된 입자의 특성화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 용해된 입자의 특성을 측정하기 위한 방법 및 이를 수행하기 위한 기기에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 용해된 입자의 샘플(상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 가짐)을 포함하는 용기를 제공하는 단계; 단색 광원 및 광 검출기를 제공하는 단계; 단색 광원으로부터의 광을 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 송신하는 단계; 상기 용기로부터 방사된 광을 상기 광 검출기로 검출하는 단계; 및
상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성을 DLS(동적 광산란) 측정에 기반하여 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
Description
일반적으로, 본 발명은 동적 광산란에 기반한 용해된 입자를 특성화하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단백질의 3차원 구조 및 용해된 단백질의 3차원 구조의 변화의 특성화를 허용하는 방법(예를 들면 시차주사 형광측정법과 결합되어 바람직하게는 1초 미만의 시간 내에 수행되는 특히 동적 광산란(DLS)를 사용하는 작은 샘플 부피의 경우, 예를 들면 온도에 종속되는 이들의 안정성을 바람직하게는 포함함); 및 이를 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 본 발명은 바람직하게는 응집 및 내재적 성질의 개량된 정확한 측정값을 제공하는 시스템과 방법을 제공하며, 예를 들면 입자의 폴딩, 예를 들면 단백질의, 폴딩을, 짧은 시간 안에 그리고 단일 시스템 안에서 제공한다.
빠르고 정확하게 제품의 특성을 결정하는 것은 많은 어플리케이션에서 중요하다. 예를 들면, 식품 산업 및 재료 과학은 물론 의약품 또는 생명과학적 상황에서, 그 생산 및 잠재적 저장 중 제품의 안정적 품질 및/또는 고순도를 보장하는 것이 중요하다. 품질 관리는 용해된 입자와 같은, 예를 들면 단백질과 같은 제품을 포함하는 샘플 및/또는 제품의 샘플에 기반하여 일상적으로 수행된다. 이들 관리는 전형적으로 시간 소모적이며 결과가 나올 때까지 상당한 지연을 야기할 수 있다. 따라서, 불순물 및/또는 원치 않는 제품 속성으로부터 일어나는 비용을 줄이기 위해, 제품의 특성을 평가하기 위해 용액을 마련하는 것이 바람직하며, 예를 들면 용해된 입자의 제품으로, 높은 정확도 및 바람직하게는 실시간으로 평가하기 위해서다.
이와 같은 입자의 한 예시는 단백질이다. 단백질은 거의 모든 세포적 과정에서 수반되며 따라서 인간을 포함한 세포 생물의 기능을 위해 결정적이다. 그들의 기능에 따라, 단백질은 예를 들면 조직 및 세포의 구조를 결정하는 구조적 단백질, 촉매적 기능을 갖는 단백질, 즉 엔자임; 세포 이온 농도 및 그에 따른 삼투압 항상성 및 신호 전달을 규제하는 이온 채널, 운반 단백질, 호르몬 포함 조절 단백질; 및 항체와 같이 면역 반응에서 수반되는 단백질로 분류될 수 있다. 단백질의 양 및/또는 활성은 예를 들면 고온 포함 생리학적 스트레스 상태에 노출된 경우 및/또는 유전병의 경우 영향을 받을 수 있다. 세포적 과정에 미치는 이들의 영향과 보급으로 인해, 단백질의 양 및/또는 활성의 변화는 생물의 생존과 건강에 중요한 영향을 미칠 수 있다.
이들의 관련성으로 인해, 단백질은 그들의 구조, 기능, 분포, 레벨 및 의료를 포함한 다양한 적용에서의 잠재적 사용의 관점에서 집중적으로 조사되어 왔다. 단백질은 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 거대분자적 화합물이다. 특정 아미노산 서열은, 또한 단백질의 1차 구조로서 지칭되며, 유전적으로 결정된다. 상기 아미노산 서열은 단백질의 아미노산 잔기간 수소 결합 때문에 폴드될 수 있으며, 그 결과로서 2차 구조로 또한 지칭되는 형태가 되며, 여기서 아미노산 서열의 공간 배열은 3차 구조로서 지칭된다. 상기 3차 구조, 및 따라서 단백질의 3차원 폴딩은, 특별한 관심을 받고 있는데 그 조사는 단백질의 분자적 구조에 대한 정보만을 제공하지는 않기 때문이다. 이는 반응성 아미노산 잔기의 공간 배열에 대한 상세한 정보를 더 제공할 수 있으며, 예를 들면 엔자임의 촉매적으로 활성 중심 또는 항체의 항원 결합 부위, 및 따라서, 그 활성에 대한 상세한 정보를 제공할 수 있다. 더욱이, 일부 단백질은 4차 구조를 갖고, 이는 단백질의 응집 및/또는 관계를 지칭하며 따라서 (올리고머릭) 단백질의 서브유닛으로 지칭되는 개별 단백질을 갖는 안정적 (올리고)단백질을 형성하는 것이다. 단백질의 고유 입체형태(들)의 편차는 흔히 그 효능의 감소와 관련되기 때문에 특히 단백질의 3차원 구조는 생물학적 효과에 필수적인 것으로 고려될 수 있다.
단백질의 이용가능성을 최적화하는 것은, 특히 생물학적으로 활성 형태에서, 예를 들면 치료적 상황에서 희망적인 접근법을 나타낸다. 대상이 대조군과 같은 기타 대상에서 관찰될 수 있는 레벨과 비교하여 단백질의 감소된 레벨을 나타내는 경우, 상기 단백질의 기설정된 양을 취득하는 것이 대상에 이득일 수 있다. 특히 치료법 적용에서, 투여시 원치 않는 면역 반응을 피하려면 주어진 형태의 관심 단백질의 고순도가 요구된다. 같은 이유로, 단백질 기반 바이오의약품의 유효 성분과 같은 활성물질은 저장중에 안정적이어야 하며, 즉 바이오의약품에 포함된 관심 단백질은 온전하게 남고 의도된 형태로 남으며 따라서, 그들의 3차원 구조를 분해하거나 변화 및/또는 저장중에 응집을 형성하지 않는다.
항체와 같은 활성 물질은 천연형으로만 활성인 방식으로 개발되었으므로, 변성된 활성 물질은 흔히 효과적이지 않고 피해야 한다. 변성은 단백질과 같은 바이오분자에서 구조적 변화를 지칭하며, 대부분의 경우 이는 이들 분자의 생물학적 기능의 손실을 수반한다. 변성은 물리적 또는 화학적 영향으로 인한 것일 수 있다. 항체와 같은, 입자의 변성은, 효능을 감소시키기 때문에 피해야 한다. 따라서, 유효 성분 제형은 약물의 변성이 방지될 수 있도록 개발되어야 하고, 즉 열적, 화학적 및/또는 시간적으로 이들을 안정화시키도록 개발되어야 한다. 또한, 응집 또는 활성 물질의 응집은 무효성을 초래할 수 있다. 추가적으로, 응집된 및/또는 변성된 입자는, 예를 들면 투여된 응집 항체는, 신체에서 면역 체계의 반응을 트리거링할 수 있고 따라서 약물에서 피해야 하거나 약물에서 그 비율이 최소화되어야 한다. 따라서, 입자의 응집은, 예를 들면 항체 치료에서, 피해야 하며 이는 면역 체계에서의 반응을 야기하며 효능의 감소를 초래할 수도 있기 때문이다.
그러나, 입자가 왜 응집 및/또는 변성되는지는 흔히 분명하지가 않다: 입자는 변성되기 때문에 응집하는가, 즉 천연형으로 존재하지 않는가, 또는 천연형으로 응집한 후 변성되는가?
천연 및 화학적 및/또는 열적 변성 상태를 포함하는 다양한 환경 조건에서 (올리고머릭) 단백질의 3차원 구조를 특성화할 것을 겨냥하여 다양한 접근법이 개발되었다. 온도, pH, 및/또는 기타 화학적 요소의 존재의 예를 들면 종속된 단백질의 3차원 폴딩의 안정성을 조사하는 것은 저장 상태를 최적화하기 위해 매우 유리할 수 있으며, 예를 들면 단백질 기반의 바이오의약품의 경우 그렇다. 단백질의 안정성을 결정하기 위해 시차주사 형광측정법(DSF) 방법이 예를 들면 나노-DSF를 포함하여 적용될 수 있다. 예를 들면 후방 반사를 포함하는 정성 방법을 사용하여 원치 않는 단백질 응집과 같은 큰 입자의 존재가 분석될 수 있으며, 반면 용해된 단백질의 크기 분포는 예를 들면 동적 광산란(DLS) 기반 분석을 사용하여 조사될 수 있다.
입자의 포괄적 특성화를 위해, 응집만 또는 변성만 별개로 분석하는 것은 흔히 충분치 않다. 그러나, 비록 두 파라미터의 상호작용은 대부분의 경우에서 동시에 관심대상이지만, 기존의 시스템은 응집 및 단백질의 (언)폴딩을 동시에 고민감도로 측정할 수 없다. 예를 들면, 프로메테우스TM 장치(나노템퍼)는 응집 및 용해된 단백질의 (언)폴딩을 모두 측정할 수 있지만, 응집의 경우 민감도가 한정되며 그로 인해 일부 작은 응집의 존재는 소수 큰 응집의 존재로부터 구별될 수 없다. 후자는 예를 들면 다이나프로® 플레이트 판독기(와이어트 테크놀로지)와 같은 다른 장치와 상기 장치를 결합하여 달성될 수 있다. 그러나, 후자를 사용할 때는 낮은 가열 속도를 포함하는 추가적인 기술적 한정의 결과로서 입자가 열에 노출 시 언폴딩 또는 응집 중 어느 쪽이 먼저 일어났는지의 정보의 손실을 일으킨다.
따라서, 입자가 많지 않을 경우에도 재생산가능한 양적 결과를 보장하는 높은 처리량에서 용해된 단백질처럼 입자를 종합적으로 및 효율적으로 특성화하기 위한 대안적 용액을 마련할 필요가 아직 있다.
본 발명은, 그 중에서도, 바람직하게는 짧은 시간에 작은 샘플 부피의 경우에도, 용해된 상기 입자를 포함하는 같은 샘플에 기반한 나노-DSF 측정과 같이 DLS 측정을 수행하여, 용해된 입자의 3차원 구조가 고처리량에서 재생산성과 고민감도로 분석될 수 있다는 발견에 기반한 것이다. 상기 측정에 기반하여, 응집과 단백질의 폴딩의 자유 에너지는 빠르고 정확하게 결정될 수 있으며, 바람직하게는 단일 장치 안에서 결정될 수 있다. 또한, 예상 입자 크기 분포의 편차 및/또는 용해된 입자 응집의 존재 또는 부재에 대한 정보가 취득될 수 있기 때문에 품질 관리는 거대하게 가속화될 수 있는데, 예를 들면 2초 또는 그 미만으로도 본 발명의 시스템 및 방법을 사용하는 약 48개 샘플에 대해 가속화될 수 있다. 비교하여, DLS를 사용하는 기존의 접근법은 하나의 샘플에 대해 적어도 약 12초를 요구한다. 따라서, 실시간으로도, 예를 들면 액체는 흐르며, 본 발명의 장치와 방법을 사용하여 용해된 입자를 특성화하기 위해 측정은 수행될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 시스템과 방법은 모두, "인트라-파티클"처리와 "인터-파티클"처리가 측정될 수 있으며, 예를 들면 용해된 입자의 응집과 변성은 측정될 수 있으며, 또한, 준동시(즉, 필수적으로 동시에) 또는 동시에, 측정될 수 있다.
가령, "인트라-파티클"처리는 바람직하게는 폴딩/언폴딩에 관련되며 일반적으로는 입자의 3D 구조에 관련된다(1차, 2차, 3차, 4차 구조). 입자의 변성은 또한 "인트라-파티클"처리이며 고유의 입자 형광성을 측정하여 본 발명에 따른 시스템 및 절차에서 측정될 수 있다(예를 들면, 트립토판 형광, 타이로신 형광). 동시에, 입자 응집, "인터-파티클"처리는 입자 사이즈를 변화시키며, 산란 비흡수광에 의해 측정될 수 있다.
예를 들면, 입자의 변성이 응집에 의해 유도된 것인지 입자의 응집이 변성에 의해 유도된 것인지 결정하기 위해, 동시에 입자/분자의 열적으로 유도된 변성 및 응집을 측정하는 것이 이득이다. 달리 말하면, 입자들이 그들의 고유 입체형태로 응집하는지 그들이 언폴디드 또는 부분적 언폴디드 형태로 응집하는지 이해하는 것이 이득이다. 이 지식은 응집 메커니즘의 더 나은 이해를 제공하며 따라서 연구에서 입자의 안정적 제형의 개발 과정을 개선할 것이다(예를 들면 안정화 성분을 갖는 버퍼를 포함하는 것). 앞서 언급한 처리가 다른 시간의 척도 (예를 들면 약 1초에서 몇 시간) 및 다른 순서로 일어날 수 있으므로, 이들 상호의존과정의 운동을 감시하기 위해 동시에 시간을 두고 나노-DSF 및 DLS 측정을 하는 것이 특히 이득이다.
본 발명은 독립항의 특징에 의해 정의된다. 본 발명의 바람직한 실시예는 종속항에 의해 정의된다.
본 발명은 용해된 입자의 특성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은: 상기 용해된 입자의 샘플을 포함하는 용기를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 샘플은 바람직하게는 작은 부피, 예를 들면 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 바람직하게는 실질적으로 단색 광을 방사하는 광원을 제공하는 단계, 광 검출기를 제공하는 단계 및 상기 단색 광원으로부터 광을 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 송신하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 달리 말하면, 상기 용기 안의 상기 입자는 상기 광원으로부터 광과 함께 방사되며, 상기 입자로부터의 산란광은 상기 광 검출기로 검출된다. 또 달리 말하면, 상기 용기로부터 오는 광, 즉 상기 용기로부터 준방사되는 광은 상기 광 검출기로 검출되며, 상기 샘플 안에 용해된 상기 입자의 특성은 동적 광산란(DLS) 측정에 기반하여 결정될 수 있다. 여기서, 상기 용기로부터 방사된/오는 광은 또한 "방사된 광"으로 지칭되며 상기 샘플과 상호작용 후 샘플로부터 "산란광" 또는 "후방산란광"이라는 용어와 교환되어 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 샘플은 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 갖고, 더욱 바람직하게는 1μL 와 15 μL 사이, 더욱 더 바람직하게는 8μL 와 12 μL 사이의 부피를 갖는다. 상기 샘플은 바람직하게는 작은 부피를 갖는 용기 안에 제공되며, 예를 들면 모세 및/또는 다중 웰 플레이트의 웰 안에 제공되며, 이는 상기 모세관이 모세관힘의 수단에 의해 쉽게 채워질 수 있는 추가적인 이점을 제공한다. 예를 들면, 단일 모세관 또는 배열(홀더)상에 거치된 복수의 모세관조차도 상기 샘플을 갖는 용액 안으로 침지될 수 있으며, 그로 인해 각 모세관은 그 자체를 완전히 몇 초간 모세관힘으로 인해 침지시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 단색 광원으로부터의 상기 광은 간섭성이며 바람직하게는 350nm과 500nm사이의 파장, 바람직하게는 405nm, 445nm, 또는 488nm의 파장을 갖는 것을 특징으로 한다. 통상의 기술자는 실제 광원은 물론 절대 완전히 단색일 수는 없다는 것을 이해할 것이며, 즉 0의 광학적 대역폭을 가질 수는 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 단색 광원이라는 용어는 상기 언급한 바와 같이 매우 한정된 파장 범위 또는 대역폭을 갖는 광원을 지칭한다. 달리 말하면, 단색 및 준단색이라는 용어는 본 발명에서 대체가능하다. 예를 들면, 레이저원은 흔히 단색 또는 준단색, 즉 광학적 대역폭이 충분히 작아서 광의 특정 성질이 진짜 단색 광의 그것으로부터 구별되기 어렵다.
바람직하게는, 상기 (준-)단색 광원은 간섭성 광원, 예를 들면 레이저, 바람직하게는 다이오드 레이저, 바람직하게는 주파수 안정화 다이오드 레이저, DPSS 레이저, PPLN 주파수 더블 다이오드 레이저, 주파수 체배 DPSS 레이저, 다이오드 펌프 광섬유 레이저, 체배 다이오드 펌프 광섬유 레이저 및 다이오드 펌프 업컨버전 광섬유 레이저로 이루어진 집단으로부터 선택된 다이오드 레이저인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 레이저는 적어도 0.1mm의 간섭 길이를 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 레이저는 바람직하게는 적어도 0.1mm의 간섭 길이를 갖고, 바람직하게는 적어도 1mm의 간섭 길이를 갖는다.
바람직하게는, 상기 레이저는 1mW와 200mW사이의 전력, 바람직하게는 10mW와 100mW사이, 더 바람직하게는 45mW와 80mW사이, 더욱 더 바람직하게는 50mW와 70mW사이인 전력을 갖는다. 상기 레이저는 또한 1mW와 200mW사이의 전력, 바람직하게는 10mW와 180mW사이의 전력, 더 바람직하게는 50mW와 150mW사이, 더욱 더 바람직하게는 70mW와 120mW사이, 예를 들면 100mW인 전력을 가질 수 있다. 바람직하게는, 전기적으로/디지털 변경가능/제어가능 출력을 갖는 DLS 레이저가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 단색 광은 상기 단색 광원으로부터 레이저 파장 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 편광 유지(PM) 광섬유가 사용되며, 예를 들면 레이저 파장 편광 유지 단일 모드 광섬유가 사용된다. 추가적인 실시예에 따라서 편광을 유지하지 않는 광섬유를 사용하는 것이 이득일 수 있다. 상기 광은 후속적으로 예를 들면 대물 렌즈에 의해 상기 용기로 초점이 맞춰지도록 추가적으로 바람직하다.
바람직하게는, 상기 단색 광원으로부터의 광은 상기 용기의 종축에 각도 φL로 상기 용기로 송신되며, φL는 0도와 45도 사이, 바람직하게는 용기 안에 초점을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 검출기로 검출되는 광은 상기 용기의 종축에 각도 φD로 상기 용기로부터 방사되며(또는 산란되며, 후방산란되며), φD는 0도와 45도 사이이며, 상기 φL의 값은 바람직하게는 상기 φD의 값과 동일한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 단색 광원으로부터 상기 용기로 송신되는 상기 광과 상기 광 검출기로 검출된 상기 용기로부터 방사된 상기 광 사이의 각도 φS는 0도와 150도 사이이며, 바람직하게는 10도와 150도 사이이고, 더 바람직하게는 10도와 60도 사이인 것을 특징으로 한다. 상기 언급한 방사된 또는 산란된 광의 각도는 바람직하게는 상기 용기에 대하여 측정되며, 이는 상기 용기의 위치는 상기 장치 안에서 결정될 수 있기 때문이다. 통상의 기술자는 그러나, 상기 용기 안에서 상기 입자로부터 산란되거나 방사되는 광은 상기 입자의 정보를 갖는 상기 광이며, 이는 그들의 특성화에 사용될 수 있는 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 용해된 입자로부터 산란되는 광에 기반하는 DLS 측정을 수행하도록 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 입자로부터 방사된 형광성 광에 기반하는 DSF 측정을 수행하도록 사용될 수도 있다. 거시적으로, 상기 산란광 및 상기 형광광은 용기로부터 오는/방사되는 것이다.
바람직하게는, 상기 송신된 단색 광은 대물 렌즈를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 상기 용기로부터 방사되는 상기 광은 바람직하게는 또한 상기 대물 렌즈에 의해 초점이 맞춰지는 것을 특징으로 한다. 상기 대물 렌즈는 10mm와 200mm사이의 초점거리를 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 송신된 단색 광은 3 μm와 30μm사이의 반값 전폭(FWHM)을 갖는 초점을 갖는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 0.01nl과 0.1nl사이의 측정 체적, 바람직하게는 0.01nl과 0.02nl사이, 더욱 바람직하게는 약 0.016nl의 측정 체적으로 되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 광 검출기는 광전(자) 증배관(PMT), 실리콘 광전(자) 증배관(SiPM), 또는 애벌란시 포토 다이오드(APD) 광자 계수 검출기, 더 바람직하게는 PMT 또는 SiPM인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 DLS 측정은 5초 미만의 시간내에 수행되며, 바람직하게는 1초 미만의 시간내에, 바람직하게는 200 ms에서 800 ms 사이, 더 바람직하게는 약 500 ms의 시간내에 수행되는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 DLS 측정은 샘플당 단 1회만 특정 온도에서 수행되는 것, 예를 들면 측정의 속도를 개선하도록 하는 것을 특징으로 한다. 상기 DLS 측정은, 그러나, 같은 온도에서 및/또는 다른 온도에서 샘플/용기당 여러 번 수행될 수 있으며, 이는 예를 들면 측정의 수단을 계산하도록 (예를 들면 같은 온도에서) 및/또는 상기 입자의 다양한 상태를 고려하도록 (예를 들면 다른 온도에서) 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 DLS 측정을 수행하는 것은 적어도 하나의 상관 연산, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관 연산을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 DLS 측정은 상기 광 검출기로부터 취득되는 아날로그 출력 신호를 취득하는 단계; 및 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 검출기로부터의 상기 아날로그 출력 신호 (전체)를 디지털화하는 것은 선행 기술에 대한 특정 이점을 제공하며 이는 하기에 더 상세하게 논의될 것이다. 특히, 그 결과의 디지털 출력 데이터는 디지털 무가공 신호로 간주될 수 있으며, 이는, 그러나, 상기 검출기에 의해 검출된 상기 광의 강도에 따라 후속적으로 다루기 쉽다. 짧게 말해, 상기 디지털 출력 데이터는 개별 광자를 위한 개별 피크를 구별하기 위해 후속적으로 아날로그 처리 수단에 의해 처리되거나 디지털 처리 수단에 의해 처리될 수 있다.
따라서, 상기 출력 신호를 처리하는 단계는 i) 바람직하게는 상기 용기로부터 방사되는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 미만일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 디지털 단일 광자 펄스 신호로 처리하는 단계; 및/또는 ii) 바람직하게는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 초과일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 아날로그 신호의 이산값으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 하나를 포함하며, 상기 디지털 출력 신호를 상기 i) 단계 또는 ii) 단계에 따라 디지털 신호로서 처리할지 결정하는 시간이 1초 미만이며, 바람직하게는 최대 0.05초이며, 바람직하게는 FPGA(Field Programmable Gate Array: 필드 프로그램 가능 게이트 어레이)를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, 양측 신호, 즉, 상기 광자 계수 및 아날로그 출력 신호는 동시에 처리될 수 있다. 이와 같이, 단계 i) 또는 ii)에 따라 처리할 상기 결정이 상기 측정 후 행해질 수 있다.
바람직하게는, 상기 취득된 출력 신호를 처리하는 단계는: 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계; 또는 상기 i) 단계 및 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 신호가 어떻게 처리되어야 할 지의 예시로서, 광자 계수 신호 및/또는 아날로그 신호로서 처리될 경우, 광자를 검출하는 상기 검출기에 의해 기정의되는 것이 아니며, 예를 들면 이는 전용 광자 계수 검출기를 사용할 때처럼이 아닌, 후속 단계에서 예를 들면 FPGA(필드 프로그램가능 게이트 어레이), ASIC(Application-Specific Integrated Circuit: 응용 주문형 집적 회로), 또는 기타 프로그램가능 수단 안의 알고리즘에 의해, 결정된다. 바람직하게는 이들 알고리즘은 변경될 수 있으며, 예를 들면 개선될 수 있고, 이는 하드웨어를 바꾸지 않고 그렇게 될 수 있다. 예를 들면 상기 신호를 광자 계수 신호로 표시하는 것에서 아날로그 신호로 표시하는 것으로 알고리즘이 변하는 2백만 광자의 한계는, 펌웨어 및/또는 소프트웨어 수단에 의해 갱신 및/또는 변경될 수 있다. 예를 들면 상기 한계는 초당 2백만 광자 검출부터 예를 들면 초당 1백만 광자 검출 또는 초당 4백만 광자 검출로 교체될 수 있다. 이는 상기 언급한 한계를 변경하기 위해 하드웨어가, 예를 들면 광자 계수기가 교환되어야 하는 기존의 해결책에 비해 바람직하다.
바람직하게는, 상기 방법은 형광성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 측정된 형광성은 바람직하게는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 및/또는 상기 용기의 재질의, 형광성이며, 상기 형광성은 바람직하게는 상기 입자의 및/또는 용기의 재질의, 자가형광성인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 방법은 상기 측정된 형광성에 기반하여 상기 용기의 위치를 결정하는 단계, 및 선택적으로 상기 광원에 대하여 상기 용기를 재위치시키는 단계, 즉 상기 측정된 형광성 및 상기 결정된 용기 위치에 기반하여, 상기 용기 및/또는 상기 광원을 재위치시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 용기의 위치를 결정하는 단계는 바람직하게는 또한 자가형광성을 자체적으로 충분히 나타내지 않는 용기를 사용하여 (자가)형광성 입자 없는 샘플에도 작동한다. 달리 말하면, 본 발명의 방법은 바람직하게는 용기, 예를 들면 모세관의 위치를, 형광 측정에 의해 결정하며, 상기 형광성 검출은 상기 입자 및/또는 상기 용기의 재질에 기반할 수 있다. 예를 들면, 유리 또는 수정 글래스로부터 형성된 용기는 이미 상기 언급한 형광성 측정에 기반한 상기 용기의 위치를 결정하기 위한 충분한 자가형광성 방사를 생성하며, 이는 샘플이 없거나 (자가)형광성 입자가 없는 샘플이 상기 용기 안에 존재할 경우에도 그렇다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 상기 샘플의 상기 입자의 특성화에 이용 및/또는 상기 용기의 위치를 결정하기 위해 이용될 수 있는 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 방법은: 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 입자의 특성이 두 다른 온도에서 결정된 경우, 특성의 변화를 측정하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법은 제 1 온도 T1에 의해 본 발명의 방법을 행하고 이후 제 2의 상이한 온도 T2 또는 다수의 다양한 온도 Txy에 의해 상기 방법을 행하여 용해된 입자의 특성의 변화를 측정하고, T1과 T2 또는 다수의 온도 Txy를 비교하여 입자의 특성에서의 변화를 결정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 용해된 입자의 특성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 상기 용해된 입자의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 접촉 가열 및/또는 냉각에 의해 상기 샘플 프로브의 정의된 온도를 생성하기 위한 온도 제어 시스템을 제공하는 단계;
(c) 제 1 온도에서 상기 입자를 측정하는 단계;
(d) 상기 온도 제어 시스템의 수단에 의해 상기 샘플 안에서 제 2 온도를 생성하는 단계;
(e) 이 제 2 온도에서 상기 샘플 안에서 상기 입자를 측정하는 단계; 및
(f) 상기 두 측정에 기반하여 상기 입자를 특성화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따라서, 상기 측정 단계 c) 및 e)는 현재 개시된 DLS 측정 단계 및/또는 현재 개시된 나노 DSF 측정 단계다. 바람직한 실시예에 따라서, 상기 측정 단계 c) 및 e) 모두 DLS 측정 단계, 추가적 제 1 형광성 판독 및 제 2 형광성 판독을 포함한다.
바람직한 실시예에 따라서, 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계는 분당 섭씨 0.01도와 분당 섭씨 30도 사이의 템퍼링 속도, 바람직하게는 분당 섭씨 0.1도와 분당 섭씨 10도 사이의 템퍼링 속도, 및/또는 상기 제 1 온도와 상기 제 2 온도는 섭씨 -20도와 섭씨 160도 사이에서 상기 용기를 템퍼링하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 특정 온도, 바람직하게는 상기 언급된 범위의 및 상기 온도를 특정 시간동안 유지 시키는 것, 예를 들면 10초, 1분 이상 또는 그 이상, 예를 들면 특정 정확도를 갖는 등온선 모드로, 특정 정확도는 바람직하게는 +/-0.01℃와 +/-1.5℃ 사이, 바람직하게는 +/-0.01℃와 +/-0.5℃ 사이에서 균질성, 재생산성 및 정밀성 관한 측정의 특정 이점을 제공한다:
바람직하게는, 상기 방법은 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하는 단계; 및/또는 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 방법은 추가적인 광 검출기를 제공하는 단계, 및 상기 추가적인 광 검출기를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 정적 산란광을, 바람직하게는 상기 용기의 종축에 대한 각도 φ로 (상기 φ는 바람직하게는 10도와 150도 사이, 더욱 바람직하게는 10도와 60도 사이의 각도임)측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 작은 샘플 볼륨을 수용하기 위한 용기는 모세 및/또는 다중 웰 플레이트와 같은 작은 용기이다. 바람직하게는, 상기 모세관은 모세관 샘플 용기 또는 단지 모세관 또는 모세이다. 본 발명의 모세관은 바람직하게는 실질적으로 일관된 내경 및/또는 실질적으로 일관된 외경을 상기 모세관의 전체 길이에 걸쳐서 포함한다. 바람직하게는, 상기 모세관은 유리로 이루어져 있으며 바람직하게는 자가형광성 특성이 없거나 작은 유리, 예를 들면 붕규산염 유리 및/또는 수정 유리 및/또는 합성 용융 실리카이다.
상기 모세관은 바람직하게는 둥근 단면을 가지고 바람직하게는 0.1mm와 1mm사이의 내경을 가지며 바람직하게는 0.15mm와 0.5mm사이의 내경을 가지며, 바람직하게는 0.2mm와 1.2mm사이의 외경을 가지며 바람직하게는 0.65mm와 1mm사이의 외경을 가지며, 그리고 바람직하게는 5mm와 70mm사이의 길이를 가지며 바람직하게는 32mm와 50mm사이의 길이를 가지며, 더 바람직하게는 약 50mm의 길이를 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 직경에 기반하여 상기 모세관의 벽의 두께 사이를 충분히 크도록 타협을 선택하는 것이 더 바람직하며, 따라서 수동적으로 다루어질 수 있게 안정적이고 원하는 범위내에서 광학적 굴절을 최소화하도록 충분히 얇도록 하는 것이다. 모세관벽의 바람직한 두께는 따라서 개별 요구사항에 따라 선택될 수 있으며, 예를 들면 수동적 핸들링, 자동적 핸들링 등이다.
또한, 적용에 따라서, 짧거나 긴 모세관이 이로울 수 있다. 상기 모세관의 길이에 기반한 효과는 바람직하게는 원하는 적용에 따라 선택된다. 매우 짧은 모세관이 예를 들면 이들이 매우 작은 부피를 갖는다는 이점을 갖고, 이는 작은 양의 재료가 필요하다는 점에서 이득이다(효율). 매우 짧은 모세관은 모세관힘에 의해 완전히 유리하게 채워질 수 있다 (이들이 대응하는 적응된 직경을 가질 때). 이들이 충분히 짧을 경우, 상기 모세관은 중력(g)에 대하여 기울어질 필요조차 없는데 이는 모세관힘 자체가 완전히 상기 모세관을 중력 g에 역평행으로 채우기 때문이다. 짧은 모세관은 또한 공간에 대해서도 이점을 갖는다; 따라서, 많은 모세관이 한정된 표면에 배치될 수 있다.
긴 모세관은 한쪽 또는 양쪽 단부의 밀봉이 필요하지 않다는 이점을 제공하며, 예를 들면 상기 용액의 증발이 본 발명에 따른 측정 시간에 비하여 적다는 효과이다. 예를 들면, 32mm보다 긴 모세관은 본 발명의 바람직한 측정 시간동안 낮은 증발율을 제공한다.
바람직하게는, 복수의 용기가 제공되며, 각 용기는 용해된 입자의 샘플을 포함하며, 용해된 입자의 특성은 본 발명의 방법에 따른 각 용기에 대해 측정되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 각 용기에 대한 형광성 측정이 각 용기에 대한 DLS 측정에 선행하거나; 또는 각 용기에 대한 상기 DLS 측정이 각 용기에 대한 상기 형광성 측정에 선행하거나; 또는 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정은 상기 복수의 용기 중 하나에 수행되고 후속하여 상기 복수의 용기 중 다른 용기에 대하여 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정이 뒤따르는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 복수의 용기의 각 용기에 대해 형광성 측정은 DLS 측정과 함께 동시에 수행된다.
바람직하게는, 상기 특성은 입자 크기 분포, 응집(aggregation) 온도, 용융 온도, 전이 온도, 언폴딩(unfolding) 온도 개시, 액상 분리 (TLLPS) 기복 표면 자유(free folding) 에너지, 제 2 비리알 계수(B22), 입자의 자기상호작용, 콜로이드 안정성, 유체역학적 반경, 입자간에 밀거나 당기는 상호작용 (kD), 용해도, 장기 단백질 안정성 및 임계 변성제 농도로 이루어진 집단으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
예를 들면, 언폴딩/올리고머화/응집에 대한 크기 증가 개시 (반경부터 온도측정까지) 특성을 결정하는 것은 응집의 개시와 대조하여 유도가능하다.
언폴딩의 활성화 에너지는 유도가능할 수 있으며, 예를 들면 다양한 가열속도를 가진 후속적 실험으로부터 그리고 콜로이드 안정성을 평가하기 위한 어플리케이션일 수 있다.
본 발명은 용해된 입자의 특성을 측정하기 위한 기기에 추가적으로 관한 것이며, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라, 상기 기기는 상기 용해된 입자의 샘플 (상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 가짐) 을 포함하는 용기를 수용하는 수단; 단색 광원 및 광 검출기; DLS 측정을 수행하는 수단; 제어 수단: (상기 제어 수단은, 적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단을 제어하고; 상기 단색 광원으로부터 상기 적어도 하나의 용기까지 광을 송신하기 위한 상기 단색 광원을 제어하고; 상기 적어도 하나의 용기로부터의 신호를 검출하기 위한 상기 광 검출기를 제어하고; DSL 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응됨) ;을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는 상관 연산, 바람직하게는 자기상관 연산을 수행하기 위한 수단 (상기 자기상관 연산은 바람직하게는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에 구현된 자기상관연산 로직임)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 상기 광 검출기로부터 취득된 신호를 디지털화하기 위한 수단 (상기 수단은 바람직하게는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)를 포함하며, 상기 제어 수단은 상기 광 검출기로부터 취득되는 신호를 디지털화하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응됨) 을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 상기 용해된 입자의 상기 샘플을 수용하기 위한 상기 수단을 위치시키기 위한 포지셔닝 수단 (상기 제어 수단은 상기 샘플을 수용시키기 위한 상기 포지셔닝 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 온도 제어 시스템 (상기 제어 수단은 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 상기 온도 제어 시스템을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 상기 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 추가적인 광 검출기; 및 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 기기는: 단일 모드 광섬유; 및 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위의 태양과 다른 태양, 특징 및 장점은 동봉된 도면과 결합되어 기술된 다음 설명에서 더욱 명백해질 것이다.
도 1: a) 메인 광선 빔의 모세관축에 대한 각도. b) DLS 광학은 반사의 검출을 피하도록 상기 모세관축에 비스듬히 위치한다.
도 2: 파고 선별기의 기능.
도 3: 아날로그 신호의 신호 강도 위로 표시된 광자 계수 신호의 신호 강도 (파선은 선형 범위의 추론 핏을 표시한다).
도 4: a) 광자 계수와 아날로그 데이터간에 교환되는 입력을 갖는 상관자를 갖는 신호 플랜. b) 하나는 아날로그 모드, 다른 하나는 광자 계수 모드인, 두 평행 주행 상관자를 갖는 신호 플랜.
도 5: 본 발명에 따른 측정 시스템의 개략도
도 6: a) DLS 광학의 개략도. b) 두 분광 렌즈를 갖는 DLS 광학의 CAD 모델의 일부(섹션도).
도 7: a) 하나의 여기와 2개의 검출기를 갖는 DLS 광학의 개략도, 예를 들면 멀티모드 광섬유를 갖는 포토다이오드와 단일모드 광섬유를 갖는 PMT. b) DLS 광학의 공초점의 버전. c) 결합된 형광 광학 및 DLS 광학 공초점 (x-거리=0). d) 자유 공간 결합 광원을 갖는 DLS 광학의 설계. e) 렌즈 후드를 갖는 DLS 광학의 설계, 비점수차 보정, 형광성 차단 필터 및 편광 필터. f) 한 시점의 동시 측정을 위해 2개의 DLS 아암과 하나의 공초점의 형광성 광학을 갖는 DLS 광학의 설계. g) 대물렌즈 없이 2개의 아암을 갖는 DLS 광학의 설계.
도 8: a) 아세트산 나트륨 버퍼에서 IgG의 온도상의 입자 크기 분포 및 형광성 시프트의 결합 측정. b) 아세트산 나트륨 버퍼에서 IgG의 온도상의 평균 입자 크기 및 형광성 시프트의 결합 측정. c) HEPES 버퍼에서 IgG의 온도상의 입자 크기 분포 및 형광성 시프트의 결합 측정. d) HEPES 버퍼에서 IgG의 온도상의 평균 입자 크기 및 형광성 시프트의 결합 측정.
도 9: 다양한 샘플의 DLS 정성 파라미터의 예시적 요약
도 10: 측정 위치의 기능으로서의 붕괴율의 표시 (상기 입자 반경에 반비례). 백색 원은 상기 분석된 측정 위치를 부호화한다.
도 11: 본 발명의 바람직한 실시예의 개략도
도 12: 예시적 단백질 분자량 분포 (유니프롯, 인간; https://smith.chem.wisc.edu/content/proteomics-technologies).
도 13: 본 발명에 따른 기기와 발명을 사용하여 특성화될 수 있는 예시적 단백질의 개략도 (http://book.bionumbers.org/how-big-is-the-average-protein/).
도 14: 상기 용기 안에서 최적 측정 스팟을 결정하도록 용기 안에서 다양한 위치에서 DLS 측정의 상기 신호 품질을 도시한다.
도 15: 항체 버퍼 스크린의 측정 및 항체 후보 선택.
도 16: 항체 버퍼 스크린의 추가적 측정 및 항체 후보 선택.
도 17: 항체 버퍼 스크린의 추가적 측정 및 항체 후보 선택.
도 18: 랜덤 응집을 갖는 예시에 기반한 응집 경로를 이해하기 위한 측정
도 19: 구조화된 응집을 갖는 예시에 기반한 응집 경로를 이해하기 위한 추가적인 측정
도 1: a) 메인 광선 빔의 모세관축에 대한 각도. b) DLS 광학은 반사의 검출을 피하도록 상기 모세관축에 비스듬히 위치한다.
도 2: 파고 선별기의 기능.
도 3: 아날로그 신호의 신호 강도 위로 표시된 광자 계수 신호의 신호 강도 (파선은 선형 범위의 추론 핏을 표시한다).
도 4: a) 광자 계수와 아날로그 데이터간에 교환되는 입력을 갖는 상관자를 갖는 신호 플랜. b) 하나는 아날로그 모드, 다른 하나는 광자 계수 모드인, 두 평행 주행 상관자를 갖는 신호 플랜.
도 5: 본 발명에 따른 측정 시스템의 개략도
도 6: a) DLS 광학의 개략도. b) 두 분광 렌즈를 갖는 DLS 광학의 CAD 모델의 일부(섹션도).
도 7: a) 하나의 여기와 2개의 검출기를 갖는 DLS 광학의 개략도, 예를 들면 멀티모드 광섬유를 갖는 포토다이오드와 단일모드 광섬유를 갖는 PMT. b) DLS 광학의 공초점의 버전. c) 결합된 형광 광학 및 DLS 광학 공초점 (x-거리=0). d) 자유 공간 결합 광원을 갖는 DLS 광학의 설계. e) 렌즈 후드를 갖는 DLS 광학의 설계, 비점수차 보정, 형광성 차단 필터 및 편광 필터. f) 한 시점의 동시 측정을 위해 2개의 DLS 아암과 하나의 공초점의 형광성 광학을 갖는 DLS 광학의 설계. g) 대물렌즈 없이 2개의 아암을 갖는 DLS 광학의 설계.
도 8: a) 아세트산 나트륨 버퍼에서 IgG의 온도상의 입자 크기 분포 및 형광성 시프트의 결합 측정. b) 아세트산 나트륨 버퍼에서 IgG의 온도상의 평균 입자 크기 및 형광성 시프트의 결합 측정. c) HEPES 버퍼에서 IgG의 온도상의 입자 크기 분포 및 형광성 시프트의 결합 측정. d) HEPES 버퍼에서 IgG의 온도상의 평균 입자 크기 및 형광성 시프트의 결합 측정.
도 9: 다양한 샘플의 DLS 정성 파라미터의 예시적 요약
도 10: 측정 위치의 기능으로서의 붕괴율의 표시 (상기 입자 반경에 반비례). 백색 원은 상기 분석된 측정 위치를 부호화한다.
도 11: 본 발명의 바람직한 실시예의 개략도
도 12: 예시적 단백질 분자량 분포 (유니프롯, 인간; https://smith.chem.wisc.edu/content/proteomics-technologies).
도 13: 본 발명에 따른 기기와 발명을 사용하여 특성화될 수 있는 예시적 단백질의 개략도 (http://book.bionumbers.org/how-big-is-the-average-protein/).
도 14: 상기 용기 안에서 최적 측정 스팟을 결정하도록 용기 안에서 다양한 위치에서 DLS 측정의 상기 신호 품질을 도시한다.
도 15: 항체 버퍼 스크린의 측정 및 항체 후보 선택.
도 16: 항체 버퍼 스크린의 추가적 측정 및 항체 후보 선택.
도 17: 항체 버퍼 스크린의 추가적 측정 및 항체 후보 선택.
도 18: 랜덤 응집을 갖는 예시에 기반한 응집 경로를 이해하기 위한 측정
도 19: 구조화된 응집을 갖는 예시에 기반한 응집 경로를 이해하기 위한 추가적인 측정
하기에서, 본 발명의 일반적인 원칙은 추가적으로 논의되고 본 발명의 바람직한 실시예 또는 도시된 예시에 기반하여 상세하게 논의될 것이다.
특히, 본 발명은 제 1 태양에 따르면 용해된 입자의 특성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: 상기 용해된 입자의 샘플 (상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 가짐) 을 포함하는 용기를 제공하는 단계; 단색 광원 및 광 검출기를 제공하는 단계; 단색 광원으로부터의 광을 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 송신하는 단계; 상기 용기로부터 방사된 광을 상기 광 검출기로 검출하는 단계; 및 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성을 DLS(동적 광산란) 측정에 기반하여 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 알려진 DLS 측정은 이제 매우 작은 샘플 부피로 수행된다는 이점을 제공하는데, 예를 들면 선행기술에 의해서는 모세관 안에서의 샘플의 DLS 측정은 절대 개시되지도 제안되지도 않았었다. 오히려, 선행 기술은 상기 언급한 샘플 프로브보다 바람직하게 더 큰 부피를 DLS 측정은 요구한다고 교시한다. 또한, 본 발명의 방법은 높은 처리량으로 정밀한 측정 결과가 취득될 수 있다는 이점이 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하며, 이는 상기 방법에 의해 취득된 DLS 및 나노-DSF 측정에 기반하여 입자 크기 분포 및 잠재적 입자 응집이 빠르고 정확한 방법으로 평가될 수 있다는 이점이 있으며, 바람직하게는 단일 기기 안에서 평가될 수 있다는 이점이 있다. 본 발명의 방법에 따라 수행된 측정의 정밀성을 증가시키기 위해, DLS 측정 및 바람직하게는 나노-DSF 측정과 같이, 상기 방법은 바람직하게는 상기 용기의 위치를 결정하도록 형광석을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 용해된 입자의 (자가)형광성 및/또는 상기 용기의 자가형광성이 사용될 수 있으며, 그렇게 취득된 형광성 신호를 이용하여 상기 용기의 위치가 결정될 수 있다. 따라서, 연구에서 상기 용해된 입자를 갖는 샘플을 포함하는 상기 용기의 위치는 완전히 정확하게 결정될 수 있고 선택적으로 각 측정의 정확성을 최적화하기 위해 상기 용기를 (재)위치시키는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 방법은 방사된 단색광을 사용하여, 따라서 산란광을 사용하여, DLS 측정을 위해, 고민감도로 작은 샘플 부피의 경우에도 용해된 입자의 특성을 측정하기가 매우 유리하다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 자동적으로 수행된다.
DLS는 용해된 입자의 이동성의 측정인 확산 계수를 갖는 입자의 확산 계수를 분석하기 위해 사용되는 방법이다. DLS 측정에서는, 용해된 입자를 포함하는 용기 안의 샘플에 단색광이 방사되고 산란광의 강도가 기정의된 각도로 검출된다. 입자로 가는 단색광의 경로 길이와 상기 검출기로 가는 산란광의 경로 길이는 상기 용기 안에서 각 입자의 위치에 따라 다르다. 상기 샘플에 포함된 다양한 입자의 상기 산란광의 상기 광 파동을 겹쳐서, 샘플 특정 간섭 패턴이 검출된 광에 기반하여 취득될 수 있다. 결과적으로, 상기 검출된 신호의 강도는 상기 용기 안의 상기 입자의 위치와 그들의 이동에 종속되며, 즉 브라우니안 분자 이동/운동으로, 광 경로의 길이를 변경 그리고 따라서, 상기 취득된 간섭 패턴을 변경하는 것이다. 예를 들면, 입자가 빠르게 이동할수록 신호의 강도 역시 빠르게 변하며 그 결과로서 높은 확산 계수를 초래한다. DLS측정에 기반하여 샘플에 포함된 용해된 입자의 확산 계수를 결정하는 것은 유리한데 이는 예를 들면 수화 겉층을 포함하는 입자의 유체역학적 반경을 결정하는 것에 사용될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법을 적용하여 작은 입자조차도, 0.1nm부터 3000nm까지의 범위의 유체역학적 반경을 갖는 입자와 같은, 바람직하게는 0.5nm부터 1000nm까지의 범위, 2부터 3000nm, 작은 입자도 검출될 수 있고 고민감도 및 정확도로 특성화될 수 있다.
입자는, 그 특성이 본 발명에 따른 방법을 사용하여 그 특성이 측정될 수 있는 것으로, 자연적으로 발생할 수 있고, 생화학적으로 및/또는 합성적으로 개질된 입자 및 합성 입자 또는 그 조합일 수 있다. 바람직하게는, 1000nm 이하의 평균 직경을 갖는 입자, 바람직하게는 0.1nm에서 700nm, 더 바람직하게는 1nm에서 500nm을 갖는 입자. 입자는 적어도 부분적으로 또는 완전히 생물학적인 입자 (또는 바이오입자로 지칭)이며, 따라서, 상기 용어 "입자"는 바람직하게는 그을음, 금 입자 등을 지칭하지 않는다. 금 입자를 포함하는 후자의 예시는 바람직하게는 연구에서 예를 들면 본 발명에 따른 방법을 선행하는 준비 단계 및/또는 샘플 처리 단계에서 그 자체로서는 상기 샘플에 포함되어 있지도 않고 거기에 부가되지도 않는다. 샘플 안에서 이들의 존재는 유리하지 않은데 이들은 바이오입자에 비해 광을 상대적으로 강하게 산란시키기 때문이며, 따라서 이들은 연구중인 (바이오)입자로부터의 산란광 신호를 가릴 수 있다. 소위 말하는 "프로브 입자"가 샘플에 부가되지 않는 것이 바람직하며, 이는 상기 샘플은 그 천연형으로 연구되는 것이 바람직하기 때문이다.
본 발명의 문맥에서, 특히 청구항에서, 용어 "입자" 또는 "입자들"은 또한 비드에 관한 것이며, 특히 마이크로비드, 소낭, 미셀, 나노입자, 또는 분자, 특히 바이오분자, 예를 들면 (DNA, RNA, LNA, PNA와 같은) 핵산, 단백질, 및 기타 바이오고분자 및 그 조합 및 생물학적 세포 (예를 들면 박테리아, 전핵 또는 진핵 세포) 또는 서브-세포 프레그먼트, 바이러스적 입자, 바이러스유사입자 또는 바이러스 및 세포적 세포기관 등. 분자의 예는 하기에 제한되지 않지만, 형광성 염료, 펩티드, 특히 폴리펩티드, 당류, 특히 다당류, 화합물, 저분자, 프레그먼트 또는 계면활성제가 있다.
용어 "개질된 입자" 또는 "개질된 비드"는 특히 분자를 포함하거나 또는 분자, 바람직하게는 바이오분자, 또는 형광성 염료에 연결된 입자 또는 비드에 관한 것이다. 이는 또한 이와 같은 입자 또는 이들 (바이오)분자를 갖는 입자의 코팅을 포함한다.
본 발명에 따른 입자의 추가적 예시는 바이러스 입자, 바이러스유사입자, 세포 (특히 20000 nm보다 작은 직경을 갖는 세포), DNA 분자, RNA 분자, DNA-접기기술, 900 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자와 같은 저분자, 리포솜, 단백질, 예를 들면 올리고단백질의 경우와 같은 단백질 복합체, 및/또는 단백질 응집체, 여기서 입자의 유형은, 예를 들면 조사될 용액에 포함된 단백질의 유형은, 동일하거나 다를 수 있다. 바람직하게는, 상기 용해된 입자는 예를 들면 단백질 또는 그 형성된 복합체 및/또는 응집체의 동일한 유형이다.
바람직하게는, 연구에서의 상기 샘플은 제품의 생산 과정 중 또는 이후에 직접적으로 취득된다. 따라서, 상기 샘플은 바람직하게는 본 발명에 따른 방법을 적용하기 전에는 개질 및/또는 수정되지 않는다. 예를 들면 금 입자가 샘플에 부가될 경우, 결과적인 효과는 수행된 DLS, 및 바람직하게는 부가적 형광성, 측정(들)의 취득된 결과를 해석할 때 및/또는 처리할 때 고려될 것이다. 따라서, 연구에서 직접적으로 취득되고 추가적으로 수정되지 않은 샘플 안의 입자를 조사하는 것은 유리한데, 상기 용해된 입자의 특성에 대한 정보가 잠재적으로 시간 및/또는 비용소모 전-및/또는 후-처리 없이 취득될 수 있기 때문이다.
여기서, 용어 "단백질" 및 "올리고단백질"이 구체적으로 명시되지 않을 경우 대체가능하게 사용된다. 특히, 용어 "단백질"은 여기서 어떤 종류의 아미노산 서열이든 포함하며, 즉 각각 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산의 사슬을 말한다. 더 구체적으로, 용어 "단백질"은 여기서 어떤 관심 아미노산 서열이든 지칭한다. 바람직하게는, 상기 아미노산 서열은 적어도 5개의 아미노산의 길이를 갖고, 더 바람직하게는 10개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50, 100, 200 또는 500개의 아미노산이다. 따라서, 용어 "단백질"은 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 단백질 프레그먼트, 즉 알려진 단백질의 일부를 포함하며, 생물학적으로 활동적이거나 에피토프를 포함하는 항원적 부분과 같은 것을 포함한다. 단백질의 기능에 대해서는, 한계가 없다.
상기 입자의 집속 범위는 바람직하게는 단일 입자간의 것으로, 예를 들면 나노입자, 금 나노입자부터 500mM, 예를 들면 저분자의 경우까지 있다.
상기 용해된 입자는 바람직하게는 용해된 단백질이다. 하기 표1에 나타난 바와 같이 (다양한 질량의 단백질에 대하여 Rmin; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3055910/) 및 도 12에 나타난 바와 같이, 대부분의 단백질은 예를 들면 500kDa 분자량보다 작고 따라서 5nm보다 작은 반경 및/또는 10nm보다 작은 직경을 갖는다. 따라서, 바람직한 단백질은 5nm보다 작은 반경 및/또는 10nm보다 작은 직경을 갖는다. 더욱이, 일부 바람직한 예시는 도 13에서 도시된다.
| 단백질 M (kDa) | 5 | 10 | 20 | 50 | 100 | 200 | 500 |
| Rmin (nm) | 1.1 | 1.42 | 1.78 | 2.4 | 3.05 | 3.84 | 5.21 |
낮은 농도의 단백질의 예시는 리소자임의 경우 0.5 mg/ml, 인슐린의 경우 0.4 mg/ml, IgG의 경우 0.06 mg/ml이다. 단백질의 바람직한 농도 범위는 0.001 mg/ml부터 250 mg/ml이며, 더욱 바람직하게는 0.01 mg/ml부터 200 mg/ml이다.
단백질과 같은 입자는 생물학적 재료로부터 분리된 입자일 수 있으며, 예를 들면 시험관 단백질 생산에 사용된 세포 배양, 및/또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다. 후자의 경우 시간 및/또는 비용 효율적이고 관심 단백질의 높은 순도를 보장한다는 여러가지 이점이 있다. 바람직하게는, 용해된 입자는 동일한 단백질 또는 그 구성된 복합체 및/또는 응집체이며, 상기 단백질은 합성적으로 생산되었다. 따라서, 매우 정확하고 민감한 측정이 용해된 입자를 특성화하기 위해 취득된다.
용해된 입자의 여러 특성이 상업적 및 학문적 관심을 받는다. 예를 들면, 용해된 입자의 크기 분포는 특정 상태에서 단백질 불안정성으로 인한 분해 및/또는 응집된 단백질과 같은 원치 않는 입자의 양 및/또는 존재를 포함하는 용해된 입자 구성을 평가하기에 유리하다. 다양한 입자는 다양한 상태에서 응집할 수 있으므로, 주어진 입자에 대한 응집 상태는 상기 입자를 특성화한다고 평가될 수 있으며, 예를 들면 입자들의 온도는 주어진 부분에 노출될 수 있고, 예를 들면 응집되는 입자들의 절반 부분일 수 있다. 따라서, 상기 응집 온도는 응집(Tagg)의 개시를 정의하도록 사용될 수 있다. 동일한 원리가 상기 입자-특화 언폴딩 온도 개시를 통한 입자의 온도 종속 폴딩 및 언폴딩의 관점에서 적용될 수 있다. 상기 용융 온도/점(Tm)은 추가적인 관심사인데, 이는 단백질과 같은 입자의 잠재적 폴딩 상태 중 어느 것에서도 열역학적으로 다른 것보다 더 유리하지 않은 온도를 정의하는 것이다. 따라서, 상기 입자들은 양측 구성 모두로 존재하며, 즉, 천연적으로 폴딩된 형태 및 언폴딩된, 따라서, 변성된 형태로, 이는 비교가능한 양으로 존재한다. 상기 용융 온도는 따라서 입자의 열적 안정성의 표시자로서 사용될 수 있다. 더욱이, 기복 표면 자유(free folding) 에너지는 조사될 수 있고, 이는 단백질 안정성에 직접적으로 관련되며 단백질의 아미노산 구성에 종속된다. 상기 제 2 비리얼 계수 (B22, 또한 A2로 지칭)는 입자의 콜로이달 안정성의 표시자를 지칭하며, 이는 양수값을 갖는 단백질 응집을 예측하도록 추가적으로 사용될 수 있는 것으로, 대부분 음성 단백질-단백질 콜로이달 상호작용을 지칭하며 음의 값은 결과적으로 끌어당기는 단백질-단백질 상호작용을 나타낸다(kD; 확산 상호작용 파라미터).
따라서, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 측정될 수 있는 용해된 입자의 특성은 바람직하게는 입자 크기 분포, 응집(aggregation) 온도, 용융 온도, 전이 온도, 언폴딩(unfolding) 온도 개시, 기복 표면 자유(free folding) 에너지, 제 2 비리알 계수(B22), 입자의 자기상호작용, 콜로이드 안정성, 유체역학적 반경, 입자간에 밀거나 당기는 상호작용 (kD), 용해도, 장기 단백질 안정성 및 임계 변성제 농도로 이루어진 집단으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 언폴딩/올리고머화/응집에 대한 크기 증가 개시 (반경부터 온도측정까지) 특성을 결정하는 것은 응집의 개시와 대조하여 유도가능하다. 추가적으로, 언폴딩의 활성화 에너지는 유도가능할 수 있으며, 예를 들면 다양한 가열속도를 가진 후속적 실험으로부터 그리고 콜로이드 안정성을 평가하기 위한 어플리케이션일 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 수용액에 용해된 입자의 특성을 측정하도록, 용해된 상기 용액의 샘플을 포함하는 용기를 제공하여, 적용될 수 있고, 상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 갖는다.
따라서, 분석되는 샘플은 용해된 입자의 일부 또는 전부를 포함하여 조사되고, 상기 샘플은 용기에 포함된다. 용기가 예를 들면 모세관인 경우, 상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 갖고, 더욱 바람직하게는 1μL 와 15 μL 사이, 더욱 더 바람직하게는 8μL 와 12 μL 사이의 부피를 갖는다. 상기 용기가 예를 들면 다중 웰 플레이트인 경우, 상기 샘플은, 바람직하게는 상기 용기가 384 웰 플레이트인 경우 5μL 와 40μL 사이의 부피를 갖고, 바람직하게는 상기 용기가 96 웰 플레이트인 경우 50μL 와 200μL 사이의 부피를 갖고, 그리고 바람직하게는 상기 용기가 1536 웰 플레이트인 경우 1μL 와 15 μL사이의 부피를 갖는다. 이와 같은 작은 샘플 부피는 이용가능한 입자의 수가 한정 및/또는 연구중인 입자가 비쌀 때 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 방법을 사용하여 작은 샘플 부피를 분석하는 것은 적어도 다음 추가적 이점을 갖는다: i) 용기 벽 위의 산란을 더 잘 가린다, 즉, 측정 중 모세관벽과 같은 용기 벽 위의 광 산란의 효과가 최소화될 수 있다, ii) 연구중인 용해된 상기 입자를 포함하는 상기 샘플로부터의 산란 신호가 더 강하며 따라서, 측정 시간이 감소된다, iii) 샘플에 포함된 용해된 입자의 수에 종속된 높은 농도에서 다중 산란의 확률 감소, iv) 덜 비싼 단색 광원, 예를 들면 짧은 간섭 길이를 갖는 레이저가, 높은 품질의 측정 결과를 취득하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서, 연구중인 입자의 정확한 특성화가 가능하다.
연구중인 용해된 상기 입자를 포함하는 상기 샘플은 용기에 포함되며, 바람직하게는 모세관 또는 다중 웰 플레이트의 웰에 포함된다. 모세관의 경우, 상기 모세관은 예를 들면 수지, 플라스틱, 세라믹, 고분자 또는 유리로 이루어져 있다. 바람직하게는, 상기 모세관은 상기 모세관의 종방향으로 양 단부에서 개방된 단부를 갖고 있다. 바람직하게는 상기 모세관은 유리 모세관이다. 본 발명에 따른 방법의 정확성과 재생산성을 위하여, 용해된 상기 입자의 샘플을 포함하는 상기 용기로부터 방사되는 상기 광 신호에 기반한 DLS 측정에 영향을 줄 수 있는 신호적 소음 및 가공물을 줄이는 것이 유리하다. 따라서, 유리로 이루어진 용기가 이득인데 왜냐하면 유리는 광투과 및 산란에 수지 등 다른 재질에 비해 덜 영향을 주며 고온 및 산성 상태와 같은 극단적인 용액 상태에도 안정적이고 불활성이기 때문이다. 따라서, 상기 모세관은 바람직하게는 둥근 단면을 가지고 0.1mm와 1mm사이의 내경을 가지며 바람직하게는 0.15mm와 0.5mm사이의 내경을 가지며, 바람직하게는 0.2mm와 1.2mm사이의 외경을 가지며 바람직하게는 0.65mm와 1mm사이의 외경을 가지며, 그리고 바람직하게는 5mm와 70mm사이의 길이를 가지며 바람직하게는 32mm와 50mm사이의 길이를 가지며, 더 바람직하게는 약 50mm의 길이를 가지는, 유리 모세관인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 내경 및/또는 외경은 바람직하게는 모두 상기 모세관의 길이 전체에 걸쳐 일관된다. 이와 같은 모세관은 흔히 관 모세관이라고 호칭되어 모세관의 형태를 추가적으로 강조한다. 상기 모세관벽은 렌즈처럼 작용하며 따라서, 광학적 효과를 갖는다. 따라서, 상기 모세벽의 두께는 측정의 정밀성과 민감도에 영향을 줄 수 있다. 0.1mm와 1mm사이의 내경을 가지며 바람직하게는 0.15mm와 0.5mm사이의 내경을 가지며, 바람직하게는 0.2mm와 2mm사이의 외경을 가지며 바람직하게는 0.3mm와 0.7mm사이의 외경을 갖는 모세관의 사용은 정밀하고 민감한 측정을 취득하기 위해 바람직한 것이 발견되었다. 특히, 상기와 같이 정의된 내경은 연구중인 상기 샘플 안에서 광선 빔의 짧은 경로 길이를 보장하기에 유리하다; 추가적으로, 상기 용기 재질 (및 따라서 상기 샘플)과 상기 가열 부품간의 열전도는, 바람직하게는 실리콘으로 이루어지며, 작은 직경일 경우 더 좋다. 그러나, DLS측정에서는, 큰 직경이 더 좋은 것으로 간주된다.
본 발명의 방법에 따라서, 단색 광원이 제공되며, 바람직하게는 레이저와 같은 가간섭성 광원이 제공된다. 단색 광원은 단일 광학 주파수를 포함하는 광학적 방사를 묘사한다. 통상의 기술에서 알려진 바와 같이, 어떤 실제 레이저도 진짜로 단색이지 않고 모든 레이저는 일부 주파수의 범위로 광을 방사할 수 있으며, 이는 레이저 상전이의 선폭으로 알려져 있다. 다수의 레이저에서, 선폭은 확실히 좁다. 따라서, 본 발명은, 단순함 때문에, 단색광을 지칭한다. 단색광은 그 사용이 정의된, 일관된 측정 상태를 보장하므로 용해된 입자를 특성화하기에 특히 유리하며, 따라서, 정밀하고 매우 정확한 분석을 보장한다.
바람직하게는, 상기 단색 광원으로부터의 상기 광은 500nm보다 작은 파장을 갖고, 더 바람직하게는 350nm과 500nm, 더욱 더 바람직하게는 405nm, 445, 또는 488nm의 파장을 갖는 것을 특징으로 한다. 445nm, 405nm 또는 488nm과 같은 500nm보다 작은 파장에서 측정하는 것은 저렴한 레이저와 덜 복잡한 레이저가 사용될 수 있어서 결과의 고품질을 유지하는 동안 비용을 감소시키는 이점이 특히 있다. 더욱이, 445nm, 405nm 또는 488nm과 같은 500nm보다 작은 파장을 갖는 단색 광원으로부터의 광을 사용하는 것은, 강한 산란광 신호 및 대부분의 단백질을 포함하는 대부분의 입자의 낮은 흡수를 초래하는 이점을, 500nm 이상의 파장을 갖는 단색 광원으로부터의 광을 사용하는 것에 비해서 갖는다.
단색광은 레이저에 의해 제공될 수 있으며, 상기 레이저는 바람직하게는 다이오드 레이저, 바람직하게는 주파수 안정화 다이오드 레이저, DPSS 레이저, PPLN 주파수 더블 다이오드 레이저, 주파수 체배 DPSS 레이저, 다이오드 펌프 광섬유 레이저, 주파수 체배 다이오드 펌프 광섬유 레이저 및 다이오드 펌프 업컨버전 광섬유 레이저로 이루어진 집단으로부터 선택된 다이오드 레이저인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 레이저는 1mW와 200mW사이의 전력, 바람직하게는 10mW와 100mW사이, 더 바람직하게는 45mW와 80mW사이, 더욱 더 바람직하게는 50mW와 70mW사이인 것을 특징으로 한다.
단색 광원은 그 간섭 길이에 의해 특성화될 수 있다. 상기 간섭 길이는 경로 길이의 최대차, 또는 주행 시간으로, 같은 단색 광원으로부터의 두 광선 빔이 가질 수 있는 것으로 그로 인해 그들이 겹쳐질 때 안정적 간섭 패턴이 생성되는 것이다. 간섭 패턴은 간섭 효과의 결과로서 일어날 수 있으며, 이는 광의 다양한 경로 길이 및/또는 주행 시간으로 인해 상기 검출기에 도착하는 광 파장의 위상차에 의해 야기될 수 있다. 상기 단색 광원은, 바람직하게는 레이저이며, 바람직하게는 적어도 0.1mm의 간섭 길이를 갖는다.
본 발명의 방법에 따라서, 연구중인 용해된 상기 입자를 포함하는 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 단색 광원으로부터의 광, 바람직하게는 레이저가 송신된다. 따라서, 광은 바람직하게는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성화하기 위해 연구중인 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 레이저로부터 광선 빔으로서 송신된다. 여기서, "광," "광선 빔," 및 "빔"은 교환가능하게 사용된다.
광은 여러 수단에 의해 전달될 수 있다. 바람직하게는, 상기 단색 광은 상기 단색 광원으로부터 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 단색 광은 레이저로부터 레이저 파장 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 것, 예를 들면, 레이저 파장 편광 유지 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 것을 특징으로 한다.
상기 단색 광원으로부터 상기 용기로 송신된 상기 단색 광은, 즉 상기 송신된 단색 광은, 바람직하게는 대물 렌즈를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 초점이 맞춰지는 것을 특징으로 한다. 더욱이, 상기 용기로부터 방사되는 상기 광은 바람직하게는 상기 대물 렌즈에 의해 또한 집광된다. 상기 대물 렌즈는 바람직하게는 10mm와 200mm사이의 초점거리를 갖는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 송신된 단색 광은 3 μm와 30μm사이의 반값 전폭(FWHM)을 갖는 초점을 갖는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 그 결과로서 상기 샘플 부피보다 더 작은 측정 체적이 된다. 특히, 본 발명에 따른 상기 방법을 사용하여 조사될 수 있는 측정 체적은 바람직하게는 0.01nl과 0.1nl사이의 측정 체적, 바람직하게는 0.01nl과 0.02nl사이, 더욱 바람직하게는 약 0.016nl의 측정 체적으로 되는 것을 특징으로 한다.
따라서, 폭넓은 구멍을 통해 강력한 레이저로부터 단색 광이 제공되는 것이 특히 바람직한데, 예를 들면 0.5mm와 10mm 사이, 바람직하게는 1mm와 5mm 사이의 폭을 갖는 구멍이며, 상기 광은 405nm, 445nm, 또는 488nm의 파장을 갖고, 대물 렌즈를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 초점이 맞춰지는 것을 특징으로 한다. 따라서, 예를 들면 초당 약 1백만 광자 검출이 상기 용기로 송신된다. 이와 같은 경우에서, 용해된 입자의 특성을 측정하기 위한 방법은 통상의 기술에서 알려져 있다. 정확한 결과를 보장하기 위해, 상기 방법은 예를 들면 상기 광원과 상기 용기 사이에 위치한 광학 필터를 사용하여 상기 용기로 송신되는 광의 양을 감소시키도록, 및/또는 용해된 입자의 농도를 감소시키기 위한 상기 샘플을 희석시키는 단계를 포함하여 방사되는 광의 양을 감소시키도록 한다. 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 샘플을 희석시키거나 그와 같은 필터를 사용하지 않고도 하기 설명되는 바와 같은 적어도 2가지 다른 분석 모드를 제공하여 적용될 수 있다(cf. 출력 신호를 처리하고 취득하는 것의 상세한 설명)
고품질로 상기 용해된 입자를 특성화하기 위해, 상기 광이 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 얼마나 정확하게 송신되었는지 또한 더 관련이 있다. 더 구체적으로, 상기 용기로부터 반사의 검출을 피하도록 상기 모세축에 옵틱(optic)을 비스듬히 위치시키는 것이 유리하다. 따라서, 상기 단색 광원으로부터의 광은 바람직하게는 상기 용기로, 예를 들면 상기 모세관으로 기정의된 각도로 송신된다. 특히, 상기 단색 광원으로부터의 광은 바람직하게는 상기 용기의 종축, 예를 들면 모세관의 종축으로 각도 φL로 상기 용기로 송신되며, 여기서 φL은 바람직하게는 0도와 45도 사이의 각도이다.
본 발명의 방법에 따르면, 광 검출기가 더 제공되며 상기 용기로부터 방사되는 광을 검출하기 위해 사용되며, 상기 용기로부터 방사된 광은 상기 용기, 예를 들면 모세관으로부터 산란되는 광을 지칭한다. 더욱이, 상기 방사된 광은 바람직하게는 기정의된 각도에 검출된다. 따라서, 상기 광 검출기로 검출되는 광은 바람직하게는 상기 용기, 예를 들면 상기 모세관으로부터 방사되며, 상기 용기, 예를 들면 모세관의 종축에 각도 φD로 방사되며, φD는 바람직하게는 0도와 45도 사이의 각도이다. 바람직하게는 φL의 값은 φD의 값과 동일하다. 더욱이, 상기 단색 광원으로부터 상기 용기, 예를 들면 모세관으로 송신된 상기 광과 상기 용기, 예를 들면 모세관으로부터 방사되거나 산란된 상기 광, 여기서 상기 광은 상기 광 검출기로 검출된 것으로, 이 광 사이의 각도 φs는, 바람직하게는 0도와 150도 사이, 바람직하게는 10도와 150도 사이, 더 바람직하게는 10도와 60도 사이의 각도이다.
도 1a)에 예시적으로 나타난 바와 같이, 레이저와 같은 단색 광원으로부터의 광은 용기(11), 예를 들면 모세관(11)으로 송신될 수 있으며, 상기 용기는 연구중인 상기 용해된 입자(12)를 포함하는 샘플을 포함하며, 상기 용기(11)의 상기 종축(10)에 각도 φL(53)으로 여기 빔(50)으로서 상기 광은 송신될 수 있다. 상기 여기 빔(50)의 상기 광은 상기 샘플(12)에 포함된 연구중인 상기 용해된 입자에 의해 산란될 수 있으며, 따라서, 상기 용기(11)로부터 방사된다. 상기 방사된 또는 산란된 광은 상기 용기(11)의 상기 종축(10)에 각도 φD(20)에서 검출된 빔(51)로서 검출될 수 있다. 상기 여기(광) 빔(50)과 상기 검출(광) 빔(51) 사이의 각도는 φs (54)로 지칭되며 또한 상기 단색 광원으로부터 상기 용기(11)로 송신되는 상기 광과 상기 용기로부터 방사되어 상기 광 검출기로 검출되는 상기 광 사이의 각도로서도 묘사된다.
도 1B)에 예시적으로 나타난 바와 같이, DLS 옵틱스(15)를 위치시켜서 상기 여기 빔(50)이 상기 용기(11)의 종축(10)에 대한 각도 φL(53)에서 송신되도록, 예를 들면 상기 모세관축에 비스듬히 송신되어, 반사광 빔(19)의 검출을 피하도록 하는 것이 유리하며, 여기서 반사광 빔(19)은 상기 모세관(11)의 벽에 의해 반사된다. 도 1b)는 상기 각도(53')을 나타내며 이는 90도 - φL이다. 본 발명은 상기 여기 빔(50)이 초점(17)에 적절한 DLS 옵틱스(15)를 사용하여 초점이 맞춰지는 이점을 제공하며, 여기서 상기 초점(17)은 용기 내에 위치한다. 따라서, 적절한 결상 광학계를 사용하고 상기 모세관의 종축(10)에 대하여 적절한 각도로 상기 광을 방사하여, 상기 모세벽으로부터의 방해성 반사를 피할 수 있다. 바람직하게는 상기 광학계(15)와 상기 모세관(11) 사이에 어떤 광섬유도 필요하지 않으며, 그로 인해 상기 광학계(15)와 상기 모세관 사이의 작은 거리의 공기가 상기 광학계(15)와 상기 모세관(11) 사이의 상대적으로 쉬운 이동을 허용하며, 이는 짧은 시간 내에 측정되어야 하는 복수의 모세관의 경우 유리하다. 상기 모세관 내에 초점(17)을 배치하는 것은 작은 초점거리로 강하게 초점을 맞추는 것에 의해 달성될 수 있다.
특히, 상기 초점(17)이 작은 모세관 안에서 있도록 보장하기 위해, 본 발명은 상기 모세관의 위치의 개량된 측정을 위한 방법을 제공하며 선택적으로는 상기 측정 및/또는 후속적 측정을 위한 상기 위치 및/또는 상기 모세관을 재위치시키도록 피드백 제어를 제공한다. 또한, 본 발명에 따르면 측정이 용기 안 (어딘가에) 있을 것을 보장하도록 가능할 뿐만 아니라, 상기 용기 안 최선의 위치에서 측정하는 것이 더 바람직하다.
예를 들면, 상기 용기가 모세관일 경우, 이와 같은 모세관은 전형적으로 500μm를 갖지만, 그 크기는, 예를 들면 바람직한 위치의 직경은 약 50μm이다. 상기 언급한 초점 맞추는 수단으로, 10μm의 정확도가 달성가능하다. 상기 고정확성에 기반하여, 상기 용기/모세관의 지점이 정밀하게 결정될 수 있을 뿐만 아니라 상기 용기내 측정 체적 또한, 예를 들면 상기 용기의 "중앙" 어딘가에 위치한 부피로서 상기 용기 벽(들)로부터 일정 거리에 위치한 부피 또한 정밀하게 결정될 수 있다.
이 위치 또는 지점은 예를 들면, 약한 산란 샘플을 사용하여, 상기 용기/모세관 내 다양한 위치에서 다수의 DLS 측정을 수행하여 발견될 수 있다. 상기 바람직한 지점은 자기상관 기능의 가장 높은 SNR을 가진 하나이다(SNR = (acf의 진폭)/(적합한 잔류의 제곱의 합)). 예를 들면, 도 14는 다양한 색의 SNR의 다양한 값을 갖는 모세관의 스캔을 나타내며, 이는 예를 들면 원으로 표시된 영역을 측정 지점으로서 식별하도록 하는 것이다. 예시로서, 농도 2mg/ml의 리소자임 샘플을 사용하고 측정 시간이 200ms일 때 SNR의 전형적인 값은 50이다.
제공되는 광 검출기는 바람직하게는 광전(자) 증배관(PMT), 실리콘 광전(자) 증배관(SiPM), 또는 애벌란시 포토 다이오드(APD) 광자 계수 검출기다. 이와 같은 검출기의 무가공 출력 신호는 전형적으로 아날로그 출력 신호이며, 예를 들면 가변 전류 또는 전압으로, 이는 각각 가변 전압 또는 전류로 변환될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 가변 출력 신호는 바람직하게는 하기 상세하게 논의되는 바와 같이 추가적으로 처리된다. 대조적으로, 종래에는, DLS 측정은 APD 광자 계수 검출기를 사용해서만 한정되었다. 그러나, APD 광자 계수 검출기는 검출된 광의 강도가 약해야만 검출될 수 있다는 단점을 갖고 있다. 일부 최첨단 기기는 이 단점을 극복하려고 예를 들면 상기 광의 강도를 줄이는 추가적 필터를 사용하였고 이는 시간이 걸리며, 따라서, 처리량을 감소시킨다. 따라서, 이들 결점을 극복하기 위해 본 발명의 광 검출기는 바람직하게는 PMT또는 SiPM으로 하기 상세하게 논의되는 바와 같은 추가적인 이점을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 광 검출기에 의해 검출된 상기 광은 동적 광산란 측정에 사용될 수 있으며, 따라서, 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성이 DLS 측정에 기반하여 결정될 수 있다. 주어진 샘플에 대하여, 상기 DLS측정은 바람직하게는 5초 미만의 시간내에 취득되며, 바람직하게는 1초 미만의 시간내에, 바람직하게는 200ms에서 800ms, 더 바람직하게는 약 500ms의 시간내에 취득된다. 따라서, 연구중인 샘플의 적은 부피의 경우에도 분석의 높은 정확성과 민감도를 보장하면서도 높은 처리량이 보장된다.
상기 DLS 측정은 바람직하게는 적어도 하나의 상관 연산, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관 연산을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 자사상관 연산(또는 기능)은 특정 지연 시간 후 신호와 주어진 시간의 신호의 유사도를 평가하며, 여기서 강도의 변동은 작은 입자보다는 큰 입자에서 더 느리다. 따라서, 자가연산자는 특정 지연 시간 후 신호의 유사도를 묘사하는 정규화 자가연산 기능을 계산하며, 따라서, 시간에 대한 산란광의 강도 변동을 상관시켜 얼마나 가파르게 강도가 변동하는지 결정하도록 하며, 이는 입자의 확산 행동에 관련된다. 따라서, 적어도 하나의 상관 연산을 수행하는 단계는, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관 연산을 수행하는 단계는, 상기 검출기에 도달하는 상기 광 강도의 변동에 기반한 상기 용해된 입자의 확산 계수를 결정하기 위해 유리하다. 바람직하게는, 각 상관, 바람직하게는 자기상관, 기능(들)은 추가적인 분석을 위해 PC로 전송 및/또는 하드 디스크와 같은 저장 매체에 저장된다.
상기 DLS 측정은 바람직하게는 상기 광 검출기로부터 취득되는 아날로그 출력 신호를 취득하는 단계; 및 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 취득된 아날로그 출력 신호는 다양한 데이터 속도를 갖는 디지털 출력 신호로 디지털화될 수 있고, 바람직하게는 적어도 400MS/s의 높은 데이터 속도를 갖는다. 이는 제공된 광 검출기가 PMT 또는 SiPM인 경우 특히 유리한데, 이는 따라서 본 발명의 방법에 따라 계속 작업 중 사용될 수 있는 것이다.
바람직하게는, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계는: i) 바람직하게는 상기 용기로부터 방사되는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 미만일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 디지털 단일 광자 펄스 신호로 처리하는 단계; 및/또는 ii) 바람직하게는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 초과일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 아날로그 신호의 이산값으로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 이는 상기 취득된 아날로그 출력 신호가 상기 신호 강도 및/또는 샘플의 신호 강도 변동에 종속되어 처리될 수 있다는 이점을 갖고, 따라서 취득된 아날로그 출력 신호의 최적의 처리와 연구중인 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 최적화된 특성화를 보장한다는 이점을 갖는다.
특히, 연구중인 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로부터 방사되는 광자는 PMT와 같은 광 검출기에 의해 검출될 수 있으며 상기 취득된 아날로그 출력 신호는 바람직하게 디지털화된다.
따라서, 상기 용기로부터 방사되는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 미만일 경우, 상기 낮은 산란 샘플의 상기 디지털 신호는 바람직하게는 이산 신호로서 처리되며, 따라서, 디지털 신호로서 처리된다. 따라서, 상기 용기로부터 방사되는 개별 광자는 높은 정밀성으로 검출될 수 있다. 낮은 휘도 범위의 단일 광자를 계수하는 것의 이점은 모든 광자는 같은 에너지 함량을 갖는다는 지식에 기반하며 따라서 (모든) 기타 신호 부분은 신호로서 추정되거나 오프셋 드리프트 및/또는 이득 변동과 같은 기타 랜덤 요인에 의해 야기될 수 있다.
단일 광자는 예를 들면 파고 선별기를 사용하여 계수될 수 있다. 도 4a와 도 4b에 대해 추가적으로 상세히 논의된 바와 같이, 상기 검출기(30)로부터 (직접적으로) 오는 상기 아날로그 출력 신호는 디지털화되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 ADC에 의해 되는 것이 그렇다. 결과적인 디지털 출력 신호(39)의 예시는 도 2의 좌측에 나타난다. 특히, 상기 도시된 신호(39)는 PMT의 디지털 출력 신호이다. 또한 도 2에 예시적으로 나타난 바와 같이, 파고 선별기(32)는 예를 들면 디지털화 후 광 검출기로부터 취득된, 상기 디지털 출력 신호(39)를 이산화하기 위해, 광자 계수 임계값(36)과 같은 임계값을 적용하여 사용될 수 있다. 따라서, 상기 디지털 출력 신호가 상기 임계값(36)을 초과할 경우, 이산화된 신호는 생성되어 예를 들면 광자의 존재를 나타낸다. 달리 말하면, 디지털 출력 신호(39)는 디지털(단일) 광자 펄스 신호로서 처리된다. 상기 신호(39)는 상기 임계값을 초과하지 않으며, 상기 각 이산화 신호는, 예를 들면 광자의 부재를 나타낸다.
그러나, 상기 취득된 신호가 너무 밝아질 때 그리고 따라서, 너무 많은 광자 신호가 겹칠 때, 예를 들면 단일 광자 계수는 불가능하거나 거의 불가능하다. 이 경우, 상기 디지털 출력 신호는 바람직하게는 "아날로그 신호로서" 처리되며, 예를 들면 아날로그 신호의 이산값으로서 처리된다. 또한 달리 말하면, 상기 디지털 신호는 연속된 신호를 제공하며 이는 원본 아날로그 신호와 유사하게 처리될 수 있다. 본 발명에서, 이는 또한 상기 디지털 출력 신호를 이산값을 갖는 아날로그 신호의 이산값으로 처리하는 단계를 지칭한다. 후자의 선택지는 바람직하게는 상기 검출된 광의 강도가 특정 임계치를 초과할 경우 사용되며, 예를 들면 초당 200만 광자 검출 초과일 경우 또는 예를 들면 디지털화 후 양자화 깊이에 따라 각 휘도값 초과일 경우 사용된다. 상기 광 검출기가 SiPM일 경우, 디지털 출력 신호는 중간 휘도 레벨의 경우 디지털 신호로서 처리될 수도 있으며, 예를 들면 초당 200만 광자 검출과 초당 600만 광자 검출 사이의 상기 검출된 광의 강도의 경우, 광자 피크 영역의 이산화에 의해서 처리될 수도 있고 따라서, 실제 광자 검출의 양은 추산될 수 있다.
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계 및 상기 후속적으로 생성된 디지털 출력 신호를 처리하는 단계는 바람직하게는 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 디지털 출력 신호는 바람직하게는 디지털 단일 광자 펄스 신호로서 또는 아날로그 신호의 이산값으로서 처리된다. 상기 디지털 출력 신호를 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 어느 쪽에 따라 처리할 지 결정하기 위해 필드 프로그램가능 게이트 어레이(FPGA)가 바람직하게는 사용된다. 예를 들면 FPGA를 사용하는 것은, 광자 계수와 아날로그 연산 사이의 교환이 마이크로초 안에 수행될 수 있다. 따라서, 디지털 출력 신호를 상기 i) 단계에 따라 디지털 신호로서 처리할 지 결정하기 위해 걸리는 시간은 바람직하게는 1초 미만, 더 바람직하게는 최대 0.05초 미만, 예를 들면 FPGA를 사용했을 경우이다. 상기 FPGA의 알고리즘은 바람직하게는 FPGA 상의 "소프트웨어"의 일부 종류로서 바람직하게는 실행된다. 상기 데이터를 처리하기 위한 상기 알고리즘(소프트웨어)는 변경될 수 있으며, 예를 들면 갱신에 의해 변경될 수 있다. 달리 말하면, 소프트웨어 업데이트를 통한 상기 신호 처리의 사양/알고리즘의 변경은 쉽게 가능하다. 따라서, 하드웨어/검출기의 변경은 필요하지 않으면 이는 큰 이점을 제공한다.
본 발명에 따르면 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계에 따라 동시에 디지털 출력 신호를 처리하는 것이 또한 가능하다. 이와 같이, 상기 i) 단계 또는 상기 ii)단계 중 어느 쪽에 따라 처리할 지의 결정은 상기 측정 후 이루어질 수 있다.
상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 어느 쪽에 따라 상기 디지털 출력 신호를 처리할지 결정하는 것의 이점은 도 3에 예시적으로 나타나며, 이는 아날로그 신호의 신호 강도 위로 광자 계수 신호의 신호 강도를 묘사한 것으로, 파선은 선형 범위의 추론 핏을 표시한다. 간단히, PMT는 매우 낮은 전력을 갖는 LED를 사용하여 조사되며 신호는 몇 밀리초 내에 측정된다. 도 3에서 도시된 "아날로그 신호"는 상기 신호의 평균 값을 표현하며, 도시된 "초당 광검출" 신호는 광자 피크의 수를 각 측정 간격마다 계수하여 취득된 것이며, 1초로 비례 축소한 것이다. 이후, 상기 LED 전력은 증가되었고 상기 측정은 반복되었다.
따라서, 도 3에 나타난 바와 같이, 특정 방사 전력에서 더 많은 광자 피크가 겹쳐지고 분리된 피크로서 더 이상 인식되지 않았다. 더 구체적으로, 일부 지점에서 상기 광자 신호는 더 이상 상기 LED 전력에 비례적으로 증가하지 않았다. 종래의 DLS 기구는 광자 계수 범위 내에서 측정하며, 따라서, 신호가 너무 강할 경우, 즉 검출된 광자의 수는 너무 높게 될 경우, 상기 광선 빔 경로에 들어가는 필터를 포함한다. 대조적으로, 본 발명에 따른 DLS 측정은, 선형 오차가 예를 들면 5% 미만일 경우, 즉 상기 도 3에 나타난 예시에서 초당 약 3*106 광자 또는 20 카운트 평균 아날로그 신호일 경우, 디지털 출력 신호를 "광자 계수 신호"로서 분석하는 것을 포함하며, 반면 높은 전력에서 상기 디지털 출력 신호는 아날로그 신호로서 분석된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법과 기기를 사용하는 것은 감소된 DLS 측정 시간의 이점을 갖고, 따라서, 상기 서술된 바와 같이 강도 종속 신호 처리로 인해 증가된 처리량을 갖는다.
대안적으로, 양측 처리 선택지 모두 병렬로 적용될 수 있으며, 여기서 용어 "병렬"이란 "1ns 미만의 시간 오프셋을 갖고"로서 이해되도록 의도되었다. 이는 바람직하게는 예를 들면 2개의 프로세서를 병렬로 사용하여 달성된다(바람직하게는 같은 FPGA에서 합성된다). 따라서, 상기 디지털 출력 신호는 디지털 및 아날로그 신호로서 처리되며 상기 취득된 데이터는 저장될 수 있다. 이는 양측 처리된 디지털 출력 신호가 모두 저장될 수 있고 후속 단계에서 처리되는 이점을 갖는다. 따라서, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계, 및 상기 저장된 출력 신호의 하나를 더 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 방사된 광부터 상기 처리된 신호까지의 단계는 다음과 같이 짧게 요약될 수 있다. 상기 광섬유로부터 방사된 상기 레이저 광은 콜리메이터 렌즈를 통해 병렬로 향하여 대물 렌즈를 통해 상기 용기, 예를 들면 모세관 안으로 초점이 맞춰질 수 있다. 상기 산란광의 상기 빔 및 그에 따라 상기 용기로부터의 상기 방사된 광은, 같거나 또는 추가적인, 바람직하게는 같은 대물렌즈를 경유하여 초점이 맞춰져서, 추가적인 콜리메이터 렌즈를 통해서, 광 검출기로서의 상기 DLS 검출기의 광섬유로 그리고 이후 PMT에 의해 검출될 수 있다. PMT는 대부분의 경우 전류 출력을 가지므로, 반면 상기 아날로그/디지털 변환기(ADC)의 경우 전압 신호는 보통 요구되고, 증폭기는 상기 PMT와 상기 ADC사이에 배치되어 상기 PMT로부터의 상기 전류가 전압 신호로 변환되고 증폭될 수 있다. 상기 ADC는, 예를 들면 16비트 해상도를 갖는 디지털 신호 안으로, 예를 들면 40 MS/s (초당 4천만 샘플)의 샘플링 레이트로 상기 증폭된 전압 신호를 더 변환할 수 있다. 바람직하게는 상기 FPGA로 프로그램된 자기상관자가 실시간으로 사용되어 상기 강도 신호의 자기상관 기능을 계산하도록 할 수 있으며, 이는 이후 예를 들면 컴퓨터를 사용하여 평가될 수 있다.
더 상세하게는, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 도 4A) 및 B)를 참조하여 예시적으로 묘사된다. 따라서, DLS 측정에 사용되는 광 검출기, 즉 DLS 검출기 (30)은, 연구중인 샘플을 포함하는 용기로부터 방사되고 산란되는 광을 검출할 수 있다. 상기 DLS 검출기에 의해 취득되는 상기 아날로그 신호는 예를 들면 아날로그/디지털 변환기(ADC; 31)을 사용하여 바람직하게는 디지털 신호로 변환되며, 즉 디지털 출력 신호로 디지털화되며, 그리고 추가적으로 필드 프로그램가능 게이트 어레이(FPGA; 34)로 송신된다. 상기 FPGA(34)는 적어도 하나의 상관연산, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관연산을 수행하는 하나 이상의 상관자를 포함할 수 있다. 상기 FPGA(34)는 도 4A)에 예시적으로 나타난 바와 같이 하나의 상관자(33)를 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 FPGA는 바람직하게는 파고 선별기(32)를 더 포함하며 상기 상관자(33)에 대한 상기 입력 신호는 아날로그 데이터로서 다루어지는 디지털 데이터와 상기 파고 선별기(32)로부터 취득되는 광자 계수 데이터 사이에서 교환될 수 있다. 대안적으로, 상기 FPGA는 병렬로 주행하는 2개의 상관자(33)를 포함할 수 있으며, 하나는 아날로그 모드이며, 다른 하나는 도 4B)에 예시적으로 나타난 바와 같이 파고 선별기(32)에 의해 변환된 신호에 기반한 광자 계수 모드이다. 모든 경우에서, 상기 FPGA(34)에 포함된 상기 하나 이상의 상관자(33)의 출력은 바람직하게는 추가적인 분석을 위해 PC(35)로 전송 및/또는 하드 디스크와 같은 저장 매체에 저장된다.
따라서, 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 바람직하게는 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계; 및 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를, 바람직하게는 하드 디스크와 같은 저장 매체에 저장하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 형광성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 바람직한 형광성은 상기 형광성 측정에 사용되며, 상기 형광성은 바람직하게는 상기 입자의 자가형광성인 것을 특징으로 한다. 용해된 입자의, 형광성, 바람직하게는 자가형광성을, 측정하는 것은, 유리할 수 있다. 자가형광성의 부재는 용기의 누락 또는 형광성 또는 자가형광성 없는 빈 용기를 나타낸다. 이런 경우, (추가적) 측정, 즉 DLS 측정 및 바람직하게는 추가적 형광성 측정으로 나노-DSF 측정과 같은 것은, 생략될 수 있다. 따라서, 자가형광성의 존재 또는 부재에 대한 정보를 사용하는 것은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 용해된 입자를 특성화하기 위해 요구되는 시간을 줄이기에 유리할 수 있다. 또한, 신호 강도 및/또는 상기 검출된 자가형광성 신호의 신호 강도 패턴에 대한 정보가 취득될 수 있다. 이 유형의 정보는 특히 유리한데 그렇게 취득된 정보가 예를 들면 광으로 여기 시 및/또는 나노-DSF 측정 시, 형광성을 방사할 수 있는 용해된 입자를 갖는 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 위치를 결정하기 위해, 및/또는 금 입자와 같이 자가형광성 없이 오염물질을 포함하는 샘플을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 형광성은 바람직하게는 LED와 같은 추가적 광원을 제공하여 측정되며, 추가적 광원으로부터 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 광을 송신하여, 따라서 상기 입자의 자가형광성을 여기시키고, 상기 용기로부터 상기 방사된 광을 검출하는 것이다. 바람직하게는, 추가적 광원은 용해된 입자, 바람직하게는 용해된 단백질의 자가형광성의 여기를 위해 약 280nm의 파장을 갖는 광을 제공한다.
여기서, 용어 "형광성"은 전자기 방사의 방사의 형태로 에너지의 방출을 포함하는 전자기 방사를 지칭하며, 예를 들면 광자의 흡수에 의해 여기되는 입자의 경우가 있다. 더 구체적으로, 단백질과 같은 입자는 자가형광성을 보일 수 있으며, 또한 자기형광으로도 지칭되며, 이는 그들이 예를 들면 적어도 하나의 3개의 구체적 방향족 아미노산, 즉 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함할 경우이다. 단백질의 자가형광성은 트립토판에 의해 지배되며, 이는 타이로신 및 페닐알라닌에 비해 더 높은 흡광 계수를 갖는다. 흡광 계수는, 몰 흡수 계수로도 지칭되며, 희석의 측정을 지칭, 즉 매체에 의한 전자기적 방사의 소멸을 지칭, 그리고 상기 매체를 통해 경로 길이에 의해 영향을 받고 상기 용해된 입자의 농도에 의해 영향을 받으며, 약화는 산란 및 흡수에 의해 야기될 수 있다. 타이로신과 트립토판의 흡수 최대치는 트립토판에 비해 단백질과 같은 입자에서 그 위치상 방사된 파장의 낮은 종속을 나타내는 타이로신으로 약 280nm의 파장에 있다. 따라서, 단백질과 같은 입자의 자가형광성의 여기는 바람직하게는 광에 의해 이루어지며, 바람직하게는 약 280nm 또는 278nm의 파장을 갖는, 추가적 광원으로부터의 광에 의해 이루어진다. 예를 들면, 약 270nm에서 290nm, 그러나 예를 들면 278nm, 280nm 또는 285nm의 최대 강도를 갖는 LED가 효능을 개선하기 위해 바람직하다.
상기 용해된 입자의 형광성을 측정하는 단계는 도 5의 상부 패널을 참조하여 더 상세하게 예시적으로 서술된다. 도 5의 상기 상부 패널에 예시적으로 나타난 바와 같이, 모세관(11)과 같은 용기의 샘플(12)에 포함된 용해된 입자의 형광성은 예를 들면 기정의된 형광 초점(16)을 갖는 형광성 광학계를 사용하여 측정될 수 있다. 상기 용기 및/또는 상기 광학계(14)는 상기 용해된 입자(12)를 포함하는 상기 샘플의 형광성을 측정하기 위한 상기 용기 안에 상기 형광성 초점(16)이 위치하도록 포지셔닝될 수 있다. 형광성 측정 시, 상기 용기는 다른 위치로 이동되어 DLS 광학계(15)의 DLS 초점(17)이 DLS 측정을 수행하기 위한 상기 용기 안에 위치하도록 하며, 상기 형광성 초점 및 상기 DLS 초점은 기정의된 서로의 x-거리를 두고 위치한다. 대안적으로, 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 위치는 상기 형광성 및 상기 DLS 측정 중에 동일하게 남을 수 있고, 상기 형광 광학계(14)와 상기 DLS 광학계(15)는 따라서 상기 용기에 대하여 각각 위치한다. 따라서, 상기 용기, 예를 들면 모세관은, 바람직하게는 상기 광학계 (14 및 15)에 대하여 이동한다. 추가적 대안으로서, 양 측정 모두 동시에 수행될 수 있다.
상기 용기는 정확하고 재생산가능한 측정을 위해 DLS 광학계와 같은 광학계에 대하여 특별히 위치하므로, 측정간 상기 용기의 이동 시에도 정밀하게 위치시키는 것을 보장하기에 이는 유리하다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 상기 측정된 형광성에 기반하여 상기 용기의 위치를 결정하는 단계 및 선택적으로 상기 측정된 형광성 및 상기 결정된 용기 위치에 기반하여 상기 용기를 위치시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 샘플의 상기 위치는 상기 측정된 형광성에 기반하여 정확하게 결정될 수 있으며, 예를 들면 연구중인 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자 및/또는 상기 용기의 형광성에 기반하여 정확하게 결정될 수 있다. 이는 높은 처리량으로 여러 샘플이 측정되어야 할 때 특히 유리하다. 이 경우, 모세관 홀더 안에 흔히 배치되는 모세관을 갖는 기기의 수동적 채움은, 가능하지 않다. 더욱이, 높은 품질로 측정의 재생산가능한 결과를 취득하기 위해, 각 모세관에서 상기 측정 위치는 빠르게 위치되어야 한다. 이는 상기 DLS 측정과 병렬로 또는 그 전에, 바람직하게는 상기 DLS 측정과 병렬로 바람직하게는 수행되는 형광성 스캔에 기반하여 상기 모세관 위치를 결정하는 것에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들면 48개의 모세관은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 약 2초 안에 측정될 수 있다. 종래의 해결책은 모세관 홀더와 같은 샘플 컨테이너의 산란광 신호의 검출에 기반한다. 그러나, 형광성 측정으로부터 취득된 신호는 일반적으로 산란광으로부터 취득된 신호보다 강하다. 따라서, 이와 같은 형광성 스캔을 사용하는 것은 추가적으로 유리한데 이는 모세관의 더 정확한 위치시킴 및 선택적으로 (재)위치시킴을 상기 종래 해결책에 비하여 가능하게 하기 때문이다.
단백질과 같은 입자의 상기 열적 안정성은 용융 곡선을 사용하여 분석될 수 있으며, 이는 온도의 기능과 같은 형광성의 변화를 나타낸다. 더 구체적으로, 상기 용융 곡선의 1차 도함수를 형성하여, 상기 용융점 Tm, 즉, 상기 입자의 반이 변성되는 온도는, 결정될 수 있다. 따라서, 샘플은 온도 램프를 적용하여 예를 들면 15℃에서 95℃, 바람직하게는 20℃에서 90℃로, 분당 0.1℃와 분당 7℃ 사이의 가열 속도로 가열될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 용기를 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계는 분당 섭씨 0.01도와 분당 섭씨 30도 사이의 템퍼링 속도, 바람직하게는 분당 섭씨 0.1도와 분당 섭씨 10도 사이의 템퍼링 속도, 및/또는 상기 제 1 온도와 상기 제 2 온도는 섭씨 -20도와 섭씨 160도 사이에서 상기 용기를 템퍼링하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 나노 시차주사 형광측정법 (나노-DSF) 측정을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 나노-DSF 측정을 수행하는 것은 입자, 바람직하게는 단백질의 구성적 변화를 분석하기에 유리하다. 나노-DSF는 바람직하게는 LED와 같은 추가적 광원을 제공하여 측정되며, 추가적 광원으로부터 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 광을 송신하여, 상기 용기로부터 상기 방사된 광을 검출하는 것이다. 바람직하게는, 추가적 광원은 용해된 입자, 바람직하게는 용해된 단백질의 여기를 위해 약 280nm의 파장을 갖는 광을 제공한다. 형광성 측정을 수행하기 위한 상기 용기로 광을 송신하기 위한 상기 추가적 광원, 예를 들면 상기 용기의 포지셔닝의 결정을 위해서 및 나노-DSF 측정을 수행하기 위해 사용되는 것과 같은, 추가적 광원은, 각각, 동일한 추가적 광원 또는 다른 추가적 광원일 수 있다.
나노-DSF 측정은 단백질의 방사 스펙트럼의 종속 및 상기 단백질 내의 트립토판의 위치에 기반한다. 트립토판은 아로마틱 아미노산으로 대부분 그 천연형에서 단백질의 내부 부분에 위치한다. 그러나, 단백질이 예를 들면 변성으로 인해 그 천연형을 잃을 경우, 상기 단백질의 내부 부분은 더 극 환경에 노출된다. 트립토판의 상기 방사 스펙트럼은 그 환경에 종속되며, 단백질의 천연형의 손실은 그 결과로서 더 극 환경에 트립토판의 노출을 초래할 수 있으며, 이는 그 결과로서 비극성 환경에서 약 325 nm의 방사 최대치를 약 350nm의 긴 파장 범위로 옮기게 된다. 따라서, 트립토판의 환경-특화 방사 스펙트럼에 대한 정보는 단백질의 형태적 변화를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 단백질의 형광성은 약 280nm의 파장으로 여기될 수 있으며, 결과적인 방사는 약 350nm 및 330nm에서 검출되며, 약 350nm 및 330에서의 형광성의 강도에 기반하여 형성된 몫은, 통상적으로 변성으로 인해 증가한다. 단백질의 변성은 온도 증가를 포함하는 화학적 및/또는 열적 변성 상태로 인해 일어날 수 있다.
나노-DSF 측정은 바람직하게는 변동하는 온도에 입자를 노출시킬 때 수행되며, 예를 들면, 온도 램프를 사용하여 그리고 따라서, 연구중인 상기 용해된 입자를 포함하는 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)할 때 수행되는 것을 특징으로 한다. 이는 상기 입자가 노출된 온도에 따라 연구중인 용해된 입자의 형태적 변화에 대한 정보를 취득하기에 특히 유리하다.
본 발명의 방법 안으로 나노-DSF 측정의 편입은 예시적으로 도 5를 참조하여 더 상세하게 서술된다. 도 5의 상부 패널에 예시적으로 나타난 바와 같이, 모세관(11)과 같은 용기 안의 샘플(12)에 포함된 용해된 입자의 형광성은 예를 들면 기정의된 형광성 초점(16)을 갖는 나노-DSF 광학계와 같은 형광성 광학계(14)를 사용하여 측정될 수 있다. 상기 용기는 상기 용기, 예를 들면 모세관을 가열 및/또는 냉각할 수 있는 템퍼링 부품, 예를 들면 가열 패드/베드를 사용하여 템퍼링될 수 있으며, 상기 용해된 입자의 방사된 형광성은 DLS 및 나노-DSF와 같은 형광성 측정을 사용하여 주어진 온도에서 측정될 수 있다. 따라서, 상기 형광성 초점(16)이 상기 용해된 입자(12)를 포함하는 상기 샘플의 형광성을 측정하기 위한 상기 용기 내에 위치하도록 제 1 온도에서 템퍼링된 상기 용기는 위치한다. 형광성 측정 시, 상기 용기는 다른 위치로 이동되어 DLS 광학계(15)의 DLS 초점(17)이 DLS 측정을 수행하기 위한 상기 용기 안에 위치하도록 하며, 상기 형광성 초점 및 상기 DLS 초점은 기정의된 서로의 x-거리를 두고 위치한다. 대안적으로, 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 위치는 상기 형광성 및 상기 DLS 측정 중에 동일하게 남을 수 있고, 상기 형광 광학계(14)와 상기 DLS 광학계(15)는 따라서 상기 용기에 대하여 각각 위치한다. 추가적 대안으로서, 양 측정 모두 동시에 수행될 수 있다. DLS 및 형광성 측정이 주어진 온도에서 수행된 후 (도 5의 중앙 및 하부 패널에 나타난 바와 같음), 상기 샘플의 온도는 예를 들면 상기 용기에 근접하게 위치한 상기 템퍼링 부품(13)의 온도를 증가시켜서 증가된다. 상기 샘플이 제 2 온도에서 템퍼링되면, DLS 및/또는 측정의 다른 회차가 상기 서술된 바와 같이 수행될 수 있다. 따라서, 상기 용기에 포함된 상기 용해된 입자는 상기 용해된 입자를 포함하는 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 것 및 적어도 DLS 및 형광성, 바람직하게는 나노-DSF, 측정을 시점당 하는 것에 의해 상기 온도에 따라 특성화될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 후방 반사는 바람직하게는 LED와 같은 추가적 광원을 제공하는 것, 상기 샘플을 포함하는 상기 용기를 통해 상기 추가적 광원으로부터 광을 송신하는 것 및 예를 들면 상기 용기 아래의 거울에 의해 반사되는 광을 검출하는 것에 의해 측정된다 (cf. 예를 들면 도 11). 따라서, 상기 측정된 후방 반사된 광의 강도에 따라서 용기 및/또는 샘플이 존재 및/또는 정보가 상기 용기 및/또는 샘플의 위치 상에서 취득될 수 있는지 추론될 수 있다. 더 구체적으로, 예를 들면 상기 의도된 용기 위치 아래의 거울에 의해, 후방산란된 상기 측정된 광의 강도는, 용기가 제공된 경우보다 용기가 제공되지 않은 경우 더 강하다. 더욱이, 용기가 제공되면 상기 후방반사된 광의 강도는 빈 용기, 연구중인 입자가 없는 액체를 포함 및/또는 오염물질을 포함하는 용기 및 본 발명에 따른 샘플을 포함하는 용기 간에 각각 다르다. 따라서, 후방 반사를 측정하는 것은 용기 및/또는 샘플을 검출하는 것 및/또는 각 정확한 위치의 정보를 취득하는 것에 유리할 수 있다. 또한, 상기 샘플이 제공되고 적어도 부분적으로 응집될 경우, 광 검출기의 수용 콘 바깥쪽 방향의 상기 광의 상기 샘플 산란부에 포함된 응집된 입자는, 응집이 강할수록 상기 검출된 신호는 약하다. 따라서, 입자 응집의 강도 및/또는 존재에 대한 정보는 후방 반사를 측정하여 취득될 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 요구되는 시간을 줄이는 것 및 그 정확성을 증가시키는 것에 유리하다.
바람직하게는, 상기 추가적 광원은 용해된 입자, 바람직하게는 용해된 단백질의 여기를 위해 약 385nm의 파장을 갖는 광을 제공한다. 바람직하게는, 약 385nm의 파장의 광은 추가적으로 후방 반사 측정을 위해 검출된다. 원하는 파장의 LED 방사광이 바람직하며, 예를 들면 약 385nm의 최대 강도를 갖는 LED가 바람직하다. 형광성 측정, 나노-DSF 측정 및/또는 후방 반사 측정을 각각 수행하기 위한 상기 용기로 광을 송신하기 위한 상기 추가적 광원은 각각, 동일한 추가적 광원 또는 다른 추가적 광원일 수 있다. 후방 반사를 측정하는 것은 단백질과 같은 용해된 입자의 콜로이달 안정성을 조사하기에 유리하다.
후방 반사를 사용하는 분석을 위해, 상기 용해된 입자를 포함하고 샘플 홀더에 의해 들려 있는 샘플에 광선 빔, 예를 들면 385nm의 광선 빔이 방사되며, 그로 인해 상기 광선 빔은 상기 광원이 상기 용기 위에 위치하고 상기 샘플을 다른 시간에 가로지를 때 상기 용기 아래에 상기 템퍼링 부품의 재질에 의해 반사된다. 예를 들면, 규소로 이루어진 템퍼링 부품이 템퍼링 및 반사면 제공을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 입자 집단을 포함하는 큰 입자가 작은 입자보다 광을 더 강하게 산란시키므로, 상기 반사광은 큰 입자의 경우보다 더 강하게 감쇄된다. 따라서, 상기 반사광의 강도는 연구중인 샘플의 입자 집단을 포함하는 큰 입자의 존재에 대한 정성적 정보를 제공한다.
바람직한 실시예에 따라서, 템퍼링 부품은 규소(Si)로 이루어지며, 이는 특정한 이득을 제공, 예를 들면 규소는 매끈한 표면, 양호한 열 전도성, 양호한 기계적 및 화학적 안정성 및 양호한 반사도를 제공한다. 바람직하게는 템퍼링될 상기 용기는 상기 템퍼링 부품과 직접적으로 접촉한다. 규소는 또한 자가형광성을 갖지 않는데, 이 자가형광성은 본 발명에 의해 바람직하게 이루어지는 형광성에 의한 상기 용기의 포지셔닝 결정을 방해할 수 있다. 상기 규소 템퍼링 부품은 예를 들면, 실리콘 웨이퍼의 부분으로부터 형성될 수 있다. 추가적인 실시예에 따라서, 템퍼링 부품은 상기 용기에 접촉한 상기 표면이 같이 변경되어, 예를 들면 간섭 코팅을 갖고, 상기 후방 반사 및/또는 상기 형광성 측정을 위해 사용되는 상기 광의 파장을 반사하고 상기 DLS 측정을 위해 사용되는 상기 광을 반사하지 않도록 (예를 들면 흡수 및/또는 송신) 변경되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 반사도를 약 405nm, 바람직하게는 400nm ±10nm로 감소시키는 것이 바람직하다.
또한, 예를 들면 온도 램프 중 반사광의 강도 변화를 측정하여, 응집의 개시(Tagg)가 결정될 수 있으며, 이는 응집의 개시로 인해 상기 용해된 입자의 크기가 증가하는 온도를 나타낸다. 따라서, 후방 반사는 서술된 바와 같이 시간에 걸쳐 상기 용기를 템퍼링하는 동안 바람직하게는 측정되어, 콜로이달 안정성 및 용해된 입자의 온도유도 응집에 대한 정보를 취득하도록 한다.
더욱이, 다음 섹션에서 더 상세하게 설명되는 바와 같이 상기 후방 반사 기술 및 DLS의 조합으로부터 일어나는 유리한 효과가 있다. DLS와 후방 반사는 서로 잘 상호보완하며 본 발명의 방법 및 기기의 측정 범위를 상당히 연장할 수 있다. 특히, DLS의 사용은 "더러운"샘플에 한정되며, 예를 들면 흐린 것들인 반면, 후방 반사 기술은 이와 같은 샘플에 잘 작용한다. 다른 한편으로는, 상기 후방 반사 기술은 고품질로 작은 입자를 검출하기에 충분히 민감하지 않은 반면 고품질 측정이 DLS로부터 이와 같은 샘플에 대해 취득될 수 있다. 또한, 가끔 실제 활성 물질을 안정화시키기 위해 사용되는 많은 PEG 분자가 의약품 제형에서 있는데, 이들 분자는 그러나 강한 산란 신호를 야기할 수 있으며 DLS는 포화될 수 있고 따라서 "안 보이게" 될 수 있다. 따라서, 상기 후방 반사 측정은 "탁도"측정으로 비교될 수 있으며 이는 매우 강하다: 응집된 입자가 큰 경우 및/또는 흔한 경우 (예를 들면 샘플 실패 및/또는 "흐리게" 보일 경우), 이 때 DLS 광학계는 포화될 수 있으며, 따라서 적게 사용되고, 반면 상기 후방 반사 광학계는 아직 고품질로 측정할 수 있다. 이는 어떤 다른 기기로도 가능하지 않고 추가적인 극한의 큰 측정 범위를 허용한다.
예로서: 모세관을 사용 및 섭씨 20도에서 시작하여 항체가 조사될 경우, DLS, 나노-DSF 및 후방 반사는 고품질로 측정될 수 있으며, 이는 상기 샘플을 특정 항체 영역의 "변곡 온도"(즉, "용융 온도") 로 분당 섭씨 1도씩 가열할 때조차도 그렇게 측정될 수 있다. 용융 온도에 한번 도달하면, 상기 항체는 응집하기 시작한다. 그러나, "변곡 온도"+섭씨 5도까지, DLS, 나노-DSF 및 후방 반사는 아직 고품질로 측정될 수 있다. 그러나, "변곡 온도" +섭씨 5도부터 시작해서, 상기 항체는 너무 강하게 응집하고 침전하기 시작하여 상기 DLS 광학계는 포화/안 보이게 될 수 있는 반면, 나노-DSF 및 후방 반사는 해석가능한 데이터를 생산한다. 그러나, 상기 후방 반사 광학계는 산란광 신호를 낼 수 있는데 왜냐하면 그것이 덜 민감하기 때문이며, 그러나 상기 샘플의 탁도는 아직 고품질로 측정될 수 있다. 따라서, 실질적으로 같은 시간에 같은 샘플에서의 이들 측정의 결합은 상기 샘플의 특성의 개선된 결정을 제공한다.
단백질과 같은 용해된 입자의 크기는 예를 들면 정적 산란광 측정을 사용하여 추가적으로 결정될 수 있으며, 이는 폭넓은 측정 범위를 갖는 이점을 갖는다. 정적 산란광 측정의 경우, 레이저와 같은 단색 광원으로부터의 광은 연구중인 상기 샘플을 포함하는 용기로 송신되며 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자에 의해 산란된 상기 광은 적어도 2개의 광 검출기에 의해 다른 각도에서 측정된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 추가적인 광 검출기를 제공하는 단계, 및 상기 추가적인 광 검출기를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 정적 산란광을, 바람직하게는 상기 용기의 종축에 대한 각도 φ로 (상기 φ는 바람직하게는 10도와 150도 사이, 더욱 바람직하게는 10도와 60도 사이의 각도임) 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 높은 처리량으로 용해된 입자의 특성을 측정하기 위해 연구중인 용해된 입자를 포함하는 하나 이상의 샘플에 바람직하게 적용될 수 있다. 따라서, 복수의 용기가 제공되는 것이 바람직하며, 각 용기는 용해된 입자의 샘플을 포함하며, 용해된 입자의 특성은 본 명세서에 서술된 바와 같이 각 용기에 대해 측정된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 복수의 용기를 사용하여 높은 처리량으로 용해된 입자를 특성화하도록 사용될 수 있으며, 상기와 동일한 용해된 입자는 각 용기에 포함되되 다른 실험적 조건으로 예를 들면 다른 세제 농도와 같은 조건으로 포함된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 방법은 복수의 용기를 제공하고, 상기 용기는 다양한 용해된 입자의 샘플을 각각 포함하여 높은 처리량으로 다양한 용해된 입자를 특성화하도록 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 방법이 상기 서술된 바와 같이 복수의 용기에 적용된 경우, i) 각 용기에 대한 형광성 측정이 각 용기에 대한 DLS 측정에 선행하거나; 또는 ii) 각 용기에 대한 상기 DLS 측정이 각 용기에 대한 상기 형광성 측정에 선행하거나; 또는 (ii) 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정은 상기 복수의 용기 중 하나에 수행되고 후속하여 상기 복수의 용기 중 다른 용기에 대하여 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정이 뒤따르는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 형광성 측정은 수행되고 DLS 측정에 선행한다. 이는 특히 형광성 측정으로부터의 정보가, 추가적으로 상기 DLS 측정을 위한 각 용기를 정확하게 위치시키고 선택적으로 (재)위치시키기 위해 이에 따라 상기 DLS 측정의 재생산가능 고품질 결과를 보장하기 위해 사용될 수 있기에, 특히 유리하다. 더 바람직하게는, 상기 복수의 용기의 각 용기에 대해 형광성 측정은 DLS 측정과 함께 동시에 수행된다.
바람직한 실시예의 예시
바람직하게는, 본 발명의 방법은 적어도 상기 상세하게 설명된 용기의 형광성 신호를 검출하는 단계, 용기의 정확한 위치를 결정하는 단계, 선택적으로 상기 광원 및/또는 광학계에 대하여 용기를 (재)위치시키는 단계, DLS 측정, 바람직하게는 추가적 나노-DSF 측정을 수행하는 단계를, 제 1 온도에서, 상기 용기를 템퍼링하는 단계, 상기 용기의 형광성 신호를 검출하는 단계, 상기 용기의 정확한 위치를 결정하는 단계, 선택적으로 용기를 상대적 (재)위치시키는 단계, DLS 측정, 바람직하게는 추가적 나노-DSF 측정을, 제 2 온도에서, 수행하는 단계 등을 포함한다. 따라서, 3차원 구조, 입자 크기 분포 및 입자의 응집 및 온도와 같은 파라미터에 대한 그들의 종속은, 비교적 저렴하고, 빠르고 높은 재생산성 및 정확성을 갖고 평가될 수 있다. 또한, 적어도 상기 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 바람직하게는 복수의 용기를 사용하여 수행된다. 이는 결과로서 높은 처리량을 가져오는 정밀한 측정을 취득하는 이점이 있다.
본 발명에 따른 측정 주기의 바람직한 예시는 도 11을 참조하여 다음에서 더 상세하게 서술될 것이다. 특히, 상기 측정은 용기로서 모세관을 사용하여 예시되며, 연구중인 상기 입자를 포함하는 상기 샘플은 상기 모세관힘에 의해 상기 용기 안으로 끌려들어간다. 상기 모세관은 이후 샘플 캐리어/홀더 위에 배치된다. 다른 실시예에 따르면, 복수의 모세관이 홀더 위에 거치되며 상기 복수의 모세관이 다양한 샘플 안에서 각 모세관의 한 단부를 삽입하는 것에 의해 동시에 채워질 수 있고, 예를 들면, 상기 복수의 모세관을 동시에 다중 웰 플레이트의 각 웰에 삽입하여 채워질 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 1에서 48까지의 모세관이 상기 샘플 캐리어/홀더 상에 제공된다. 이들 복수의 모세관/용기 (도 11 참조)의 온도가 특정 온도로 매우 정밀하게 제어될 수 있는 것이 더 바람직하다. 예를 들면, 템퍼링 수단이 제공될 수 있으며 그로 인해 예를 들면 섭씨 75도의 온도의 모든 모세관은 섭씨 75도 +/- 섭씨 0.2도 "균질성"의 온도 범위 안에 있다. 이는 모든, 단일 모세관은 사실상 같은 온도를 갖고 있으며 따라서 상기 모세관들은 서로 비교할만하다는 것을 의미한다. 이는 복수의 모세관/용기를 위해 정밀하게 제어된 온도는, 예를 들면, 등온선 측정 또는 온도 램프(ramp) 측정을 가능하게 한다. 예를 들면, 등온선 모드에서, 모든 샘플은 +/- 섭씨 0.5도의 정밀도 안에서 단일 온도로 유지된다 [명시를 부탁 드립니다, 특정 시간에는 +/-섭씨 0.2도의 정밀도, 예를 들면 1분 초과, 2분 초과, 1시간 초과, 1일 초과, 7일까지. 정밀하게 제어된 온도는 또한 온도 램프 모드를 허용하며, 예를 들면 분당 섭씨 1도의 가열속도로 섭씨 20도에서 섭씨 95도로 상기 복수의 모세관에서 상기 샘플을 템퍼링하는 것이다. 주변 온도에서, 모든 모세관은 실질적으로 같은 온도를 갖는다. 본 발명으로, 그러나, 상기 온도 램프(ramp)의 모든 온도에서 모든 모세관에 걸쳐서 온도에서 특정 정밀도를 유지하는 것이 가능하다.
상기 측정은 바람직하게는 상기 샘플 캐리어가 x-방향으로 이동하도록 수행되어 그로 인해 모든 용기의 신호가 상기 각 광학계, 예를 들면 DLS 및/또는 나노-DSF 측정에 의해 연속적으로 검출될 수 있도록 한다. 대안적으로, 상기 광원, 상기 검출기 및/또는 상기 각 광학계는 상기 샘플 캐리어에 대하여 이동될 수 있다. 추가적 실시예에 따라서, 상기 캐리어 및 상기 광원, 검출기 및 각 광학계는 이동될 수 있다. 달리 말하면, 상기 용기와 상기 검출 시스템 사이에 상대적 이동이 있는 것이 바람직하다. 상기 샘플 캐리어가 양의 x 방향으로 이동될 때, 상기 나노-DSF 및 후방 반사 측정이 수행될 수 있고, 여기서 모든 모세관은 상기 샘플 캐리어를 멈추지 않고 스캔될 수 있다. 상기 샘플 캐리어가 수축될 때, 즉 음의 x-방향으로 이동될 때, 상기 각 DLS 측정이 수행될 수 있고, 그동안 상기 샘플 캐리어는 각 측정을 위해 멈춘다. 샘플 홀더에 배치된 모든 모세관이 측정되지 않을 경우, 모세관들의 부분집합이 선택된 후 고려될 수 있으며, 이는 상기 광학계가 모세관에 포함된 각 샘플의 산란 강도를 검출할 수 있기 때문이다.
각 측정의 경우 상기 용기의 포지셔닝은 고품질 결과를 취득하기 위해 중요하다. 또한, 상기 용기 내 상기 측정 지점의 결정은 상기 측정의 품질 및 민감도를 개선할 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 용기의 위치를 측정하는 것은 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으며, 상기 입자 및/또는 상기 용기로부터 상기 자가형광성 신호를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 방법은 도 10을 참조하여 상세하게 설명된다. 예를 들면 용해된 단백질과 같은 입자의 열적 안정성을 결정하기 위해, 상기 용해된 단백질을 포함하는 상기 샘플은 섭씨 20도에서 섭씨 95도로 가열될 수 있다("온도 램프"). 한 샘플을 포함하는 복수의 용기가 분석되어야 하는 경우, 상기 샘플은 측정 회차당 이동될 수 있는 샘플 데크 상의 샘플 홀더 안에 예를 들면 위치할 수 있고, 즉 상기 온도 램프의 적어도 하나의 기정의된 온도의 각각에서의 측정으로, 그로 인해 모든 샘플이 측정될 수 있는 측정 회차를 말한다. 이와 같은 온도 램프 중 상기 샘플 홀더의 온도 유도 확장으로 인해, 상기 샘플을 포함하는 상기 용기들의 위치들은 약간 이동할 수 있다. X-방향으로의 상기 용기의 중앙이 따라서 바람직하게 결정되며 선택적으로 (재)위치되며 이는 형광성 신호(가령, 이전 형광성 측정 및/또는 검출된 상기 형광성 신호의 최대치)에 기반한 (DSL 및/또는 나노-DSF 측정과 같은) 측정 및/또는 각 측정 회차를 위한 것이다. 그러나, 바람직하게는 모세관인, 용기의 상기 측정 위치는, 측정 부정확성 및/또는 약한 형광 샘플로 인해 측정에 따라 다를 수 있다. 상기 z 위치는, 다른 한편으로는, 바람직하게는 측정 전에 설정되며 전형적으로 상기 샘플 홀더의 확장으로 인해 섭씨 20도에서 섭씨 90도까지의 온도 램프동안 약±20μm만큼만 변화한다. 만일 x-방향의 상기 측정 위치가 용기의 중앙으로부터 기정의된 값보다 많이 벗어난다면, 상기 측정은 상기 용기 벽의 산란 신호에 의해 영향을 받을 수 있다. 추가적으로, 상기 광은 상기 측정 위치에 따라 상기 용기 벽의 굴곡에 의해 다르게 굴절될 수 있으며, 그로 인해 벗어나는 측정 위치가 상기 측정 각도에 영향을 미칠 수 있고 따라서 입자 특성에 영향을 줄 수 있으며, 예를 들면 상기 입자의 붕괴율이 결정될 수 있다. 상기 샘플의 붕괴율은 따라서 상기 용기 내의 특정 측정 지점에서 바르게 결정되며, 이는 소위 "상기 용기의 측정 가능 영역"이라고 한다(도 10에 녹색 영역으로 나타난 바와 같다; 백색 원은 상기 분석된 측정 위치를 부호화한다). 이 영역은 상기 샘플의 바른 초점 맞추기에 종속된다. 상기 광이 상기 용기 벽의 굴곡에 의해 너무 강하게 굴절되어 상기 검출기가 상기 조명된 영역을 더 이상 검출할 수 없으면 같은 샘플에 대해 다른 붕괴율이 관찰될 수 있다. 이와 같은 경우에 기록된 상기 자기상관 기능(들)은 주로 간섭성 신호를 포함한다(예를 들면 주변 광 또는 전자적 소음). 추가적으로, 상기 모세관의 위에서 상기 모세관 벽은 상기 산란 신호에 강한 영향을 줄 수 있으며 (낮은 z값에 바이올렛 지점), 이는 그 결과로서 의미없는 데이터가 되는 가공물로 이어질 수 있다. 따라서, 도 10에 나타난 바와 같이, 상기 용기의 상부의 z 위치 (낮은 z값)은 정확한 결과를 취득하기에 최선이다. 따라서, 형광성 스캔 사용은 재생산가능하고 정확한 측정 결과를 취득하기 위해 용기를 정밀하게 위치시키고 선택적으로는 (재)위치시키기에 유리하다.
상기 결정에 추가적으로, 상기 용기 안의 최선의 지점을 찾는 것이 더 바람직하며, 즉 신호 대비 최선의 비율이 취득될 수 있는 상기 용기 안의 지점을 찾는 것이 더 바람직하다. 예를 들면, 상기 용기의 벽 옆의 지점을 측정하는 것은 소음을 개선할 수 있다.
예를 들면, 바람직한 모세관을 사용하는 것은 500μm의 내경을 갖지만, 그러나 측정하기 위한 최선의 지점의 크기(예를 들면 직경)는 바람직하게는 약 50μm이다. 자기형광성 측정 및 강한 포커싱 렌즈의 사용으로, 10μm 정밀도가 달성된다.
최선의 신호 대 소음 비율 (SNR)을 갖는 바람직한 지점은 예를 들면, 약한 산란 샘플을 사용하여, 상기 모세관 내 다양한 위치에서 다중 DLS 측정을 수행하여 발견될 수 있다. 상기 바람직한 지점은 자기상관 기능의 가장 높은 SNR을 가진 하나이다(SNR = (acf의 진폭)/(적합한 잔류의 제곱의 합)). 예시로서 SNR의 전형적인 값은, 농도 2mg/ml의 리소자임을 사용할 때 및 측정 시간이 200ms일 때 50이다. 리소자임을 사용할 때 SNR의 전형적인 값은 예시로서 50이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 방법은, 상기 검출된, 방사된 광으로부터 취득된 신호 강도와 같은 정보가 연구중인 입자의 존재를 나타내는 경우, i) 연구중인 용해된 입자의 샘플을 포함하는 용기를 제공하는 단계; ii) 제 1 제공된 광원으로부터 광을 상기 용기로 송신하는 단계; 상기 용기 및/또는 그 포함된 상기 샘플로부터 방사된 형광성을 측정하는 단계; 상기 검출된, 방사된 광에 기반하여 상기 제 1 광원을 포함하는 상기 제 1 광학계에 대하여 상기 용기의 위치를 결정하는 단계; 상기 검출된, 방사된 광에 기반하여 상기 제 1 광학계에 대하여 상기 용기의 측정 가능한 영역의 위치를 결정하는 단계; 선택적으로 상기 제 1 광학계에 대하여 상기 용기를 (재)위치시키는 단계; 형광성 측정을 수행하는 단계; iii) ii) 단계에서 상기 검출된, 방사된 광으로부터 취득된 정보, 예를 들면 신호 강도가 연구중인 입자의 존재를 나타내는 경우, 제 2 제공된 광원으로부터 광을 상기 용기로 송신하는 단계; DLS 측정을 수행하는 단계; 및 iv) 입자 크기 분포 및/또는 존재 및/또는 응집의 양과 같은 연구중인 용해된 입자의 특성을 ii) 단계 및 iii) 단계에서의 상기 측정된 형광성 및 DLS 측정으로부터 취득된 정보에 기반하여 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 예를 들면 ii)단계 전 iv)단계인 상기 용기를 템퍼링하는 단계를 더 포함할 수 있다. 더욱이, 형광성을 측정하는 단계는 바람직하게는 나노-DSF 측정을 수행하여 자기형광성을 측정하는 단계를 지칭한다. 더욱이, 상기 방법은 ii)단계 및 iii)단계 및/또는 iv), ii) 및 iii)단계를 반복 수행하여 반복적으로 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들면 상기 제 1 광학계를 사용하여, 후방 반사 및/또는 정적 광 산란을 측정하는 단계가 본 발명에 따른 방법에 더 포함될 수 있다. 중요한 건, 상기 제 1 및 제 2 광학계는 같거나 다른 것일 수 있다는 것이다.
본 발명은 제 2 태양에 따르면 용해된 입자의 특성을 측정하는 기기에 관한 것으로서, 상기 용해된 입자의 특성은 바람직하게는 상기 서술된 본 발명에 따른 방법에 따라 측정된다. 따라서, 본 발명에 따른 기기는 바람직하게는 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 사용 및/또는 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 본 발명의 기기를 사용하여 수행된다.
본 발명에 따른 기기는 상기 용해된 입자의 샘플 (상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이, 더욱 바람직하게는 1μL 와 15 μL 사이, 더욱 더 바람직하게는 8μL 와 12 μL 사이의 부피를 가짐) 을 포함하는 용기를 수용하는 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 수단은 예를 들면 모세관 홀더 또는 마이크로웰 플레이트 홀더와 같은 샘플 홀더를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 기기는 단색 광원, 바람직하게는 레이저, 및 광 검출기, 바람직하게는 PMT, SiPM 또는 APD 광 계수 검출기를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 기기는 DLS 측정을 수행하기 위한 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 수단은 예를 들면 FPGA, 파고 선별기, 상관자, ADC 및 콜리메이팅 렌즈 및/또는 대물 렌즈(또는 대물 거울)와 같은 렌즈를 포함할 수 있다.
DLS 측정을 수행하기 위한 수단과 같은 본 발명에 따른 기기의 수단은, DLS 광학계에 포함될 수 있다. 상기 DLS 광학계는 단색 광원, 광 검출기 및/또는 제어 수단의 일부 또는 전부를 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 기기는 도 6에 예시적으로 나타난 바와 같이 DLS 광학계를 포함할 수 있다. DLS 광학계(15)는 단색 광원(55), 예를 들면 레이저, DLS 검출기(30) 및 바람직하게는 대물 렌즈 또는 대물 거울(52)을 도 6A)에 나타난 바와 같이 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 여기 빔(50)은 상기 단색 광원(55)에 의해 제공될 수 있으며, 상기 단색 광원(55)은 상기 대물 렌즈(52)에 의해 초점이 맞춰질 수 있고, 바람직하게는 그로 인해 결과적인 형광성 초점(17)이 연구중인 샘플내에 위치하게 된다. 샘플이 본 발명에 따른 방법 및 기기를 사용하여 분석되는 경우, 상기 샘플에 포함된 용해된 입자는 상기 DLS 광학계(15)로부터 송신된 상기 광을 산란시킨다. 그렇게 취득된 방사된 광/산란된 광은 상기 DLS 검출기(50)에 의해 검출될 수 있다(51). 특히, 상기 검출된 광선 빔(51)은 상기 DLS 광학계(15)에 포함된 같거나 추가적인 대물 렌즈 (또는 대물 거울)에 의해 초점이 맞춰지고 국소화될 수 있으며 그로 인해 PMT 또는 SiPM과 같은 DLS 검출기(30)에 의해 검출될 수 있다. DLS 광학계(15)의 CAD 모델 (섹션도)의 일부가 도 6B)에 예시적으로 나타나며, 상기 DLS 광학계(15)는 두 개의 콜리메이터 렌즈(56) 및 하나의 대물 렌즈(52)를 포함한다. 연구중인 샘플로부터 산란되거나 방사된 광으로서 퍼짐 광원으로부터 약 병렬 빔 경로를 갖는 광을 생성하도록 콜리메이터 렌즈(56)는 사용될 수 있다. 콜리메이터 렌즈는 또한 상기 대물 렌즈(52)에 의해 초점이 맞춰지는 단색 광원(55) (미도시)로부터의 여기 광선 빔 및/또는 상기 DLS 검출기(30) (미도시)에 의해 검출되기 위해 검출된 광선 빔에 유리하다.
본 발명에 따른 기기는 적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단을 제어, 상기 단색 광원으로부터 광을 상기 적어도 하나의 용기로 송신하기 위한 상기 단색 광원을 제어, 상기 적어도 하나의 용기로부터 신호를 검출하기 위한 상기 검출기를 제어, 및 DLS 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응된 제어 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 상관 연산, 바람직하게는 자기상관 연산을 수행하기 위한 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 자기상관 연산은 바람직하게는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에 구현된 자기상관연산 로직인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 기기는 데이터 처리 연산을 수행하기 위한 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 데이터 처리 연산은 바람직하게는 상기 서술된 바와 같이 본 발명에 따른 방법의 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계(들)을 적어도 수행하기 위한 데이터 처리 로직을 바람직하게는 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 데이터 처리 연산은 바람직하게는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에 구현된 데이터 처리 로직인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 기기는 상기 광 검출기로부터 취득된 신호를 디지털화하기 위한 수단 (상기 수단은 바람직하게는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)를 포함하며, 상기 제어 수단은 상기 광 검출기로부터 취득되는 신호를 디지털화하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 기기는 단일 모드 광섬유, 및 단일 모드 광섬유; 및 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 상기 기기는 DLS 광학계 및 광섬유, 바람직하게는 단일 모드 광섬유, 편광 보존 또는 다중 모드 광섬유, 더욱 바람직하게는 단일 모드 광섬유를 포함할 수 있다. 비록 레이저는 광섬유(57)를 통해서 DLS 광학계에 연결되고 광섬유는 상기 단색 광원(55)으로부터 단색 광을 상기 DLS 광학계(15) 안에 위치한 콜리메이팅 렌즈(56)로 전달하지만, 도 7a)에 예시적으로 묘사된 바와 같이, 단색 광원(55), 예를 들면 레이저는, 상기 서술된 도 6a)에 예시적으로 묘사된 상기 DLS 광학계와는 대조적으로 DLS 광학계(15) 안에 직접적으로 위치하지 않는다. 상기 DLS 광학계(15)는 하나 이상의, 여기서는 두 개의 추가적인 콜리메이팅 렌즈(56)를 각각 검출된 광선 빔(51)의 초점을 맞추기 위해 포함하며, 상기 검출된 광선 빔(51)은 추가적인 광섬유(57)를 통해서 광 검출기(상기 광 검출기는 이 예시에서는 상기 DLS 광학계 안에 직접적으로 위치하지 않음; 30)로 전송된다. 따라서, 도 7a)는 하나의 여기와 두 개의 광 검출기, 예를 들면 다중모드 광섬유를 갖는 포토다이오드 및 단일 모드 광섬유를 갖는 PMT를 갖는 DLS 광학계의 예시적 개략도를 묘사한다.
기기의 다른 예시는 도 7b)에서 예시적으로 DLS 광학계의 공초점 버전을 나타낸다. 상기 서술된 도 7a)와 비교하여, 상기 DLS광학계(15)는, 각각 콜리메이터 렌즈(56)에 의해 초점이 맞춰질 수 있는 두 개의 광선 빔으로 동일한 비율로 예를 들면 광선 빔을 분할하기 위한 광 분리기(58)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 이는 적은 공간이 필요하다는 이점이 있다.
바람직하게는, 본 발명의 기기는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응됨) 을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 기기의 추가적 예시는 도 7c)에 예시적으로 나타나는데, 결합된 형광성 광학계 및 DLS 광학계 공초점 (x-거리 = 0)을 도시한다. 상기 서술된 도 7B)에 비하여, 상기 DLS 광학계는 상기 형광성 광학계(14)를 포함하며 상기 광 분리기(58)는 기정의된 광 분리기 파장(59)를 갖고, 이는 예를 들면 저주파 620nm이다. 따라서, 상기 검출된 광선 빔(51)은 두 개의 광선 빔으로 분리되고, 620nm이하의 파장을 갖는 광만 형광성 광학계(14)로 통과된다. 이와 같은 설정은 적은 공간이 요구된다는 것과, 형광성 및 산란이 동시에 측정될 수 있고 같은 샘플을 사용하여 측정될 수 있다는 이점을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 상기 용해된 입자의 상기 샘플을 수용하기 위한 상기 수단을 위치시키기 위한 포지셔닝 수단 (상기 제어 수단은 상기 샘플을 수용시키기 위한 상기 포지셔닝 수단을 제어하기 위해 더 적응됨)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 온도 제어 시스템 (상기 제어 수단은 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 상기 온도 제어 시스템을 제어하기 위해 더 적응됨) 을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 상기 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨) 을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 추가적인 광 검출기; 및 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 수단 (상기 제어 수단은 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨) 을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 기기는 상기 레이저의 빔 품질을 개선하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 기기는 상기 레이저의 빔 품질을 개선하기 위한 광학계를 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 DLS 광학계에 포함된 것이 있다.
본 발명의 기기의 다른 예시로서, 기기는 도 7D)에 예시적으로 나타나며, 상기 서술된 도 7A)에 도시된 상기 기기와는 대조적으로, 상기 레이저는 단일 모드 광섬유 없이 결합되어 있다. 이는 광섬유에 결합시킬 때 비용과 전력 소모를 줄이는 이점이 있다. 도 7D)에 묘사된 예시에서, 상기 단색 광원은 예를 들면 상기 DLS 광학계(15) 안에 위치한다. 따라서, 자유공간 결합 광원을 갖는 DLS 광학계의 설계에서 예시적으로 나타나 도시되었다.
본 발명의 기기는 다이크로익 필터, 편광 필터, 미광을 줄이기 위한 구멍, 및/또는 모세관 난시의 교정을 위한 원통형 렌즈와 같은 측정의 품질을 개선하기 위해 유리한 추가적인 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 기기의 다른 예시는 예시적으로 도 7E)에서 나타나며, 여기서 모세관 난시(64)의 교정을 위한 원통형 렌즈는 미광(63)을 줄이기 위한 구멍과 대물 렌즈(52) 사이에 위치한다. 따라서, 상기 단색 광원(55)으로부터 송신되는 광선 빔은 콜리메이팅 렌즈(56)를 통과할 수 있고, 이후 상기 대물 렌즈(52), 상기 원통형 렌즈(64) 및 이후 상기 구멍(63)을 예를 들면 샘플에 의해 산란되기 전에 통과할 수 있다. 특히, 상기 구멍(63), 상기 원통형 렌즈(64), 상기 대물 렌즈(52)를 통과하고, 다음 적어도 하나의 추가적, 예를 들면 2개의 콜리메이팅 렌즈(56)를 통과할 때, 상기 산란광은 이후 상기 DLS 광학계(15)를 통과할 때 광 검출기(30)에 의해 검출될 수 있다. 추가적으로 도 7E에 예시적으로 나타난 바와 같이, DLS 검출기와 같은 상기 광 검출기(30)는 다이크로익 필터(60)를 포함할 수 있으며, 예를 들면 형광성을 막기 위한 주파수폭 405/5 nm을 갖는 다이크로익 필터(60), 및/또는 편광 필터(61)를 포함할 수 있다. 이는 특히 자기형광성(주파수폭) 또는 높은 종횡비를 갖는 입자(편광 필터)를 나타내는 약한 산란 샘플에 유리하다.
기기의 추가적 예시는 도 7F)에 도시되며, 2개의 DLS 아암(검출 및 여기)과 공초점 형광성 광학계를 한 지점에서 동시 측정을 하기 위해 갖는 DLS 광학계의 설계가 도시된다. 이 설계에서, 상기 DLS 광학계(15)는 콜리메이팅 렌즈들(56)은 물론 형광성 광학계(14)를 포함하며, 예를 들면 2개의 콜리메이팅 렌즈(56)를 직렬로 대물 렌즈 없이 상기 단색 광원(55)으로부터 광을 샘플로 송신하기 위해 및 상기 샘플로부터 방사된 광을 상기 광 검출기(30)로 송신하기 위해, 각각 포함한다. 이 설계에서, 상기 직렬의 2개의 콜리메이팅 렌즈(56)를 통과하는 각 광선 빔의 방향으로, 상기 제 2 콜리메이팅 렌즈(56)는 상기 여기로 초점을 맞춘다. 이와 같은 DLS 광학계의 설계는 더 큰 산란 각도, 즉 레이저와 검출기 사이의 각도가 이 방식으로 이루어지고, 이는 광산란의 감소도 허용한다는 점에서 유리하다.
추가적인 바람직한, 기기의 예시는 비록 형광성 광학계(14)는 없이 도시하였지만 도 7g)에서 나타나며, 도 7f)의 경우에서와 같이 2개의 아암(검출 및 여기)과 대물 렌즈 없는 DLS 광학계의 설계가 도시된다. 이는 특히 형광성 및 산란 측정이 상기 동일 샘플에 동시에 취득될 수 있다는 점에서 유리하다.
상기 용기, 상기 샘플, 상기 입자 및 그들의 특성에 대해, 상기 샘플, 상기 용기, 상기 단색 광원, 상기 광 검출기, 상기 시간에 걸친 템퍼링, 상기 (자기)상관 연산, 상기 FPGA, 및 상기 전달, 전송, 방사, 및 광의 검출, 및 상기 측정(상기 측정은 DLS 측정, 형광성 측정, 나노-DSF 측정, 후방 반사 측정, 및 정적 산란 광 측정을 포함함), 동일한 내용이 본 발명에 따른 방법과 관련하여 상기 서술된 바와 같이 적용된다. 또한, 이와 같은 측정의 기타 특징 또한 상기 서술된 바와 같을 수 있다. 따라서, 본 발명의 제 1 태양의 유리한 특징 및 특성은 본 발명의 제 2 태양의 유리한 특징으로서 취급되며 그 역으로도 취급된다.
본 발명의 기타 태양 및 이점은 다음 예시에서 서술될 것이며, 이는 도시의 목적을 위해서이며 한정을 목적으로 하지 않는다. 본 출원에 인용된 각 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류는 여기서 전체로서 참조에 의해 추가된다.
예시
여기에 서술된 방법 및 자료는 본 개시에서의 사용을 위한 것이다; 통상의 기술에 알려진 기타 적합한 방법 및 자료 또한 사용될 수 있다. 자료, 방법, 예시는 도시적일 뿐이며 한정을 의도하지 않는다.
면역 체계는 체액성 및/또는 세포 개제 면역 반응에 의해 병원체(박테리아, 바이러스, 독소)를 인식하고 막아낼 수 있다. 체액성 면역 반응은 병원체-특화 항원을 향한 병원체-특화 항체를 포함하는 특정 단백질의 생산을 수반한다. 항체는 용해가능 단백질로서 혈액 혈장 및 림프액 안에서 순환하며 병원체적 항원의 인식, 중화, 응집 및 침전에 관련된다. 병원체적 항원에 대한 그들의 특이성 및 그들의 일반적인 역할에서의 면역의 상황에서의 기본적인 역할로 인해서, 항체는 병의 진단 및 치료 분야와 매우 관련이 있다.
그러나, 항체를 조사하는 것과 항체 기반의 치료 및 의약학적 조성물을 개발하는 것은 항체의 기능과 안정성 면에서 복잡한 과제이다. 예를 들면, 항체의 불안정성은 그들의 형태의 열적 안정성의 화학적 수정, 변화(특히 감소) 및 그들의 콜로이달 안정성의 변화(특히 감소)에 의해 야기될 수 있다. 이들 태양 중 어떤 것이든 치료성 및/또는 진단성 항체의 안전 및/또는 효율에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상기 항체의 안정성을 종합적으로 특성화하고 최적화하기 위해 광범위한 분석이 수행된다.
이 상황에서, 용해된 단백질, 예를 들면 IgG 및 버퍼를 포함하는 (의약 또는 진단) 항체 조성물의 안정성을 분석하고 최적화하기 위한 전형적인 실험을 시뮬레이션하기 위해 한 실험이 수행되었다.
시재료는 면역 글로불린 클래스 G의 치료용 항체의 상용 물질 (HyQvia, 박살타 이노베이션즈 게엠베하, 비엔나, 오스트리아)이다. IgG 항체는 다양한 버퍼(아세트산 나트륨 및 HEPES)를 사용하여 희석된다. HyQvia 제품의 초기 질량 농도는 1 ml의 주사 용액당 100mg의 단백질이었다. 상기 항체 조성물은 1ml 버퍼당 2mg 단백질의 최종 질량 농도로 아세트산 나트륨 또는 HEPES 버퍼를 사용하여 50배 희석되었다. 희석된 물질은 14000배 가속에서 중력으로 15분간 원심분리되어 용해되지 않는 육안 및 현미경으로 보이는 입자를 제거하도록 했다. 모세관들은 상기 희석되고 원심분리된 항체 용액으로 상기 단백질 용액 안에 각 모세관을 하나씩 붙들려서, 모세관힘에 의해 단백질 용액으로 스스로 채워졌다. 형광성 이동 및 입자 크기의 거의 동시 측정으로 이루어진 결합된 열적 디콘볼루션 실험이 수행되었다. 상기 열적 디콘볼루션을 유도하는 가열 속도는 분당 섭씨 1도였다. 상기 DLS 측정 시간은 모세관당 500ms였다.
도 8은 어느 온도에 IgG가 형광성 이동(항상 상부 서브플롯) 및 어떻게 상기 검출된 입자의 분포 또는 그들의 크기(항상 하부 서브플롯)가 온도의 기능으로서 변화하는지 결정하는지를 목표로 하는 실험의 결과를 나타낸다. 상기 단백질 용액의 크기 분포(항상 하부 서브플롯) 또는 크기의 측정을 통한 단백질 형태(항상 상부 서브플롯)의 안정성 및 상기 단백질 입자의 콜로이달 안정성의 결합적 결정은 이들 두 결정적 파라미터의 정밀한 분석을 허용한다. 상기 결합적 결정이 병렬로 48개 샘플까지 수행될 수 있으므로, 연구중인 단백질이 용해된 다양한 버퍼와 같은, 많은 다양한 상태가 테스트될 수 있고 효율적으로 평가될 수 있다. 따라서, DLS 및 나노-DSF 측정의 결합은 그들의 단백질 구성 및 그들의 콜로이달 안정성 관점에서 단백질의 결합된 특성화에 의해 진단용 또는 치료용 단백질의 개발을 가속화하는 것의 이점을 갖는다.
도 9는 평균 누적 반경, 평균 누적 다분산성 지수 및 상기 입자 파라미터의 기초가 되는 자기상관 연산의 수학적 파라미터를 포함하는 DLS-결정가능 입자 파라미터의 개요를 나타낸다. 전체 샘플의 데이터, 소의 글로불린(BGG) 및 도 8에 서술된 버퍼로부터의 IgG가 나타나 있다. 상기 온도는 측정중 섭씨 25도에 일관되게 유지되었다. 5회의 측정이, 각각 5000ms DLS 측정 시간으로, 모세관당 기록되었다. 그래프의 점은 누적법에 의해 결정된 평균 반경을 나타낸다. 회색 영역은 상기 각 모세관 내에 상기 검출된 입자의 크기 분포를 나타낸다. 보이는 바와 같이, BGG와 IgG의 특정 입자 파라미터간의 차이가 식별될 수 있다. 이와 같은 실험적 설정은 주어진 샘플의 균질성을 평가하기에 유리하며, 예를 들면 입자 분포가 좁고 평균 누적 다분산성 지수가 작을수록, 연구중인 샘플은 더 균질하다.
도 15는 항체 버퍼 스크린 및 NISTmAb 참고 자료 RM 8671을 사용한 항체 후보 선택의 적용 예시를 나타내며, 이는 단일 클론 항체의 물리 화학적 및 생물 물리학적 속성을 결정하는 방법의 성능을 평가하는 것에서 사용하기 위해 의도되는 것이다. 이는 또한 치료성 단백질 특성화를 위한 신기술의 개발을 위한 대표 시험 분자를 제공한다.
상기 테스트 샘플은 염분 속에서 NISTmAB를 1mg/ml 포함한다. 가로축은 섭씨 100도 초과와 약 주변 온도 사이의 온도 범위의 온도를 나타낸다. 상기 제 1 플롯(상단의 플롯부터 아래 방향으로 플롯을 넘버링함)은 온도상 350nm에 있는 1차 도함수를 나타낸다. 섭씨 60도와 섭씨 75도 사이의 피크는 제 1 전이를 나타내며, 섭씨 75도와 섭씨 90도 사이의 상기 피크는 제 2 전이를 나타내고 섭씨 90도와 섭씨 100도 사이의 상기 피크는 제 3 전이를 나타낸다(이 항체에 대해서는 이 채널에서 더 잘 보인다). 각 전이는 개별 단백질 도메인의 언폴딩에 대응한다. 상기 제 2 플롯은 후방 산란으로부터의 탁도를 나타내며, 상기 개시는 세로 직선으로서 표시된다. 상기 제 3 플롯은 DLS로부터의 산란을 나타내며(평균 산란강도), 상기 개시는 다시 직선으로서 표시된다. 상기 제 4 플롯(가장 낮은 플롯)은 누적 반경을 nm로 나타내며, 상기 개시는 또한 직선으로 표시된다.
IgG/항체(NIST mAb가 대표적)는 3개의 단백질 도메인을 포함한다: CH2, Fab 단편, CH3. 특히, Y 모양 IgG 분자의 "아암"은 가변형 항원 결합 부위를 포함하며 따라서 흔히 Fab 영역으로 지칭된다 (단편, 항원-결합). Y의 "발치"는 항체의 면역학적 성질에 대해 책임지는 부분이며 Fc 영역이라고 불린다(단편, 결정화가능). 상기 Fc 영역은 CH2 및 CH3 도메인으로 분할될 수 있다(각각 중쇄의 일관된 부분의 도메인 2 및 3). 열적 언폴딩 실험에서, 3개의 개별 언폴딩 이벤트가 흔히 상기 언폴딩 프로파일에서 보일 수 있으며, CH2 영역, Fab 영역, 및 CH3 영역의 3개의 언폴딩 이벤트를 나타낸다. 특히, 상기 CH2 영역이 먼저 (가장 낮은 온도에서) 언폴딩하며, 다음으로 Fab 및 CH3가 후속한다. 상기 IgG의 정확한 분자 구조에 따라, 3개의 영역이 모두 개별 언폴딩 이벤트를 나타내지 않을 수도 있다. 일부 경우, 2개의 언폴딩 이벤트는 겹치거나 동시에 일어날수조차 있으며, 명확한 분리를 배제할 수 있다. 큰 Fab의 언폴딩은, 상기 제 2 전이에 대응하며, 전형적으로 크기 증가로 이어지며 이는 협력적 언폴딩(누적 반경 개시, 가장 아래 쪽의 플롯)이지만, 응집은 없는 것으로 해석된다. CH3의 언폴딩은, 상기 제 3 전이에 대응하며, 추가적 크기 증가에서 응집이 보일 수 있게 하지만, 또한 (후방 반사로부터) 탁도 및 산란 (DLS로부터 평균 강도)에서 개시로부터도 보일 수 있게 한다.
도 16은 도 15과 유사하지만, 상기 샘플은 1mg/ml NISTmAb를 25mM 아세트산 나트륨 pH4에 포함한다. 상기 제 1 플롯(상단의 플롯부터 아래 방향으로 플롯을 넘버링함)은 온도 위 350nm에서 1차 도함수를 나타낸다. 섭씨 50도와 섭씨 60도 사이의 상기 피크는 제 1 전이를 나타내며 섭씨 70도와 섭씨 80도 사이의 상기 피크는 제 2 전이를 나타낸다(이 항체에서는 이 채널에서 더 잘 보일 수 있다). 각 전이는 개별 단밸질 도메인의 언폴딩에 대응한다. 상기 제 2 플롯은 후방반사로부터의 탁도를 나타낸다. 상기 제 3 플롯은 DLS로부터의 산란을 나타낸다(평균 산란강도). 상기 제 4 플롯(가장 낮은 플롯)은 누적 반경을 nm로 나타내며, 상기 개시는 또한 직선으로 표시된다. Fab의 언폴딩은 크기 증가로 이어지며, 협력적 언폴딩으로서 해석된다. 응집은 일어나지 않는다. 특히, 이는 DLS에서 상기 개시가 응집의 개시가 아닌 양호한 예시다. 응집이 관찰되지 않을 경우, 이 개시는 (단일 도메인 단백질에 대해) Tonset과 일치해야 하지만, 다중 도메인 단백질에 대해 더 높을 수 있고 그 결과로서 Rh의 가장 큰 변화로 이어지는 도메인의 언폴딩에 대응한다. 이 예시에서, nDSF와 결합하여 DLS를 모니터링하여, 상기 단백질의 언폴딩 메커니즘에 대한 추가적인 세부 사항이 취득될 수 있다.
도 17은 도 15와 유사하지만, 상기 샘플은 1mg/ml NISTmAb를 25mM 아세트산 나트륨 pH4 + 130 mM NaCl에 포함한다. 상기 제 1 플롯(상단의 플롯부터 아래 방향으로 플롯을 넘버링함)은 온도 위 350nm에서 1차 도함수를 나타낸다. 섭씨 45도와 섭씨 60도 사이의 상기 피크는 제 1 전이를 나타내며 섭씨 60도와 섭씨 75도 사이의 상기 피크는 제 2 전이를 나타내며, 섭씨 75도와 섭씨 90도 사이의 상기 피크는 제 3 전이를 나타낸다(이 항체에서는 이 채널에서 더 잘 보일 수 있다). 각 전이는 개별 단백질 도메인의 언폴딩에 대응한다. 상기 제 2 플롯은 후방반사로부터의 탁도를 나타낸다. 상기 제 3 플롯은 DLS로부터의 산란을 나타내며(평균 산란강도), 온셋은 직선으로 표시된다. 상기 제 4 플롯(가장 아래 쪽의 플롯)은 누적 반경을 nm로 나타낸다.
Fab의 언폴딩은, 상기 제 2 전이에 대응하며, 크기 증가로 이어지며 협력적 언폴딩으로서 해석된다. CH3의 언폴딩은, 상기 제 3 전이에 대응하며, 산란에서 개시되면 보이고 탁도에서 개시가 누락되는 약한 응집을 야기한다.
이들 3가지 예시는 대응 결과가 후보 분자의 문제적 도메인을 식별하고 구조의 추가적 최적화를 시작할 곳에 대한 안내를 제공하도록 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 이들 결과는 기대되는 버퍼 상태를 식별하도록 사용될 수 있다.
도 18은 응집 경로를 이해하기 위한 추가적인 예시다. 상기 샘플은 염분 속에서 NISTmAB를 1mg/ml 포함하는 테스트 샘플을 갖는 도 15의 예시와 같다. 도 15의 상위 온도가 섭씨 100도 초과인 반면, 도 19의 상위 온도는 섭씨 약 110도임을 알 수 있다. 따라서, 상기 제 1 플롯(위에서부터)은 온도상 350nm에 있는 1차 도함수를 나타내는 것이, 도 15에서 상기 제 1 플롯에 대한 것이다. 도 18의 상기 제 2 플롯은 또한 도 15의 마지막 플롯과 유사하며 이는 누적 반경을 나타낸다. 도 18의 제 3 플롯은 온도에 걸친 크기 분포를 나타낸다. 이 제 3 플롯에서, 랜덤 응집은 CH3 도메인의 언폴딩 시 스펙클 무늬로서 보일 수 있다. Fab의 언폴딩은 그 결과로서 크기 증가만 된다(누적 반경에서의 개시는 나노DSF에서의 제 2 전이에 매치된다).
도 18은 응집 경로를 이해하기 위한 추가적인 예시다. 상기 테스트 샘플은 2mg/ml BSA (PierceTM 앰풀 (소의 혈청 알부민 표준 앰풀, Thermo Fisher 과학, 록포드, 미국))다. 여기서 나타난 플롯으로부터 정리된 상태의 응집이 유도가능하다. 특히, 누적 반경 ta를 나타내는 두번째 플롯(즉, 중앙 플롯)에서, 크기 분포에서의 꾸준한 증가는 언폴딩 시에 보이며, 이는 상기 제 1 (상위) 플롯으로부터 유도가능하고, 비율 신호를 나타낸다. 상기 제 2 플롯은 모든 입자의 평균 크기(누적 반경)만을 나타내며, 반면 상기 제 3 플롯은 크기 분포를 나타낸다(반경의 분포). 상기 제 3 플롯에서 크기의 꾸준한 증가가 언폴딩 시에 보인다. 도 18의 스펙클 무늬와는 대조적으로, 크기 분포의 꾸준한 증가는 정리된 상태의 응집을 나타낸다.
따라서, DLS와 형광성 판독을 결합하는 것은 응집 경로를 이해하는 것을 돕는다(랜덤 또는 구조적 응집). 유사한 방식으로 천연을 비천연 응집으로부터 구별하는 것이 형광성 신호에서 언폴딩 전이를 온도 위 크기 분포에 비교하여 가능하다. 전이 중간점 전의 스펙클 무늬는 천연 상태로부터의 응집을 나타낼 것이다.
본 발명의 추가적 바람직한 실시예는 다음 태양에서 추가적으로 명시된다.
[제 1항목]
용해된 입자의 특성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 용해된 입자의 샘플 - 상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 가짐 - 을 포함하는 용기를 제공하는 단계;
단색 광원 및 광 검출기를 제공하는 단계;
단색 광원으로부터의 광을 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 송신하는 단계;
상기 용기로부터 방사된 광을 상기 광 검출기로 검출하는 단계; 및
상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성을 DLS(동적 광산란) 측정에 기반하여 결정하는 단계;를 포함하는, 방법.
예를 들면, DLS 측정을 위한 단색 광원을 제공하는 것이 바람직하다. DLS 측정을 위한 레이저를 사용하는 것이 바람직하다. 형광성 측정을 위해 추가적 광원을 제공하는 것이 더 바람직하다. 예를 들면 약 280nm의 광을 방사하는 LED를 제공하는 것이 바람직하다. 후방 반사 측정을 위해 추가적 광원을 제공하는 것이 더 바람직하다. 예를 들면, 385nm의 파장의 광을 방사하는 LED가 사용될 수 있다.
제공된 광원 및 수행된 측정에 따라 DLS 측정을 위해 광 검출기가 사용되는 것이 바람직하다. 후방 반사 측정을 위해 추가적 광 검출기가 제공되는 것이 더 바람직하며, 바람직하게는 상기 후방 반사 측정을 위해 사용된 상기 광원의 파장을 검출하기 위한 검출기, 예를 들면 약 385nm의 광을 검출하기 위한 검출기가 바람직하다. 적어도 하나의 추가적, 바람직하게는 2개의 추가적 광 검출기를 형광성 측정(들)을 위해 제공하는 것이 또한 더 바람직하다. 바람직하게는, 상기 형광성 측정을 위한 상기 검출된 광은 여기 형광성을 위해 사용된 상기 광보다 긴 파장을 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 2개의 광 검출기는 330nm 및/또는 350nm의 광의 검출을 위해 사용될 수 있다. 광원 및 광 검출기의 바람직한 예시는 예를 들면 도 11에 나타나 있다.
[제 2항목]
제 1 항목에 있어서,
상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이, 바람직하게는 1μL 와 15 μL 사이, 더 바람직하게는 8μL 와 12 μL 사이의 부피를 갖는, 방법.
[제 3항목]
제 1항목 또는 제 2항목에 있어서,
상기 단색 광원으로부터의 상기 광은 간섭성이며 바람직하게는 350nm과 500nm사이의 파장, 바람직하게는 405nm, 445nm, 또는 488nm의 파장을 갖는 방법.
[제 4항목]
제 1항목 내지 제 3항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 단색 광원은 레이저, 바람직하게는 다이오드 레이저, 바람직하게는 주파수 안정화 다이오드 레이저, DPSS 레이저, PPLN 더블 다이오드 레이저, 주파수 체배 DPSS 레이저, 다이오드 펌프 광섬유 레이저, 체배 다이오드 펌프 광섬유 레이저 및 다이오드 펌프 업컨버전 광섬유 레이저로 이루어진 집단으로부터 선택된 다이오드 레이저인, 방법.
[제 5항목]
제 4항목에 있어서,
상기 레이저는 적어도 0.1mm의 간섭 길이를 갖는 방법.
[제 6항목]
제 4항목 또는 제 5항목에 있어서,
상기 레이저는 1mW와 200mW사이의 전력, 바람직하게는 10mW와 180mW사이, 더 바람직하게는 50mW와 150mW사이, 더욱 더 바람직하게는 75mW와 120mW사이, 예를 들면 100mW이며, 상기 레이저는 바람직하게는 지속파(CW)이며 바람직하게는 펄스 레이저가 아닌, 방법.
[제 7항목]
제 4항목 내지 제 6항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 단색 광은 상기 단색 광원으로부터 레이저 파장 단일 모드 광섬유를 통해서 그리고 바람직하게는 레이저 파장 편광 유지 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 방법.
[제 8항목]
제 1항목 내지 제 7항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 단색 광원으로부터의 광은 상기 용기의 종축에 각도 φL로 상기 용기로 송신되며, φL는 0도와 45도 사이인 방법.
[제 9항목]
제 8항목에 있어서,
상기 검출기로 검출되는 광은 상기 용기의 종축에 각도 φD로 상기 용기로부터 방사되며, φD는 0도와 45도 사이이며, 상기 φL의 값은 바람직하게는 상기 φD의 값과 동일한 방법.
[제 10항목]
제 9항목에 있어서,
상기 단색 광원으로부터 상기 용기로 송신되는 상기 광과 상기 광 검출기로 검출된 상기 용기로부터 방사된 상기 광 사이의 각도 φS는 0도와 150도 사이이며, 바람직하게는 10도와 150도 사이이고, 더 바람직하게는 10도와 60도 사이인 방법.
[제 11항목]
제 1항목 내지 제 10항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 송신된 단색 광은 대물 렌즈를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 상기 용기로부터 방사되는 상기 광은 바람직하게는 또한 상기 대물 렌즈에 의해 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 상기 대물 렌즈는 10mm와 200mm사이의 초점거리를 갖고, 및/또는 상기 송신된 단색 광은 3 μm와 30μm사이의 반값 전폭(FWHM)을 갖는 초점을 갖는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 0.01nl과 0.1nl사이의 측정 체적, 바람직하게는 0.01nl과 0.02nl사이, 더욱 바람직하게는 약 0.016nl의 측정 체적으로 되는, 방법.
[제 12항목]
제 1항목 내지 제 11항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 광 검출기는 광전(자) 증배관, 실리콘 광전(자) 증배관(SiPM), 또는 애벌란시 포토 다이오드(APD) 광자 계수 검출기, 바람직하게는 PMT 또는 SiPM인, 방법.
[제 13항목]
제 1항목 내지 제 12항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 DLS 측정은 5초 미만의 시간내에 수행되며, 바람직하게는 1초 미만의 시간내에 수행되는 방법.
[제 14항목]
제 1항목 내지 제 13항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 DLS 측정은 샘플당 단 1회만 수행되는 방법.
[제 15항목]
제 1항목 내지 제 14항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 DLS 측정을 수행하는 것은 적어도 하나의 상관 연산, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관 연산을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
[제 16항목]
제 1항목 내지 제 15항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 DLS 측정은:
상기 광 검출기로부터 취득되는 아날로그 출력 신호를 취득하는 단계; 및
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계;를 포함하는 방법.
[제 17항목]
제 16항목에 있어서,
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계;를 포함하는 방법.
[제 18항목]
제 17항목에 있어서,
상기 디지털 출력 신호는:
i) 바람직하게는 상기 용기로부터 방사되는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 미만일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 디지털 단일 광자 펄스 신호로 처리하는 단계;
및/또는
ii) 바람직하게는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 초과일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 아날로그 신호의 이산값으로 처리하는 단계로 더 처리되는 방법.
[제 19항목]
제 18항목에 있어서,
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 하나를 포함하며, 상기 디지털 출력 신호를 상기 i) 단계 또는 ii) 단계에 따라 디지털 신호로서 처리할지 결정하는 시간이 1초 미만이며, 바람직하게는 최대 0.05초이며, 바람직하게는 FPGA를 사용하고, 또는 상기 광자 계수 및 아날로그 출력 신호는 동시에 처리되어 단계 i) 또는 ii)에 따라 처리할 상기 결정이 상기 측정 후 행해지는, 방법.
[제 20항목]
제 18항목 또는 제 19항목에 있어서,
상기 취득된 출력 신호를 처리하는 단계는:
상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계; 또는
상기 i) 단계 및 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계;를 포함하는 방법.
[제 21항목]
제 1항목 또는 제 20항목에 있어서, 상기 방법은:
바람직하게는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 및/또는 상기 용기의 재질의, 형광성 - 상기 형광성은 바람직하게는 상기 입자의 및/또는 용기의 재질의, 자가형광성임 - 을 측정하는 단계, 및/또는
상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계;를 포함하는, 방법.
상기 언급된 바와 같이, 상기 형광성 및/또는 후방 반사 측정을 위해, 추가적 광원(들) 및/또는 추가적 광 검출기(들)이 사용될 수 있다.
[제 22항목]
제 21항목에 있어서, 상기 방법은:
상기 측정된 형광성에 기반하여 및/또는 상기 측정된 후방 반사에 기반하여 상기 용기의 위치를 결정하는 단계, 및
선택적으로 상기 측정된 형광성 및/또는 후방 반사 및 상기 결정된 용기 위치에 기반하여 상기 용기를 위치시키는 단계;를 포함하는 방법.
[제 23항목]
제 1항목 또는 제 22항목에 있어서,
상기 방법은:
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계;를 더 포함하는 방법.
[제 24항목]
제 23항목에 있어서,
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계는 분당 섭씨 0.01도와 분당 섭씨 30도 사이의 템퍼링 속도, 바람직하게는 분당 섭씨 0.1도와 분당 섭씨 10도 사이의 템퍼링 속도, 및/또는 상기 제 1 온도와 상기 제 2 온도는 섭씨 -20도와 섭씨 160도 사이에서 상기 용기를 템퍼링하는 단계;를 포함하는, 방법.
[제 25항목]
제 1항목 내지 제 24항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 방법은:
나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하는 단계; 및/또는
상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계;를 포함하는 방법.
[제 26항목]
제 1항목 내지 제25항목 중 어느 한 항목에 있어서,
추가적인 광 검출기를 제공하는 단계, 및
상기 추가적인 광 검출기를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 정적 산란광을, 바람직하게는 상기 용기의 종축에 대한 각도 φ로 - 상기 φ는 바람직하게는 10도와 150도 사이, 더욱 바람직하게는 10도와 60도 사이의 각도임 - 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
[제 27항목]
제 1항목 내지 제26항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 용기는 모세관 및/또는 다중 웰 플레이트이고, 상기 모세관은, 바람직하게는 둥근 단면을 가지고 0.1mm와 1mm사이의 내경을 가지며 바람직하게는 0.15mm와 0.5mm사이의 내경을 가지며, 바람직하게는 0.2mm와 1.2mm사이의 외경을 가지며 바람직하게는 0.65mm와 1mm사이의 외경을 가지며, 그리고 바람직하게는 5mm와 70mm사이의 길이를 가지며 바람직하게는 32mm와 50mm사이의 길이를 가지며, 더 바람직하게는 약 50mm의 길이를 가지는, 유리 모세관인, 방법.
[제 28항목]
제 1항목 내지 27항목 중 어느 한 항목에 있어서,
복수의 용기가 제공되며, 각 용기는 용해된 입자의 샘플을 포함하며, 용해된 입자의 특성은 제 1항목 내지 제 27항목 중 어느 한 항목에 따라 각 용기에 대해 측정되는, 방법.
[제 29항목]
제 28항목에 있어서,
각 용기에 대한 형광성 측정이 각 용기에 대한 DLS 측정에 선행하거나; 또는
각 용기에 대한 상기 DLS 측정이 각 용기에 대한 상기 형광성 측정에 선행하거나; 또는
상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정은 상기 복수의 용기 중 하나에 수행되고 후속하여 상기 복수의 용기 중 다른 용기에 대하여 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정이 뒤따르는, 방법.
[제 30항목]
제 1항목 내지 29항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 특성은 입자 크기 분포, 응집(aggregation) 온도, 용융 온도, 전이 온도, 언폴딩(unfolding) 온도 개시, 액상 분리 (TLLPS) 기복 표면 자유(free folding) 에너지, 제 2 비리알 계수(B22), 입자의 자기상호작용, 콜로이드 안정성, 유체역학적 반경, 입자간에 밀거나 당기는 상호작용 (KD), 용해도, 장기 단백질 안정성 및 임계 변성제 농도로 이루어진 집단으로부터 선택되는 방법.
[제 31항목]
바람직하게는 제 1항목 내지 제 30항목 중 어느 한 항목에 따라 용해된 입자의 특성을 검출하는 기기로서, 상기 기기는:
상기 용해된 입자, 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 상기 입자의 샘플을 포함하는 적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단;
단색 광원 및 광 검출기;
DSL 측정을 수행하기 위한 수단; 및
제어 수단: - 상기 제어 수단은, 적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단을 제어하고; 상기 단색 광원으로부터 상기 적어도 하나의 용기까지 광을 송신하기 위한 상기 단색 광원을 제어하고; 상기 적어도 하나의 용기로부터의 신호를 검출하기 위한 상기 광 검출기를 제어하고; DSL 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응됨 - ;을 포함하는, 기기.
[제 32항목]
제 31항목에 있어서, 상기 기기는:
상관 연산, 바람직하게는 자기상관 연산을 수행하기 위한 수단 - 상기 자기상관 연산은 바람직하게는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에 구현된 자기상관연산 로직임 - 을 더 포함하는 기기.
[제 33항목]
제 31항목 또는 제 32항목에 있어서, 상기 기기는:
상기 광 검출기로부터 취득된 신호를 디지털화하기 위한 수단 - 상기 수단은 바람직하게는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)를 포함하며, 상기 제어 수단은 상기 광 검출기로부터 취득되는 신호를 디지털화하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
[제 34항목]
제 31항목 내지 제 33항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 상기 형광성을 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
[제 35항목]
제 31항목 내지 제 34항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
상기 용해된 입자의 상기 샘플을 수용하기 위한 상기 수단을 위치시키기 위한 포지셔닝 수단 - 상기 제어 수단은 상기 샘플을 수용시키기 위한 상기 포지셔닝 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 -을 더 포함하는 기기.
[제 36항목]
제 31항목 내지 제 35항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 온도 제어 시스템 - 상기 제어 수단은 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 상기 온도 제어 시스템을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
[제 37항목]
제 31항목 내지 제 36항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 상기 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
상기 언급된 바와 같이, 상기 후방 반사 측정을 위해 추가적 광원을 제공하는 것이 바람직하며, 예를 들면 385nm의 여기 파장을 갖는 LED를 제공하는 것이 바람직하다. 후방 반사 측정을 위해 추가적 광 검출기, 예를 들면 385nm의 후방 반사광을 검출하기 위한 광 검출기를 제공하는 것이 더 바람직하다.
[제 38항목]
제 31항목 내지 제 37항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
추가적인 광 검출기; 및
정적 산란광 측정을 수행하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
[제 39항목]
제 31항목 내지 제 38항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 기기는:
단일 모드 광섬유; 및
상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 상기 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기.
10: 용기의 종축, 예를 들면 모세관의 종축
11: 용기, 예를 들면 모세관
12: 연구중인 용해된 입자를 포함하는 샘플
13: 템퍼링 부품, 예를 들면 가열 패드/베드
14: 형광성 광학계
15: DLS 광학계
16: 형광성 초점
17: DLS 초점
18: 형광성 초점과 DLS초점 사이의 x-거리
19: 반사된 빔
20: 모세관과 검출된 전광빔 사이의 각도 (φD)
30: 광 검출기, 예를 들면 DLS 검출기
31: ADC (아날로그/디지털 변환기)
32: 파고 선별기
33: 상관자
34: 필드 프로그램가능 게이트 어레이(FPGA)
35: PC
36: 광자 계수 임계값
38: 디지털 광자 펄스 신호로서의 디지털 출력 신호
39: PMT의 디지털 출력 신호
50: 여기 빔
51: 검출된 빔
52: 대물 렌즈 (또는 대물 거울)
53: 모세관 축과 여기 광선 빔 사이의 각도 (φL)
53`: φL 로 묘사된 모세관 축과 여기 광선 빔 사이의 각도 (φL) - 90 도
54: 여기 광선 빔과 검출된 광선 빔 사이의 각도 (φS)
55: 단색 광원, 예를 들면 레이저
56: 콜리메이팅 렌즈
57: 광섬유 (단일 모드, 대안적으로 편광 보존, 또는 다중 모드)
58: 빔 분할기 전력, 예를 들면 50:50
59: 빔 분할기 파장, 예를 들면 로 패스 620 nm
60: 다이크로익 필터, 예를 들면 형광성을 막기 위해 주파수폭 405/5 nm
61: 편광 필터
62: 상기 레이저의 빔 품질을 개선하기 위한 광학계
63: 미광을 줄이기 위한 구멍
64: 모세관 난시의 교정을 위한 원통형 렌즈
11: 용기, 예를 들면 모세관
12: 연구중인 용해된 입자를 포함하는 샘플
13: 템퍼링 부품, 예를 들면 가열 패드/베드
14: 형광성 광학계
15: DLS 광학계
16: 형광성 초점
17: DLS 초점
18: 형광성 초점과 DLS초점 사이의 x-거리
19: 반사된 빔
20: 모세관과 검출된 전광빔 사이의 각도 (φD)
30: 광 검출기, 예를 들면 DLS 검출기
31: ADC (아날로그/디지털 변환기)
32: 파고 선별기
33: 상관자
34: 필드 프로그램가능 게이트 어레이(FPGA)
35: PC
36: 광자 계수 임계값
38: 디지털 광자 펄스 신호로서의 디지털 출력 신호
39: PMT의 디지털 출력 신호
50: 여기 빔
51: 검출된 빔
52: 대물 렌즈 (또는 대물 거울)
53: 모세관 축과 여기 광선 빔 사이의 각도 (φL)
53`: φL 로 묘사된 모세관 축과 여기 광선 빔 사이의 각도 (φL) - 90 도
54: 여기 광선 빔과 검출된 광선 빔 사이의 각도 (φS)
55: 단색 광원, 예를 들면 레이저
56: 콜리메이팅 렌즈
57: 광섬유 (단일 모드, 대안적으로 편광 보존, 또는 다중 모드)
58: 빔 분할기 전력, 예를 들면 50:50
59: 빔 분할기 파장, 예를 들면 로 패스 620 nm
60: 다이크로익 필터, 예를 들면 형광성을 막기 위해 주파수폭 405/5 nm
61: 편광 필터
62: 상기 레이저의 빔 품질을 개선하기 위한 광학계
63: 미광을 줄이기 위한 구멍
64: 모세관 난시의 교정을 위한 원통형 렌즈
Claims (37)
- 용해된 입자의 특성을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 용해된 입자의 샘플 - 상기 샘플은 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 부피를 가짐 - 을 포함하는 용기를 제공하는 단계;
적어도 하나의 단색 광원 및 적어도 하나의 광 검출기를 제공하는 단계;
단색 광원으로부터의 광을 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 송신하는 단계;
상기 용기로부터 방사된 광을 상기 광 검출기로 검출하는 단계;
바람직하게는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 및/또는 상기 용기의 재질의, 형광성 - 상기 형광성은 바람직하게는 상기 입자의 및/또는 용기의 재질의, 자가형광성임 - 을 측정하는 단계,
및
상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 특성을 DLS(동적 광산란) 측정에 기반하여 결정하는 단계;를 포함하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계;를 더 포함하는, 방법. - 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 방법은:
상기 측정된 형광성에 기반하여 및/또는 상기 측정된 후방 반사에 기반하여 상기 용기의 위치를 결정하는 단계, 및
선택적으로 상기 측정된 형광성 및/또는 후방 반사 및 상기 결정된 용기 위치에 기반하여 상기 용기를 위치시키는 단계;를 포함하는 방법. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은:
나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하는 단계; 및/또는
상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 후방 반사를 측정하는 단계;를 더 포함하는 방법. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
각 용기에 대한 형광성 측정이 각 용기에 대한 DLS 측정에 선행하거나; 또는
각 용기에 대한 상기 DLS 측정이 각 용기에 대한 상기 형광성 측정에 선행하거나; 또는
상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정은 상기 복수의 용기 중 하나에 수행되고 후속하여 상기 복수의 용기 중 다른 용기에 대하여 상기 형광성 측정 및 상기 DLS 측정이 뒤따르는, 방법. - 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단색 광원으로부터의 상기 광은 간섭성이며 바람직하게는 350nm과 500nm사이의 파장, 바람직하게는 405nm, 445nm, 또는 488nm의 파장을 갖는 방법. - 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단색 광원은 레이저, 바람직하게는 다이오드 레이저, 바람직하게는 주파수 안정화 다이오드 레이저, DPSS 레이저, PPLN 더블 다이오드 레이저, 주파수 체배 DPSS 레이저, 다이오드 펌프 광섬유 레이저, 체배 다이오드 펌프 광섬유 레이저 및 다이오드 펌프 업컨버전 광섬유 레이저로 이루어진 집단으로부터 선택된 다이오드 레이저인, 방법. - 제 7항에 있어서,
상기 레이저는 적어도 0.1mm의 간섭 길이를 갖는 방법. - 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
상기 레이저는 1mW와 200mW사이의 전력, 바람직하게는 10mW와 180mW사이, 더 바람직하게는 50mW와 150mW사이, 더욱 더 바람직하게는 75mW와 120mW사이, 예를 들면 100mW인 방법. - 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단색 광은 상기 단색 광원으로부터 레이저 파장 단일 모드 광섬유를 통해서 그리고 바람직하게는 편광 유지가 아닌 단일 모드 광섬유를 통해서 전달되는 방법. - 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단색 광원으로부터의 광은 상기 용기의 종축에 각도 φL로 상기 용기로 송신되며, φL는 0도와 45도 사이인 방법. - 제 11항에 있어서,
상기 검출기로 검출되는 광은 상기 용기의 종축에 각도 φD로 상기 용기로부터 방사되며, φD는 0도와 45도 사이이며, 상기 φL의 값은 바람직하게는 상기 φD의 값과 동일한 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 단색 광원으로부터 상기 용기로 송신되는 상기 광과 상기 광 검출기로 검출된 상기 용기로부터 방사된 상기 광 사이의 각도 φS는 0도와 150도 사이이며, 바람직하게는 10도와 150도 사이이고, 더 바람직하게는 10도와 60도 사이인 방법. - 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 송신된 단색 광은 대물 렌즈를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 상기 용기로부터 방사되는 상기 광은 바람직하게는 또한 상기 대물 렌즈에 의해 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 상기 대물 렌즈는 10mm와 200mm사이의 초점거리를 갖고, 및/또는 상기 송신된 단색 광은 3 μm와 30μm사이의 반값 전폭(FWHM)을 갖는 초점을 갖는 상기 용기로 초점이 맞춰지며, 바람직하게는 0.01nl과 0.1nl사이의 측정 체적, 바람직하게는 0.01nl과 0.02nl사이, 더욱 바람직하게는 약 0.016nl의 측정체적으로 되는, 방법. - 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광 검출기는 광전(자) 증배관, 실리콘 광전(자) 증배관(SiPM), 또는 애벌란시 포토 다이오드(APD) 광자 계수 검출기, 바람직하게는 PMT 또는 SiPM인, 방법. - 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DLS 측정은 5초 미만의 시간내에 수행되며, 바람직하게는 1초 미만의 시간내에 수행되는 방법. - 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DLS 측정은 샘플당 단 1회만 수행되는 방법. - 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DLS 측정을 수행하는 것은 적어도 하나의 상관 연산, 바람직하게는 적어도 하나의 자기상관 연산을 수행하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DLS 측정은:
상기 광 검출기로부터 취득되는 아날로그 출력 신호를 취득하는 단계; 및
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계;를 포함하며,
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 취득된 아날로그 출력 신호를 디지털 출력 신호로 디지털화하는 단계;를 포함하며,
상기 디지털 출력 신호는:
i) 바람직하게는 상기 용기로부터 방사되는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 미만일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 디지털 단일 광자 펄스 신호로 처리하는 단계;
및/또는
ii) 바람직하게는 상기 검출된 광의 강도가 초당 200만 광자 검출 초과일 경우, 상기 디지털 출력 신호를 아날로그 신호의 이산값으로 처리하는 단계로 더 처리되는 방법. - 제 19항에 있어서,
상기 취득된 아날로그 출력 신호를 처리하는 단계는 상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계 중 하나를 포함하며, 상기 디지털 출력 신호를 상기 i) 단계 또는 ii) 단계에 따라 디지털 신호로서 처리할지 결정하는 시간이 1초 미만이며, 바람직하게는 최대 0.05초이며, 바람직하게는 FPGA를 사용하고, 또는
상기 광자 계수 및 아날로그 출력 신호는 동시에 처리되어 단계 i) 또는 ii)에 따라 처리할 상기 결정이 상기 측정 후 행해지는, 방법. - 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
상기 취득된 출력 신호를 처리하는 단계는:
상기 i) 단계 또는 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계; 또는
상기 i) 단계 및 상기 ii) 단계로부터 취득된 상기 처리된 디지털 출력 신호를 저장하는 단계; 및
상기 저장된 출력 신호의 하나를 추가적으로 처리하는 단계;를 포함하는 방법. - 제 1항 또는 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은:
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계;를 더 포함하는 방법. - 제 22항에 있어서,
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하는 단계는 분당 섭씨 0.01도와 분당 섭씨 30도 사이의 템퍼링 속도, 바람직하게는 분당 섭씨 0.1도와 분당 섭씨 10도 사이의 템퍼링 속도, 및/또는 상기 제 1 온도와 상기 제 2 온도는 섭씨 -20도와 섭씨 160도 사이에서 상기 용기를 템퍼링하는 단계;를 포함하는, 방법. - 제 1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
추가적인 광 검출기를 제공하는 단계, 및
상기 추가적인 광 검출기를 사용하여 상기 샘플을 포함하는 상기 용기의 정적 산란광을, 바람직하게는 상기 용기의 종축에 대한 각도 φ로 - 상기 φ는 바람직하게는 10도와 150도 사이, 더욱 바람직하게는 10도와 60도 사이의 각도임 - 측정하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제 1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용기는 모세관 및/또는 다중 웰 플레이트이고, 상기 모세관은, 바람직하게는 둥근 단면을 가지고 0.1mm와 1mm사이의 내경을 가지며 바람직하게는 0.15mm와 0.5mm사이의 내경을 가지며, 바람직하게는 0.2mm와 1.2mm사이의 외경을 가지며 바람직하게는 0.65mm와 1mm사이의 외경을 가지며, 그리고 바람직하게는 5mm와 70mm사이의 길이를 가지며 바람직하게는 32mm와 50mm사이의 길이를 가지며, 더 바람직하게는 약 50mm의 길이를 가지는, 유리 모세관인, 방법. - 제 1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
복수의 용기가 제공되며, 각 용기는 용해된 입자의 샘플을 포함하며, 용해된 입자의 특성은 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 따라 각 용기에 대해 측정되는, 방법. - 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 특성은 입자 크기 분포, 어그리게이션(aggregation) 온도, 용융 온도, 전이 온도, 언폴딩(unfolding) 온도 개시, 액상 분리 (TLLPS) 기복 표면 자유(free folding) 에너지, 제 2 비리알 계수(B22), 입자의 자기상호작용, 콜로이드 안정성, 유체역학적 반경, 입자간에 밀거나 당기는 상호작용 (KD), 용해도, 장기 단백질 안정성 및 임계 변성제 농도로 이루어진 집단으로부터 선택되는 방법. - 바람직하게는 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 따라 용해된 입자의 특성을 검출하는 기기로서, 상기 기기는:
상기 용해된 입자, 바람직하게는 0.1μL 와 15 μL 사이의 상기 입자의 샘플을 포함하는 적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단;
단색 광원 및 광 검출기;
DSL 측정을 수행하기 위한 수단;
바람직하게는 상기 샘플에 포함된 상기 용해된 입자의 및/또는 상기 용기의 재질의, 형광성을 측정하는 단계; 및
제어 수단: - 상기 제어 수단은,
적어도 하나의 용기를 수용하기 위한 수단을 제어하고;
상기 단색 광원으로부터 상기 적어도 하나의 용기까지 광을 송신하기 위한 상기 단색 광원을 제어하고;
상기 적어도 하나의 용기로부터의 신호를 검출하기 위한 상기 광 검출기를 제어하고;
상기 형광성을 측정하기 위한 수단을 제어하고;
상기DSL 측정을 수행하기 위한 수단을 제어하기 위해 적응됨 - ;을 포함하는, 기기. - 제 28항에 있어서, 상기 기기는:
상관 연산, 바람직하게는 자기상관 연산을 수행하기 위한 수단 - 상기 자기상관 연산은 바람직하게는 하드웨어 및/또는 소프트웨어에 구현된 자기상관연산 로직임 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 기기는:
상기 광 검출기로부터 취득된 신호를 디지털화하기 위한 수단 - 상기 광 검출기로부터 취득된 신호를 디지털화하기 위한 수단은 바람직하게는 필드 프로그램 가능 게이트 어레이(FPGA)를 포함하며, 상기 제어 수단은 상기 광 검출기로부터 취득되는 신호를 디지털화하기 위한 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
상기 용해된 입자의 상기 샘플을 수용하기 위한 수단을 위치시키기 위한 포지셔닝 수단 - 상기 제어 수단은 상기 샘플을 수용시키기 위한 상기 포지셔닝 수단을 제어하기 위해 더 적응됨 -을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 온도 제어 시스템 - 상기 제어 수단은 상기 용기를 적어도 제 1 온도로 제 1 시점에서 및 제 2 온도로 제 2 시점에서 시간에 걸쳐 템퍼링(tempering)하기 위한 상기 온도 제어 시스템을 제어하기 위해 더 적응됨 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 수단 및/또는 후방 반사를 측정하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 상기 나노 시차주사 형광측정법 (nano-DSF) 측정을 수행하기 위한 수단 및/또는 상기 후방 반사를 측정하기 위한 수단을 제어하기 위해 더 조정됨 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
추가적인 광 검출기; 및
정적 산란광 측정을 수행하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 상기 정적 산란광 측정을 수행하기 위한 수단을 제어하기 위해 더 조정됨 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
단일 모드 광섬유; 및
상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 수단 - 상기 제어 수단은 상기 단일 모드 광섬유를 통해 상기 단색 광원으로부터 단색 광을 전달하기 위한 수단을 제어하기 위해 더 조정됨 - 을 더 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
상기 DLS 측정을 위한 상기 적어도 하나의 단색 광원;
바람직하게는
상기 형광성 측정을 위한 LED 광원; 및 바람직하게는
상기 후방 반사 측정을 위한 추가적 LED 광원을 포함하는 기기. - 제 28항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기기는:
상기 동적 광산란(DLS) 측정을 위한 상기 적어도 하나의 광 검출기; 바람직하게는
적어도 하나의 추가적인, 바람직하게는 상기 형광성 측정을 위한 2개의 추가적 광 검출기, 및 바람직하게는
상기 후방 반사 측정을 위한 하나의 추가적 광 검출기를 포함하는 기기.
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