CN110411933A - 前向散射光探测系统、流式细胞仪和测量细胞直径的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种前向散射光探测系统、流式细胞仪和测量细胞直径的方法。前向散射光探测系统包括用于发射光线的激光器，在光线的传递路径上依次设置有将光线聚焦形成光斑的聚光元件、将光线改变为平行光的第一透镜和探测接收到的光强的第一探测器，液流系统位于聚光元件和第一透镜之间，还包括遮挡元件，设置为：在液流系统内的细胞未移动经过光斑的横向中心线时使第一探测器探测的光强为第一稳定值，细胞的移动方向垂直于横向中心线，在细胞开始经过横向中心线到完全离开横向中心线的时间内，使第一探测器探测的光强为小于第一稳定值的第二稳定值。本发明提供的前向散射光探测系统、流式细胞仪和测量细胞直径的方法，能够精确测量细胞尺寸。

Description

前向散射光探测系统、流式细胞仪和测量细胞直径的方法

技术领域

本发明涉及医疗仪器领域，特别涉及一种前向散射光探测系统、流式细胞仪和测量细胞直径的方法。

背景技术

流式细胞仪技术是细胞分析的一种非常重要的方法，它已被广泛应用于临床医学、细胞学、生物学、制药学等领域。流式细胞仪是用激光或者氙灯逐个照射到细胞上，细胞对光进行散射以及发射荧光，通过对散射光和荧光的分析对细胞进行分析和分类，它具有检测速度快、检测参数多、分选纯度大等优点。

目前的流式细胞仪主要检测三个参数，细胞对照射光线的前向散射光、侧向散射光和荧光，其中前向散射光和细胞的大小、细胞折射率和细胞表面活性有关，侧向散射光和细胞内部的复杂程度有关，用不同的荧光剂对不同细胞进行标定，可以区分出各类细胞。

在现有技术中，主要通过对前向散射光的光强值来判断细胞的尺寸，用于细胞的初选，细胞尺寸越大前向散射光的强度越强，细胞尺寸越小，前向散射光的强度越弱，由于细胞本身的折射率以及细胞表面的活性也会影响前向散射光的强度，所以仅通过前向散射光的光强来判断细胞的尺寸并不精确。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的无法精确测量细胞尺寸的问题，提供了一种前向散射光探测系统，该前向散射光探测系统能够精确测量细胞尺寸。

本发明的另一目的是为了提供一种包括上述前向散射光探测系统的流式细胞仪。

本发明的再一目的是为了提供一种测量细胞直径的方法。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种前向散射光探测系统，用于流式细胞仪，包括用于发射光线的激光器，在所述光线的传递路径上依次设置有用于将所述光线聚焦形成光斑的聚光元件、用于将所述光线改变为平行光的第一透镜和用于探测接收到的光强的第一探测器，所述流式细胞仪的液流系统位于所述聚光元件和所述第一透镜之间，所述前向散射光探测系统还包括遮挡元件，所述遮挡元件设置为：在所述液流系统内的细胞未移动经过所述光斑的横向中心线时，使所述第一探测器探测的光强为第一稳定值，所述细胞的移动方向垂直于所述横向中心线，在所述细胞开始经过所述横向中心线到完全离开所述横向中心线的时间内，使所述第一探测器探测的光强为小于所述第一稳定值的第二稳定值。

在一些实施例中，所述遮挡元件包括第一遮挡板和第二遮挡板，所述第二遮挡板在所述第一透镜和所述第一探测器之间靠近所述第一探测器设置，所述第一遮挡板设置在所述第二遮挡板和所述液流系统之间，所述第一遮挡板上设置有正对所述横向中心线的第一狭缝，所述第二遮挡板上设置有正对所述横向中心线的第二狭缝，且所述第二狭缝的沿着所述细胞的移动方向的宽度小于或等于所述第一狭缝的沿着所述细胞的移动方向的宽度且大于所述光线的波长。

在一些实施例中，所述第一遮挡板设置在所述液流系统和所述第一透镜之间，且所述第一狭缝位于所述第一透镜的焦点处。

在一些实施例中，所述第一遮挡板设置在所述第一透镜和所述第二遮挡板之间。

在一些实施例中，所述聚光元件包括沿着所述光线的传递路径设置的用于横向聚焦所述光线的第一柱透镜和用于竖向聚焦所述光线以形成所述光斑的第二柱透镜。

本发明第二方面提供一种流式细胞仪，包括液流系统、光线探测系统以及上述的前向散射光探测系统，所述光线探测系统用于探测侧向散射光和荧光。

在一些实施例中，所述液流系统包括能够通入靶液的柱形稳流腔、连接在所述柱形稳流腔底部的锥形汇流腔以及与所述锥形汇流腔的出口连接的毛细管，所述毛细管穿过所述前向散射光探测系统的激光器发射的光线设置，所述柱形稳流腔内设有能够通入细胞悬液且出口与所述锥形汇流腔连通的样品通道。

在一些实施例中，所述光线探测系统包括用于将所述光线经过所述液流系统后的所述侧向散射光和所述荧光改变为平行光的第二透镜以及设置在所述第二透镜下游的用于探测所述侧向散射光的第一探测支路和用于探测所述荧光的第二探测支路。

在一些实施例中，所述第一探测支路包括第一二向色镜、第三透镜和第二探测器，所述第一二向色镜用于将经过所述第二透镜后的所述平行光中的所述侧向散射光反射到所述第三透镜，所述第二探测器用于接收经过所述第三透镜会聚后的所述侧向散射光；和/或，所述第二探测支路包括第二二向色镜、第四透镜和第三探测器，所述第二二向色镜用于将经过所述第二透镜后的平行光线中的所述荧光反射到所述第四透镜，所述第三探测器用于接收经过所述第四透镜进行会聚后的所述荧光。

在一些实施例中，所述流式细胞仪包括细胞分选系统，包括设置在所述液流系统的出液口处的用于对一部分所述细胞施加正电压或负电压的充电装置以及在所述充电装置下方相对间隔设置的第一偏转板和第二偏转板，所述第一偏转板下方设置有用于接收带正电的所述细胞的第一容器，所述第二偏转板下方设置有用于接收带负电的所述细胞的第二容器，所述第一容器和所述第二容器之间设置有位于所述出液口下方的用于接收未带电的另一部分所述细胞的第三容器。

本发明第三方面提供一种测量细胞直径的方法，包括：获取细胞移动通过光斑的垂直于所述细胞的移动方向的横向中心线的时间；获取所述细胞移动通过所述横向中心线的速度；通过获取的所述时间和所述速度计算所述细胞的直径。

在一些实施例中，在所述细胞未经过所述横向中心线时探测的光强为第一稳定值，在所述细胞开始经过所述横向中心线到完全离开所述横向中心线的时间内探测的所述光强为小于所述第一稳定值的第二稳定值，所述获取细胞移动通过光斑的横向中心线的时间包括：记录探测到的所述光强从所述第一稳定值切换为所述第二稳定值的第一时刻；记录探测到的所述光强从所述第二稳定值切换为所述第一稳定值的第二时刻；将所述第二时刻减去所述第一时刻以获得所述细胞移动通过所述光斑的横向中心线的时间。

在一些实施例中，采用上述的流式细胞仪获取所述细胞移动通过所述横向中心线的时间和速度。

在上述技术方案中，由于遮挡元件设置为在液流系统内的细胞未经过光斑的横向中心线时使第一探测器探测的光强为第一稳定值，在细胞开始经过横向中心线到完全离开横向中心线的时间内，使第一探测器探测的光强为小于第一稳定值的第二稳定值，这样第二稳定值持续的时间即为细胞穿过光斑的横向中心线的时间，再配合细胞的运动速度，即可推算出细胞的尺寸，与传统流式细胞仪相比，避免了在测定细胞尺寸时受细胞折射率和细胞活性影响的问题，从而达到精确测量细胞尺寸的效果。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

在不一定按比例绘制的附图中，相同的附图标记可以在不同的视图中描述相似的部件。具有字母后缀或不同字母后缀的相同附图标记可以表示相似部件的不同实例。附图大体上通过举例而不是限制的方式示出各种实施例，并且与说明书以及权利要求书一起用于对所公开的实施例进行说明。在适当的时候，在所有附图中使用相同的附图标记指代同一或相似的部分。这样的实施例是例证性的，而并非旨在作为本装置或方法的穷尽或排他实施例。

图1为本发明第一种实施方式的前向散射光探测系统的结构示意图；

图2为图1的前向散射光探测系统的局部结构图；

图3-图8为细胞经过图2所示的结构的过程的视图；

图9为本发明第二种实施方式的前向散射光探测系统的局部结构图；

图10-图15为细胞经过图9所示的结构的过程的视图；

图16为本发明优选实施方式的流式细胞仪的结构示意图。

附图标记：

1-激光器；2-聚光元件；3-第一透镜；4-第一探测器；51-第一遮挡板；X1-第一狭缝；52-第二遮挡板；X2-第二狭缝；10-液流系统；101-柱形稳流腔；102锥形汇流腔；103-毛细管；104-样品通道；20-光线探测系统；201-第二透镜；B1-第一探测支路；B11-第一二向色镜；B12-第三透镜；B13-第二探测器；B2、B2’、B2”-第二探测支路；B21、B21’-第二二向色镜；B22、B22’、B22”-第四透镜；B23、B23’、B23”-第三探测器；30-前向散射光探测系统；40-细胞分选系统；401-充电装置；402-第一偏转板；403-第二偏转板；R1-第一容器；R2-第二容器；R3-第三容器；C-细胞；Z-中心线；T-直透光；F-前向散射光。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。下面结合附图和具体实施例对本发明的实施例作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其他要素的可能。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。

在本发明中，当描述到特定器件位于第一器件和第二器件之间时，在该特定器件与第一器件或第二器件之间可以存在居间器件，也可以不存在居间器件。当描述到特定器件连接其它器件时，该特定器件可以与所述其它器件直接连接而不具有居间器件，也可以不与所述其它器件直接连接而具有居间器件。

本发明使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本发明所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用字典中定义的术语应当被解释为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非这里明确地这样定义。

对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。

本发明一方面提供了一种前向散射光探测系统，用于流式细胞仪，包括用于发射光线的激光器1，在光线的传递路径上依次设置有用于将光线聚焦形成光斑的聚光元件2、用于将光线改变为平行光的第一透镜3和用于探测接收到的光强的第一探测器4，流式细胞仪的液流系统位于聚光元件2和第一透镜3之间，前向散射光探测系统还包括遮挡元件，遮挡元件设置为：在液流系统内的细胞未移动经过光斑的横向中心线Z时，使第一探测器4探测的光强为第一稳定值，细胞的移动方向垂直于横向中心线Z，在细胞开始经过横向中心线Z到完全离开横向中心线Z的时间内，使第一探测器4探测的光强为小于第一稳定值的第二稳定值。其中，激光器1可以是气体激光器、固体激光器和半导体激光器。

在上述技术方案中，由于遮挡元件设置为在液流系统内的细胞未经过光斑的横向中心线Z时使第一探测器4探测的光强为第一稳定值，在细胞开始经过横向中心线Z到完全离开横向中心线Z的时间内，使第一探测器4探测的光强为小于第一稳定值的第二稳定值，这样第二稳定值持续的时间即为细胞穿过光斑的横向中心线Z的时间，再配合细胞穿过光斑的横向中心线Z的运动速度，即可推算出细胞的尺寸，与传统流式细胞仪相比，避免了在测定细胞尺寸时受细胞折射率和细胞活性的影响，从而达到了精确测量细胞尺寸的效果。

为了实现第一探测器4在细胞未经过光斑的横向中心线Z时和细胞经过光斑的横向中心线Z时探测的光强不同，在一些实施例中，遮挡元件包括第一遮挡板51和第二遮挡板52，第二遮挡板52在第一透镜3和第一探测器4之间靠近第一探测器4设置，第一遮挡板51设置在第二遮挡板52和液流系统之间，第一遮挡板51上设置有正对横向中心线Z的第一狭缝X1，即横向中心线Z与第一狭缝X1的横向中线位于垂直于细胞C的移动方向的同一个平面上，这样第一遮挡板51可挡住光路上的主要光线，防止第一探测器4信号过饱和，并且能够阻挡细胞C的一部分散射光(不是光斑的横向中心线Z附近的光线)通过第一狭缝X1，第二遮挡板52上设置有正对横向中心线Z的第二狭缝，即横向中心线Z与第二狭缝X2的横向中线位于垂直于细胞C的移动方向的同一个平面上，这样第二遮挡板52也可阻挡细胞的一部分散射光(不是光斑的横向中心线Z附近的光线)经过第二狭缝X2，确保通过第一狭缝X1和第二狭缝X2的光线是光斑的横向中心线Z附近的光线，从而使第一探测器4接收到的光强为光斑横向中心线Z附近的光线，且第二狭缝X2的沿着细胞C的移动方向的宽度小于或等于第一狭缝X1的沿着细胞C的移动方向的宽度且大于光线的波长。其中，第二狭缝X2的宽度小于或等于第一狭缝X1的宽度，可使第二遮挡板52更好地阻挡通过第一狭缝X1的散射光通过第二狭缝X2。另外，第一狭缝X1和第二狭缝X2的宽度设定取决于对细胞尺寸测量精度的要求，但是为了防止第一狭缝X1和第二狭缝X2产生衍射效应，第一狭缝X1和第二狭缝X2的宽度应该远大于光线的波长，通常用于流式细胞仪的激光波长为可见光波段和紫外波段，因此第一狭缝X1和第二狭缝X2的宽度可以设置为大于0.01mm(比可见光波段大一个数量级)。

其中，第一遮挡板51的设置位置可以有以下两种方式：

第一种实施方式

如图1-图8所示，优选地，第一遮挡板51设置在液流系统和第一透镜3之间，且第一狭缝X1位于第一透镜3的焦点处。这样前向散射光F入射到第一遮挡板51上的大部分光线被挡住，只有小部分穿过第一狭缝X1，穿过第一狭缝X1后的光线由第一透镜3汇聚成平行光，再通过第二遮挡板52的第二狭缝X2可到达第一探测器4，其中，细胞C散射的不是横向中心线Z附近的光线一部分被第一遮挡板51遮挡而穿过第一狭缝X1和第一透镜3后的部分被第二遮挡板52遮挡，从而确保通过第一狭缝X1和第二狭缝X2的光线是光斑的横向中心线Z附近的光线。

具体地，细胞经过光斑的过程如下：

如图1和图2所示，入射光聚焦到液流系统10的毛细管103(下面将介绍))内部后，被细胞C散射，其中前向散射光F入射到第一遮挡板51上，第一狭缝X1可设置在第一遮挡板51的中心位置且第一狭缝X1的横向中线和入射光在毛细管103中的光斑的横向中心线Z在同一水平线上，以确保通过第一狭缝X1的光线是光斑的中心线Z位置附近的光线，如图3所示。入射到第一遮挡板51上的大部分光线被挡住，只有小部分光线穿过第一狭缝X1后由第一透镜3汇聚成平行光，再通过第二遮挡板52的第二狭缝X2后，到达第一探测器4。其中，第二狭缝X2的横向中线和入射光在毛细管103中的光斑的横向中心线Z在同一水平线上，同样是为了确保通过第二狭缝X2的光线是光斑的中心线Z位置附近的光线。

图3是细胞C未到达入射光线在毛细管103中的聚焦光斑的位置时，入射光线没有被散射，光线依次通过第一遮挡板51、第一透镜3和第二遮挡板52，只有一小部分光线通过第一狭缝X1和第二狭缝X2到达第一探测器4，此时第一探测器4探测到的光强是第一稳定值。

如图4所示，细胞C到达毛细管103中的聚焦光斑位置，但是未到达聚焦光斑的中心线Z位置附近，有一部分光线被细胞C散射，例如图中的散射光S1和散射光S2，散射光S1被第一遮挡板51遮挡，散射光S2可以通过第一遮挡板51的第一狭缝X1，但是被第二遮挡板52遮挡，很少有散射光线同时通过第一遮挡板51和第二遮挡板52，所以第一探测器4探测到的光强基本不变，即也是第一稳定值。

如图5所示，细胞C到达毛细管103中的聚焦光斑的中心线Z位置附近，和图4一样，图中的散射光S3被第一遮挡板51遮挡，散射光S4可以通过第一遮挡板51的第一狭缝X1，但是被第二遮挡板52遮挡，且由于穿过细胞C的直透光T部分被散射，此时第一探测器4所探测到的光强会发生变化，即改变为第二稳定值。根据事先的程序设定，此时相关程序开始计时。

如图6所示，细胞C完全进入毛细管103的聚焦光斑中，和图5一样，中心线Z附近的直透光T由于细胞C的遮挡和散射而发生变化，同时散射光很难同时通过第一狭缝X1和第二狭缝X2而进入第一探测器4，因此第一探测器4探测得到的光强未恢复到正常值，即第一探测器4探测得到的光强未恢复为第一稳定值，仍旧为第二稳定值。

如图7所示，细胞C的另外一侧位于聚焦光斑的中心线Z位置附近，和图5一样，细胞C的边缘对中心线Z附近的光线进行散射，例如图中的散射光S7和散射光S8，散射光S7被第一遮挡板51遮挡，散射光S8可以通过第一遮挡板51的第一狭缝X1，但是被第二遮挡板52遮挡，且由于穿过细胞C的直透光T部分被散射，所以第一探测器4探测到的光强依然未恢复到正常值，仍旧为第二稳定值。

如图8所示，细胞C的另外一侧离开聚焦光斑的中心线Z位置，但是还没有完全离开聚焦光斑，此时中心线Z位置附近的光线没有被散射，不是中心线Z附近的散射光线也到达不了第一探测器4中，所以第一探测器4接受到的信号恢复正常值，即第一稳定值。当第一探测器4所探测到的光强信号刚恢复正常值时，程序所设定的计时器停止计时。

程序根据第一探测器4探测到的光强为第二稳定值的时间以及液滴的下落速度，可以计算出细胞的直径值，具体地，将第一探测器4探测到的光强为第二稳定值的时间乘以液滴的下落速度即可获得细胞的直径值。其中，液滴的下落速度可在仪器使用之前得到标定，不同细胞悬液、鞘液、仪器结构会有不同的下落速度值。

第二种实施方式

如图9-图15所示，优选地，第一遮挡板51设置在第一透镜3和第二遮挡板52之间。在该实施方式中，前向散射光F先通过第一透镜3聚焦成平行光束，然后再通过第一遮挡板51和第二遮挡板52，其中大部分光线被第一遮挡板51和第二遮挡板52遮挡，只有位于聚焦光斑中心线Z位置附近的光线才能通过第一遮挡板51的第一狭缝X1和第二遮挡板52的第二狭缝X2。

另外，在图9-图15中，细胞C经过光斑的过程与图2-图8类似，其中，散射光S1、S3、S5、S6、S7、S9被第一遮挡板51遮挡，散射光S2、S4、S8、S10、S7、S9可以通过第一遮挡板51的第一狭缝X1，但是被第二遮挡板52遮挡。

如图1所示，为了形成光强分布均匀的光斑，在一些实施例中，聚光元件2包括沿着光线的传递路径设置的用于横向聚焦光线的第一柱透镜和用于竖向聚焦光线以形成光斑的第二柱透镜。其中，光斑的形状可为椭圆形。光斑照射到液流系统10的毛细管103内的细胞上，产生三种光：一是前向散射光F，二是侧向散射光，三是荧光染料吸收入射光后激发出的荧光。

本发明第二方面提供一种流式细胞仪，包括液流系统10、光线探测系统20以及上述的前向散射光探测系统30，所述光线探测系统20用于探测侧向散射光和荧光。由于该流式细胞仪包括上述前向散射光探测系统，因此具有该前向散射光探测系统所有或至少部分优点。

如图16所示，在一些实施例中，液流系统10包括能够通入靶液的柱形稳流腔101、连接在柱形稳流腔101底部的锥形汇流腔102以及与锥形汇流腔102的出口连接的毛细管103，毛细管103穿过前向散射光探测系统30的激光器1发射的光线设置，柱形稳流腔101内设有能够通入细胞悬液且出口与锥形汇流腔102连通的样品通道104。其中，待测样品，即细胞悬液，放置于液流系统的样品通道104内，鞘液放置于液流系统的柱形稳流腔101内，细胞悬液和鞘液同时经过锥形汇流腔102并流入到毛细管103中，鞘液的作用是包裹在细胞的周围，使得细胞悬液中的细胞C处于毛细管103的中心位置，一方面使得聚焦在毛细管103中的激光可以充分照射到细胞C上，另外一方面可以防止细胞C在毛细管103内阻塞，并且每种细胞C都由特定的荧光染料标记。

为了能够探测侧向散射光和荧光，在一些实施例中，光线探测系统20包括用于将光线经过液流系统10后的侧向散射光和荧光改变为平行光的第二透镜201以及设置在第二透镜201下游的用于探测侧向散射光的第一探测支路B1和用于探测荧光的第二探测支路B2。

在一些实施例中，第一探测支路B1包括第一二向色镜B11、第三透镜B12和第二探测器B13，第一二向色镜B11用于将经过第二透镜201后的平行光中的侧向散射光反射到第三透镜B12，第二探测器B13用于接收经过第三透镜B12会聚后的侧向散射光。可选择地，第二探测支路B2包括第二二向色镜B21、第四透镜B22和第三探测器B23，第二二向色镜B21用于将经过第二透镜201后的平行光线中的荧光反射到第四透镜B22，第三探测器B23用于接收经过第四透镜B22进行会聚后的荧光。光线探测系统20可包括多个第二探测支路，以分别用于探测不同颜色的荧光。如图16所示，光线探测系统20还可包括第二探测支路B2’和B2”，第二探测支路B2’包括第二二向色镜B21’、第四透镜B22’和第三探测器B23’，第二二向色镜B21’用于将经过第二透镜201和第二二向色镜B21后的平行光线中的荧光反射到第四透镜B22’，第三探测器B23’用于接收经过第四透镜B22’进行会聚后的荧光。第二探测支路B2”包括第二二向色镜B21’、第四透镜B22”和第三探测器B23”，透过第二二向色镜B21’的荧光射入第四透镜B22”，第三探测器B23”用于接收经过第四透镜B22”进行会聚后的荧光。

具体地，侧向散射光和荧光经过第二透镜201后变为准平行光，依次经过第一二向色镜B11、第二二向色镜B21、第二二向色镜B21’进行分光，二向色镜的作用是对某一波段的光线反射，而对其他波段的光线透射，根据实际需求，二向色镜对不同波段的反射和透射也有不同的设定，例如：第一二向色镜B11对侧向散射光所处的波段，也就是激光器1的发射光波段进行反射，而对其他波段透射，于是由荧光染料吸收激发光后所发射的荧光透射过第一二向色镜B11。第二二向色镜B21可以设定为对红光反射，对其他光透射；第二二向色镜B21’可以设定为对绿光反射，对其他光透射。

在图16中，第一二向色镜B11对侧向散射光反射，对荧光透射，侧向散射光由第三透镜B12会聚，入射到第二探测器B13中。第二二向色镜B21对某一波段的荧光反射而对其他波段的光透射，由第四透镜B22会聚，入射到第三探测器B23中。第二二向色镜B21’对某一波段的荧光反射，其他波段的光透射，由第五透镜B22’会聚，入射到第四探测器B23’中。透射过第二二向色镜B21’的荧光则由第六透镜B22”会聚到第五探测器B23”中。

将探测器探测到的信号输入到计算机程序中进行分析，即可根据前向散射光信号、侧向散射光信号和荧光信号来判断细胞的类别。

为了实现对不同的细胞进行分类，在一些实施例中，流式细胞仪包括细胞分选系统40，包括设置在液流系统10的出液口(例如毛细管103的喷嘴处，细胞C穿过毛细管103后由该喷嘴滴出)处的用于对一部分细胞施加正电压或负电压的充电装置401以及在充电装置401下方相对间隔设置的第一偏转板402和第二偏转板403，第一偏转板402下方设置有用于接收带正电的细胞的第一容器R1，第二偏转板403下方设置有用于接收带负电的细胞的第二容器R2，第一容器R1和第二容器R2之间设置有位于出液口下方的用于接收未带电的另一部分细胞的第三容器R3。其中，充电装置401的作用是根据计算机程序对细胞类别的判定，给含有不同细胞C的液滴施加正电压和负电压，或者不加电压。在充电装置401下方是两块电压板，即第一偏转板402和第二偏转板403，例如，两块电压板的电压可分别为+150V和-150V，由于一些液滴被施加了电压，带正电的液滴朝向第一偏转板402偏转后进入第一容器R1，带负电的液滴朝向第二偏转板403偏转后进入第二容器R2，没施加电的液滴为废液，进入第三容器R3，这样就实现了对不同细胞的分类。

本发明的流式细胞仪，在前向散射光F的后端，第一探测器4的前方设置第一遮挡板51和第二遮挡板52，第一遮挡板51上设置有第一狭缝X1，第二遮挡板52上设置有第二狭缝X2，第一狭缝X1和第二狭缝X2与聚焦光斑的中心线Z位置对应。当细胞C未达到聚焦光斑时，第一探测器4探测到的光强是第一稳定值；当细胞C到达聚焦光斑但是未到达聚焦光斑的中心线Z位置时，细胞C对光线有散射，但是散射光线不容易通过第一狭缝X1和第二狭缝X2而到达第一探测器4，大部分散射光线被第一遮挡板51和第二遮挡板52遮挡，因此第一探测器4所探测到的光强依然是第一稳定值；当细胞C达到聚焦光斑的中心线Z位置时，中心线Z附近的光线被散射，散射光线会被第一遮挡板51和第二遮挡板52遮挡，第一探测器4的光强值会减弱，此时开始计时，直到细胞C离开中心线Z位置，光强重新恢复到正常值后停止计时，根据细胞C穿越中心线Z的时间以及细胞C穿过中心线Z的运动速度可以推算细胞C的直径，具体地，将第一探测器4探测到的光强为第二稳定值的时间乘以液滴的下落速度即可获得细胞的直径值，与传统流式细胞仪相比，避免了在测定细胞尺寸受细胞折射率和细胞活性的影响，从而达到了精确测量细胞尺寸的效果。

本发明第三方面提供一种测量细胞直径的方法，包括：获取细胞移动通过光斑的垂直于细胞的移动方向的横向中心线Z的时间；获取细胞移动通过横向中心线Z的速度；通过获取的时间和速度计算细胞的直径。这样通过细胞穿过光斑的横向中心线Z的时间，再配合细胞的运动速度，即可推算出细胞C的尺寸，具体地，将细胞C移动通过光斑的横向中心线Z的时间乘以细胞C移动通过横向中心线Z的速度即可获得细胞C的直径尺寸，可免受细胞折射率和细胞活性的影响，从而达到了精确测量细胞尺寸的效果。

在一些实施例中，在细胞未经过横向中心线Z时探测的光强为第一稳定值，在细胞C开始经过横向中心线Z到完全离开横向中心线Z的时间内探测的光强为小于第一稳定值的第二稳定值，获取细胞C移动通过光斑的横向中心线Z的时间包括：记录探测到的光强从第一稳定值切换为第二稳定值的第一时刻；记录探测到的光强从第二稳定值切换为第一稳定值的第二时刻；将第二时刻减去第一时刻以获得细胞C移动通过光斑的横向中心线Z的时间。例如，第一时刻记录为0，即在第一时刻开始计时，则在第二时刻记录的时间即为细胞C移动通过光斑的横向中心线Z的时间。并且，在一些实施例中，采用上述的流式细胞仪获取细胞C移动通过横向中心线Z的时间和速度。

此外，尽管已经在本文中描述了示例性实施例，其范围包括任何和所有基于本发明的具有等同元件、修改、省略、组合(例如，各种实施例交叉的方案)、改编或改变的实施例。权利要求书中的元件将被基于权利要求中采用的语言宽泛地解释，并不限于在本说明书中或本申请的实施期间所描述的示例，其示例将被解释为非排他性的。因此，本说明书和示例旨在仅被认为是示例，真正的范围和精神由以下权利要求以及其等同物的全部范围所指示。

以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如，上述示例(或其一个或更多方案)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施例。另外，在上述具体实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简单化本发明。这不应解释为一种不要求保护的公开的特征对于任一权利要求是必要的意图。相反，本发明的主题可以少于特定的公开的实施例的全部特征。从而，以下权利要求书作为示例或实施例在此并入具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的实施例，并且考虑这些实施例可以以各种组合或排列彼此组合。本发明的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求赋权的等同形式的全部范围来确定。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (13)

1.一种前向散射光探测系统，用于流式细胞仪，其特征在于，包括用于发射光线的激光器(1)，在所述光线的传递路径上依次设置有用于将所述光线聚焦形成光斑的聚光元件(2)、用于将所述光线改变为平行光的第一透镜(3)和用于探测接收到的光强的第一探测器(4)，所述流式细胞仪的液流系统位于所述聚光元件(2)和所述第一透镜(3)之间，所述前向散射光探测系统还包括遮挡元件，所述遮挡元件设置为：在所述液流系统内的细胞(C)未移动经过所述光斑的横向中心线(Z)时，使所述第一探测器(4)探测的光强为第一稳定值，所述细胞(C)的移动方向垂直于所述横向中心线(Z)，在所述细胞(C)开始经过所述横向中心线(Z)到完全离开所述横向中心线(Z)的时间内，使所述第一探测器(4)探测的光强为小于所述第一稳定值的第二稳定值。

2.根据权利要求1所述的前向散射光探测系统，其特征在于，所述遮挡元件包括第一遮挡板(51)和第二遮挡板(52)，所述第二遮挡板(52)在所述第一透镜(3)和所述第一探测器(4)之间靠近所述第一探测器(4)设置，所述第一遮挡板(51)设置在所述第二遮挡板(52)和所述液流系统之间，所述第一遮挡板(51)上设置有正对所述横向中心线(Z)的第一狭缝(X1)，所述第二遮挡板(52)上设置有正对所述横向中心线(Z)的第二狭缝(X2)，且所述第二狭缝(X2)的沿着所述细胞(C)的移动方向的宽度小于或等于所述第一狭缝(X1)的沿着所述细胞(C)的移动方向的宽度且大于所述光线的波长。

3.根据权利要求2所述的前向散射光探测系统，其特征在于，所述第一遮挡板(51)设置在所述液流系统和所述第一透镜(3)之间，且所述第一狭缝(X1)位于所述第一透镜(3)的焦点处。

4.根据权利要求2所述的前向散射光探测系统，其特征在于，所述第一遮挡板(51)设置在所述第一透镜(3)和所述第二遮挡板(52)之间。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的前向散射光探测系统，其特征在于，所述聚光元件(2)包括沿着所述光线的传递路径设置的用于横向聚焦所述光线的第一柱透镜和用于竖向聚焦所述光线以形成所述光斑的第二柱透镜。

6.一种流式细胞仪，其特征在于，包括液流系统(10)、光线探测系统(20)以及根据权利要求1-5中任一项所述的前向散射光探测系统(30)，所述光线探测系统(20)用于探测侧向散射光和荧光。

7.根据权利要求6所述的流式细胞仪，其特征在于，所述液流系统(10)包括能够通入靶液的柱形稳流腔(101)、连接在所述柱形稳流腔(101)底部的锥形汇流腔(102)以及与所述锥形汇流腔(102)的出口连接的毛细管(103)，所述毛细管(103)穿过所述前向散射光探测系统(30)的激光器(1)发射的光线设置，所述柱形稳流腔(101)内设有能够通入细胞(C)悬液且出口与所述锥形汇流腔(102)连通的样品通道(104)。

8.根据权利要求6所述的流式细胞仪，其特征在于，所述光线探测系统(20)包括用于将所述光线经过所述液流系统(10)后的所述侧向散射光和所述荧光改变为平行光的第二透镜(201)以及设置在所述第二透镜(201)下游的用于探测所述侧向散射光的第一探测支路(B1)和用于探测所述荧光的第二探测支路(B2)。

9.根据权利要求8所述的流式细胞仪，其特征在于：

所述第一探测支路(B1)包括第一二向色镜(B11)、第三透镜(B12)和第二探测器(B13)，所述第一二向色镜(B11)用于将经过所述第二透镜(201)后的平行光线中的所述侧向散射光反射到所述第三透镜(B12)，所述第二探测器(B13)用于接收经过所述第三透镜(B12)会聚后的所述侧向散射光；和/或，

所述第二探测支路(B2)包括第二二向色镜(B21)、第四透镜(B22)和第三探测器(B23)，所述第二二向色镜(B21)用于将经过所述第二透镜(201)后的所述平行光中的所述荧光反射到所述第四透镜(B22)，所述第三探测器(B23)用于接收经过所述第四透镜(B22)进行会聚后的所述荧光。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的流式细胞仪，其特征在于，所述流式细胞仪包括细胞(C)分选系统(40)，包括设置在所述液流系统(10)的出液口处的用于对一部分所述细胞(C)施加正电压或负电压的充电装置(401)以及在所述充电装置(401)下方相对间隔设置的第一偏转板(402)和第二偏转板(403)，所述第一偏转板(402)下方设置有用于接收带正电的所述细胞(C)的第一容器(R1)，所述第二偏转板(403)下方设置有用于接收带负电的所述细胞(C)的第二容器(R2)，所述第一容器(R1)和所述第二容器(R2)之间设置有位于所述出液口下方的用于接收未带电的另一部分所述细胞(C)的第三容器(R3)。

11.一种测量细胞直径的方法，其特征在于，包括：

获取细胞(C)移动通过光斑的垂直于所述细胞(C)的移动方向的横向中心线(Z)的时间；

获取所述细胞(C)移动通过所述横向中心线(Z)的速度；

通过获取的所述时间和所述速度计算所述细胞(C)的直径。

12.根据权利要求11所述的测量细胞直径的方法，其特征在于，在所述细胞(C)未经过所述横向中心线(Z)时探测的光强为第一稳定值，在所述细胞(C)开始经过所述横向中心线(Z)到完全离开所述横向中心线(Z)的时间内探测的所述光强为小于所述第一稳定值的第二稳定值，所述获取细胞(C)移动通过光斑的横向中心线(Z)的时间包括：

记录探测到的所述光强从所述第一稳定值切换为所述第二稳定值的第一时刻；

记录探测到的所述光强从所述第二稳定值切换为所述第一稳定值的第二时刻；

将所述第二时刻减去所述第一时刻以获得所述细胞(C)移动通过所述光斑的横向中心线(Z)的时间。

13.根据权利要求11或12所述的测量细胞直径的方法，其特征在于，采用根据权利要求6-10中任一项所述的流式细胞仪获取所述细胞(C)移动通过所述横向中心线(Z)的时间和速度。