CN111855544A - 一种荧光成像装置及其成像方法 - Google Patents

一种荧光成像装置及其成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种荧光成像装置及其成像方法，本发明装置包括至少一激光器、分光装置、流动室、第一探测单元及荧光成像单元；第一探测单元包括第一探测器，第一探测器用于检测所述第一散射光信号的第一部分，以识别颗粒的特征；荧光成像单元用于分析第二照明光路的散射光信号和荧光探测信号，荧光成像单元包括第二探测器，第二探测器用于检测所述第二散射光信号和第二荧光探测信号，以进行成像分析。本发明可有效解决现有技术中细胞成像分析效率低的问题，通过增加荧光成像光路系统可以获取颗粒图像，同时还能识别颗粒的特征信息，将能量探测与成像分析相结合，使分析方式多元化，且分析分选颗粒的速度快、效率高，使得颗粒分选的准确性也大大提高。

Description

一种荧光成像装置及其成像方法
技术领域
本发明涉及光学分析领域，尤其涉及一种荧光成像装置及其成像方法。
背景技术
由于不同的细胞成分能被激发的荧光波长、能量不同，不同形貌的细胞被激发的能量也不同，现有的流式细胞分析装置通过获取细胞的荧光能量判断细胞成分，再根据大量细胞的成分统计来分选细胞，通过激光器照射被充电偏转的液滴，并通过探测器检测液滴中的荧光信号，若充电延时不准确，则在非分选通道可以检测到荧光信号，因此需要调整充电延时，使所有荧光信号均出现在分选通道。但是利用传统的方法来调整充电延需要多次测量才能获得准确的充电延时时间，其耗费时间长，操作不方便，效率低。
发明内容
针对上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种荧光成像装置及其成像方法。相对于现有技术来说，本发明可以实现自动调整充电延时，有效提高了分选效率。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种荧光成像装置，所述装置包括至少一激光器、分光装置、流动室、第一探测单元及荧光成像单元；
所述激光器用于发射至少一种激光；
所述分光装置用于将所述激光器发射的激光分散为第一照明光路和第二照明光路，所述第一照明光路和第二照明光路分别照射至所述流动室；
所述流动室用于限制所述颗粒的流动，第一照明光路和第二照明光路照射经过流动室的液流产生第一照射光斑和第二照射光斑，所述颗粒经过所述第一照射光斑产生第一光信号，所述颗粒经过第二照射光斑产生第二光信号，所述第一光信号包括第一散射光信号和第一荧光探测信号，所述第二光信号包括第二散射光信号和第二荧光探测信号；
所述第一探测单元用于分析第一照明光路的散射光信号，所述第一探测单元包括第一探测器，所述第一探测器用于检测所述第一散射光信号的第一部分，以识别颗粒的特征；
所述荧光成像单元用于分析第二照明光路的散射光信号和荧光探测信号，所述荧光成像单元包括第二探测器，所述第二探测器用于检测所述第二散射光信号和第二荧光探测信号，以进行成像分析。
进一步的，所述第一探测单元还包括第三探测器，所述第三探测器用于检测所述第一散射光信号的第二部分和荧光探测信号，以识别颗粒的特征。
进一步的，还包括第一反射装置，所述第一反射装置设置于所述分光装置的一侧，所述第一反射装置的角度可调，以用于调节所述第二照明照明光路在所述流动室的位置。
进一步的，所述荧光成像装置还包括荧光成像光路系统，所述荧光成像光路系统用于获取颗粒图像；所述荧光成像光路系统包括第六镜头及第四探测器，所述第六镜头用于将颗粒二次成像，所述第四探测器用于对所述二次成像进行拍摄。
进一步的，还包括放大成像系统，所述放大成像系统用于将所述第一照射光斑与第二照射光斑之间的间隔放大，所述放大成像系统包括第四镜头和第五镜头。
进一步的，还包括第二反射装置和第八镜头，所述第二反射装置用于将第一光信号反射，所述第八镜头用于将所述反射的第一光信号分别反射成用于第三探测器接收的侧向散射光路和侧向荧光光路。
一种利用上述荧光成像装置进行荧光成像的方法，包括以下步骤：
第一探测器采集第一散射光信号的第一部分和/或第三探测器采集第一散射光信号的第二部分及第一荧光信号；
第一探测器处理第一散射光信号的第一部分和/或第三探测器处理散射光信号的第二部分及第一荧光信号，以根据处理结果识别颗粒的特征；
根据识别颗粒的特征判断是否通过荧光光路系统获取图像；当颗粒的特征不符合条件，荧光光路系统不获取图像或当颗粒的特征符合条件时，荧光光路系统获取图像；
获取图像后对所述图像进行保存与预处理；
对所述预处理的图像进行二次处理；
对所述二次处理的图像进行显示；
进一步的，在获取图像之前可以检测颗粒从第一照射光斑到达第二照射光斑的时间间隔t，所述时间间隔t的计算公式如下：
t＝y'/v
其中，v为颗粒运行速度，y'为第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距。
进一步的，所述第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距y’的计算公式如下：
y'＝f×tan(α)
其中α为调节前第二照明光路与调节后第二照明光路之间的夹角，f为照明镜头的焦距。
进一步的，所述图像的获取可以择一选取或全部选取。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
本发明可以有效解决现有技术中细胞成像分析效率低的问题，通过增加荧光成像光路系统可以获取颗粒图像，同时还能识别颗粒的特征信息，将能量探测与成像分析相结合，使分析方式多元化，且分析分选颗粒的速度快、效率高，使得颗粒分选的准确性也大大提高。
附图说明
图1示出了本发明实施例一种荧光成像装置及其成像方法中荧光成像装置的结构示意图。
图2示出了本发明实施例一种荧光成像装置及其成像方法中荧光成像装置中反射装置角度调节的示意图。
图3示出了本发明实施例一种荧光成像装置及其成像方法中荧光成像光路的结构示意图。
图4示出了本发明实施例一种荧光成像方法的流程示意图。
图5示出了本发明实施例一种荧光成像方法中前向散射光和侧向散射光图谱中较难分辨出A类细胞与B类细胞的示意图。
图6示出了本发明实施例一种荧光成像方法中前向散射光和侧向散射光图谱中明显区分出A类细胞与B类细胞的示意图。
图7示出了本发明实施例一种荧光成像方法中荧光光路较难分辨出A1和A2细胞。
图8示出了本发明实施例一种荧光成像方法中荧光光路明显区分出A1和A2细胞。
附图中标记：101、激光器；102、第一镜头；103、分光装置；104、第一反射装置；105、第一光阑；106、第二镜头；107、第二光阑；108、第一探测器；109、第三镜头；110、第二探测器；111、第三探测器；112、第一照明光路；113、第二照明光路；114、流动室；201、第一照射光斑；202、第二照射光斑；301、第四镜头；302、第五镜头；303、第二反射装置；304、第三光阑；305、第六镜头；306、第四探测器；307、第七镜头；308、侧向散射光路；309、第八镜头；310、侧向荧光光路。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施方式对本发明提出的一种荧光成像装置及其成像方法作进一步详细说明。根据下面说明，本发明的优点和特征将更清楚。需要说明的是，附图采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施方式的目的。为了使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，请参阅附图。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
请参考图1，一种荧光成像装置，所述装置包括至少一激光器101、分光装置103、流动室114、第一探测单元及荧光成像单元。
激光器101用于发射至少一种激光，激光照射至流动室114中任意位置点的颗粒上，本实施例提供的液滴延时计算装置中，所述激光器101为一个单波长激光器，通过更换不同的波长的激光器选择照明激发波长。
在本发明的另一实施例中，所述激光器101可以为多个激光器，同时用作照明激发光源。或选择特定波长组合作为照明激发光源，也可以是白光激光器，通过分光/滤光装置，选择特定波长作为照明激发光源。
分光装置103用于将激光器101发射的激光分散为第一照明光路112和第二照明光路113，第一照明光路112和第二照明光路113分别照射至流动室114，其中第一照明光路112照射至流动室114内的液流后产生第一照射光斑，第二照明光路113照射至流动室114内的液流后产生第二照射光斑。在本实施例提供的荧光成像装置中，所述分光装置103可优选为平板或棱镜。
在本发明实施例提供的荧光成像装置中，所述荧光成像装置还包括第一镜头102，所述第一镜头102设置于所述激光器101的发射端，优选的，所述第一镜头102为照明镜头，所述照明镜头用于将第一照明光路112和第二照明光路113汇聚至流动室114的的中心(如图2所示)，汇聚处光斑轮廓为椭圆形，所述椭圆形的窄边沿着液流方向。
所述流动室114用于限制颗粒的流动，例如，所述流动室114仅允许一个颗粒通过，用荧光素标记法、荧光染料上色等方法标记颗粒，使标记后的颗粒受第一照射光斑产生第一光信号，颗粒经过第二照射光斑产生第二光信号，第一光信号包括第一散射光信号和第一荧光探测信号，第二光信号包括第二散射光信号和第二荧光探测信号。
上述颗粒可以是细胞、细菌等包括但不限于生物学的微粒物质，例如微生物、核糖体、染色体、线粒体、细胞器官等，所述微生物包括例如大肠杆菌等细菌、例如烟草花叶病毒等病毒、例如酵母等真菌，所述生物学的颗粒还包括核酸、蛋白质及其复合物等有关生物学的聚合物；所述颗粒也可以是人造颗粒，例如乳胶粒、凝胶粒、工业颗粒等，所述工业颗粒包括但不限于由有机聚合材料、无机材料以及金属材料等形成的颗粒，所述有机聚合材料包括聚苯乙烯等，所述无机材料包括玻璃、二氧化硅、磁性材料等，所述金属材料包括金属胶体等。尽管微粒物质的形状通常是球形，所述颗粒可具有非球形形状。此外，所述颗粒的大小、质量等也不受限制。例如，所述颗粒被样本液包裹，可以在液流室中流动。
下面描述第一探测单元的具体结构：
请参考图1，所述第一探测单元用于分析第一照明光路的散射光信号，第一探测单元包括第一探测器108，第一探测器108用于检测第一散射光信号的第一部分，所述第一散射光信号的第一部分可以称为前向散射光(forward scatter，FSC)，通过检测该前向散射光来识别颗粒的特征，具体为识别所述颗粒的大小，优选的，本发明提供荧光成像装置中，所述第一探测器108为光电二极管探测器(PDA)或光电倍增管(PDF)中的任意一种。
在本发明的一可选实施例中，所述第一探测单元还包括从前向后依次布置的第一光阑105、第二镜头106及第二光阑107，所述第一光阑105用于消除前向散射光中的照明直射光，所述第二镜头106用于接收前向散射光的散射信号，所述第二光阑107用于消除视场外的杂光，该第二光阑设置于第一探测器108的接收端之前。
请参考图1，所述第一探测单元还包括第三探测器111，所述第三探测器111用于检测第一散射光信号的第二部分和荧光探测信号，所述第一散射光信号的第二部分称为侧向散射光(side scatter，SSC)，所述第三探测器用于识别颗粒的特征，所述特征为一个或多个，所述颗粒的特征具体为所述颗粒的内部成分、所述颗粒的结构、所述颗粒的复杂度。所述颗粒的复杂度可以包括颗粒表面的微观信息，例如颗粒表面的粗糙程度。
请参考图1，荧光成像单元用于分析第二照明光路的散射光信号和荧光探测信号，荧光成像单元包括第二探测器110，该第二探测器110为荧光成像探测器，第二探测器110用于检测第二散射光信号和第二荧光探测信号，以获取颗粒的荧光特征信息并进行成像分析。
上述第一散射光信号和第一荧光探测信号可以称为侧向探测光路，上述第二散射光信号和第二荧光探测信号可以称为荧光探测光路。
上述获取荧光特征信息具体为使用不同的荧光素或荧光染料标记颗粒，不同的颗粒中包含的特征物不同，所述特征物可以是不同的细胞质，例如抗原、DNA、RNA等。包含不同的特征物的颗粒在被标记后对应的荧光特征信息也不同。所述荧光特征信息包括颗粒以下特征中的一个或多个：颗粒的荧光波长，颗粒的荧光能量，颗粒包含的荧光素含量，颗粒中包含的特征物，颗粒中包含的各特征物的数量。
请参考图1，在本发明的一可选实施例中，所述第二探测器110和第三探测器111共用一个第三镜头109，所述第三镜头109设置于第二探测器110和第三探测器111的信号接收端之前，优选的，所述第三镜头109优选为显微物镜，所述显微物镜的数值孔径大于0.6mm，视场大于0.5mm。
请参考图1和图2，在本发明实施例提供的荧光成像装置中，还包括第一反射装置104，所述反射装置104的角度调节实现第二照明光路113在流动室114中的位置可调，优选的，所述反射装置104为平面反射镜或反射棱镜。例如，当调整反射装置104的反射角度之前，所述第二照明光路113与第一照明光路112共同汇聚至流动室114的中心，当调整反射装置104的反射角度之后，第二照明光路113不在与第一照明光路112共同汇聚至流动室114的中心，第二照明光路113照射于流动室114的另一位置并形成第二照射光斑，使第二照射光斑与第一照射光斑之间具有间隔可调，请参考图2，第一照明光路与第二照明光路之间的夹角为α。
下面具体描述荧光成像光路系统的结构：
请参考图1和图3，上述荧光成像装置还包括荧光成像光路系统，荧光成像光路系统用于获取颗粒图像。荧光成像光路系统包括第六镜头305及第四探测器306，第六镜头305用于将颗粒二次成像，第四探测器306用于对二次成像进行拍摄。优选的，本实施例提供的荧光成像装置中，所述第六镜头305为二次成像镜头，所述第四探测器306为高速相机，所述二次成像镜头将颗粒的像二次成像至高速相机，所述高速相机每秒至少拍1000张照片，且分辨率高于30万像素。
所述荧光成像光路系统还包括放大成像系统，所述放大成像系统包括第四镜头301和第五镜头302，其中第四镜头301设置于流动室114发出信号的一侧，所述第五镜头302位于第四镜头301之后，优选的，所述第四镜头301为显微物镜，所述显微物镜的数值孔径大于0.6，视场大于0.5mm，所述第五镜头302为管镜，所述放大成像系统用于将第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距放大，放大倍率为大于10倍的倍数，例如20倍、40倍、60倍、100倍等。
第一照射光斑201与第二照射光斑202之间的光斑间距根据不同放大倍率改变，例如当放大倍率为10倍时，第一照射光斑201与第二照射光斑202之间的的间距为0.5mm。当放大倍率为50倍时，第一照射光斑201与第二照射光斑202之间的的间距为0.1mm。
在本发明的可选实施例中，所述荧光成像光路系统还具有第三光阑304，第三光阑304也为视场光阑并用于消除杂光，该第三光阑304为于第六镜头305与第五镜头302之间。
请参考图3，所述荧光成像光路系统还还包括第二反射装置303和第八镜头309，第二反射装置303用于将第一光信号反射，第八镜头309用于将反射的第一光信号分别反射成用于第三探测器111接收的侧向散射光路308和侧向荧光光路310，该侧向散射光路308和侧向荧光光路310具有多个支路。优选的，本实施例提供的荧光成像光路系统中第二反射装置303为反射镜，第八镜头309为二向色镜，所述二向色镜可以按照光的波长区分，其中一种特定波长反射，另一种特定波长则透射。上述第二反射装置303与第三光阑304的位置与流动室中颗粒的流动方向在同一位置，第三光阑304的中心与第二反射装置303的中心之间的间隔大于2mm。
请参考图3，在本发明的可选实施例中所述荧光成像光路系统还还包括第七镜头307，第七镜头307为准直透镜，该准直透镜用于将第二照射光斑202激发的侧向散射光信号和荧光信号转折进入。
请参考图4，利用上述荧光成像装置进行成像的方法，包括以下步骤：
步骤401：第一探测器108采集第一散射光信号的第一部分和/或第三探测器111采集第一散射光信号的第二部分及第一荧光信号。请参考图1，具体为激光器101发射激光，激光通过分光装置103分我第一照明光路112和第二照明光路113，其中第一照明光路112照射在流动室114的液流上形成第一照射光斑201，第二照明光路113通过第一反射装置104反射在流动室114的液流上形成第二照射光斑202，颗粒经过第一照射光斑201时激发出第一光信号，第一光信号包括第一散射光信号和第一荧光探测信号，第一散射光信号的第一部分(前向散射信号)通过第一探测器108采集，第一散射光信号的第二部分(侧向散射信号)及第一荧光信号通过第三探测器采集。
步骤402：第一探测器108对所述第一散射光的第一部分进行处理，第二探测器111对所述第一散射光的第二部分及第一荧光信号进行处理，根据处理结果，识别颗粒特征。所述颗粒特征具体为第一探测器108识别颗粒的大小，第三探测器111识别颗粒的内部成份、颗粒的结构、颗粒的复杂度中的任意一种或多种。
步骤403：根据上述识别的颗粒大小、颗粒的内部成份、颗粒的结构或颗粒的复杂度判断是否需要荧光光路系统获取图像。
步骤404：当所述颗粒的特征满足条件时，荧光光路系统获取图像。本实施例提供的荧光成像方法中颗粒的特征满足分选条件，不同的研究对象分选条件不同。荧光光路系统获取图像的具体过程为通过第四镜头301和第五镜头302将第一照射光斑201和第二照射光斑202之间的间距放大10倍，通过第六镜头305将颗粒经过第二照射光斑202时的图像成像，并通过第四探测器306拍摄出该图像。
对于图像的获取可以择一获取或全部获取，例如，请参考图5，从前向散射FSC和侧向散射SSC图谱中较难分辨出A类细胞和B类细胞，此时用户可以选择获取这两种细胞的所有图像，用作后续处理和分析。请参考图6，从前向散射FSC和侧向散射SSC图谱中可以明显区分出A类细胞和B类细胞，此时用户可以选择分别对A类细胞或B类细胞中的任意一种进行拍照，而不需要全部拍照。A类细胞中包含A1和A2两种细胞，通过侧向荧光光路FL1能够探测到A1和A2两种细胞的荧光信号。请参考图7，荧光光路FL1很难将A1和A2两种细胞区分开，此时用户可以选择获取这两种细胞的所有图像。请参考图8，荧光光路FL1可以将A1和A2两种细胞区分开，此时用户可以选择性的获取图像。
步骤405，图像保存与预处理，将上述获取的图像进行分类，例如具有A特征的细胞命名为A_XXXX并保存,XXXX表示编号，例如0001表示第一张照片；同样，具有B特征的细胞命名为B_XXXX并保存。
步骤406：图像二次处理，将上述获取的细胞图像保存完后统一处理或边保存边处理，图像保存的速度快于图像处理的速度，图像处理完成后需要对图像重新命名保存，命名规则应与步骤405一致，例如具有A特征的细胞命名为A_XXXX_N，A表示特征，XXXX表示图像编号，N表示处理后的图像。
步骤407：图像显示，对处理完的图像进行实时显示，根据用户需求，也可以选择需要的图像进行显示。
在上述步骤403时，若当所述颗粒的特征不满足条件时，则如步骤408所示不获取图像。
在获取图像之前本发明提供的荧光成像装置中可以检测颗粒从第一照射光斑201到第二照射光斑的时间间隔t,该时间间隔t的计算公式如下：
t＝y'/v
其中，v为颗粒运行速度，y'为第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距。
上述第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距y'的计算公式如下：
y'＝f×tan(α)
其中α为调节前第二照明光路与调节后第二照明光路之间的夹角，f为照明镜头102的焦距。上述夹角α是通过调整第一反射装置104的角度获取。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种荧光成像装置，其特征在于：所述装置包括至少一激光器(101)、分光装置(103)、流动室(114)、第一探测单元及荧光成像单元；
所述激光器(101)用于发射至少一种激光；
所述分光装置(103)用于将所述激光器(101)发射的激光分散为第一照明光路和第二照明光路，所述第一照明光路和第二照明光路分别照射至所述流动室(114)；
所述流动室(114)用于限制所述颗粒的流动，第一照明光路和第二照明光路照射经过流动室(114)的液流产生第一照射光斑和第二照射光斑，所述颗粒经过所述第一照射光斑产生第一光信号，所述颗粒经过第二照射光斑产生第二光信号，所述第一光信号包括第一散射光信号和第一荧光探测信号，所述第二光信号包括第二散射光信号和第二荧光探测信号；
所述第一探测单元用于分析第一照明光路的散射光信号，所述第一探测单元包括第一探测器(108)，所述第一探测器(108)用于检测所述第一散射光信号的第一部分，以识别颗粒的特征；
所述荧光成像单元用于分析第二照明光路的散射光信号和荧光探测信号，所述荧光成像单元包括第二探测器(110)，所述第二探测器(110)用于检测所述第二散射光信号和第二荧光探测信号，以进行成像分析。
2.如权利要求1所述的一种荧光成像装置，其特征在于：所述第一探测单元还包括第三探测器(111)，所述第三探测器(111)用于检测所述第一散射光信号的第二部分和荧光探测信号，以识别颗粒的特征。
3.如权利要求1所述的一种荧光成像装置，其特征在于：还包括第一反射装置(104)，所述第一反射装置(104)设置于所述分光装置(103)的一侧，所述第一反射装置(104)的角度可调，以用于调节所述第二照明照明光路在所述流动室(114)的位置。
4.如权利要求1所述的一种荧光成像装置，其特征在于：所述荧光成像装置还包括荧光成像光路系统，所述荧光成像光路系统用于获取颗粒图像；所述荧光成像光路系统包括第六镜头(305)及第四探测器(306)，所述第六镜头(305)用于将颗粒二次成像，所述第四探测器(306)用于对所述二次成像进行拍摄。
5.如权利要求4所述的一种荧光成像装置，其特征在于：还包括放大成像系统，所述放大成像系统用于将所述第一照射光斑与第二照射光斑之间的间隔放大，所述放大成像系统包括第四镜头(301)和第五镜头(302)。
6.如权利要求5所述的一种荧光成像装置，其特征在于：还包括第二反射装置(303)和第八镜头(309)，所述第二反射装置(303)用于将第一光信号反射，所述第八镜头(309)用于将所述反射的第一光信号分别反射成用于第三探测器(111)接收的侧向散射光路和侧向荧光光路。
7.利用权利要求1～6任一项荧光成像装置进行荧光成像的方法，其特征在于包括以下步骤：
第一探测器采集第一散射光信号的第一部分和/或第三探测器采集第一散射光信号的第二部分及第一荧光信号；
第一探测器处理第一散射光信号的第一部分和/或第三探测器处理散射光信号的第二部分及第一荧光信号，以根据处理结果识别颗粒的特征；
根据识别颗粒的特征判断是否通过荧光光路系统获取图像；当颗粒的特征不符合条件，荧光光路系统不获取图像或当颗粒的特征符合条件时，荧光光路系统获取图像；
获取图像后对所述图像进行保存与预处理；
对所述预处理的图像进行二次处理；
对所述二次处理的图像进行显示。
8.如权利要求7所述利用荧光成像装置进行荧光成像的方法，其特征在于：在获取图像之前可以检测颗粒从第一照射光斑到达第二照射光斑的时间间隔t，所述时间间隔t的计算公式如下：
t＝y'/v
其中，v为颗粒运行速度，y'为第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距。
9.如权利要求8所述利用荧光成像装置进行荧光成像的方法，其特征在于：所述第一照射光斑与第二照射光斑之间的间距y’的计算公式如下：
y'＝f×tan(α)
其中α为调节前第二照明光路与调节后第二照明光路之间的夹角，f为照明镜头的焦距。
10.如权利要求7所述利用荧光成像装置进行荧光成像的方法，其特征在于：所述图像的获取可以择一选取或全部选取。
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