CN205826481U - 一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其包括依序设置的发射光路、接收光路和探测光路；所述发射光路包括依序设置的激光器、聚焦物镜和流动室；待测细胞位于流动室内，且待测细胞处于所述聚焦物镜的焦点处；所述接收光路包括接收物镜，所述接收物镜设置在所述流动室一侧；其特征在于，其还包括反射光路，所述反射光路设置在流动室的另一侧，反射光路包括至少一反射镜，且反射镜的像点和物点在待测细胞处重合或像点位于待测细胞附近。本实用新型增加反射光路后，可以使得整个系统的荧光采集能力提高一倍。在满足相同使用要求条件下，本系统结构简单、操作方便、成本相对低、性价比高。

Description

一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统

技术领域

本实用新型涉及光学技术领域，尤其涉及一种用于流式细胞仪的流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统。

背景技术

流式细胞仪是一种采用液压或其他手段，使得被测细胞排成单列，并用激光束对细胞进行快速检测和分选的仪器。待测细胞经荧光染料染色后，能被相应波长的激光激发产生荧光。这些不同波长的荧光被接收物镜采集并以自由空间光学或者导波光学的方式传递给分光元件(如光栅等色散元件，或者长通/短通等滤波片)，从而将不同波长的荧光分开，最终通过聚焦物镜将荧光分别聚焦到各自对应的探测器上，实现荧光的检测。探测器上的荧光能量越强，越能实现精确检测。若能量太弱，则可能被噪声湮没，从而丢掉了相应细胞的信息。

提高荧光接收量的方法包括：激光激发更多的荧光和让采集系统接收更多的荧光。而细胞携带的染料数量是一定的，当激光能量超过一定量值后，被激发出的荧光将趋于饱和，此时只能靠提高采集系统的性能来增加荧光的接收量。

对于荧光接收物镜而言，每个被激发出荧光的细胞或其他颗粒均可看作一个点光源。该点光源的光线向四周的立体空间发散。由于接收物镜的口径和焦距限制，只有一定角度的光线才能被物镜采集。因此采集系统的接收物镜的采集能力可由物镜的数值孔径表示：NA＝nsinU。其中，n为物空间的折射率，U为能被物镜组接收的光锥的半角，即接收半角。数值孔径越大，接收物镜能采集到的光线就越多。

物镜的物空间一般为空气，此时n＝1，理论上现有的接收物镜可以最大做到数值孔径接近0.9。但是，现有技术中的接收系统，由于物镜的本身的尺寸、工艺的影响，以及工作长度受到系统流动室的尺寸限制，能接收的角度一般最大为89°左右，，其数值孔径值一般在0.6～0.7之间。

从数值孔径的公式可以看出，可以通过增大物空间的折射率n和增大接收半角U来提高数值孔径。比如使用胶合树脂将物镜和特殊设计的流动室粘合起来，这样的数值孔径值可以达到1.2，其相比常规的接收方式有较大的提高。但这种方法的缺点是：一、流动室和接收物镜必须综合考虑起来设计，增加了设计难度；二、流动室和接收物镜的尺寸都比较大，增大了系统体积且整体较为复杂，价格较高，同时还无法使用货架产品。

很明显由于材料的制约，物空间的折射率具有上限，受系统尺寸的限制，接收角度也不可能无限增大。随着对仪器分析能力需求的提高，我们需要从其它角度进一步增强整个系统的荧光接收信号。

实用新型内容

为了解决现有技术中的问题，本实用新型的目的是提供一种可提高流式细胞仪的灵敏度和准确性的流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统。在满足相同使用要求条件下，整个系统结构简单、操作方便、成本相对低、性价比高。

为了实现上述目的，本实用新型采用的技术方案是：

一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，包括依序设置的发射光路、接收光路和探测光路；所述发射光路包括依序设置的激光器、聚焦物镜和流动室；待测细胞位于流动室内，且待测细胞依次流过所述聚焦物镜的焦点位置；所述接收光路包括接收物镜，所述接收物镜设置在所述流动室一侧；其特征在于，其还包括反射光路，所述反射光路设置在所述流动室的另一侧，所述反射光路包括至少一反射镜，且反射镜的像点和物点在待测细胞处重合或像点位于细胞附近。待测细胞或其他颗粒在被激光激发后，可以看作点光源。该点光源作为反射光路的物，且位于反射光路的光轴上。调节物距，使得点光源经该反射光路中反射镜所成的像点与物点重合。也即，由于受系统尺寸和接收物镜接收角度的限制，部分无法被接收物镜直接接收的激发荧光，经反射光路反射会聚后，可以被接收物镜接收到。

优选的技术方案，所述反射光路还包括一滤波片，所述滤波片位于反射镜和待测细胞之间。该反射光路的滤波片为陷波滤波片，且该陷波滤波片为吸收型陷波滤波片。由于系统中除了被激发的荧光之外，还包括原激光发生器发出的散射光。为了避免该散射光被反射镜反射后可能造成对待测细胞或其他颗粒的多次激发，反射光路中加入了滤波片。其作用是吸收散射激光，透过被待测细胞激发的荧光。

优选的技术方案，所述反射镜的反射面上镀有反射膜，该反射膜反射所述激光器发出的波长以外的波长。直接在反射镜上镀相应的反射膜，该反射膜反射散射激光以外的波长，这种情况下反射光路就不需要设置滤波片。

优选的技术方案，所述反射镜为双锥曲面，即:biconic面型,反射镜的曲率半径在x和y方向并不相同，从而消除流动室的光焦度的影响。

对于后续分光光路短，或者探测器面积大等场景，反射镜使用普通的球面镜，亦不会对聚焦产生较大的影响。

优选的技术方案，所述流动室为毛细管流动室。

优选的技术方案，所述接收光路和探测光路之间还设置有分光光路。

优选的技术方案，所述分光光路包括至少两个依序平行设置的短通滤波片，所述短通滤波片的中心波长不相同，且短通滤波片与接收物镜的中心轴成45°。

优选的技术方案，所述发射光路中的聚焦物镜由柱面镜组构成，所述接收光路中的接收物镜的光轴与发射光路中的聚焦物镜的光轴之间的夹角为90°。夹角为90°可以方便安装。

通过采用以上技术方案，本实用新型一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统与现有技术相比，其有益效果为：

1、本实用新型增加反射光路后，可以使得整个系统的荧光采集能力提高一倍。

2、荧光采集能力的提高，进而提高了系统的灵敏度与准确性；

3、反射光路可以选择货架产品，并不会明显增加系统的成本与复杂度。

综上所述，在满足相同使用要求条件下，本系统结构简单、操作方便、成本相对低、性价比高。

附图说明

图1为实施例1中一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统中发射光路和接收光路的结构示意图；

图2为实施例1中一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统中反射光路和接收光路的结构示意图；

图3为实施例2中一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统中反射光路、接收光路、分光光路和探测光路的结构示意图；

图4为无反射光路时，探测器上接收到的光斑图；

图5为有反射光路时，探测器上接收到的光斑图。

具体实施方式

为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实例，对本实用新型进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本实用新型的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本实用新型的概念。

实施例1

如图1或图2所示，所述发射光路包括依序设置的激光器(未画出)、聚焦物镜20和流动室30；待测细胞40位于流动室30内，且待测细胞40处于所述聚焦物镜20的焦点处；所述接收光路包括接收物镜50，所述接收物镜50设置在所述流动室30一侧；发射光路中的激光器(图中为未画出，本实施例激光器采用488nm的固体激光器)激光束10被聚焦物镜20聚焦，聚焦物镜20的焦点位于流动室30中心轴上。根据需要，聚焦物镜20可以为两个柱面镜组，或一个光束整形结构与一个聚焦系统的组合。当处理后的待测细胞40经过激光束10的聚焦光斑时，会被激发出激发荧光11，这些激发荧光11以待测细胞40为中心向着周围空间无序发散。激发荧光11中的部分荧光被接收光路的接收物镜50采集后形成平行荧光12，接收物镜50可以为单个透镜，或者为镜头组。根据光路的布局不同，接收物镜50可垂直于流动室30的轴，布置在流动室30的一侧。本实施例将接收物镜50安装在流动室30的侧面，接收物镜50的光轴与聚焦物镜20的光轴成90°夹角。

调节接收物镜50与流动室30之间的距离，使得恰好等于接收物镜50的工作距离，此时接收物镜50接收到的光线最多。

本实用新型在流动室30的另一侧引入一个反射光路，该反射光路60包括一个滤波片61和一个反射镜62。待测细胞40或其他颗粒在被激光束10激发后，可以看作点光源。该点光源作为反射光路的物，且位于反射光路的光轴上。调节物距，使得点光源经该反射光路的反射镜62所成的像点与物点重合或使其离物点很近的地方。也即，让无法被接收物镜50直接接收的部分光束13，经反射系统会聚后，也可以被接收物镜50采集。

由于光束13中除了被激发的荧光之外，还包括原激光束10中的散射光。为了避免该散射光对待测细胞40或其他颗粒的多次激发，反射光路加入了滤波片61。其作用是吸收散射激光，透过被待测细胞40激发的荧光。当然，也可以直接在反射镜62上镀相应的反射膜，该反射膜反射散射激光以外的波长，这种情况下就可以不需要滤波片61。

光束13在入射到反射光路之前，需要首先通过流动室30，而流动室30实质上可以看作一个柱面镜。因此，为了精确的对光束13聚焦，反射镜62优选为一个biconic面型，即:反射镜62的曲率半径在x和y方向并不相同。当然，对于后续分光光路短，或者探测器面积大等场景，反射镜62使用普通球面镜，亦不会对聚焦产生较大的影响。

实施例2

如图3、图4或图5所示，一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统包括依序设置的发射光路(和实施例1类似，因此图中未画完整)、接收光路、分光光路和探测光路；所述发射光路包括依序设置的激光器(图中未画出)、聚焦物镜(图中未画出)和流动室100(本实施例为毛细管流动室)；待测细胞(图中未画出)位于流动室100内，且待测细胞处于所述聚焦物镜的焦点处；所述接收光路包括接收物镜130，所述接收物镜130设置在所述流动室100一侧；所述反射光路设置在所述流动室100的另一侧，所述反射光路包括一反射镜110和滤波片120(为吸收型陷波滤波片)，且反射镜110的像点和物点在待测细胞处重合。

本实施例中的激光器为488nm的固体激光器。对待测细胞进行染色，使其能被488nm的激光激发出530nm、670nm的荧光。当流动室100中的待测细胞通过激光聚焦光斑时，将会以待测细胞为中心，向四周散射光线。这些光束包含530nm、670nm的荧光，以及488nm的散射光。

其中一部分散射光线，穿过流动室100，直接入射到位于流动室100右侧的接收物镜130上。接收物镜130的光轴，与入射激光的光轴垂直。调节接收物镜130与接收物镜100的距离，使得流动室100的轴线位于接收物镜130的前焦点上(需要考虑流动室100的厚度及光焦度)。此时，那些入射角在接收物镜130的接收范围内的光线将会被接收物镜130准直为平行光。接收物镜130可以为显微物镜，或者其他配合流动室100设计的物镜。在本实例中，由于后续光路并不太长，因此直接使用Edmund的货架产品。其为一个偶次面型的非球面透镜，工作距离为2.68mm，数值孔径为0.7，即该透镜能接收的光锥角度约89°。

另一部分光线，穿过流动室100，经陷波滤波片120入射到反射镜110上。反射镜110位于流动室100的左侧，其光轴与接收物镜130的光轴重合。反射镜110的作用是，将这部分光线再次反射聚焦到原来的光源(即，待测细胞)的位置。设计反射镜110的面型，调节其位置，使得被反射聚焦的光线特性与直接入射到接收物镜130上的光线特性相同。等效于接收物镜130接收了2倍光锥角的光线。

本实例中，该反射镜110为biconic面型(椭球面型反射镜)，从而消除流动室100的光焦度的影响。考虑到流动室100内径为0.1mm，接收物镜130的数值孔径，本反射镜110的面参数如下(图中未画出反射镜110的衬底)：

面	Radius X	Radius Y	Conic X	Conic Y	X Aper	Y Aper	CT
								反射面	10.246	10.291	0	-0.051	7.1	7.1	2.5
衬底	Infinity	Infinity	0	0	7.1	7.1	N.A.

反射镜110的反射面上镀有可见光高反膜。由于入射到反射镜110的光线中含有488nm的散射激光，为了避免该散射激光对细胞的再次激发，需要将该波长的光滤掉。因此，在反射镜110之间加入了一个陷波滤波片120，该滤波片为吸收型，对于488±20nm的光，OD大于4；而对于其他波长的光则有很高的透过率。从而使得反射回去的光束只包含530nm和670nm的荧光。反射镜110与陷波滤波片120之间的距离为4mm，与流动室100轴线的距离为10.5mm。

被反射镜110反射的光束，与直接入射到接收物镜130上的光束，被准直为平行光或准平行光。这些光束以45°角入射到分光光路中的第一短通滤波片141上。第一短通滤波片141为中心波长为630nm的短通滤波片，即反射波长大于630nm的光波，透射波长小于630nm的光波。因此，670nm的荧光被分离开来，并被第一短通滤波片141反射到探测光路中的第一会聚透镜151上。第一会聚透镜151将光束聚焦到PMT探测器170上。PMT探测器170探测表面大小为3mm x 3mm。为了降低其他杂散光的影响，在PMT探测器170之前放置了一个670nm±10nm的第一窄带滤波片161。

通过第一短通滤波片141的光束包括488nm和530nm的光波，这些光波以45°角入射到第二短通滤波片142上。第二短通滤波片142为中心波长为500nm的短通滤波片。因此，530nm的波长被反射，488nm的波长透射。530nm的光波被第二会聚透镜152聚焦和30nm±10nm的第二窄带滤波片162滤波后到对应PMT探测器170上。透射的488nm光束，被第三会聚透镜153聚焦和488nm±10nm的第三窄带滤波片163滤波后到对应PMT探测器170上。

由于PMT探测器170上光斑的直径远小于PMT探测器170接收面的大小，为了更准确的分析反射光路对荧光采集的影响，设PMT探测器170表面尺寸为0.5mm x 0.5mm(实际寸尺为3mm x 3mm)，像素为256x 256。设670nm的荧光功率为1w，直接通过接收物镜130的光线，在PMT探测器170上的分布如图4所示，总功率为0.031w。在光路中加入反射光路后，本实施例PMT探测器170上的光线分布如图5所示，总功率为0.067w。由此可见，本方法的增强效果相当明显，而且并不会使整个系统变得复杂。

上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。

Claims (10)

1.一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，包括依序设置的发射光路、接收光路和探测光路；所述发射光路包括依序设置的激光器、聚焦物镜和流动室；待测细胞位于流动室内，且待测细胞处于所述聚焦物镜的焦点处；所述接收光路包括接收物镜，所述接收物镜设置在所述流动室一侧；其特征在于，其还包括反射光路，所述反射光路设置在所述流动室的另一侧，所述反射光路包括至少一反射镜，且反射镜的像点和物点在待测细胞处重合。

2.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述反射光路还包括一滤波片，所述滤波片位于反射镜和待测细胞之间。

3.根据权利要求2所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述反射光路的滤波片为陷波滤波片，且该陷波滤波片为吸收型陷波滤波片。

4.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述反射镜的反射面上镀有反射膜，该反射膜反射所述激光器发出的波长以外的波长。

5.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述反射镜为球面镜。

6.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述反射镜为双锥曲面。

7.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述流动室为毛细管流动室。

8.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述接收光路和探测光路之间还设置有分光光路。

9.根据权利要求8所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述分光光路包括至少两个依序平行设置的短通滤波片，所述短通滤波片的中心波长不相同，且短通滤波片与接收物镜的中心轴成45°。

10.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪用的增强荧光接收信号的系统，其特征在于，所述发射光路中的聚焦物镜由柱面镜组构成，所述接收光路中的接收物镜的光轴与发射光路中的聚焦物镜的光轴之间的夹角为90°。