CN106841014A - 流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统，采集镜头包括依次设置的第一平凸透镜、正弯月透镜、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组，第一胶合透镜组包括第一双凸透镜和第一负弯月透镜，第二胶合透镜组包括第二负弯月透镜和第二双凸透镜；双色激光流式细胞仪的光学系统包括荧光采集透镜组、D形反射镜、第一荧光采集光路、第二荧光采集光路；D形反射镜安装于荧光采集透镜组的焦面上，且与荧光采集透镜组的焦面成45°夹角，第一荧光采集光路、第二荧光采集光路中包含多个按照等光程、位相补偿的方法设置的二向色滤光片。本发明采集镜头性能优异，各光路的光波能量损失少且损失一致，并不会对后续的信号处理造成较大影响。

Description

流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统

技术领域

本发明属于光学仪器技术领域，涉及生物检测、细胞分析技术，具体涉及一种流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统。

背景技术

流式细胞分析及流式细胞术，是一种对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，可以短时间内高速分析成千上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。流式细胞仪被称为实验室的CT，流式细胞仪的液流系统将细胞样液聚焦为单细胞流层流，细胞排队依次通过激光照射区。采用激光照射样本，细胞的散射光，以及从细胞携带的染料上激发出的荧光，以细胞为中心，朝四周发射。因此，细胞可以看作是点光源。通过对荧光的收集分析，从而得到样本的信息。

由于荧光信号很微弱，而且类似于点光源朝着四周发射。因此，尽可能多的接收荧光信号，是提高流式细胞仪探测性能的关键。而提高采集量的关键则是使用大数值孔径的收集镜头。目前大数值孔径的镜头主要为显微镜头，然而显微镜头的工作距离一般为小于1mm，流式细胞仪的流动室壁厚则一般都大于1.5mm，无法匹配。对于更加昂贵的大数值孔径、长工作距的显微镜头，其物高往往很小。因为显微镜可以移动载物台，所以设计镜头时往往只对轴上物点做优化。而对于配置多个激光光源的流式细胞仪，其光斑之间的最大间距可以达到400μm，面对这种场景，长工作距的显微镜头也无法胜任。因此，设计大视场范围、长工作距离、大数值孔径的采集镜头是高性能流式细胞仪急需解决的问题。

公开号为CN103091821A的中国专利公布了一种光收集系统及细胞分析仪，该采集镜头数值孔径为1.2，轴上光斑RMS半径为100μm，轴外光斑RMS半径为200μm。然而该4组6片的采集镜头，却用掉了5种不同的玻璃，显然镜头结构还不是最优。

美国专利US6510007B1采用了BK7和SF8两种常见的肖特玻璃，实现了1.75mm的工作距离，轴上光斑RMS小于100μm。该镜头总共5组8片，镜片较多，镜头相对较长。

目前用于流式细胞仪的采集镜头大多只针对单激光的配置，这些镜头的视场范围小，不能满足多色光流式细胞仪的需求。而视场范围大，数值孔径大的镜头又较为复杂，或者材料要求高，或者镜片数量多，价格昂贵。

对于多色激光流式细胞仪而言，当流式细胞仪配置多个激光时，激光聚焦点沿着流动室轴线纵向分布，每个激光聚焦点都会激发出荧光和散射光，此时可以看作在流动室的轴线上有多个点光源。每两个光点的间隔在几十微米到两百微米之间。为了将这些光点从空间上分开，一般方法为：先使用采集透镜组将光点轴向放大，然后使用反射镜进行空间分光，或者直接使用光纤接收。由于成本以及空间结构的限制，采集镜头的放大倍数一般在10～20倍之间，因此像点间距不可能被放得很大。而反射镜分光的方式仅为左右、或者上下反射，考虑到反射镜尺寸的限制和安装的限制，反射镜分光的方式一般只适合于2～3色激光的系统，而超过3色激光的系统使用光纤分光更为直接和便捷。

光纤分光优点很多，如杂散光少、紧凑、布局自由等。然而它的容错率低，要求流式细胞仪的液流系统相当稳定，否则它能接收到的能量将会锐减。所以在2～3色激光系统里，反射镜分光是一个很好的选择，尤其是对于低成本的流式细胞仪。

授权公告号为CN104280327B的中国发明专利文献公开了一种流式荧光收集光学系统，其指出由于反射镜边缘分界尺寸精度很不好，容易引入不同激光激发的荧光串扰，容易导致过多杂散光进入荧光通道。因此，该发明描述了一种微分束镜，可以有效分离1.44mm间距内的、不大于60μm的像点。

而实际上，该发明所描述的微分束镜也只是尺寸更小的反射镜(或具有类似功能的器件)。如上面所述，反射镜分光的应用场合限制在2～3色激光。如果采集镜头的性能够优秀的话，完全可以将荧光像点间的间距放大到4～5mm，并且保证光斑的RMS半径尺寸很小，配合后续更合理的荧光光路，可以使用反射镜进行空间分光，而不产生所谓的杂散光以及串扰。

另外，经过反射镜后的光线需要进行进一步分光，从而实现每个波长单独探测。传统的做法是，使用二向色滤光片将不同波长的光依次滤出，如附图5所示，该图为授权公告号为CN104280327B的中国专利中描述的接收方式。每个二向色滤光片的反射率约为96％，透过率约94％，因此每使用一次二向色滤光片均会有5％左右的能量损失。这种做法，使得最先滤出的光损失较少的能量，而最后滤出的光波将损失很多能量。如用传统的方法使用二向色滤光片依次滤出680nm、625nm、575nm、525nm的荧光和488nm散射光，总共要使用4次二向色滤光片。若原本入射能量为1，那么最先出射的680nm光波，能量损失5％；而最后出射的525nm和488nm光波的能量只剩下了0.81，损失几乎达到了20％。每个光波损失的能量均不一致，对后续的信号处理造成了很大的影响。尤其是当使用的二向色滤光片镀膜不均匀的时候，这些损失将无法定量，信号处理更为困难。另一方面，这种接收方式没有考虑光线经过二向色滤光片后的位相变化。光线经过的二向色滤光片数量越多，光线的横向位移就会越大。从而需要更大尺寸的接收器，或者需要对接收器的位置重新调节，以免光线落入接收器的死区或者感光区之外，造成无效接收。

综上可见，随着配置多色激光器的流式细胞仪成为主流，急需一种结构优化、性能优秀的荧光采集镜头和能最大限度降低光波能量损失、使光波能量损失一致、不对接收器提出更高要求的多色激光流式细胞仪系统。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统，其荧光收集性能优异、采用的光学玻璃种类少、透镜数量少，且加工方便；光学系统中荧光到达探测器时，损失的能量相等，且光斑在探测器上的偏移量小，探测器尺寸要求低，安装调试更加简单。

本发明的技术方案如下：

一种流式细胞仪采集镜头，其包括设于流动室外部的荧光采集透镜组，所述荧光采集透镜组包括依次设置于流动室外且彼此共光轴的第一平凸透镜、正弯月透镜、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组；所述第一平凸透镜的平面为光入射面，凸面为光出射面；所述正弯月透镜的凹面为光入射面，凸面为光出射面；所述第一胶合透镜组包括依次设置的第一双凸透镜和第一负弯月透镜，所述第一双凸透镜和第一负弯月透镜的半径较小面相胶合，且第一双凸透镜半径较大的一面朝向流动室；所述第二胶合透镜组包括依次设置的第二负弯月透镜和第二双凸透镜，两个透镜半径较小的一面相胶合，且第二负弯月透镜半径较大的一面朝向流动室。采用了6片透镜，两种常规材料，透镜数量少，镜头结构简单，长度短，更适合配置于小型便携的仪器。

优选的，所述正弯月透镜的口径大于第一平凸透镜的口径，所述第一双凸透镜的口径大于正弯月透镜的口径，所述第一负弯月透镜的口径大于或等于第一双凸透镜的口径，所述第二负弯月透镜的口径大于或等于第一负弯月透镜的口径，所述第二双凸透镜的口径大于或等于第二负弯月透镜的口径。

优选的，所述第一平凸透镜、正弯月透镜、第一双凸透镜、第二双凸透镜均为冕牌玻璃，所述第一负弯月透镜和第二负弯月透镜为火石玻璃。本发明只采用了冕牌玻璃中的H-K9L和火石玻璃中的ZF6两种玻璃，玻璃种类少，镜头结构相对简单，成本更低。

优选的，所述荧光采集透镜组与流动室之间通过光学凝胶胶合。采用此方案，可使光线从流动室内部液体射入流动室壁后，光线出射后发射角不会急剧增大，被采集透镜接收的光线更多。

优选的，所述荧光采集透镜组中各透镜的光轴共线，且和流动室的轴线垂直。

所述荧光采集透镜组中各透镜的半径公差为5个光圈，不规则度为0.5个光圈，厚度公差为0.05mm。公差要求低，生产加工更加方便。

通过采用上述方案，采集镜头透镜组数值孔径达到了1.2，其放大率为12倍，视场范围为±200μm，完全满足了多色激光同时激发的需求。

本发明还提供了一种双色激光流式细胞仪的光学系统，其包括荧光采集透镜组、D形反射镜、第一荧光采集光路、第二荧光采集光路；

所述荧光采集透镜组包括多个透镜，用于将多种不同间隔较小的激光束激发的荧光物点放大为多个相互之间存在较大间距的荧光像点；所述D形反射镜用于将经荧光采集透镜组放大后的荧光像点进行空间分光；所述第一荧光采集光路用于将其中一路荧光根据不同波长进行分光；所述第二荧光采集光路用于将另外一路荧光根据不同波长进行分光；

所述荧光采集透镜组与流动室之间通过光学凝胶胶合，所述D形反射镜安装于荧光采集透镜组的焦面上或者焦面附近，且所述D形反射镜的反射面与荧光采集透镜组的焦面之间成45°夹角；所述第一荧光采集光路包括在光路方向上依次设置的第二平凸透镜、多个不同中心波长的二向色滤光片、多个不同中心波长的窄带滤光片、多个荧光聚焦物镜和多个荧光光电探测器；所述第二荧光采集光路包括在光路方向上依次设置的第三平凸透镜、多个不同中心波长的二向色滤光片、多个不同中心波长的窄带滤光片、多个聚焦物镜和多个光电探测器；所述二向色滤光片均按照等光程、位相补偿的方法设置，所述第二平凸透镜和第三平凸透镜可以相同。本发明二向色滤光片按照不同波长的光线经过滤光片的数量相同、经过滤光片后偏移最小的原则设置，从而抵消了通过二向色滤光片后光线的横向偏移，使得光线的位相一致，最终使光线聚焦在探测器的中心附近，免去了再次对探测器位置的安装调试。

优选的方案，所述D形反射镜的法线和第三平凸透镜的轴线分别位于所述荧光采集透镜组光轴的相对两侧。所述D形反射镜的上边缘位于所述荧光采集透镜组的光轴上，所述第二平凸透镜的光轴与所述荧光采集透镜组的光轴垂直，所述第二平凸透镜的轴线和D形反射镜的反射面相交，且第二平凸透镜的轴线与D形反射镜的反射面呈45°夹角。采用此种方案，使进入第三平凸透镜的激发的光点的像点，不受D形反射镜的影响，直接入射到第二荧光采集光路中，而另一像点的光路，经D形反射镜反射后进入第一荧光采集光路。

更进一步优选的方案，所述荧光采集透镜组包括依次设置于流动室外且彼此共光轴的第一平凸透镜、正弯月透镜、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组，所述第一平凸透镜的平面为光入射面，凸面为光出射面；所述正弯月透镜的凹面为光入射面，凸面为光出射面；所述第一胶合透镜组包括依次设置的第一双凸透镜和第一负弯月透镜，所述第一双凸透镜和第一负弯月透镜的半径较小面相胶合，且第一双凸透镜半径较大的一面朝向流动室；所述第二胶合透镜组包括依次设置的第二负弯月透镜和第二双凸透镜，所述第二负弯月透镜和第二双凸透镜通过半径较小的一面相胶合，且第二负弯月透镜半径较大的一面朝向流动室。

本发明一种流式细胞仪采集镜头及双色激光流式细胞仪的光学系统与现有技术相比，其有益效果在于：

1、本发明采集镜头采用了一种4组6片采集透镜组，仅用了两种常见的光学玻璃就达到了很好的效果，其结构简单、成本低，且采用简单的透镜组，即可使镜头组数值孔径达到1.2，轴上光斑RMS半径小于50μm，轴外光斑RMS半径小于100μm，而且96％的能量集中在120μm的半径内。

2、本发明采集透镜组的透镜公差要求较松，加工简便。

3、本发明双色激光流式细胞仪的光学系统，配合采集镜头，使用货架产品D形反射镜就实现了双色激光流式细胞仪的系统布局，并且荧光通道间没有杂散光和荧光串扰，从而避免了使用更加精细、定制化的微分束器，降低了仪器成本，提高了普适性。

4、本发明的荧光采集光路中的二向色滤光片按照等光程的原则布局，每个波长的荧光到达探测器时，损失的能量一致，使得后续信号分析变得简单可靠。

5、本发明的荧光采集光路中的二向色滤光片均按照位相补偿的原则布局，抵消了通过二向色滤光片后光线的横向偏移，使得光线的位相一致，最终使光线聚焦在探测器的中心附近，大大降低了对探测器尺寸的要求，并免去了调节探测器位置的需求。

附图说明

图1为本发明的采集镜头组光路图；

图2为本发明像面上荧光像点的能量分布图；

图3为本发明双色激光流式细胞仪的光学系统的光路俯视图；

图4为本发明双色激光流式细胞仪的光学系统的简化光路正视图；

图5为现有技术传统流式细胞仪分光光路图；

图6为探测器上荧光像点的能量分布图。

图中标记为：1、流动室，2、荧光采集透镜组，21、第一平凸透镜，22、正弯月透镜，23、第一双凸透镜，24、第一负弯月透镜，25、第二负弯月透镜，26、第二双凸透镜，3、D形反射镜，4、第一荧光采集光路，5、第二荧光采集光路，41、第二平凸透镜，51、第三平凸透镜，42、521、522、523、524为不同中心波长的长通二向色滤光片，431、432、531、532、533、534、535为不同中心波长的窄带滤光片，441、442、541、542、543、544、545为相同型号规格的聚焦物镜，451、452、551、552、553、554、555为相同型号规格的光电探测器，61为细胞或其他微小颗粒，62、63、64分别为不同细胞颗粒对应的像点。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

本发明一种流式细胞仪采集镜头的光路图如图1所示。1为流动室，61为沿着1的轴线排布的细胞颗粒。21～26为本发明的荧光采集透镜组，彼此共轴。62～64为流动室内的细胞颗粒经采集透镜组后所成的像点。所述荧光采集透镜组包括依次设置于流动室1外且彼此共光轴的第一平凸透镜21、正弯月透镜22、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组；所述第一平凸透镜21的平面为光入射面，凸面为光出射面；所述正弯月透镜22的凹面为光入射面，凸面为光出射面；所述第一胶合透镜组包括依次设置的第一双凸透镜23和第一负弯月透镜24，所述第一双凸透镜23和第一负弯月透镜24的半径较小面相胶合，且第一双凸透镜23半径较大的一面朝向流动室1；所述第二胶合透镜组包括依次设置的第二负弯月透镜25和第二双凸透镜26，所述第二负弯月透镜25和第二双凸透镜26通过半径较小的一面相胶合，且第二负弯月透镜25半径较大的一面朝向流动室1。所述正弯月透镜22的口径大于第一平凸透镜21的口径，所述第一双凸透镜23的口径大于正弯月透镜22的口径，所述第一负弯月透镜24的口径大于或等于第一双凸透镜23的口径，所述第二负弯月透镜25的口径大于或等于第一负弯月透镜24的口径，所述第二双凸透镜26的口径大于或等于第二负弯月透镜25的口径。

由于像差随着入射角度增大而增大，因此，靠近流动室1的透镜21被设计为平凸透镜，平面朝向流动室。考虑到加工工艺，以及像差要求，引入正弯月透镜22来分担光焦度，其弯月方向朝向流动室1。为了更进一步分担光焦度，同时消色差，引入第一对胶合透镜组，该胶合透镜组由第一双凸透镜23和第一负弯月透镜24组成。考虑到角度分配问题，半径较大的一面面向流动室，并且采用冕牌玻璃在前的形式。从第一胶合透镜组出射的光略有一点会聚。为了进一步消色差、轴上球差，同时将荧光聚焦在合适的距离内，引入了第二对胶合透镜组，该透镜组由第二负弯月透镜25和第二双凸透镜26组成。透镜材料为普通的成都光明玻璃(H-K9L和ZF6)，价格便宜，加工性好。透镜的具体参数如下表所示：

序号	半径	厚度	材料	口径
					1	Infinity	4	H-K9L	8
2	-4.069	0.3	Air	8
					3	-22.03	6	H-K9L	13
4	-9.583	0.2	Air	17
					5	134.283	9.6	H-K9L	21.5
6	-11.455	2.5	ZF6	21.5
					7	-19.32	0.2	Air	25
8	64.27	2.5	ZF6	25
					9	16.218	9.3	H-K9L	25
10	-36.836	100.0	Air	25
					像面	Infinity

表中，序号1至9是按从第一平凸透镜至像面的各部件数据，材料为air的是指相邻两透镜之间的空间，透镜组最后一个面到像面的距离为100mm，满足小型流式细胞仪的需求。

被激发的荧光依次经过流动室1内部的样液层、鞘液层、流动室的壁，然后出射出来。流动室1内部的液体折射率和水相当，约1.333。而流动室1一般由石英玻璃制成，其折射率比水稍大。因此，光线从内部液体射入流动室壁后，方向稍微有些改变。而流动室外部的空气和流动室的折射率相差太多，光线出射后发射角会急剧增大，原本可以被采集透镜接收的光线，由于出射角增大，变得不能接收。为解决这个问题，通常将流动室1用光学凝胶胶合在荧光采集透镜组上，如图1所示，流动室1被粘合在第一平凸透镜上。采用这种方法，本发明描述的透镜组数值孔径达到了1.2。其放大率为12倍，视场范围为±200μm，完全满足多色激光同时激发的需求(图1中的62、63、64即为不同激光点的像点)。该透镜组轴上视场，在像面的RMS半径小于50μm；±200μm视场RMS半径小于100μm，优于之前的专利报道。同时，半径公差为5个光圈，不规则度为0.5个光圈，厚度公差为0.05mm，加工难度低。

图2为本发明采集镜头轴上及轴外像点的能量分布图，能量聚集很快，大约96％的能量集中在120μm的半径内。为后续的荧光分光提供了很好的基础。

采用上述荧光采集透镜组的双色激光流式细胞仪的光学系统，如图3所示，其包括荧光采集透镜组、D形反射镜3、第一荧光采集光路4、第二荧光采集光路5；

所述荧光采集透镜组包括多个透镜，用于将多种不同的激光束激发的荧光放大为多个相互之间存在间距的荧光像点；所述D形反射镜3用于将经荧光采集透镜组放大后的荧光像点进行空间分光；所述第一荧光采集光路4用于将其中一路荧光根据不同波长进行分光；所述第二荧光采集光路5用于将另外一路荧光根据不同波长进行分光。

所述D形反射镜3安装于荧光采集透镜组的焦面上，且所述D形反射镜3与荧光采集透镜组的焦面之间成45°夹角；所述第一荧光采集光路4包括在光路方向上依次设置的第二平凸透镜41、多个不同中心波长的二向色滤光片42(本实施中为一个)、多个不同中心波长的窄带滤光片(431和432)、多个荧光聚焦物镜(441和442)和多个荧光光电探测器(451和452)；所述第二荧光采集光路5包括在光路方向上依次设置的第三平凸透镜51、多个不同中心波长的二向色滤光片(521、522、523、524)、多个不同中心波长的窄带滤光片(531、532、533、534、535)、多个聚焦物镜(541、542、543、544、545)和多个光电探测器(551、552、553、554、555)；所述二向色滤光片(521、522、523、524)均按照等光程、位相补偿的方法设置。所述D形反射镜3的法线和第三平凸透镜51的轴线分别位于所述荧光采集透镜组光轴的相对两侧；所述D形反射镜3的上边缘位于所述荧光采集透镜组的光轴上，所述第二平凸透镜41的光轴与所述荧光采集透镜组的光轴垂直，所述第二平凸透镜41的光轴和D形反射镜3的反射面相交，且第二平凸透镜41的光轴与D形反射镜3的反射面呈45°夹角。

本发明使用货架产品D形反射镜3，配合荧光采集透镜组实现了双激光流式细胞仪的空间分光。D形反射镜3的型号为Thorlabs BBD05-E02，其尺寸为0.5英寸，镀有宽带介质膜，反射率大于99％。反射膜边缘距离反射镜直边边缘的距离小于0.05mm。

荧光采集透镜组的放大倍率为12倍，调节两个激光聚焦点的坐标为(0，+0.17mm)和(0,-0.17mm)，因此像点之间的间隔为4mm，像点的GEO半径小于200μm。更极端一点，假设每个像点的GEO半径为500μm，此时两个像点之间最小间距依然有3mm，远远大于D形反射镜0.05mm的膜层间距。因此使用该反射镜可以得到一个很锐利的反射谱。

图3为双色激光流式细胞仪的光学系统布局俯视图。本实施例中，采用常用的488nm和640nm激光作为激发源。激光被聚焦在流动室1的轴线上。为了便于后续描述，假设488的光点在640光点的上方。如上所述，两个聚焦点之间的间隔为0.34mm，也即被激发出的点光源间隔0.34mm。点光源发出的光经采集透镜组2收集并聚焦，并且像点的间隔为4mm。D形反射镜3的中心安装在采集透镜组2的焦面上，并于焦面成45°角(或135°)夹角，其上边缘位于采集透镜组2的光轴上，也即使两个像点的连线的中心上。因此488nm激光激发的光点的像点，不受D形反射镜2的影响，直接入射到第二荧光采集光路5中。而640nm激光激发的光点的像点，则落在D形反射镜中心，然后被D形反射镜垂直反射到第一荧光采集光路4中。

图4为该光学系统的正视图，为了便于观察，隐藏了一些元器件。如图4所示，D形反射镜3的中心比荧光采集透镜组2的光轴低2mm，51为一个准直透镜，作为第二荧光采集光路5的入口，它比荧光采集透镜组2的光轴高2mm。41为一个准直透镜，作为第一荧光采集光路4的入口，它的光轴与D形反射镜3的中心重合，因此也比荧光采集透镜组2的光轴低2mm。这样就通过D形反射镜将两个相距不远的像点从空间上分离了。

第一荧光采集光路4和第二荧光采集光路5的原理一样，只是入射到其中的光波长不同。在此我们重点描述第二荧光采集光路5，第一荧光采集光路4可以类比。

进入到采集光路5中的光，包括被激发的波长为525nm、575nm、625nm、680nm的荧光，以及被散射的488nm的侧散射光。这些光波被第三平凸透镜51准直。因为经过荧光采集透镜组2聚焦的像点很小，同时采集光路5并不算长，探测器的有效面积较大(3mm x 3mm)，可忽略色差的影响。因此，此处我们直接采用了一个普通的平凸透镜，而所谓的准直也不是严格的准直。如果所使用的探测器面积较小，可将第三平凸透镜51更换为一个非球面透镜。

被第三平凸透镜51准直的光波，需要进行进一步分光，从而实现每个波长单独探测。传统的做法是，使用二向色滤光片将不同波长的光依次滤出，如图5所示。每个二向色滤光片的反射率约为96％，透过率约94％，因此每使用一次二向色滤光片均会有5％左右的能量损失。这种做法，使得最先滤出的光损失较少的能量，而最后滤出的光波将损失很多能量。以本实例的激发荧光为例，传统的方法是使用二向色滤光片依次滤出680nm、625nm、575nm、525nm的荧光和488nm散射光，总共要使用4次二向色滤光片。若原本入射能量为1，那么最先出射的680nm光波，能量损失5％；而最后出射的525nm和488nm光波的能量只剩下了0.81，损失几乎达到了20％。每个光波损失的能量均不一致，对后续的信号处理造成了很大的影响。

针对这个缺点，本发明使用经过二向色滤光片等光程原则，每种波长的光波到达探测器的光程几乎一致，从而能量损失也几乎一致。

如图3所示，准直光线先被中心波长为550nm的长通二向色滤光片521分光，680nm、625nm及575nm的荧光透射，形成透射光1；而525nm荧光和488nm散射光被反射，形成反射光1。反射光1被中心波长为500nm的长通二向色滤光片522分光，525nm荧光透射，并经过窄带滤光片531、聚焦透镜541到达传感器551；488nm散射光被反射，依次经过窄带滤光片532、聚焦透镜542，到达传感器552。透射光1继续前进，被中心波长为600nm的二向色滤光片523分光，680nm透射，并经过窄带滤光片533、聚焦透镜543到达传感器553；625nm及575nm的荧光波长的光反射。此后重复进行，在此不再赘述。

最终，488nm、525nm和680nm的光波经过二向色滤光片的光程相同，能量损失约10％。575nm和625nm光波的光波经过二向色滤光片的光程相同，能量损失约14％。由于本实例用到的二向色滤光片数量为偶数，因此，不可避免后面两个波长的光会比前三个波长的光多经历一次二向色滤光片。但依然比传统方法平均很多。若二向色滤光片总数为奇数，则每个通道的能量损失完全一致。

值得注意的是，二向色滤光片521(-45°)和二向色滤光片523(+45°)的倾角符号相反，主要是为了抵消通过二向色滤光片的光线的横向偏移，使得光线的位相一致，最终使光线聚焦在光电探测器的中心附近。若按传统的方式，假设二向色滤光片的厚度为1mm，每经过一次透射后，光线将沿着光轴平移0.33mm，3次透射就达到了大约1mm。如果二向色滤光片的厚度更厚，或是经过二向色滤光片的次数更多，最终聚焦光斑可能就落在了探测器的边缘死区上。而使用本方法，聚焦光斑最远离探测器中心为0.1mm。免去了再次对探测器位置的装调。光电探测器555上接收到的光斑能量分布如图6所示，光斑面积远远小于3mm x3mm。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种流式细胞仪采集镜头，其包括设于流动室外部的荧光采集透镜组，其特征在于，所述荧光采集透镜组包括依次设置于流动室外且彼此共光轴的第一平凸透镜、正弯月透镜、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组；所述第一平凸透镜的平面为光入射面，凸面为光出射面；所述正弯月透镜的凹面为光入射面，凸面为光出射面；所述第一胶合透镜组包括依次设置的第一双凸透镜和第一负弯月透镜，所述第一双凸透镜和第一负弯月透镜的半径较小面相胶合，且第一双凸透镜半径较大的一面朝向流动室；所述第二胶合透镜组包括依次设置的第二负弯月透镜和第二双凸透镜，所述第二负弯月透镜和第二双凸透镜通过半径较小的一面相胶合，且第二负弯月透镜半径较大的一面朝向流动室。

2.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪采集镜头，其特征在于，所述正弯月透镜的口径大于第一平凸透镜的口径，所述第一双凸透镜的口径大于正弯月透镜的口径，所述第一负弯月透镜的口径大于或等于第一双凸透镜的口径，所述第二负弯月透镜的口径大于或等于第一负弯月透镜的口径，所述第二双凸透镜的口径大于或等于第二负弯月透镜的口径。

3.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪采集镜头，其特征在于，所述第一平凸透镜、正弯月透镜、第一双凸透镜、第二双凸透镜均为冕牌玻璃，所述第一负弯月透镜和第二负弯月透镜为火石玻璃。

4.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪采集镜头，其特征在于，所述荧光采集透镜组与流动室之间通过光学凝胶胶合。

5.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪采集镜头，其特征在于，所述荧光采集透镜组中各透镜的光轴共线，且和流动室的轴线垂直。

6.根据权利要求1所述的一种流式细胞仪采集镜头，其特征在于，所述荧光采集透镜组中各透镜的半径公差为5个光圈，不规则度为0.5个光圈，厚度公差为0.05mm。

7.一种双色激光流式细胞仪的光学系统，其特征在于，其包括荧光采集透镜组、D形反射镜、第一荧光采集光路、第二荧光采集光路；

所述荧光采集透镜组包括多个透镜，用于将多种不同间隔较小的激光束激发的荧光物点放大为多个相互之间存在较大间距的荧光像点；所述D形反射镜用于将经荧光采集透镜组放大后的荧光像点进行空间分光；所述第一荧光采集光路用于将其中一路荧光根据不同波长进行分光；所述第二荧光采集光路用于将另外一路荧光根据不同波长进行分光；

所述荧光采集透镜组与流动室之间通过光学凝胶胶合，所述D形反射镜安装于荧光采集透镜组的焦面上，且所述D形反射镜的反射面与荧光采集透镜组的焦面之间成45°夹角；所述第一荧光采集光路包括在光路方向上依次设置的第二平凸透镜、多个不同中心波长的二向色滤光片、多个不同中心波长的窄带滤光片、多个荧光聚焦物镜和多个荧光光电探测器；所述第二荧光采集光路包括在光路方向上依次设置的第三平凸透镜、多个不同中心波长的二向色滤光片、多个不同中心波长的窄带滤光片、多个聚焦物镜和多个光电探测器；所述二向色滤光片均按照等光程、位相补偿的方法设置。

8.根据权利要求7所述的一种双色激光流式细胞仪的光学系统，其特征在于，所述D形反射镜的法线和第三平凸透镜的轴线分别位于所述荧光采集透镜组光轴的相对两侧。

9.根据权利要求8所述的一种双色激光流式细胞仪的光学系统，其特征在于，所述D形反射镜的上边缘位于所述荧光采集透镜组的光轴上，所述第二平凸透镜的光轴与所述荧光采集透镜组的光轴垂直，所述第二平凸透镜的轴线和D形反射镜的反射面相交，且第二平凸透镜的轴线与D形反射镜的反射面呈45°夹角。

10.根据权利要求7所述的一种双色激光流式细胞仪的光学系统，其特征在于，所述荧光采集透镜组包括依次设置于流动室外且彼此共光轴的第一平凸透镜、正弯月透镜、第一胶合透镜组和第二胶合透镜组，所述第一平凸透镜的平面为光入射面，凸面为光出射面；所述正弯月透镜的凹面为光入射面，凸面为光出射面；所述第一胶合透镜组包括依次设置的第一双凸透镜和第一负弯月透镜，所述第一双凸透镜和第一负弯月透镜的半径较小面相胶合，且第一双凸透镜半径较大的一面朝向流动室；所述第二胶合透镜组包括依次设置的第二负弯月透镜和第二双凸透镜，所述第二负弯月透镜和第二双凸透镜通过半径较小的一面相胶合，且第二负弯月透镜半径较大的一面朝向流动室。