CN110031384A - 流式细胞仪 - Google Patents

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Abstract

流式细胞仪，其包括：基于激光二级管的光学子系统，用于将光束入射到通过观察区的粒子上；复合显微镜物镜，用于对由通过观察区的粒子散射的光和发出的荧光进行收集和成像；流体子系统，用于将液体鞘流供应到观察区；蠕动泵，用于将与液体鞘流一起通过观察区的携载粒子的液体试样流注入到液体鞘流内；多模光纤，其接收由复合显微镜物镜收集并成像的从观察区散射和发出的荧光；以及波分多路复用器，用于将经由光纤所接收的光在光学上分离成有色带。

Description

流式细胞仪
技术领域
本公开总地涉及流式细胞术的技术领域，并且更具体地，涉及改进的流式细胞仪连同包括在其中的各个独立的组件的结构和操作。
背景技术
流式细胞术是在细胞计数、分选、生物标志物检测和蛋白质工程中采用的生物物理学技术。在流式细胞术中，悬浮于液流中的细胞通过电子检测设备。流式细胞术允许每秒对高达数千个细胞同时进行物理和/或化学特性的多参数分析。
流式细胞术具有包括在分子生物学、病理学、免疫学、植物生物学和海洋生物学领域中的多项应用。流式细胞术在医学中(尤其是在移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、产前诊断、遗传学和用于性别预选的精子分选中)也具有广泛的应用。在海洋生物学中，光合作用浮游生物的自体荧光特性可被流式细胞术用于表征个体密度和群落组成。在蛋白质工程学中，流式细胞术与酵母展示和细菌展示结合使用，以便识别具有所需性质的在细胞表面展示的蛋白质变异体。流式细胞术的一种常见变型是基于粒子的性质对粒子进行的物理分选，从而纯化所关注的群体。
整个流式细胞仪系统包括下列主要部件。
1.流通池，通常称为鞘流、鞘液体或鞘流体的液流通过流通池，携载细胞或粒子并将细胞或粒子流体动力学地对准，使得细胞或粒子单行通过流通池。
2.测量子系统，其耦连到流通池，检测通过流通池的细胞或粒子，且通常是下述之一：
a.阻抗或电导率测量子系统；或
b.光学照射子系统连同光学感测子系统。
3.转换子系统，其用于将来自测量子系统的输出信号转换成计算机可处理的数据。
4.计算机，其用于分析由转换子系统所生成的数据。
光学照射子系统提供准直而后聚焦的光束，通常为单一波长的激光，其入射到通过流通池的被流体动力学地聚焦的液流上。因此，流式细胞仪系统可具有一个或多个光源，其可以包括：
1.一个或多个灯，例如汞灯或氙灯；
2.一个或多个高功率水冷式激光器，例如氩、氪或染料激光器；
3.一个或多个低功率风冷式激光器，例如氩(488纳米)、HeNe(红-633纳米)、HeNe(绿)和HeCd(UV)；和/或
4.一个或多个二极管激光器(蓝、绿、红和紫)。
光学感测子系统包括一个或多个检测器，其瞄准聚焦的流液通过所述光速的地方。这种检测器可包括：
1.与光束方向一致的检测器(前向散射器或FSC)；
2.垂直于光束的检测器(侧向散射器或SSC)；和
3.荧光检测器。
通过光束的各悬浮粒子对该光进行散射，并且由入射光激发的存在于粒子中或附着于粒子的荧光材料发射比入射光波长更长波长的光。在每个检测器(针对每个荧光发射峰各有一个)处检测和分析散射光和荧光的组合的亮度变化允许推导出有关每个独立粒子的物理和化学结构的各类信息。FSC与细胞容积有关。由于光被散射离开细胞的内部部件，SSC取决于粒子的内部复杂度(即，细胞核的形状、胞质颗粒的数量和类型或细胞膜的粗糙度)。有些流式细胞仪省去荧光检测器而只检测散射光。其它流式细胞仪形成每个细胞的荧光、散射光、以及透射光的图像。
流式细胞仪系统的转换子系统通常包括一个或多个模拟-数字转换器(“ADC”)用于将测量子系统的输出信号转换成随后由计算机进行处理的数据，所述转换子系统可包括可为线性或对数的一个或多个放大器。
现代流式细胞仪通常包括多达四(4)个激光器和数个荧光检测器。增加激光器和检测器的数量允许以若干不同的抗体来标记细胞，并且可以通过其表型标志物来更精确地识别目标群体。某些仪器甚至可以捕获独立细胞的数字图像，从而允许对细胞内或细胞表面上的荧光信号的位置进行分析。
试样照射
在大多数的仪器中，诸如血细胞或微球的受关注的粒子由利用流体动力学聚焦的鞘流携载到小杯或喷射流内部的观察区内，并于该处由聚焦的激光束进行照射。该技术提供了准确地识别受关注的粒子并对所述粒子计数的一种手段，而不会被在注册时间窗之外出现的背景噪音所淹没(实用流式细胞术，Howard M.Shapiro，威利(2003)ISBN0471411256)。为了提高检测灵敏度，聚焦激光束的横截面通常是椭圆形的，其中短轴沿着流动方向。为了保持阈值完整性，激光轮廓必须具有沿着流动方向的平滑或钟形轮廓。用于产生这种光束的一种常见方法是，利用由棱镜或柱面透镜对所制成的扩束器沿着流动方向将几乎准直的圆形高斯光束细长化，然后用球面透镜对光束进行聚焦。因为光束在焦点处的形状是光束在远场处的空间傅立叶变换，这产生高斯形椭圆光斑，其中短轴沿着流动方向。
传统激光器价格昂贵、体积大且耗电。最近，激光二极管(“LD”)已经可以使用。与传统激光器不同，新一代LD具有成本效益、结构紧凑且节能，并为新一代紧凑型生物医学仪器展现了巨大前景。LD发射具有椭圆形横截面的光，其中经常被称为快轴的椭圆长轴垂直于LD的接头，而经常被称为慢轴的椭圆短轴平行于LD的接头。遗憾的是，典型LD的特别是沿其快轴的光束质量可谓非常不理想，从而使其无法在流式细胞术的应用中被广为接受。
原则上，LD光束的质量可通过空间滤波显著改善。如果小型针孔或单模光纤位于透镜的焦点处，使得其只能接受最低阶的空间模式，则通过针孔或单模光纤的光束将是近似完美的高斯形状。序号为5,788,927的美国专利公开这样的光束可在流动通过细胞仪的方向上被准直并扩展，并最终聚焦成椭圆形高斯光束，其中短轴沿着流动方向。遗憾的是，台式仪器的尺寸将针孔的直径限制到小于5微米。可见光波长单模光纤的纤芯大小也具有类似的尺寸。制备精密空间滤波器及其维持它的长期稳定性的挑战不仅增加了基于LD的激光系统的成本，而且还降低了其可靠性。
最近，在致力于减少因准直透镜的有限数值孔径的边缘效应所导致的可能的旁波瓣的过程中，序号为6,713,019的美国专利(“'019专利”)公开了将LD旋转过90度(90°)，使得其慢轴平行于流动方向。然后将诸如凹面柱面透镜的光束漫射区段引入，以便在垂直于流动的方向上漫射该准直光束，随后引入诸如球面聚焦透镜的光束光斑形成区段，以便在细胞仪的粒子观察区内形成椭圆形光斑。如在'019专利中详细描述的那样，在光斑形成区段之后的激光束是非常像散性的。具体地，在垂直于流动方向上的在观察区处的光束宽度可与流量通道的宽度相当或大于所述流量通道的宽度。这不仅降低了入射到粒子上的激光能量的量并因此降低信号强度，同时也增加了来自液流细胞界面的非预期的背景散射。取代旋转LD，序号为7,385,682和7,561,267的美国专利公开了使用大数值孔径非球面透镜来用于LD准直。但是这样的设计不能校正LD光束轮廓中固有的边缘效应。因此，目前对适于在流式细胞仪中使用的基于LD的简单光学系统存在需求，其能够可靠地产生沿其短轴具有近高斯形状并且沿其长轴具有一定宽度的聚焦椭圆形光束。
观察区
显微镜物镜
现代的流式细胞仪包括空间滤波器，其通常为机械针孔或大纤芯光纤，位于物镜的图像位置处以防止非预期的背景光进入到细胞仪的检测器内。由于粒子停留在细胞仪的观察区内几微秒，因此必须使用具有大数值孔径的显微镜物镜以最大化集光效率。为了支持在流式细胞仪中的多个空间上分离的激发用激光束，如在序号为4,727,020的美国专利中所公开的那样，也希望使用具有较大视野的物镜。为了实现这些目标，序号为6,510,007和7,110,192的美国专利公开了一种物镜设计，作为最靠近试样的光学元件，其利用了具有凝胶耦连或环氧树脂粘结的接近半球透镜的修正的复消色差透镜，，接着为多个凹凸透镜。虽然这种显微镜物镜提供令人满意的数值孔径和视野，但它们显著牺牲了图像质量，由此：
1.限制了空间滤波器的有效使用；以及
2.表现出欠佳的背景光识别力。
此外，这种折射型显微镜物镜体积大，制备成本昂贵，并通常表现出严重的色差。为了克服这些限制，公布的序号为WO 01/27590的专利合作条约(“PCT”)专利申请公开了基于球形凹面镜的替代性物镜设计。该设计提供了大数值孔径以及沿着光轴的良好图像质量。然而，由于其较差的离轴特性，这样的设计并不适用于具有多个空间上分离的激光束的流式细胞仪。
鞘液体供应
流式细胞仪的性能关键取决于稳定的液体鞘流。具体地，具有多个空间上分离的激发用激光束或执行液滴分选的流式细胞仪依赖于液体鞘流的恒定速度以便定时同步。如序号为5,245,318的美国专利中所公开，传统的流式细胞仪通过使用气密式的流体系统提供稳定的液体鞘流，该系统：
1.在鞘液体储槽内施加恒定的空气压力以将流体推动通过所述流通池；或
2.使用真空泵通过流通池从鞘液体储槽抽取流体。
这些系统体积大，制备成本昂贵，并容易出现故障。最近，序号为8,187,888的美国专利公开了包括鞘液体子系统和废鞘液体泵，所述鞘液体子系统将液体鞘流从鞘液体储槽泵入到观察区内，所述废鞘液体泵将废鞘液体从观察区泵入到废液槽内。虽然看起来所公开的鞘液体子系统从未在速度关键流式细胞仪中使用，但是该专利报告，所公开的鞘液体子系统通过下述来克服传统鞘液体流稳定性的大多数缺陷：
1.通过定位下述装置来阻尼泵脉动：
a.鞘液体泵和流通池之间的一个流体电容器；以及
b.流通池和废液泵之间的另一个流体电容器；以及
2.泵控制器，其操作对压力传感器作出响应，所述压力传感器测量所述流通池的入口和出口之间的压力差。
所公开的鞘液体子系统具有其它限制。例如，位于所述流通池出口附近的压力传感器可能是潜在的污染源。
蠕动泵
试样液体供应
蠕动泵是容积泵，其中一组线性地或圆形地移动的辊逐步压缩可压缩管以将流体推压通过管。蠕动泵尤其被广泛用于泵送洁净的/无菌性或腐蚀性流体，以避免外露的泵组件的交叉污染。
传统的蠕动泵在辊每次滚离泵出口附近的管时呈现脉动，其由压缩管膨胀回其原始形状时管容积的暂时性增加所导致。脉动在需要平稳流动的应用中是非预期的。在过去已经进行了许多尝试来减少脉动。例如，序号为3,726,613和3,826,593的美国专利介绍了凸轮操作的推杆，其将外部压力同步地施加到管上以补偿管的扩张。在序号为4,834,630的美国专利中，安装在分段辊上的多根管通过T形联接器在泵入口和出口处接合在一起，从而来自各个管的脉动会通过平均而被减少。序号为7,645,127的美国专利提出了一种泵送管，其在入口附近具有稍大的内径，使得泵出口附近的管的减压由入口附近的较大容积的管的压缩来补偿。各种方法或显著地增加蠕动泵的复杂性，或在降低脉动效应上的效用有限。
多色荧光检测
在多种多色荧光检测仪器诸如流式细胞仪(实用流式细胞术，Howard M.Shapiro，威利(2003)ISBN 0471411256)中，从受关注的对象发出的荧光：
1.由显微镜物镜收集；
2.通过小型针孔或多模光纤而重新成像；
3.随后准直化并分离成多个有色带；并且
4.最后由诸如光电倍增管(PMT)、PIN光电二极管或雪崩光电二极管(APD)的光检测器检测。
PMT实质上是一种特殊类型的电子管。这种“前-半导体年代”的装置体积大且昂贵。此外，其具有较差的量子效率和比基于硅系半导体检测器更少的可再现性的频谱响应，特别是在生物学上重要的红光至近红外光频谱区尤其如此。尽管有缺陷，PMT仍具有优异的噪声特性。例如，典型的13毫米PMT(例如，来自日本Hamamatsu公司的R9305)的暗电流仅约1nA。相比而言，即使其有源区减少到PMT有源区的二十分之一，APD的暗电流将为PMT暗电流的10倍以上。因此，PMT已经成为实际上在许多商业荧光检测流式细胞仪中的低水平光检测器。只有在事件发生率较低以及暗电流可通过昂贵的光子计数技术区别的某些科学应用中，PMT才由APD检测器替代。(参考，高通量流式细胞术DNA片段的尺寸制订，A.V.Orden，R.A.Keller,和W.P.Ambrose，Anal.Chem.,2000，72(1)，p37-41)。最近，也提出用盖革模型APD阵列作为PMT的替代品。(例如，日本Hamamatsu Photonics的多像素光子计数器以及爱尔兰SensL Inc.的固态光电倍增管)。但是这些检测器也有高的暗电流和在高事件率下为非线性的缺陷。
APD被广泛接受的唯一行业是在光通信中。已知的是，如果APD的有源区减小到小于1mm2，则相应的暗电流会降低到与PMT相同的水平。在光通信中，光是出自单模光纤的激光束。这种光束可被容易地准直然后聚焦到比1mm2小得多的区域。应当指出的是，在荧光检测仪器中使用的分色装置(如在序号为6,683,314的美国专利和其中的参考文献所描述的那样)在功能和结构上几乎与广泛应用于光通信中的波分多路复用器(WDM)相同，如在序号4,482,994和5,786,915的美国专利中所述的那样。阻止在荧光检测仪器中使用小面积APD的基本理由是公知的光学扩展量守恒定理：通过针孔或多模光纤的荧光是扩展光源，其具有的光学扩展量比出自单模光纤的激光束的光学扩展量大数百倍。因此，如图26中所示，除非光束直径被显著扩展，否则其就不能在延长的距离下准直。遗憾的是，光束直径越大，则将光束聚焦到一个小光斑的技术挑战越大。由于只能以经准直光束经济地完成有效分色，因此小面积的APD对多色荧光检测应用被认为是不可行的。显然，能够在延长的距离下准直较大光学扩展量的光束而不显著地扩展光束直径的技术将是非常理想的。这种技术将使得类似WDM的装置能够用于荧光检测，具有与低噪声半导体检测器相媲美的特性。
发明内容
本公开提供了改进的流式细胞仪连同包括在其中的各种改进的组件。
本公开的目的是提供一种简单而可靠的基于二极管激光器的光学系统，其能够传送椭圆形截面的聚焦激光束，该激光束具有针对流式细胞术应用优化的沿其短轴的高斯状强度分布以及沿着长轴的一定宽度。
本公开的目的是成像质量显微镜物镜，其易于制造，具有长工作距离、大数值孔径、大的视野和最小的色差。
本公开的目的是用于流式细胞仪的简单的流体系统，其不仅可靠、结构紧凑、易于制造，而且也能够支持速度关键性的应用，诸如在具有多个空间上分离的激发用激光束的仪器中或在液滴分类器中的应用。
本公开的目的是蠕动泵的简单设计，其可以提供高度期望的无脉动液体流。
本公开的目的是提供一种具有最小脉动的蠕动泵。
本公开的目的是提供一种制造和操作简单的蠕动泵。
本公开的目的是提供一种装置，其能够在延长的距离下准直来自扩展光源的光束，而不会显著扩展所述光束的直径。本公开的另一个目的是提供一种WDM系统，其使用所述装置以将所述光束分离成多个有色带。此外，本发明的目的是提供与低噪声半导体检测器兼容的该类WDM系统。此外，由于荧光探针的多样性，本发明的目的是提供可重新配置的该类WDM系统。
本文所公开的是一种流式细胞仪，其包括：
1.基于LD的光学子系统，其用于将光束入射到通过观察区的粒子上；
2.复合的显微镜物镜，其用于对通过观察区的粒子散射的光或发出的荧光进行收集和成像；
3.流体子系统，其用于将液体鞘流供应给观察区；
4.蠕动泵，其用于将携载粒子的液体试样流注入到液体鞘流内，所述液体试样流连同液体鞘流一起通过所述观察区；
5.多模光纤，其接收复合显微镜物镜所收集和成像的从观察区所散射的光和发出的荧光；以及
6.波分多路复用器，其用于将经由光纤所接收的光在光学上分离成有色带。
根据本公开的用于照射通过所述流式细胞仪观察区的粒子的基于LD的光学子系统通常包括：
1.激光二极管，以其慢轴平行于流动方向为取向；
2.准直透镜，其将来自LD的发散光束转换成椭圆形的准直光束，其长轴垂直于流动方向；
3.聚焦透镜系统，其在垂直于流动方向的方向上将在所述观察区处的激光束缩小到最佳宽度；以及
4.最后的高倍率柱面聚焦元件，其设置于所述观察区的附近，其轴垂直于流动方向。
高倍率柱面聚焦元件将LD沿其慢轴的远场轮廓转置为在沿着流动方向的观察区处的其傅立叶共轭，同时维持横向光束轮廓，使得在观察区处的激光束轮廓最适用于流式细胞术应用。
根据本公开的复合显微镜物镜通常包括：
1.凹面球面镜；
2.透明像差补偿板
其中流式细胞仪的观察区位于球面镜和补偿板之间。观察区中的粒子发射的散射光和荧光由球面镜收集并朝向补偿板向回反射。源自球面镜的光学像差在光通过所述补偿板后显著降低。在本公开的一个实施例中，观察区位于由具有小的矩形通道的矩形玻璃小杯所提供的流通池内部，携载粒子的液体流动通过所述通道。凹面镜由诸如玻璃或光学质量塑料的平凸形状的光学透明材料制成，在凸面侧上具有高度反射性涂层用于进行内部反射。镜的平面侧凝胶耦连或粘结到小杯的一个侧表面。平面-非球面补偿板由诸如玻璃或光学质量的塑料透明材料制成，平面侧凝胶耦连或粘结到小杯的相对侧。平凸形状的镜和非球面的补偿板也可与小杯整体地形成。在本公开的又一个实施例中，观察区位于喷射流内，其中凹面镜和补偿板二者独立于观察区，并且所述镜优选是前表面凹面镜。
根据本公开的流体系统通常包括鞘液储槽，液体泵从其中抽吸鞘液。鞘液然后从液体泵流到T型联接器的入口。T型联接器的一个出口臂连接到旁路，其将所泵送的鞘液的一小部分返回到鞘液储槽，所返回的鞘液体流入到鞘液储槽内的空气中。T型联接器的第二出口臂连接到鞘路径，其包括储槽容器随后是粒子过滤器然后是流通池。然后离开流通池的鞘液体进入到废液槽内。沿着旁路的流体阻力被设计为低于沿着鞘路径的流体阻力。因此，只有一小部分鞘液体通过流通池。需要指出的是在流式细胞术应用中的典型鞘流速是每分钟几十毫升。因此旁路允许使用较高流速的液体泵，其不仅更便宜、更可靠，而且可在更容易衰减的更高脉动频率下操作。由于旁路路径的出口连通到空气中，其还用作大型流体电容器，以便显著减少沿着鞘路径流动的鞘液体中的脉动。在操作过程中，过滤器滤芯的入口部分填充有空气。因此，该过滤器滤芯还用作流体电容器，用于进一步将在所述流通池处的鞘液体中的脉动降低到可忽略不计的水平。由于在流通池处的较大流体阻力，在过滤器滤芯入口附近截留的空气被压缩。如果液体泵被关闭，被朝向鞘液储槽推回的滤芯内的压缩空气被储存于尺寸可选的储槽容器内，以防止所截留的空气到达T形联接器。
根据本公开的蠕动泵通常包括多个位于转子和可压缩管的周边处的辊，所述转子使辊在弧形弯曲轨道的壳体内环形地移动，以及所述辊抵靠所述轨道而压缩可压缩管。在本公开的一个实施例中，蠕动泵壳体的轨道具有一个凹部，以便当每次辊之一移动经过所述凹部时，可压缩管逐渐减压至完全膨胀，然后压缩至完全闭合。凹部的位置和形状将保持从凹部到泵出口的可压缩管中的液体总体积基本上不变。当辊移动经过所述泵出口时管扩张的效应通过当紧接在泵出口上游的另一个不同的辊移动到凹部的压缩区段时的管压缩来补偿。在本公开的另一个实施例中，泵壳体的轨道可包括多个凹部，从而提供泵出口上游的多个辊来逐步修正沿着可压缩管的多个区段中的管压缩。设计了多个凹部的位置和形状，从而在这些区段处的管压缩的修改大致补偿由于泵出口附近的管扩张所导致的效应。在本公开的又一个实施例中，除了在入口和出口区段中之外，可压缩管在辊下方保持完全闭合。可变速马达用于驱动泵。当辊到达所述出口区段时，马达的旋转按程序加速以补偿所述管的扩张。
根据本公开的波分多路复用器(“WDM”)通常包括至少两个光学元件。第一光学元件准直所接收的来自扩展光源的光束，诸如来自针孔或来自多模光纤的光。第一光学元件放大例如如由针孔或者多模光纤的纤芯所限定的扩展光源到具有类似于第一光学元件的有效横截面大小的图像，从而在第一光学元件和它的图像之间形成准直的光束。第二光学元件位于图像附近，并中继第一光学元件，其中沿着光学路径放大倍率为一。以这种方式，第二光学元件有效地使得准直的路径长度加倍。以相同的1：1图像中继配置下的附加的光学元件也可被包括在本公开内，以进一步延长准直的光学路径。本公开的级联放大倍率为一的图像中继结构提供了显著延长准直光学路径的长度而没有大的光束扩展。因此，光通信行业中公知的WDM技术可容易地适用在荧光检测中。特别地，在光束中存在的多个有色带可使用沿着光学路径定位的二色性滤光器来分离，其中所分离的光紧密地聚焦成与低噪声半导体光检测器兼容的小光斑。
在WDM的一个实施例中，第一光学元件是透镜，以及所述第二元件是凹面镜，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，也可以使用其它类型的折射性和/或反射性光学组件来实现相同的设计目标。类似于其在光通信的对应部分，在本公开的WDM中的光学路径可使用二色性滤光器折叠。在本公开的一个实施例中，光学路径被折叠成锯齿形配置。优选地，为了促进流式细胞仪的可靠的重新配置，各个二色性滤光器粘结到机械保持器，其具有在光学上平行于滤光器反射表面的参考表面。因此，所有WDM的滤光器可通过参考抵靠共用光学平面的滤光器的保持器而精确地沿着光学路径定位。
在本公开的另一个实施例中，通过二色性滤光器的准直光束使用二次二色性滤光器被进一步分支成多个有色带。对于本领域内技术人员而言显而易见的是，二色性滤光器可在插入到由本公开的中继成像所提供的长而窄的准直光束路径沿线的任何地方，从而允许使用各种光学配置将紧密聚焦光束传送到光检测器，诸如在序号为6,683,314的美国专利中所述的星形配置，在序号为4,727,020的美国专利中所述的分支配置以及光通信行业中广泛实践的其它类型的WDM光学配置。代替凹面镜，WDM可由曲面二色性滤光器代替，以进一步增加由WDM所选择的有色带的数目。
从以下各幅附图中示出的对优选实施例的详细描述中，这些和其它特征、目的和优点对于本领域内普通技术人员而言将是易于理解或显而易见的。
附图说明
图1是示意性示出根据本公开的流式细胞仪的优选实施例的视图，其包括：
a)基于LD的光学照射子系统；
b)从基于LD的光学照射子系统发出的光入射到其上的复合显微镜物镜，所述显微镜物镜具有贯穿其形成的流体流通通道，其中粒子照射观察区位于其小杯内部；
c)流体系统，其用于将无脉动的鞘液体流供应到由贯穿复合显微镜物镜所形成的流体流通通道；
d)蠕动泵，其用于将携载待分析的细胞或粒子的无脉动试样液体流引入到由流体系统所供应的液体鞘流内；以及
f)波分多路复用器(“WDM”)，其具有用于将光束分离成多个不同有色带的锯齿形配置，WDM经由光纤接收光，当细胞或粒子通过复合显微镜物镜的流体流通通道且在其中由从基于LD的光学照射子系统发射的光照射时，所述光从细胞或粒子散射。
图2是描绘典型高功率边缘发射LD的示出光从其发射的快轴和慢轴的示意图。
图2A示出了从图2所示的LD芯片中发射的激光束的典型远场轮廓。
图3A示出了用于流式细胞仪的传统现有技术的基于LD的光学照射子系统连同系统的流通池的三维视图。
图3B示出了在该系统的流通池内部的其焦点处通过图3A所示的激光束的细胞或粒子所散射的光的典型时间相关性轮廓图。
图4A是横跨流动通过流体流通通道的液体的、替代性现有技术的基于LD的光学照射子系统配置的正视图，其改进了在流式细胞仪系统观察区中的其焦点处的光束轮廓。
图4B是沿着流动通过流体流通通道的液体的、图4A中所示的替代性的现有技术的基于LD的光学照射子系统的平面视图。
图5A是横跨流动通过图1中所示的复合显微镜物镜的流体流通通道的液体的正视图，其中所述LD的慢轴横向于液体流进行取向。
图5B是沿着流动通过图1中所示的复合显微镜物镜的流体流通通道的液体的平面视图，其中所述LD的慢轴横向于液体流进行取向。
图5C示出了从流动通过图1中所示的复合显微镜物镜的流体流通通道的细胞或粒子所散射的光的典型时间相关性轮廓图。
图6是根据本公开的基于LD的光学照射子系统的替代性实施例的透视图，其适于在液体喷射流通过观察区的流式细胞仪系统中使用。
图6A是基于LD的光学照射子系统的替代性实施例的放大透视图，更详细地示出了流动通过观察区的液体喷射流。
图7是根据本公开的适于在流式细胞仪系统中使用的基于LD的光学照射子系统的替代性实施例的透视图，其LD的慢轴平行于流动通过图1中所示的复合显微镜物镜的流体流通通道的液体方向进行取向。
图8是根据本公开的适于在图1中所示的流式细胞仪系统中使用的复合显微镜物镜的透视图，所述复合显微镜物镜具有贯穿其中所形成的流体流通通道，其中粒子照射观察区位于其中的小杯内。
图9A是沿着图8中的线9A-9A所取的复合显微镜物镜的剖视正视图，其包括从观察区中的三(3)个在空间上分离的位置到物镜成像平面的射线踪迹，示意散射和荧光的发射传播。
图9B1-9B3是针对图9A中所示三(3)个在空间上分离的光发射的位置的接近图9A中所示图像平面的光斑图。
图10是根据本公开的类似于图9A所示的视图的复合显微镜物镜的替代性实施例的剖视正视图，其包括从其中的观察区中的三(3)个在空间上分离的位置到物镜成像平面的射线踪迹，示意散射和荧光的发射传播。
图11是根据本公开的适于在图1中所示的流式细胞仪系统中使用的复合显微镜物镜的又一替代性实施例的透视图，所述复合显微镜物镜的替代性实施例具有贯穿其中所形成的流体流通通道，其中粒子照射观察区位于其中的小杯内。
图12是根据本公开的适于在图1中所示的流式细胞仪系统中使用的复合显微镜物镜的又一替代性实施例的透视图，所述复合显微镜物镜的替代性实施例适用于位于图6和图6A中所示喷射流内部的观察区。
图13是根据本公开的适于在位于显微镜载玻片表面上的观察区中使用的复合显微镜物镜的另一替代性实施例的透视图。
图14是根据本公开示出的用于将稳定的液体鞘流提供给流式细胞仪流通池的流体子系统的示意图，其包括：
1.位于鞘液体泵和流通池之间的小型器皿；以及
2.位于小型器皿和流通池之间的粒子过滤器；
粒子过滤器和小型器皿均提供用于阻尼泵脉动的空气储槽。
图15是示出了类似于图14中的流体子系统的替代实施例的示意图，其用一定长度的管代替小型器皿以便提供空气储槽。
图16A和图16B是直方图，其将当粒子过滤器的入口部分具有截留在其中的空气时(图16A)以及当在鞘液体泵和流通池之间的流体子系统中没有空气时(图16B)的在流通池所测得的粒子飞行时间进行比较。
图17是根据本公开的三辊蠕动泵的透视图，示出泵的辊、管和周围泵壳体。
图18A至图18D示出了图17中所示的三辊蠕动泵的几种状态的简化视图，其中辊处于不同的位置。
图19是被泵的辊部分地压缩的蠕动泵的管的详细纵向剖视图。
图19A和图19B是沿着图19中的线19A和19B所取的正交于蠕动泵的管长度的详细剖视图，其示出管被辊部分地压缩。
图20A和图20B是示出沿着泵的圆坐标所观察的泵的辊和管的示意图，以便示出由蠕动泵所提供的无脉动。
图21是示出当辊滚离可压缩管的出口区段时相对于辊位置的函数关系的图：
1.在泵的出口半部中的液体的总体积；以及
2.在泵的下述区段中的液体的体积：
a.凹入区段；以及
b.出口区段。
图22是根据本公开的四辊蠕动泵的简化平面图。
图23是根据本公开的六辊蠕动泵的简化平面图。
图24A是示出根据本公开的具有可编程速度的转子的脉动最小化的三辊蠕动泵的辊和可压缩管的纵向剖视图。
图24B是示出根据本公开的具有可编程速度的转子的脉动最小化的三辊蠕动泵的简化平面图。
图24C是示出图24B中所示的具有可编程速度的转子的蠕动泵脉动最小化的图：
1.相对于辊位置的负体积变化率；
2.转子速度；以及
3.泵的流速。
图25是示出根据本公开的使用锯齿形配置的示例性六端口波分多路复用器(“WDM”)的光线追踪的图。
图26是示出现有技术准直装置的光线追踪的图，示出在准直扩展光源中装置的限制。
图27是根据本公开的使用锯齿形配置和分支配置的组合的六端口WDM实施例的透视图。
图28是根据本公开的具有凹面二色性滤光器的WDM另一实施例的透视图。
图29A和图29B是示出根据本公开为可重新配置的WDM构建可更换的二色性滤光器组合件的组装过程的透视说明图。
图29C是根据图29A和图29B的视图构建的可更换的二色性滤光器组合件的透视图。
图30A和图30B是示出根据本公开的WDM的透视图，示出将图29C中所示的可更换的二色性滤光器组合件安装到WDM中以及将其从WDM移除。
具体实施方式
流式细胞仪
图1示出根据本公开的总体以附图标记40标识的流式细胞仪。流式细胞仪40包括：
1.基于LD的光学子系统50；
2.复合显微镜物镜60；
3.用于供应液体鞘流的流体子系统70；
4.蠕动泵80，其用于将包含待分析粒子的液体试样流注入到由流体子系统70所供应的液体鞘流内，所述液体试样流由流动通过观察区的液体鞘流流体动力学聚焦，，其中复合显微镜物镜60采集和成像由观察区内的粒子所散射的光和/或发出的荧光；
5.光纤852，其接收由复合显微镜物镜60所收集和成像的由观察区内的粒子所散射的光和/或发出的荧光；
6.波分多路复用器90(“WDM 90”)，其用于光学处理从光纤852所接收的散射光和/或荧光。
光学子系统50
光学子系统50包括LD 501，如图2中所详细示出的那样，所述LD 501从其边缘发射发散光束。如在图2和2A中以图形更详细地示出的那样，发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴亦即快轴和短轴亦即慢轴。从LD 501发射的发散光束照射到准直透镜502上，所述准直透镜502将由LD501所发射的发散光束转换成具有椭圆形横截面的准直光束。虽然不是必需的，但是光学子系统50还可包括可选的反射镜503，其被定位成将准直的椭圆光束朝向复合显微镜物镜60进行引导。位于所述复合显微镜物镜60附近的平凸透镜504减短椭圆形光束的长轴，其垂直于所述液体试样和周围液体鞘流通过复合显微镜物镜60内的观察区的方向而取向。在该观察区，椭圆形光束的宽度：
1.垂直于液体试样流流动通过所述观察区的方向的宽度优选略小于液体鞘流的宽度；而
2.仍然足够宽，使得试样流中的粒子在光束的最大强度处流动通过椭圆形光束的近似平坦部。
根据本公开，对于本领域内技术人员而言显而易见的是平凸透镜504可由其它类型的光学元件代替，诸如消色差双合透镜或球面透镜、柱面透镜和/或棱镜对的组合。可替代地，镜面503和透镜504也可以由凹面镜代替。对于流式细胞仪流40的偏振敏感应用而言，诸如半波片的可选的偏振调节元件)也可被放置于从准直透镜502延伸到透镜504的光束的准直区段内。最后，在通过观察区之前，光束通过位于邻近观察区处的高倍率柱面透镜505。如图1中所示，柱面透镜505的轴线垂直于液体试样流流动通过所述观察区的方向而取向，并且所述柱面透镜505的焦距在观察区处产生光束短轴的紧密聚焦。
光学子系统50相对于传统的基于LD的光学子系统的优点可在图2和2A中更清楚地看到。适于在流式细胞仪中使用的大部分市售的激光二极管从其边缘发射光束。如图2中所示，这样的LD芯片510的增益区段509在由箭头511所指示的横向方向受极大的限制。因此，为了获得高输出功率LD，制造商经常牺牲光束品质，特别是沿着平行于箭头511取向的横向或快轴方向。图2A示出了从LD所发射的光的这一特点，其中由于增益限制所导致的多个条纹512在所发射光束的短轴方向上的远场处清晰可见。应当指出的是，在图2A的图示中出现的条纹512只含有光束总能量的一小部分，因此对相应光束轮廓的传统M-平方特性影响不大。然而，如下文所更加详细论述的那样，条纹512确实对传统流式细胞仪的性能具有不利的影响。可替代地，沿着垂直于箭头511取向的边缘发射LD的慢轴方向的增益限制更为放松。因此，如图2A中所示，远场光束轮廓沿着LD光束的慢轴更为平滑。
图3A示出了用于流式细胞仪的传统的基于LD的光学子系统。图3A中所示的与图1中所示光学子系统50共有的那些元件带有相同的附图标记，但用撇号(')标示加以区分。如图3A中所示，传统的光学子系统将LD 501的快轴平行于液体试样流流动通过所述观察区的方向来取向。在其最简单的配置中，LD 501'的椭圆形光束轮廓通过球面聚焦透镜504'直接转入观察区内。在试图获得聚焦光束最佳纵横比的过程中，各种不同的传统的基于LD的光学子系统还包括除了图3A中所示的那些之外的光束成形光学元件。
条纹512沿着用于传统的光学子系统配置的LD 501'的快轴的不利影响在图3B中所示的光散射时间剖面中明显地显现。由于散射或荧光强度与入射到粒子上的局部激光功率成正比，因此沿着液体试样流流动通过观察区的方向的光束轮廓中的任何精细结构将出现在由流式细胞仪所产生信号的时间剖面中。在时间剖面中的这种结构与由小粒子所产生的信号无法区分，因此将导致流式细胞仪错误触发而错误地识别粒子。此外，条纹512也将导致其它细胞仪参数的测量中的不确定性，诸如图3B中所示的脉动的面积和宽度。
图4A和图4B示出了前述'019专利中所公开的用于基于LD的流式细胞应用的又一现有技术光学子系统。图4A和4B中所示的与图1或图3A中所示光学子系统50共有的那些元件带有相同的附图标记，但用双撇号(”)标示加以区分。如图4A和4B中所示，通过使得LD501”的慢轴平行于液体试样流流动通过所述观察区的方向来取向，图4A和图4B中所示的光学子系统有效地克服如上所述的由条纹512所导致的问题。遗憾的是，置于图4A和4B中球面聚焦透镜504”之前以便漫射垂直于所述液体试样流流动通过所述观察区的方向的光束的光束漫射元件513”产生接近观察区的高度像散性光束。具体地，在所述观察区处将该像散性光束在液体试样流流动通过所述观察区的方向上聚焦增加了垂直于液体试样流流动通过所述观察区的方向的光束宽度，使得光束宽度变得类似于或甚至宽于鞘流。因此，图4A和图4B中所示的光学子系统不仅减少了入射到流动通过观察区的粒子上的光能量，而且光学子系统也增加了来自液体鞘流与复合显微镜60的相邻部件之间界面的非预期的光散射。
图5强调在'019专利中所公开的光学子系统和在图1中所示的光学子系统50之间的主要差异。取代如图4中所示将非平面光束漫射元件513”置于球面光束聚焦透镜504之前，在图5A和5B中示出为柱面平凸透镜的高倍率柱面透镜505沿球面光束聚焦透镜504后方的光束设置，并优选与复合显微镜物镜60并列。如图5A和5B中所示，柱面透镜505将光束的短轴聚焦在观察区内，同时保留光束的长轴基本保持不变。因此，在图1、图5A和图5B中所示的光学子系统50在观察区处建立一椭圆形的光束轮廓，其具有：
1.跨合并的液体试样流和鞘流的紧密聚焦短轴；以及
2.在合并的液体试样流和鞘流方向上的平滑短轴轮廓，其为沿着LD
501的慢轴的远场光束轮廓的傅里叶共轭。
同时，如图5B中所示，非平面的光束宽度不受柱面透镜505影响。图5C示出了使用图1、图5A和图5B中所示的光学子系统50从微小粒子所散射的光测得的时间剖面。用于进行图5C中所示的测量的LD 501与生成在图3B中所显现的从微小粒子所散射光的测得的时间剖面的过程中所使用的LD相同。如图5C中所示，由条纹512所导致的沿着LD 501快轴的旁波瓣不再对流式细胞仪40的性能产生任何实质影响。
图6示出了根据本公开的适用于流式细胞仪的又一替代性的基于二极管激光器的光学子系统。图6和6A中所示的与图1、5A和5B中所示光学子系统50共有的那些元件带有相同的附图标记，但用三撇号(”')标示加以区分。除了出现没有复合显微镜物镜60的观察区之外，图6和6A中所示的光学子系统50”'与图1、5A和5B中所示的光学子系统几乎相同，因为其出现在自由流动的喷射流519内，所述喷射流519包括从喷嘴518喷出的试样流和鞘流两者。因此，对于图6和6A中所示的光学子系统50”'的配置而言，高倍率柱面透镜505从位于喷射流519内的观察区分离。
在图1、5A、5B、6和6A中所示的本公开的示例性实施例中，LD 501的短轴即慢轴垂直于所述液体试样流流动通过所述观察区的方向而取向。然而，对于本领域内技术人员而言使用替代性的光学配置将是显而易见的，LD 501的长轴即快轴可垂直于所述液体试样流流动通过所述观察区的方向而重新取向。图7示出了光学元件的这种替代性配置的一个示例。图7中所示的与图1、5A、5B、6和6A中所示光学子系统50共有的那些元件带有相同的附图标记，但用四撇号(””)标示加以区分。如图所示，LD 501””的慢轴在z方向上取向。从LD501””发射的光束则随后通过一对90度(90°)的反射镜523a和523b旋转到面内的y方向。在图7的图示中，第一椭圆形光束重新取向反射镜523a的法线以相对于x轴线成45度(45°)的角度在x-y平面内取向，并且第二椭圆形光束重新取向反射镜523b的法线以相对于z轴线成45度(45°)的角度在y-z平面内取向。
复合显微镜物镜60
图8示出了根据本公开的针对图1、5A、5B和7中所示的复合显微镜物镜60的一个实施例。如图8中所示，复合显微镜物镜60对观察区成像，所述观察区位于小型流动通道604内的棱柱形玻璃小杯603内，流动通道604优选具有矩形横截面形状，携载粒子的合并的液体试样流和鞘流通过该流动通道604。包括在复合显微镜物镜60内的平凹后表面反射镜601优选由诸如玻璃或光学品质的塑料的具有类似于玻璃小杯603的折射率的光学透明材料制成。为了最大限度地减少光损失，后表面反射镜601包括平坦的前表面，其光学耦连到棱柱形小杯603的邻接平坦表面。后表面反射镜601到小杯603的光学耦连可以采用指数匹配的凝胶、光学粘合剂或者直接的光学粘接。可替换地，后表面反射镜601也可以与小杯603整体性地形成。
复合显微镜物镜60还包括平面-非球面校正器板602，其也优选由具有诸如玻璃或光学品质的塑料的类似于玻璃小杯603的折射率的光学透明材料制成。为了减少光损失，校正器板602的平坦表面可以光学耦连到棱柱形小杯603的在其与后表面反射镜601径向相对的一面上的邻接平坦表面上。校正器板602到小杯603的光学耦连可以采用指数匹配的凝胶、光学粘合剂或直接的光学粘接。虽然根据本公开抗反射性涂层并非对复合显微镜物镜60的强制性要求，校正器板602的距离校正器板602最远的非球面表面可带有抗反射性涂层以减少光透射损耗。校正器板602的非球面表面的形状类似于经典施密特相机的形状(Schmidt,B.,Mitt.Hamburg Sternwart7(36)，1932)。如由本领域内技术人员所公知的那样，施密特相机的校正器板包括圆形中性区，其中所述校正器板不会将通过所述板的光线偏离。为了在复合显微镜物镜60中使用，在校正器板602的中性区外侧，此处该板厚度为最薄，校正器板602具有负的光倍率，同时在中性区内侧校正器板602具有正的光倍率。该非球面校正器板602的确切形状可容易地由具有本领域内普通技能的任何人员使用任何通过市售得到的光线追踪工具获得。需要指出的是在流式细胞仪40中，由图1、5A、5B和7中所示的光学子系统50所产生的光束垂直于流动通道604通过小杯603的两(2)面中不邻接后表面反射镜601或校正器板602的一(1)面而进入到小杯603内。
图9A示出了图8中所示的复合显微镜物镜60的实施例的光线追踪结果。如图9A中所示，从接近小杯603中心的流动通道604中的三(3)个在空间上分离的位置所发射的散射和荧光：
1.最初朝向后表面反射镜601传播以由后表面反射镜601进行内反射；
2.然后首先通过小杯603；
3.随后通过非球面校正器板602；以及
4.最后形成接近图像平面605的三(3)个离散图像。
需要指出的是穿过图9A中所示的复合显微镜物镜60的射线几乎为光学均匀的，以及在接近小杯603的中心所发出的光以接近法线入射而穿过校正器板602。因此，该复合显微镜物镜60在接近小杯603中心所发射的光中引入很少的色散。
此外，在天体物理学界公知的是，施密特照相机提供快焦比与具有接近衍射极限的光学性能的大视域的无以伦比的组合。传统的施密特相机中的主要缺点是图像表面位于仪器内部。对于复合显微镜物镜60而言，接近小杯603中心的光在与传统施密特相机方向相反的方向上传播，因此图像表面位于所述复合显微镜物镜60的外侧。因此，本公开可完全利用施密特相机的光学性能而不会受其限制。图9B1至图9B3示出了在流动通道604内的观察区中的三(3)个发光位置的接近图像平面605的光斑图，三个位置彼此分隔开150微米。图9B1至图9B3中所示的所有图像的直径都小于35微米。
从图8和图9A中所示的复合显微镜物镜60的流动通道604内的观察区穿过非球面校正器板602的所发射的光经受了少量色差。图10示出了根据本公开在1、5A、5B和7中所示的复合显微镜物镜60的替代性实施例。图10中所示的与图8和图9A中所示的复合显微镜物镜60共有的那些元件带有相同的附图标记，但用撇号(')标示加以区分。图10中的后表面反射镜601'和像差校正器板602'的形状略作修改以产生接近所述流动通道604'内的观察区的发光位置的准直无焦点图像。在图10中，复合显微镜物镜60'还包括插入到校正器板602'与图像平面605'之间的色差补偿双合透镜609。除了将从校正器板602'所发射的光聚焦到图像平面605'上之外，该双合透镜609还用于进一步减小由非球面校正器板602'所引入的残余色差。
校正器板602的平坦表面不是必须要光学耦连到小杯603。图11示出了本公开的复合显微镜物镜60的替代性实施例。图11中所示的与图8和图9A中所示复合显微镜物镜60共有的那些元件带有相同的附图标记，但用双撇号(”)标示加以区分。图11示出了从小杯603”光学解耦的像差校正器板602”。虽然对于复合显微镜物镜60”的操作而言不是必需的，但是为了提高光传输效率，校正器板602”的两个表面与小杯603”的外露平坦面可带有抗反射性涂层。应当理解的是图11中所示的校正器板602”通过图11中未示出的机械支撑件而保持在相对于后表面反射镜601和小杯603的固定关系下。类似于在图9A和10中分别所示的复合显微镜物镜60和60'，具有分离的校正器板602”的复合显微镜物镜60”可配置成提供有限焦距图像，或者无焦点系统，所述系统反过来通过增加色差补偿双合透镜609而聚焦到有限距离图像平面。
图12示出复合显微镜物镜60的又一替代性实施例。图12中所示的与图8、9A和11中所示的复合显微镜物镜60共有的那些元件带有相同的附图标记，但用三撇号(”')标示加以区分。图12中所示的复合显微镜物镜60”'适用于收集由喷嘴518所喷射的喷射流519携载的细胞或其它微观粒子所发射的散射和荧光。复合显微镜物镜60”'包括凹面球面形状的前表面反射镜610和像差校正板612。前表面反射镜610可由玻璃或在其凹面表面611上具有高度反射性涂层的其它类型的硬质材料制成，或由具有抛光凹面表面611的金属制成。类似于校正器板602，平面-非球面校正器板612由诸如玻璃或光学品质的塑料的薄片透明材料制成。非球面表面可在校正器板612的任一侧上形成。优选地，虽然根据本公开这种涂层并非校正器板612的强制性要求，所述校正器板612的两个表面都涂覆有抗反射性涂层以减少光传输损耗。应当理解的是前表面反射镜610和校正器板612通过图12中未示出的机械支撑件而保持在相对于彼此的固定关系下。从喷射流519内的观察区中的细胞或其它类型的微观粒子所发射的散射和荧光由前表面反射镜610的凹面表面611反射。由于从凹面表面611的反射所导致的像差在光穿过校正器板612之后由校正器板612校正。对于本领域内技术人员而言应当理解的是复合显微镜物镜60”'可配置成提供类似于图9A中所示的图像的有限聚焦图像或者准直无焦点图像，所述准直无焦点图像通过类似于图10中所示的双合透镜609的色差校正双合透镜而聚焦在距离复合显微镜物镜60”'的有限距离处。
图13示出了复合显微镜物镜60的变型，以便对固定于透明基材诸如载玻片的表面上的试样进行成像。图13中所示的与图8、9A和图11中所示复合显微镜物镜60共有的那些元件带有相同的附图标记，但用四撇号(””)标示加以区分。图13中所示的复合显微镜物镜60””包括两(2)个光学元件，一个是由诸如玻璃或光学品质的塑料的透明材料制成的平凹后表面反射镜617，以及像差校正器板618。如图13中所示，待成像的试样固定到透明的通常是玻璃载玻片616的前表面615。载玻片616优选使用指数匹配的流体薄层而光学耦连到后表面反射镜617的平坦面。由试样所发射的散射和荧光：
1.最初传播通过载玻片616和后表面反射镜617；
2.由后表面反射镜617内反射返回通过载玻片616；
3.然后通过校正器板618；并且
4.最终在位于超出校正器板618处的图像平面处形成图像。
流体子系统70
图15示出了根据本公开的流体子系统70，其包括鞘液体储槽702和从鞘液体储槽702抽吸鞘液体的液体泵701。液体泵701可以是隔膜泵，或蠕动泵，或活塞泵或任何类型的连续流体泵。液体泵701的出口连接到从所述液体泵701接收鞘液体的T型联接器703的入口。T型联接器703具有两(2)个出口，其中的第一出口连接到旁通管道710，用于将由T型联接器703从液体泵701所接收的鞘液体的一小部分返回到鞘液体储槽702。将由T型联接器703从液体泵701所接收的鞘液体的一小部分向回返回到鞘液体储槽702出于以下两(2)个原因是有利的。
1.如图1中所示，旁路管道710敞开在周围空气中，其有效地阻尼脉动，由此显著减少液体泵701操作中固有的脉动。
2.将由T型联接器703从液体泵701所接收的鞘液体的一小部分返回到鞘液体储槽702也有效地降低了液体泵701的流量，从而允许在流式细胞仪40中使用相对高流速的、成本低的泵。
将旁通管道710的流动阻力标示为“r”并且将从T型联接器703到小杯603的流动通道604的路径的流动阻力标示为“R”。到达鞘泵的输出阻力则为：
由于R>>r，因此液体泵701的表现由旁通管道710的阻力来控制，旁通管道710的流体动力学性质是温度不敏感的。因此，图15中所示的流体子系统70的配置还提供用于实现到流动通道604的温度不敏感鞘液流的简单机制。
如图15中所示，T型联接器703的第二出口连接到流动通道604，流动通道604优选首先经由小型储槽器皿704，然后经由过滤器滤芯705而延伸通过小杯603。如图16中所示，大约4英尺长的一段管路704'可取代小型储槽器皿704。在流体子系统70的初始化过程中，一些空气会在邻近其入口处截留在过滤器滤芯705内，如图15中所示，该入口位于过滤器滤芯705出口的上方。截留在过滤器滤芯705内的空气用作额外的流体电容器，其将排放到流动通道604内的鞘液体中的脉动有效地降低到可忽略不计的水平。由于在流动通道604处的较大流体阻力，截留在过滤器滤芯705内的空气被压缩。当液体泵701被关闭时，截留在过滤器滤芯705内的空气被朝向T型联接器703向回推动，类似于放电电容器。若没有小型储槽器皿704，从过滤器滤芯705排出的一些空气由于它的低流体阻力到达旁路导管710，并且一旦液体泵701再次启动则将所述空气推动到流体子系统70之外。若没有额外的空气供应，则这样的情况将重复，直到大部分空气被从流体子系统70吹扫出去，使得过滤器滤芯705丧失其作为脉动阻尼器的有效性为止。因此小型储槽器皿704或一段管路704'的目的是提供用于将过滤器滤芯705从旁路导管710隔离的储槽，确保尽管液体泵701存在重复开关操作，但截留在过滤器滤芯705内的空气保持于流体子系统70内。
接近过滤器滤芯705的入口的截留空气的脉动阻尼效应在图16A和
图16B中所示的直方图中清晰可见。图16A示出了当一袋空气被截留在接近过滤器滤芯705的入口时在流动通道604处测得的粒子飞行时间。图16B示出了当截留的空气从流体子系统70吹扫出去时在流动通道604处测得的粒子飞行时间。在图16A和图16B的直方图中所示的结果是使用间隔大约200微米的在流动通道604的中心附近聚焦的两(2)个刀刃形激光束得到的。图16A和图16B中的水平轴是粒子从一个激光束到另一个激光束所花费的飞行时间，其通过记录以距激发光束90度(90°)的方式从所述粒子散射的光的峰值到达时间而测得。在这两种情况下，对于跨越两个激光束的粒子的平均飞行时间是相同的。如图16A中所示，当过滤器滤芯705保留一些空气时，所有粒子跨越两个激光束花费大约相同量的时间。如果过滤器滤芯705不保留空气，如图16B中所示，飞行时间的分布不仅变宽，而且成为双峰的。换言之，某些粒子花费较少的时间来跨越两个激光束，而其它粒子花费长于时间平均量的时间，这种现象可容易地归因于在流动通道604处的鞘液体的速度脉动。
在到目前为止所论述的本公开的实施例中，沿着旁路导管710以及T型联接器703和流动通道604之间的流体阻力是不可调的。如对本领域内普通技术人员显而易见的那样，诸如固定式限制器或可调节阀711，711'和712，712'的限流器可有利地插入到旁路导管710内以及T型联接器703和流动通道604之间，以允许调节通过流动通道604的流速。可替代地，鞘液体流动通过流动通道604的速度也可以使用液体泵701来调节，所述液体泵701由可变速无刷直流马达驱动。
蠕动泵80
图17示出了根据本公开的蠕动泵80的一个实施例。该泵包括：具有弧形弯曲轨道808的壳体809；附接到可在壳体809内旋转的转子816的三个辊810、811和812；以及夹置于壳体809的可压缩管807与辊810、811和812之间的可压缩管807。如图18A至图18D中示意性示出的那样，蠕动泵80的辊810、811和812环绕转子816的周边与彼此间隔开、分离开或隔开基本上相等的角距离。为简明起见，假定在下面的论述中，该转子816逆时针转动，但是应当理解的是论述也同样适用于转子顺时针旋转的蠕动泵。壳体809的可压缩管807可被划分成若干区段：
1.点801和点806之间的开放区段，此处可压缩管807没有压缩；
2.点801和点802之间的泵入口区段，此处当辊在该区段滚动时可压缩管807被逐步压缩直到完全闭合；
3.点802和点803之间以及点804和点805之间的两个泵送区段，此处可压缩管807被辊完全闭合；
4.点803和点804之间的凹入区段，其中当辊滚动通过从点803到点813的凹入区段的扩展部分时，可压缩管807从完全闭合逐渐扩展到完全开放；
5.然后当辊滚动通过从点813到点804的凹入区段的压缩部分时，可压缩管807被逐渐压缩到完全闭合；并且
6.点805和点806之间的出口区段，此处当辊滚动通过所述区段时可压缩管807从完全闭合逐渐扩展到完全开放。
换言之，当辊从入口点801到出口点806逆时针方向滚动时，可压缩管807的内部间隙：
1.从点801处的完全开放逐渐减小到在点802处的完全闭合，并保持闭合直到点803；
2.然后逐渐扩展回到点813处的完全开放；
3.然后逐渐缩小到804点处的完全闭合，且维持闭合直至辊达到点805；并且
4.最后逐渐扩展回到点806处的完全开放。
可压缩管内部的间隙大小在图18A至图18D中示意性示出为虚线圆与实线可压缩管807之间的间距。如图18A至图18D中所示，在蠕动泵80的该实施例中，点801和803、点802和813、点813和805之间以及点804和866之间的角距离、间隔或的间距与相邻辊之间的角度是相同的。因此，当辊810滚动通过从点804到点805的泵送区段时，如图18A至图18B中所示，其与可压缩管807之间的相互作用完全决定了蠕动泵80的流体流速。一旦辊810到达点805和806之间的出口区段，如图18C中所示，辊810下方的可压缩管807开始逐渐扩展并且间隙开始增长。同时，辊811到达凹入区段的压缩部分并开始逐渐压缩可压缩管807。在蠕动泵80中，沿着可压缩管807的在点813和点804之间的凹入区段的压缩部分的形状是这样的，以至于由在点813和点804之间的凹入区段的压缩部分中的辊811下方的可压缩管807的压缩推送出的液体体积基本上填满了由在点5和点6之间的出口区段中辊810下方的可压缩管807扩展所产生的体积。在这期间，可压缩管807在两个辊810和811的下方为部分开放并且在辊12下方为完全闭合。因此，泵送动作主要由辊12传递。具体地，由于通过设计，在点13和点6之间的该可压缩管807的区段中的液体总体积在该期间保持基本恒定，因此在图18C中所示的状态下，所述蠕动泵80的流速保持与图18A和图18B中所示状态下的流速基本上相同。一旦辊810通过点806，则辊811到达点804和点805之间的泵送区段。注意在辊810、811和812之间没有物理差异，因此蠕动泵80的流速在整个过程中保持基本恒定。
如果沿着跟随辊运动的圆形坐标观察，则可以更清楚地理解本公开的无脉动蠕动泵的机制。参照图19，将V表示为从出口到闭合可压缩管819的最近辊820的可压缩管819内部的流体体积，即由图19中所示的阴影区域818所表示的流体量。显然，V取决于辊20的角位置θ以及由所有其它下游的辊所施加的管压缩量δ。
V＝V(θ，δ1，δ2，…) (1)
因此，蠕动泵的流速F与Vc的时间导数按下式相关：
此处R是转子的旋转速度以及下标用于识别多个下游辊。方程式(2)右侧第一项表示来自将管闭合的辊的贡献。偏导数独立于θ。求和项表示来自部分压缩所述可压缩管819的所有其它下游辊的贡献。现在ΔS假设是可压缩管819通过辊压缩所导致的横截面积变化，且L是其横截面形状受管压缩影响的管长度。则对于本领域内的技术人员而言显然已知L与管压缩δ成正比，而ΔS与其平方δ2成正比。因此，由于通过辊的管压缩所导致的流体损耗体积ΔV遵照方程式(3)：
ΔV∝L·ΔS∝δ3＝(D-G)3 (3)
其中D是可压缩管的内径并且G为图19、19A和19B中所示的最小间隙，其在图18A至图18D中也由虚线圆与壳体809的实线可压缩管807之间的间距表示。现在参照图20A和20B，在圆形坐标系中，图20A对应于图18A和图18B中所示的泵的状态。在该期间，在辊810'的下游没有辊，因此方程式(2)中的求和项消失。图20B对应图18C中所示的泵的状态。可压缩管807由辊12'闭合以及由辊810'和811'部分地压缩。但是，由两个辊810'和811'引入的体积变化基本上彼此抵消。因此，方程式(2)中的求和项也消失。因此，蠕动泵80的流速基本保持恒定，而与辊的位置无关。
满足上述要求的可压缩管807的形状可容易地从方程式(3)推导出。参照图18C，如果在点813和点804之间的凹入区段的压缩部分G13,4中以及在点805和点806之间的出口区段G5,6中的弧形可压缩管807的间隙遵照方程式：
(D-G13，4)3+(D-G5，6)3＝D3 (4)
则两区段中的总流体体积保持基本上恒定，如图21中所示。在蠕动泵80中，泵壳体809的形状相对于其中心线是对称的，使得泵壳体809的入口半部是壳体809的出口半部的镜像，如图中17所示。因此蠕动泵80可以以很少脉动的逆时针方向和顺时针方向旋转的方式进行操作，但应当理解的是对称性并不是实现根据本公开的无脉动蠕动泵所必需的。例如，只要在点13和点3之间的区段G13,3中以及在点2和点1之间的区段G2,1中的弧形可压缩管807的间隙遵照方程式(5)：
(D-G13，3)3+(D-G2，1)3＝D3 (5)
当转子816顺时针方向旋转时，根据本公开的蠕动泵将表现出很小的脉动。
图22示出了根据本公开的蠕动泵的替代性实施例。图22中所示的与图17中所示的蠕动泵80共有的那些元件带有相同的附图标记，但用撇号(')标示加以区分。蠕动泵80'包括具有两(2)个凹部820和821的可压缩管807'以及四(4)个辊822，823，824和825。在图22中所示的实施例中，由于靠近泵出口的管扩展所导致的流体体积损失由靠近两个凹部820和821的辊822和823对可压缩管的压缩的组合效应来补偿。
图23示出了根据本公开的蠕动泵的又一替代性实施例。图23中所示的与图17中所示的蠕动泵80以及图22中所示的蠕动泵80'共有的那些元件带有相同的附图标记，但用双撇号(”)标示加以区分。蠕动泵80”包括六(6)个辊和具有两个凹部818”和819”的弧形可压缩管807”。在蠕动泵80”中，由于靠近泵出口的管扩展所导致的流体体积损失由紧接在靠近泵出口的一个凹部818”或819”上游的辊的作用来进行补偿。
由于靠近蠕动泵出口的被压缩的可压缩管的扩展所导致的脉动还可通过具有可编程转子速度的蠕动泵来克服。图24A至图24C示出了根据本公开的针对三辊蠕动泵的用于将蠕动泵脉动最小化的机制的替代性实施例的相关方面。如图24B中所示，在泵入口和泵出口区段之间的轨道828大致是圆形的。因此，如由虚线圆829和轨道828的弯曲实线之间的间隔所示，可压缩管通过泵的三(32)个辊826，827和829的各个辊在泵入口和泵出口之间完全闭合。图24A示意性地在圆形坐标系中示出了图24B中所示的蠕动泵的辊位置。因为在将管闭合的辊的下游仅存在一个辊，因此方程式(2)显著简化：
在此管压缩δ(θ)明确地表示为辊位置θ的函数。括号内的各项表示流体体积相对于辊位置的变化率。第一项为来自将管闭合的辊的贡献，亦即图24A中的辊827，并且第二项为来自出口区段中的辊的贡献。注意根据定义，当在出口区段中没有辊时，所述体积变化率是负的，并且括号内的第二项消失。图24C中的虚线曲线为相对于辊位置的负体积变化率的代表性绘图。当辊滚离接近泵出口的所述管时，由于管扩展导致沿着曲线的隆起，其为具有恒定转子速度的常规蠕动泵中脉动的起因。然而，对于图24A至图24C中所示的蠕动泵而言，在图24C中以虚线曲线示出的转子速度R被设定为与转子位置同步变化，且与流体体积的变化率成反比。因此，作为转子速度和流体体积变化率的乘积的泵流速保持恒定，如在图24C顶部处的实线所示。注意方程式(6)的括号内的各项唯一地由泵的机械结构决定。因此转子速度轮廓可容易地根据方程式(3)由轨道828的形状产生。对于本领域内技术人员而言，有很多方式来实现可编程的转子，例如使用步进马达或直流伺服马达。
WDM装置90
图25示出了本公开的使用锯齿形配置的示例性六端口波分多路复用器(“WDM”)的光线追踪。如图25中所示，经过针孔或从诸如图1中光纤852的多模光纤的小平面所发射的荧光在位置901即WDM 90的光输入端形成扩展对象或光源。对象大小由针孔直径或多模光纤纤芯的直径限定。注意针孔的实际大小或多模光纤的纤芯直径以毫米进行测量，而相比之下，单模光纤的直径以微米测量。因此，荧光光源的光学扩展量定义为光束大小与其发散角的乘积，比其在光学传输上的对应光学扩展量大数百倍。根据光学扩展量守恒定理(Julio Chaves，Introduction to Nonimaging Optics,CRC Press，2008[ISBN978-1420054293])，来自这种扩展源的光，类似于来自闪光灯的光，只能在非常有限的距离内保持准直，特别是当准直部分的直径必须为小直径时。
如图25中所示，在该情况下为消色差双合透镜902的准直光学元件捕获来自源901的光，并在终聚焦透镜905附近投射对象的放大图像。905附近的图像大小保持与准直光学元件902的有效大小大致相同。因此，在透镜902和透镜905之间传播的光束被有效地准直。如图25所示，只要保持小的放大倍率，例如，小于约10，则利用简单的单透镜905，准直光束可容易地聚焦成一个光斑，该光斑小于由WDM 90在位置901处所接收的光束的光斑。将光束聚焦到如此小尺寸的能力允许将小面积的半导体检测器置于聚焦透镜905的焦点906处以便进行有效的光检测。
以倾斜角取向的二色性滤光器903插入到在准直光学元件902和透镜905之间的近似中间位置的光学路径内。二色性滤光器903使得所关注的有色带通过并反射光束中的剩余有色光以便用于WDM 90内的进一步处理。可选的带通滤波器904可插入到二色性滤光器903之后以便进一步改善WDM90的分色能力。
从二色性滤光器903反射的光入射到优选为凹面镜的第二光学元件907上。凹面镜907具有的曲率半径约等于准直光学元件902和接近聚焦透镜905的图像之间的距离。因此，凹面镜907产生接近第二聚焦透镜908的准直透镜902的第二图像。凹面镜907和在透镜908处的第二图像之间的光束具有的直径与准直透镜902和接近聚焦透镜905的第一图像之间的光束直径大致相同。因此中继成像凹面镜907使得准直光束路径有效地加倍，而不扩大光束直径。再次，扩展但准直的光束可容易地聚焦成光斑，所述光斑小于901处的光源的光斑。第二二色性滤光器909随后被插入到中继成像凹面镜790和接近聚焦透镜908的第二图像之间的大约中间位置。第二二色性滤光器909使得由WDM 90在位置901处所接收的光束中的另一有色带通过，而将入射光束的其余部分进行反射以便进一步处理。
如图25中所示，附加的中继准直光学元件910，911，912，913和二色性滤光器914，915，916，917可以相同的方式级联以产生接近聚焦透镜918，919，920和921的多个图像，这些图像的每一个对应于由WDM 90在位置1处所接收光束的特定有色带。如图25中所示，由于本公开的1：1成像中继结构，由聚焦透镜906，908，918，919，920和921所产生的光斑都小于光束光源的光斑，因此可容易地由小面积APD捕获。
尽管图25示出了用于来自扩展光源的光束的六端口波分多路复用器，但是对于本领域内技术人员而言显而易见的是具有不同数目的端口的WDM可根据本公开容易地构建。对于本领域内技术人员而言同样显而易见的是尽管WDM90优选使用消色差双合透镜作为第一准直光学元件，但是也可以使用单透镜，其原因在于在聚焦透镜906，908，918，919，920和921前面产生的图像几乎全部接近单色。取代使用凹面镜用于中继从二色性滤光器反射的光束，也可以使用折射光学系统作为中继元件以延伸准直光束的路径。然而在WDM 90中使用的锯齿形结构的明显优势为使得使用阵列检测器成为可能，这将导致适用于便携式仪器的更紧凑的WDM。
图26示出了现有技术准直装置的光线追踪。图26中所示的技术被广泛用于传统的多色荧光仪器中，例如，在序号为6,683,314的美国专利中的多色荧光仪器。如图26中所示，光束快速地发散超过由准直光学元件923所形成的图像924。由此，用于构建多色装置的唯一选择是将二色性滤光器插入到准直元件923和其图像924之间。
由于光学扩展量守恒的限制，准直光束的直径必须显著扩展以将多个二色性滤光器容纳在该区段内。经扩展的光束对于将准直光束重新聚焦成适于小面积半导体检测器的小光斑构成重大挑战。为了克服这些困难，一些仪器制造商选择使用Mt专门用于荧光检测，诸如用于由Becton-Dickinson,Becman Coulter和Partec制造的主流流式细胞仪以及由GEAmersham制造的MegaBACE系列的DNA排序器。其它仪器诸如Luminex多路复用珠粒分析仪具有经选择的已知明亮荧光的特定有色带，并采用大面积APD来检测所选择的有色带中的光。
图27示出了使用锯齿形配置和分支配置的组合的六端口WDM 90的替代性实施例的透视图。该设计是图25中所示的锯齿形配置的变型。在图27中所示的替代性实施例中，图25的带通滤波器904由二色性滤光器904'取代。过滤器904'定位成允许一种颜色通过，而以90度(90°)反射其它颜色。通过二色性滤光器904'以及从904'反射的光束的光学路径长度基本上相同，使得一个臂由透镜905聚焦以及另一个臂由透镜905'聚焦成小光斑，所述光斑与放置在焦点位置906和906'的小面积半导体检测器兼容。如图25中所示，由二色性滤光器903所反射的光的剩余颜色由凹面镜907中继成像，并且包括光学元件903，904'，905和905'的配置再级联两(2)次以形成六端口的WDM。
图28示出了8端口WDM 90的替代性实施例的透视图。通过用凹面形二色性滤光器907'和910'替代图27中的凹面中继成像反射镜907和910，图28中所示的WDM与图25和图27所示的WDM相比多提供两个有色带。
多年来已经开发了适于在流式细胞仪中使用的无数荧光探头。最近，多种荧光蛋白质也已变成在生物医学研究中的重要工具。为了适应不同类型的荧光探头，已开发多项技术以便使得用户能够选择适用于其特定需要的二色性滤光器。对于可更换的二色性滤光器的一个重要挑战是避免经涂覆的滤光器表面与任何硬的流式细胞仪参考框架的直接接触。经涂覆的滤光器表面与任何硬的参考框架之间的反复直接接触可能会损坏可更换的二色性滤光器。目前，解决这一问题的大部分传统解决方案采用精密加工的机械垫片以便将可更换的二色性滤光器固定。这种解决方案的一个示例出现在序号为6,683,314的美国专利中。然而，如果检测器的有源面积小于1.0平方毫米，则这样的解决方案就变得不可靠。
图29A和图29B示出了制造适用于小面积检测器的图29C中所示的可更换的二色性滤光器组合件934。可更换的二色性滤光器组合件934的组装始于图29A，其示出了构建用于其制备的参考模板。所述参考模板是由两(2)个光学平行的玻璃板925和926构成的梯形空间。以光学接触将两(2)个玻璃板925和926粘接到一起确保玻璃板925的一个表面929成为光学平行于玻璃板926的表面930。然后可更换的二色性滤光器927的前表面932压靠模板的表面929。松散地嵌合二色性滤光器927的滤光器保持器928包括参考表面931和滤光器插槽933。在可更换的二色性滤光器的组装过程中，滤光器插槽933部分地填充有环氧树脂粘合剂，并且滤光器保持器928的参考表面931压靠在模板的表面930，而滤光器保持器928朝向二色性滤光器927滑动。当环氧树脂粘合剂凝固时，二色性滤光器927的一部分保持位于滤光器插槽933内，同时抵靠二色性滤光器927和过滤器保持器928而施加压力。对于本领域内技术人员而言应当明了环氧树脂粘合剂可以是UV固化或热固化的，或者通过将A/B混合物的成分掺混到一起来制成。图29C示出了如图29A和图29B中示出的以及如上所述制备的E934～。在图29A和图29B中所示的以及上述的组装过程确保可更换的二色性滤光器组合件934的前表面932将会光学平行于参考表面931，并且在由玻璃板925的厚度精确确定的间隔下相对于后者即参考表面931而凹进。
图30A和图30B示出了本公开的实施例，其中前述的可更换的二色性滤光器组合件934在WDM 90中使用以便光学地处理来自扩展光源的光束。WDM 90的一个显著特点是具有光学平坦表面的玻璃参考区块935。如对于本领域内技术人员而言将显而易见的那样，玻璃参考区块935可由其它材料制成。如图30B中所示，当安装二色性滤光器927时，可更换的二色性滤光器组合件934的参考表面931抵靠玻璃参考区块935的平坦表面滑动并通过装载弹簧的螺钉936保持与其接触。因此，该可更换的二色性滤光器组合件934的经涂覆的前表面932保持光学平行于光学平板并准确地定位。同时，前表面932相对于所述参考表面931的凹进保护其在更换滤光器期间不与任何对象物理接触。
对于本领域内技术人员而言显而易见的是对所述可更换的二色性滤光器组合件934的实施例进行的许多修改和变化是可能的。例如，本公开的替代性实施例是使用第一和第二圆形光学平板组装的底座。当组装可更换的二色性滤光器组合件934时，滤光器保持器的参考表面抵靠第一光学平板的表面放置并且二色性滤光器的经涂覆表面的表面抵靠第二光学平板的平坦表面放置。然后环氧树脂粘合剂保持二色性滤光器的经涂覆表面光学平行于滤光器保持器的参考表面，但凹进由第二光学平板的厚度精确地确定的距离。
工业实用性
尽管已相当详细地描述了用于流式细胞术的应用的基于LD的光学系统的本公开的实施例，也已针对基于液流的流式细胞仪描述了同等有利的实施例，但是对于本领域内普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离如在权利要求中所提出的本公开的原理和理念的情况下根据上述教导可对所述实施例做出许多修改和变化。
虽然已相当详细地描述了用于将来自扩展光源的光束分离成多个有色带的波分多路复用装置的本公开实施例，也已描述了其它几个同等有利的实施例，但是对于本领域内普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离如在权利要求中所提出的本公开的原理和理念的情况下根据上述教导可对所述实施例做出许多修改和变化。
尽管以当前优选的实施例对本发明进行了描述，但是应当理解的是，这种公开纯粹是示例性的而不应被解释为限制性的。因此，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，本领域内技术人员在阅读前述公开之后将毫无疑问地建议对本公开进行各种变更、修改、和/或替代应用。因此，下列权利要求意图被解释为包括在本公开真实精神和范围内的所有变更、修改、或替代应用。
可以根据以下条款描述本公开的实施例的示例：
条款1.一种流式细胞仪(40)，包括：
a)基于激光二级管(“LD”)的光学子系统(50)，其用于将光束引导到所述流式细胞仪(40)的观察区内，携载粒子的试样液体流动通过所述观察区，所述试样液体通过也流动通过所述观察区的液体鞘流而流体动力学地聚焦在所述观察区内，所述光学子系统(50)包括：
i.LD，其用于从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴和短轴；
ii.准直透镜，其用于将从所述LD发射的所述发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述短轴平行于粒子通过所述观察区的方向而取向；
iii.光束压缩光学元件，其用于减少在所述观察区处的所述椭圆形光束的大小，由此垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向的所述椭圆形光束的所述长轴的宽度小于所述液体鞘流的宽度；以及
v.柱面聚焦元件，其位于邻近所述观察区，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向，由此：
1)所述光束的所述短轴聚焦在所述观察区处；并且
2)在所述观察区处的所述椭圆形光束的所述长轴的尺寸基本上保持不变；
b)复合显微镜物镜(60)，其用于对由存在于所述观察区内的粒子散射的光和发出的荧光进行成像，所述复合显微镜物镜(60)包括：
i.凹面镜，散射和发出的荧光入射到其上；
ii.由光学透明材料制成的像差校正器板，其中所述像差校正器板为非球面透镜，其具有：
1)所述像差校正器板的第一区域，其在所述像差校正器板的中性区域之外，所述像差校正器板于该处：
A.是最薄的；以及
B.具有负的光学倍率；以及
2)在所述中性区域内的所述像差校正器板的第二区域，其具有正的光学倍率；
从所述复合显微镜物镜(60)反射的光通过所述像差校正器板；
所述流式细胞仪(40)的所述观察区位于所述凹面镜和所述像差校正器板之间；
c)流体子系统(70)，其用于将所述液体鞘流供应至所述观察区，所述液体鞘流没有脉动，所述流体子系统(70)包括：
i.液体泵，其用于供应从储槽抽取的液体；
ii.T型联接器，其具有至少一(1)个入口和两(2)个出口，
1)所述T型联接器的入口从所述液体泵接收液体；
2)由入口所接收的液体的第一小部分经由出口的第一个并且经由旁路导管流回到所述储槽；并且
3)由入口所接收的液体的第二小部分经由出口的第二个并且经由粒子过滤器而流到所述流式细胞仪(40)的所述观察区；
d)蠕动泵80，其用于供应携载所述粒子的所述试样液体，所述试样液体通过所述液体鞘流流体动力学地聚焦在所述观察区内，所述蠕动泵80包括：
i.泵壳体，其具有形成于其中的弧形弯曲轨道，所述轨道在泵入口和泵出口之间延伸；
ii.附接到转子的多个辊，所述辊在每对紧邻的辊之间具有大致相等的角间距，所述转子可与附接到其上的辊一起在所述泵壳体内部旋转；以及
ii可压缩管，其夹置于所述辊和所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道之间，所述弧形弯曲轨道包括：
1)出口区段，其中当辊滚动通过所述出口区段时，邻近于所述辊的所述可压缩管从所述出口区段起点处的完全闭合逐渐扩展到在所述泵出口处的完全开放，在所述泵出口处所述辊断开与所述可压缩管的接触；以及
2)在所述泵入口和所述泵出口之间沿着所述弧形弯曲轨道的至少一个泵送区段，其中所述可压缩管通过至少一个所述辊被压缩至完全闭合；以及
e)波分多路复用器90(“WDM(90)”)，用于将光束分离成多个有色带，所述光束最初从所述观察区发射并由所述复合显微镜物镜(60)成像到用于传输到WDM(90)的光纤内，所述WDM(90)包括：
i.准直光学元件，其放大以产生与所述准直光学元件的有效尺寸基本上相同大小的图像；
ii.位于所述准直光学元件和所述图像之间的至少一个二色性滤光器，其中所述二色性滤光器将准直光束分离成不同颜色的两(2)个分支；
iii.位于所述分支之一内的聚焦光学元件，其中在所述分支内的光束通过所述聚焦光学元件聚焦到具有小于1.0毫米的直径的光斑；以及
iv.图像中继光学元件，其位于由在另一个分支内的所述准直光学元件所产生的图像附近，其中所述图像中继光学元件基本上以放大倍率为一来产生所述准直光学元件的图像。
条款2.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述小杯具有矩形形状，并且其中所述流式细胞仪(40)的所述观察区位于处于所述小杯内的具有矩形横截面的通道内。
条款3.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述小杯具有管形横截面，并且其中所述流式细胞仪(40)的所述观察区位于处于所述小杯内的具有圆形横截面的通道内。
条款4.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述试样液体与液体鞘流形成喷射流，所述流式细胞仪(40)的所述观察区位于所述喷射流内。
条款5.根据条款2所述的流式细胞仪(40)，其中所述柱面聚焦元件与所述矩形形状的小杯的入口面光接触。
条款6.根据条款2所述的流式细胞仪(40)，其中所述柱面聚焦元件与所述矩形形状的小杯分离。
条款7.根据条款3所述的流式细胞仪(40)，其中所述柱面聚焦元件与所述管形小杯分离。
条款8.根据条款4所述的流式细胞仪(40)，其中所述柱面聚焦元件与所述喷射流分离。
条款9.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，进一步包括偏振调节元件，所述准直的椭圆形光束通过所述偏振调节元件。
条款10.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述观察区的光学图像形成在所述复合显微镜物镜(60)的外侧。
条款11.根据条款10所述的流式细胞仪(40)，其中所述观察区位于包括在由光学透明材料制成的矩形形状的小杯内的流动通道内。
条款12.根据条款11所述的流式细胞仪(40)，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款13.根据条款12所述的流式细胞仪(40)，其中所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述小杯的平坦表面。
条款14.根据条款13所述的流式细胞仪(40)，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款15.根据条款13所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款16.根据条款13所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款17.根据条款13所述的流式细胞仪(40)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款18.根据条款13所述的流式细胞仪(40)，其中所述平凹后表面反射镜与所述小杯装置整体性地形成。
条款19.根据条款11所述的流式细胞仪(40)，其中所述像差校正器板是平面-非球面透镜。
条款20.根据条款19所述的流式细胞仪(40)，其中所述像差校正器板的平面表面光学耦连到所述平凹后表面反射镜相对侧的所述小杯的平坦表面。
条款21.根据条款20所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款22.根据条款20所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款23.根据条款20所述的流式细胞仪(40)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款24.根据条款20所述的流式细胞仪(40)，其中所述平面-非球面透镜与所述小杯整体性地形成。
条款25.根据条款19所述的流式细胞仪(40)，其中所述像差校正器板与所述小杯分离。
条款26.根据条款10所述的流式细胞仪(40)，其中所述观察区在喷射流内部。
条款27.根据条款25所述的流式细胞仪(40)，其中所述凹面镜是前表面反射镜。
条款28.根据条款10所述的流式细胞仪(40)，其中所述观察区位于平坦的、透明的基材的表面上。
条款29.根据条款28所述的流式细胞仪(40)，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款30.根据条款29所述的流式细胞仪(40)，其中所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述平坦的、透明的基材。
条款31.根据条款30所述的流式细胞仪(40)，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款32.根据条款30所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款33.根据条款30所述的流式细胞仪(40)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款34.根据条款30所述的流式细胞仪(40)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款35.根据条款29所述的流式细胞仪(40)，其中所述平凹后表面反射镜与所述平坦的、透明的基材整体性地形成。
条款36.根据条款28所述的流式细胞仪(40)，其中所述像差校正器板与所述平坦的、透明的基材分离。
条款37.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述粒子过滤器具有用于接收来自T型联接器的液体的入口，所述粒子过滤器的所述入口设置为使得空气在其入口处被捕获于所述粒子过滤器内。
条款38.根据条款37所述的流式细胞仪(40)，其中当所述液体泵关闭时，空气不能进入到所述旁路导管内。
条款39.根据条款38所述的流式细胞仪(40)，进一步包括小型器皿，所述小型器皿设置于所述T型连接器出口中的第二个出口和所述粒子过滤器之间，用于当所述液体泵关闭时储存从所述粒子过滤器排出的空气。
条款40.根据条款38所述的流式细胞仪(40)，进一步包括一定长度的管路，其设置于所述T型连接器的出口中的第二个出口和所述粒子过滤器之间，用于当所述液体泵关闭时储存从所述粒子过滤器排出的空气。
条款41.根据条款38所述的流式细胞仪(40)，进一步包括可调节阀，其位于在所述T型连接器的出口中的第一个出口和所述储槽之间的所述旁路导管内，以便限制流经其间的液体流。
条款42.根据条款38所述的流式细胞仪(40)，进一步包括可调节阀，其位于在所述T型连接器的出口中的第二个出口和所述观察区之间，以便限制流经其间的液体流。
条款43.根据条款38所述的流式细胞仪(40)，其中所述液体泵的通量是可调节的。
条款44.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述泵壳体的弧形弯曲轨道包括至少两(2)个泵送区段，所述弧形弯曲轨道进一步包括位于沿着弧形弯曲轨道的所述泵送区段之间的至少一个凹入区段，并且其中在所述凹入区段处的所述可压缩管减压至完全扩展，然后当所述辊中的一(1)个滚动通过所述凹入区段时所述可压缩管被压缩到完全闭合。
条款45.根据条款44所述的流式细胞仪(40)，包括在泵出口的上游沿着所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段，邻近于所述泵出口的所述凹入区段的压缩部分和所述弧形弯曲轨道的所述出口区段之间的角间距与每对紧邻的辊之间的角间距大致相同。
条款46.根据条款44所述的流式细胞仪(40)，其中邻近于所述泵出口的所述凹入区段的所述压缩部分具有的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在从所述凹入区段延伸到泵出口的所述可压缩管的区段内部的总流体体积基本不变。
条款47.根据条款44所述的流式细胞仪(40)，具有分别分散在紧邻成对的多个泵送区段之间的多个凹入区段。
条款48.根据条款46所述的流式细胞仪(40)，其中下述两者：
a)相邻成对的凹入区段之间的角间距；以及
b)所述弧形弯曲轨道的所述出口区段和与所述出口区段相邻的凹入区段之间的角间距
与每对紧邻的辊之间的角间距基本上相同。
条款49.根据条款47所述的流式细胞仪(40)，其中所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在所述多个凹入区段和所述出口区段处的所述可压缩管的区段中的流体体积基本不变。
条款50.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中所述转子的速度是可编程地控制的，以便以与所述可压缩管内的由于接近所述弧形弯曲轨道的出口区段的其压缩改变所导致的流体体积变化率基本上成反比的方式来改变。
条款51.根据条款1所述的流式细胞仪(40)，其中至少一个附加的二色性滤光器位于所述图像中继光学元件与由所述图像中继光学元件所产生的图像之间，其中所述二色性滤光器产生具有不同颜色的光束的两(2)个分支。
条款52.根据条款51所述的流式细胞仪(40)，其中另一个聚焦光学元件位于所述分支之一内并且将分支内的光束聚焦到具有小于1.0毫米直径的光斑内。
条款53.根据条款52所述的流式细胞仪(40)，其中所述图像中继光学元件、二色性滤光器和聚焦光学元件的连续组合被级联以针对所述光束的多个有色带产生具有小于1.0毫米直径的附加的聚焦的光斑。
条款54.根据条款52所述的流式细胞仪(40)，其中所述二色性滤光器使用模板进行组装，所述模板包括粘接到一起的光学接触的两(2)个光学平坦的玻璃板，以及其中所述二色性滤光器使用所述模板粘接到过滤器保持器，使得所述二色性滤光器的经涂覆的滤光器表面凹进且光学平行于所述过滤器保持器的参考表面。
条款55.根据条款54所述的流式细胞仪(40)，其中所述滤光器保持器的参考表面抵靠包括在WMD(90)内的参考区块的光学平坦表面放置，从而将二色性滤光器安装在WMD(90)内时提供一致的光学对准。
条款56.一种用于将光束入射到其中存在粒子的观察区内的光学子系统(50)，所述光学子系统(50)包括：
a)LD，其用于从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴和短轴；
b)准直透镜，其用于将从所述LD发射的所述发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述短轴平行于粒子通过所述观察区的方向而取向；
c)光束压缩光学元件，其用于减少在所述观察区处的所述椭圆形光束的大小，由此垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向的所述椭圆形光束的所述长轴的宽度小于所述液体鞘流的宽度；以及
d)柱面聚焦元件，其位于邻近所述观察区处，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向，由此：
i.所述光束的所述短轴聚焦在所述观察区处；并且
ii.在所述观察区处的所述椭圆形光束的所述长轴的尺寸基本上保持不变。
条款57.根据条款56所述的光学子系统(50)，进一步包括具有矩形形状横截面的小杯，并且其中所述观察区位于处于所述小杯内的具有矩形横截面的通道内。
条款58.根据条款56所述的光学子系统(50)，进一步包括具有管形横截面的小杯，并且其中所述观察区位于处于所述小杯内的具有圆形横截面的通道内。
条款59.根据条款56所述的光学子系统(50)，其中所述试样液体与液体鞘流形成喷射流，所述观察区位于所述喷射流内。
条款60.根据条款57所述的光学子系统(50)，其中所述柱面聚焦元件与所述矩形形状的小杯的入口面光接触。
条款61.根据条款57所述的光学子系统(50)，其中所述柱面聚焦元件与所述矩形形状的小杯分离。
条款62.根据条款58所述的光学子系统(50)，其中所述柱面聚焦元件与所述管形小杯分离。
条款63.根据条款59所述的光学子系统(50)，其中所述柱面聚焦元件与所述喷射流分离。
条款64.根据条款56所述的光学子系统(50)，进一步包括偏振调节元件，所述准直的椭圆形光束通过所述偏振调节元件。
条款65.一种用于使用基于LD的光学子系统(50)来传送椭圆形光束的方法，所述光束在其短轴的焦点处具有平滑轮廓，所述焦点位于试样液体流动通过其的观察区处，试样液体通过也流动通过所述观察区的液体鞘流而流体动力学地聚焦在所述观察区内，所述方法包括以下步骤：
a)提供LD，其从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴和短轴；
b)将从所述LD发射的所述发散光束入射到准直透镜上，用于将从其发射的发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述短轴平行于试样液体通过观察区的方向而取向；
c)在通过所述准直透镜之后，将所述准直的椭圆形光束入射到光束压缩光学元件上，用于减少在观察区处的所述椭圆形光束的大小，由此垂直于试样液体通过所述观察区的方向而取向的所述椭圆形光束的所述长轴的宽度小于所述液体鞘流的宽度；以及
d)在通过所述光束压缩光学元件之后，将光束入射到柱面聚焦元件上，其位于邻近所述观察区处，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于试样液体通过所述观察区的方向而取向，由此：
i.所述光束的所述短轴聚焦在所述观察区处；并且
ii.在所述观察区处的所述椭圆形光束的所述长轴的尺寸基本上保持不变。
条款66.根据条款65所述的方法，其中所述观察区位于处于所述小杯内的具有矩形横截面的通道内。
条款67.根据条款65所述的方法，其中所述观察区位于处于所述小杯内的具有圆形横截面的通道内。
条款68.根据条款65所述的方法，其中所述观察区位于喷射流内。
条款69.根据条款66所述的方法，进一步包括在所述柱面聚焦元件和所述小杯的入口面之间建立光学接触的步骤。
条款70.根据条款66所述的方法，进一步包括在所述柱面聚焦元件和所述小杯之间建立间距的步骤。
条款71.根据条款67所述的方法，进一步包括在所述柱面聚焦元件和所述小杯之间建立间距的步骤。
条款72.根据条款68所述的方法，进一步包括在所述柱面聚焦元件与所述喷射流之间建立间距的步骤。
条款73.根据条款65所述的方法，进一步包括将偏振调节元件插入到所述准直透镜和所述光束压缩光学元件之间，由此使得所述准直的椭圆形光束通过所述偏振调节元件的步骤。
条款74.一种复合显微镜物镜(60)，其适于对由存在于观察区内的粒子散射的光和发出的荧光进行成像，所述复合显微镜物镜(60)包括：
a)凹面镜，散射和发出的荧光入射到其上；
b)由光学透明材料制成的像差校正器板，其中所述像差校正器板为非球面透镜，其具有：
i.所述像差校正器板的第一区域，其在所述像差校正器板的中性区域之外，所述所述像差校正器板于该处：
1)是最薄的；并且
2)具有负的光学倍率；以及
ii.在所述中性区域内的所述像差校正器板的第二区域，其具有正的光学倍率；
从所述复合显微镜物镜(60)反射的光通过所述像差校正器板；
所述观察区位于所述凹面镜和所述像差校正器板之间。
条款75.根据条款74所述的复合显微镜物镜(60)，其中观察区的光学图像形成于所述复合显微镜物镜(60)的外侧。
条款76.根据条款75所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述观察区位于包括在由光学透明材料制成的矩形形状的小杯内的流动通道内。
条款77.根据条款76所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款78.根据条款77所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述小杯的平坦表面。
条款79.根据条款78所述的复合显微镜物镜(60)，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款80.根据条款78所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款81.根据条款78所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款82.根据条款78所述的复合显微镜物镜(60)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款83.根据条款78所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述平凹后表面反射镜与所述小杯装置整体性地形成。
条款84.根据条款76所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述像差校正器板是平面-非球面透镜。
条款85.根据条款84所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述像差校正器板的平面表面光学耦连到所述平凹后表面反射镜相对侧的所述小杯的平坦表面。
条款86.根据条款85所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款87.根据条款85所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款88.根据条款85所述的复合显微镜物镜(60)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款89.根据条款85所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述平面-非球面透镜与所述小杯整体性地形成。
条款90.根据条款84所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述像差校正器板与所述小杯分离。
条款91.根据条款75所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述观察区在喷射流内部。
条款92.根据条款90所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述凹面镜是前表面反射镜。
条款93.根据条款75所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述观察区位于平坦的、透明的基材的表面上。
条款94.根据条款93所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款95.根据条款94所述的复合显微镜物镜(60)，所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述平坦的、透明的基材。
条款96.根据条款95所述的复合显微镜物镜(60)，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款97.根据条款95所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款98.根据条款95所述的复合显微镜物镜(60)，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款99.根据条款95所述的复合显微镜物镜(60)，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款100.根据条款94所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述平凹后表面反射镜与所述平坦的、透明的基材整体性地形成。
条款101.根据条款93所述的复合显微镜物镜(60)，其中所述像差校正器板与所述平坦的、透明的基材分离。
条款102.一种用于使用显微镜物镜装置来描绘微观物种的特征的方法，所述显微镜装置包括：
a)凹面镜；
b)由光学透明材料制成的像差校正器板，其中所述像差校正器板是非球面透镜，其具有在该处所述板装置的厚度为最薄，具有负的光学倍率的、在中性区域的之外的所述板装置的区域，以及具有正光学倍率的、在所述中性区域内的区域；
c)位于所述凹面镜和所述像差校正器板之间的观察区。
条款103.根据条款102的方法，其中所述观察区的光学图像形成于所述装置的外侧。
条款104.根据条款103所述的方法，其中所述观察区位于包括在由光学透明材料制成的矩形形状的小杯内的流动通道内。
条款105.根据条款104所述的方法，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款106.根据条款105所述的方法，其中所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述小杯装置的平坦表面。
条款107.根据条款106所述的方法，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款108.根据条款106所述的方法，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款109.根据条款106所述的方法，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款110.根据条款106所述的方法，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款111.根据条款106所述的方法，其中所述平凹后表面反射镜与所述小杯整体性地形成。
条款112.根据条款104所述的方法，其中所述像差校正器板是平面-非球面透镜。
条款113.根据条款112所述的方法，其中所述像差校正器板的平表面光学耦连到所述凹面镜相对侧的所述小杯装置的平坦表面。
条款114.根据条款113所述的方法，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款115.根据条款113所述的方法，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款116.根据条款113所述的方法，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款117.根据条款113所述的方法，其中所述平面-非球面透镜与所述小杯整体性地形成。
条款118.根据条款112所述的方法，其中所述像差校正器板与所述小杯分离。
条款119.根据条款102所述的方法，其中所述观察区在喷射流内部。
条款120.根据条款119所述的方法，其中所述凹面镜是前表面反射镜。
条款121.根据条款102所述的方法，其中所述观察区位于平坦的、透明的基材的表面上。
条款122.根据条款121所述的方法，其中所述凹面镜是由光学透明材料制成的平凹后表面反射镜。
条款123.根据条款122所述的方法，其中所述平凹后表面反射镜的平面表面光学耦连到所述平坦的、透明的基材。
条款124.根据条款123所述的方法，其中光学粘合剂材料完成所述光学耦连。
条款125.根据条款123所述的方法，其中指数匹配的凝胶完成所述光学耦连。
条款126.根据条款123所述的方法，其中指数匹配的流体完成所述光学耦连。
条款127.根据条款123所述的方法，其中光学接触粘接完成所述光学耦连。
条款128.根据条款122所述的方法，其中所述平凹后表面反射镜与所述平坦的、透明的基材整体性地形成。
条款129.根据条款128所述的方法，其中所述像差校正器板与所述平坦的、透明的基材分离。
条款130.一种流体子系统(70)，其用于将无脉动的液体流供应至流体子系统(70)的出口，所述流体子系统(70)包括：
a)液体泵，其用于供应从储槽抽取的液体；
b)T型联接器，其具有至少一(1)个入口和两(2)个出口，
i.所述T型联接器的入口从所述液体泵接收液体；
ii.由入口所接收的液体的第一小部分经由出口的第一个并且经由旁路导管流回到所述储槽；并且
iii.由所述入口所接收的液体的第二小部分经由出口的第二个并且经由粒子过滤器而流至所述流体子系统(70)的出口。
条款131.根据条款130所述的流体子系统(70)，其中所述粒子过滤器具有用于接收来自T型联接器的液体的入口，所述粒子过滤器的所述入口设置为使得空气在其入口处被捕获在于所述粒子过滤器内。
条款132.根据条款131所述的流体子系统(70)，其中当所述液体泵关闭时，空气不能进入到所述旁路导管内。
条款133.根据条款132所述的流体子系统(70)，进一步包括小型器皿，所述小型器皿设置于所述T型连接器出口中的第二个出口和所述粒子过滤器之间，用于当所述液体泵关闭时储存从所述粒子过滤器排出的空气。
条款134.根据条款132所述的流体子系统(70)，进一步包括一定长度的管路，其设置于所述T型连接器的出口中的第二个出口和所述粒子过滤器之间，用于当液体泵关闭时储存从所述粒子过滤器排出的空气。
条款135.根据条款132所述的流体子系统(70)，进一步包括可调节阀，其位于在所述T型连接器的出口中的第一个出口和所述储槽之间的旁路导管内，以便限制流经其间的液体流。
条款136.根据条款132所述的流体子系统(70)，进一步包括可调节阀，其位于在所述T型连接器的所述出口中的第二个出口和所述流体子系统(70)的出口之间，以便限制流经其间的液体流。
条款137.根据条款132所述的流体子系统(70)，其中液体泵的通量是可调节的。
条款138.一种用于将无脉动的液体流供应至流体子系统(70)的出口的方法，所述方法包括：
a)液体泵，其用于供应从储槽抽取的液体；
b)T型联接器，其具有至少一(1)个入口和两(2)个出口，
i.所述T型联接器的入口从所述液体泵接收液体；
ii.由入口所接收的液体的第一小部分经由出口的第一个并且经由旁路导管流回到所述储槽；并且
iii.由入口所接收的液体的第二小部分经由出口的第二个并且经由粒子过滤器而流至所述流体子系统(70)的出口。
条款139.根据条款138所述的方法，其中在正常操作期间一定量的空气被截留在所述过滤器滤芯装置的入口部附近。
条款140.根据条款139的方法，其中所述储槽装置保持足够量的液体，使得当所述泵装置被关闭时，在所述T型装置和所述储槽装置之间的一部分管路仍充满液体，防止所截留的空气泄漏到所述旁路装置内。
条款141.根据条款140所述的方法，其中所述储槽装置是器皿。
条款142.根据条款140所述的方法，其中所述储槽装置是一段管路。
条款143.根据条款140所述的方法，其中可调节的限流器装置位于旁路路线内。
条款144.根据条款140所述的方法，其中可调节的限流器装置位于鞘路线内。
条款145.根据条款140所述的方法，其中鞘泵的通量是可调节的。
条款146.一种蠕动泵80，所述蠕动泵80包括：
a)泵壳体，其具有形成于其中的弧形弯曲轨道，所述轨道在泵入口和泵出口之间延伸；
b)附接到转子的多个辊，所述辊在每对紧邻的辊之间具有大致相等的角间距，所述转子可与附接到其上的辊一起在所述泵壳体内部旋转；以及
c)可压缩管，其夹置于所述辊和所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道之间，所述弧形弯曲轨道包括：
i.出口区段，其中当辊滚动通过所述出口区段时，邻近于所述辊的所述可压缩管从所述出口区段起点处的完全闭合逐渐扩展到在所述泵出口处的完全开放，在所述泵出口处所述辊断开与所述可压缩管的接触；以及
ii.在所述泵入口和所述泵出口之间沿着所述弧形弯曲轨道的至少一个泵送区段，其中所述可压缩管通过至少一个所述辊被压缩至完全闭合。
条款147.根据条款146所述的蠕动泵80，其中所述泵壳体的弧形弯曲轨道包括至少两(2)个泵送区段，所述弧形弯曲轨道进一步包括位于沿着弧形弯曲轨道的所述泵送区段之间的至少一个凹入区段，并且其中在所述凹入区段处的所述可压缩管减压至完全扩展，然后当所述辊中的一(1)个滚动通过所述凹入区段时所述可压缩管被压缩到完全闭合。
条款148.根据条款147所述的蠕动泵80，包括在所述泵出口的上游沿着所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段，邻近于所述泵出口的所述凹入区段的压缩部分和所述弧形弯曲轨道的所述出口区段之间的角间距与每对紧邻的辊之间的角间距大致相同。
条款149.根据条款147所述的蠕动泵80，其中邻近于所述泵出口的所述凹入区段的所述压缩部分具有的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在从所述凹入区段延伸到泵出口的所述可压缩管的区段内部的总流体体积基本不变。
条款150.根据条款147所述的蠕动泵80，具有分别分散在紧邻成对的多个泵送区段之间的多个凹入区段。
条款151.根据条款149所述的蠕动泵80，其中下述两者：
a)相邻成对的凹入区段之间的角间距；以及
b)所述弧形弯曲轨道的所述出口区段和与所述出口区段相邻的凹入区段之间的角间距
与每对紧邻的辊之间的角间距基本上相同。
条款152.根据条款150所述的蠕动泵80，其中所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在所述多个凹入区段和所述出口区段处的所述可压缩管的区段中的流体体积基本不变。
条款153.根据条款146所述的蠕动泵80，其中所述转子的速度是可编程地控制的，以便以与所述可压缩管内的由于接近弧形弯曲轨道的所述出口区段的其压缩改变所导致的流体体积变化率基本上成反比的方式来改变。
条款154.一种用于使用蠕动泵80传送液体的方法，所述蠕动泵80包括：
a)具有弧形弯曲轨道的泵壳体；
b)附接到可在所述泵壳体内旋转的转子装置的多个辊；
c)所述多个辊彼此间隔开大致相等的角间距；
d)夹置于所述辊和所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道之间的可压缩管；
e)所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道包括出口区段，其中当所述辊之一在所述泵出口处滚离所述可压缩管时，所述可压缩管逐渐减压至完全扩展；
f)在所述泵入口和所述泵出口之间沿着所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道的至少一个泵送区段，其中所述可压缩管由所述辊之一压缩至完全闭合。
条款155.根据条款154所述的方法，其中所述泵壳体的弧形弯曲轨道包括至少两(2)个泵送区段，所述弧形弯曲轨道进一步包括位于沿着弧形弯曲轨道的所述泵送区段之间的至少一个凹入区段，并且其中在所述凹入区段处的所述可压缩管变成减压至完全扩展，然后当所述辊中的一(1)个滚动通过所述凹入区段时所述可压缩管被压缩到完全闭合。
条款156.根据条款155所述的方法，其中包括在泵出口的上游沿着所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段；邻近于所述泵出口的所述凹入区段的压缩部分和所述弧形弯曲轨道的所述出口区段之间的角间距与每对紧邻的辊之间的角间距大致相同。
条款157.根据条款155所述的方法，其中邻近于所述泵出口的所述凹入区段的压缩部分具有的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在从所述凹入区段延伸到所述泵出口的所述可压缩管的区段内部的总流体体积基本不变。
条款158.根据条款155所述的方法，具有分别分散在紧邻成对的多个泵送区段之间的多个凹入区段。
条款159.根据条款157所述的方法，其中下述两者：
a)相邻成对的凹入区段之间的角间距；以及
b)所述弧形弯曲轨道的所述出口区段和与所述出口区段相邻的凹入区段之间的角间距
与每对紧邻的辊之间的角间距基本上相同。
条款160.根据条款158所述的方法，其中所述弧形弯曲轨道的多个凹入区段的形状与所述弧形弯曲轨道的所述出口区段的形状互补，以便当所述辊之一逐渐滚离所述弧形弯曲轨道的所述出口区段时，保持在所述多个凹入区段和所述出口区段处的所述可压缩管的区段中的流体体积基本不变。
条款161.根据条款154所述的方法，其中所述蠕动泵80的转子速度是可编程地控制的，以便以与所述可压缩管内的由于接近所述弧形弯曲轨道出口区段的其压缩改变所导致的流体体积变化率基本上成反比的方式来改变。
条款162.一种WDM(90)，用于将所发射的光束分离成多个有色带，WDM(90)包括：
a)准直光学元件，其放大以产生与所述准直光学元件的有效尺寸基本上相同大小的图像；
b)位于所述准直光学元件和所述图像之间的至少一个二色性滤光器，其中所述二色性滤光器将准直光束分离成不同颜色的两(2)个分支；
c)位于所述分支之一内的聚焦光学元件，其中在所述分支内的光束通过所述聚焦光学元件聚焦到具有小于1.0毫米直径的光斑；以及
d)图像中继光学元件，其位于由在另一个分支内的所述准直光学元件所产生的图像附近，其中所述图像中继光学元件基本上以放大倍率为一来产生所述准直光学元件的图像。
条款163.根据条款162所述的WDM(90)，其中至少一个附加的二色性滤光器位于所述图像中继光学元件与由所述图像中继光学元件所产生的图像之间，其中所述二色性滤光器产生具有不同颜色的光束的两(2)个分支。
条款164.根据条款163所述的WDM(90)，其中另一个聚焦光学元件位于所述分支之一内并且将分支内的光束聚焦到具有小于1.0毫米直径的光斑内。
条款165.根据条款164所述的WDM(90)，其中所述图像中继光学元件、二色性滤光器和聚焦光学元件的连续组合被级联以针对所述光束的多个有色带产生具有小于1.0毫米直径的附加的聚焦的光斑。
条款166.根据条款164所述的WDM(90)，其中所述二色性滤光器使用模板进行组装，所述模板包括粘接到一起的光学接触的两(2)个光学平坦的玻璃板，以及其中所述二色性滤光器使用所述模板粘接到过滤器保持器，使得所述二色性滤光器的经涂覆的滤光器表面凹进且光学平行于所述过滤器保持器的参考表面。
条款167.根据条款166所述的WDM(90)，其中所述滤光器保持器的参考表面抵靠包括在WMD(90)内的参考区块的光学平坦表面放置，从而将二色性滤光器安装在WMD(90)内时提供一致的光学对准。
条款168.一种用于使用WDM(90)来将所发射的光束分离成多个有色带的方法，所述WDM(90)包括：
a)准直光学元件，其放大以产生与所述准直光学元件的有效尺寸基本上相同大小的图像；
b)位于所述准直光学元件和所述图像之间的至少一个二色性滤光器，其中所述二色性滤光器将准直光束分离成不同颜色的两(2)个分支；
c)位于所述分支之一内的聚焦光学元件，其中所述分支的光束通过所述聚焦光学元件聚焦到具有小于1.0毫米直径的光斑；以及
d)图像中继光学元件，其位于由在另一个分支内的所述准直光学元件所产生的图像附近，其中所述图像中继光学元件基本上以放大倍率为一来产生所述准直光学元件的图像。
条款169.根据条款168所述的方法，其中至少一个附加的二色性滤光器位于所述图像中继光学元件与由所述图像中继光学元件所产生的图像之间，其中所述二色性滤光器产生具有不同颜色的光束的两(2)个分支。
条款170.根据条款169所述的方法，其中另一个聚焦光学元件位于所述分支之一内并且将分支内的光束聚焦到具有小于1.0毫米直径的光斑内。
条款171.根据条款170所述的方法，其中所述图像中继光学元件、二色性滤光器和聚焦光学元件的连续组合被级联以针对所述光束的多个有色带产生具有小于1.0毫米直径的附加聚焦的光斑。
条款172.根据条款170所述的方法，其中所述二色性滤光器使用模板进行组装，所述模板包括粘接到一起处于光学接触的两(2)个光学平坦的玻璃板，以及其中所述二色性滤光器使用所述模板粘接到过滤器保持器，使得所述二色性滤光器的经涂覆的滤光器表面凹进且光学平行于所述过滤器保持器的参考表面。
条款173.根据条款172所述的方法，其中所述滤光器保持器的参考表面抵靠包括在WMD(90)内的参考区块的光学平坦表面放置，从而将二色性滤光器安装在WMD(90)内时提供一致的光学对准。

Claims (10)

1.一种用于流式细胞仪的光学子系统，所述光学子系统包括：
准直光学元件，被布置为接收来自光源的光，所述准直光学元件被配置为投射经准直光束；
光学中继元件，被布置为接收来自所述准直光学元件的所述经准直光束的至少部分，所述光学中继元件包括曲面镜，所述曲面镜被配置为反射从所述准直光学元件接收的所述经准直光束的所述部分，以产生第一图像；
第一聚焦光学元件，被布置为接收由所述光学中继元件反射的所述经准直光束的至少部分；以及
第一半导体检测器，
其中所述第一聚焦光学元件被配置为将从所述光学中继元件接收的所述经准直光束的所述部分聚焦到所述第一半导体检测器上。
2.一种用于流式细胞仪的光学子系统，所述光学子系统包括：
准直光学元件，被布置为接收来自光源的光，所述准直光学元件被配置为投射包括第一图像的经准直光束，其中所述经准直光束具有准直距离；以及
光学中继元件，被布置为接收所述经准直光束，所述光学中继元件被配置为扩展所述经准直光束的所述准直距离，
其中所述光学中继元件包括被配置为产生第二图像的曲面镜或凹形的二向色滤波器。
3.一种用于流式细胞仪的光学子系统，所述光学子系统包括：
准直光学元件，被布置为接收来自光源的光，所述准直光学元件被配置为投射第一图像；以及
光学中继元件，被布置在所述第一图像附近，所述光学中继元件被配置为接收来自所述准直光学元件的光以及投射第二图像；其中所述第一图像的大小与所述第二图像的大小基本相同，
其中，所述光学中继元件包括曲面镜或凹形的二向色滤波器。
4.一种设备，包括：
第一半导体检测器，被配置为接收经准直光束的至少第一部分；
第一光学中继元件，包括第一镜子，所述第一光学中继元件被配置为接收所述经准直光束的至少第二部分以及输出所述经准直光束的所述第二部分；以及
第二半导体检测器，被配置为接收所述经准直光束的所述第二部分。
5.一种用于输送鞘液体至流通池的鞘供应系统，所述系统包括：
带通气孔的储槽，用于保持鞘液体；
泵，用于推进鞘液体，所述泵连通至所述储槽；
具有分支的联接器，其被连通以将来自所述泵的流分配到输送路径和旁路路径之中，
所述旁路路径，其被连通以将鞘液体返回至所述储槽；以及
池路径，其被连通以将鞘液体输送至所述流通池，所述池路径包括滤芯，所述滤芯具有入口、设置在所述入口下方的出口以及所述入口和所述出口之间的内部容积，
其中所述鞘供应系统被配置为将空气截留在所述内部容积中，在将鞘液体输送至所述流通池期间，被截留的空气阻尼来自所述泵的脉动。
6.一种将基本无脉动的鞘液体提供至流通池的方法，所述方法包括：
将来自有脉动的泵的流分开至池路径和旁路路径之中，所述旁路路径将所述流的第一部分返回至带有通气孔的储槽，所述池路径将所述流的第二部分输送至所述流通池，其中所述池路径的流阻大于所述旁路路径的流阻；
将空气截留在所述池路径的滤芯中，被截留的空气阻尼所述流的所述第二部分中的脉动。
7.一种蠕动泵，包括：
弯曲轨道；
多个辊，附接至转子，所述转子相对于所述弯曲轨道是可旋转的；以及
可压缩管，夹接在所述弯曲轨道和所述多个辊之间，其中所述弯曲轨道包括：
第一泵送区段，被塑形为使得当所述多个辊之一滚过所述第一泵送区段时，靠近所述辊的所述可压缩管保持完全闭合，
出口区段，设置在所述第一泵送区段的下游，所述出口区段被塑形为使得当所述多个辊之一滚过所述出口区段时，靠近所述辊的所述可压缩管从所述出口区段的开端处的完全闭合逐渐扩展至所述出口区段的末端处的至少部分开放，以及
凹入区段，设置在所述第一泵送区段和所述出口区段之间。
8.一种蠕动泵，包括：
弯曲轨道，从泵入口延伸至泵出口；
多个辊，附接至转子，所述转子相对于所述弯曲轨道是可旋转的；以及
可压缩管，夹接在所述弯曲轨道和所述多个辊之间，其中所述弯曲轨道包括：
第一泵送区段，被塑形为使得当所述多个辊之一滚过所述第一泵送区段时，靠近所述辊的所述可压缩管保持完全闭合，以及
压缩区段，位于所述第一泵送区段和所述泵出口之间，其中所述压缩区段被塑形为使得当所述多个辊之一滚过所述压缩区段时，靠近所述辊的所述可压缩管从至少部分开放逐渐压缩至完全闭合。
9.一种具有激光二极管(LD)系统的流式细胞仪，所述LD系统包括：
LD，用于从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴和短轴；
准直透镜，被配置为将从所述LD发射的所述发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述短轴平行于粒子通过观察区的方向而取向；
光束压缩光学元件，被配置为减小在所述观察区处的所述椭圆形光束的大小，从而垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向的所述椭圆形光束的宽度小于所述液体鞘流的宽度；以及
柱面聚焦元件，位于邻近所述观察区处，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于所述粒子通过所述观察区的方向而取向，从而所述椭圆形光束的所述短轴变为聚焦在所述观察区处，所述观察区处的所述椭圆形光束的所述长轴的大小基本保持不变。
10.一种具有激光二极管(LD)系统的流式细胞仪，所述LD系统包括：
LD，用于从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有快轴和慢轴；
准直透镜，被配置为将从所述LD发射的所述发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述慢轴平行于粒子通过观察区的方向而取向；
光束压缩光学元件，被配置为减小所述椭圆形光束的所述快轴和所述慢轴两者的大小；以及
柱面聚焦元件，位于邻近所述观察区处，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于所述粒子通过所述观察区的方向而取向，从而所述椭圆形光束的所述慢轴变为聚焦在所述观察区处，所述观察区处的所述椭圆形光束的所述快轴的大小基本保持不变。
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