JP2021060411A - フローサイトメータ - Google Patents

Abstract

【課題】フローサイトメータのサブアセンブリの構造および動作を改良する。【解決手段】フローサイトメータは、光ビームを、観察ゾーンを通過する粒子へ入射させるためのレーザダイオードベースの光学サブシステムと；観察ゾーンを通過する粒子から散乱された光または該粒子によって発された蛍光を集光して結像するための複合顕微鏡対物レンズと；観察ゾーンへシース液フローを供給するための流体サブシステムと；シース液フローと共に観察ゾーンを通過する粒子を担持するサンプル液フローを、シース液フローへ注入するための蠕動ポンプと；複合顕微鏡対物レンズが集光して結像する観察ゾーンからの散乱光および蛍光を受光するマルチモード光ファイバと；光ファイバを介して受光した光をカラーバンドに光学的に分離するための波長分割マルチプレクサと、を含む。【選択図】図１

Description

一般に、本開示はフローサイトメトリの技術分野に関し、より詳細には、中に含まれる様々な個別のサブアセンブリを有する改良されたフローサイトメータの構造および動作に関する。

フローサイトメトリは細胞計数、選別、バイオマーカ検出、およびタンパク質工学に用いられる生物物理学的技術である。フローサイトメトリにおいて、液体ストリーム中に懸濁された細胞が電子的検出装置を通過する。フローサイトメトリは最大毎秒数千個の細胞の物理的および／または化学的特徴の同時マルチパラメータ解析を可能にする。

フローサイトメトリは、分子生物学、病理学、免疫学、植物生物学および海洋生物学の分野において様々な用途を有している。また、フローサイトメトリは、医学（特に、移植、血液学、腫瘍免疫学および化学療法、出生前診断、遺伝学、ならびに性別を事前選択するための精子選別）にも幅広い用途を有している。海洋生物学では、光合成プランクトンの自己蛍光特性を、存在量と群集組成を特徴付ける際にフローサイトメトリによって利用することができる。タンパク質工学では、所望の特性を有する細胞表面にディスプレイされたタンパク質変異体を同定するために、フローサイトメトリは酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイに共に使用される。フローサイトメトリの一般的な変形形態は、粒子をその特性に基づいて物理的に選別し、これによって、対象の集団を精製することである。

全体的なフローサイトメトリシステムは以下の主要な構成要素を含む:
1． 細胞または粒子がフローセル中の単一の縦列を通過するように、通常、シースフロー、液体、または流体と呼ばれる液体ストリームが細胞または粒子を担持しかつこれらを流体力学的に整列させる、フローセルと、
2． フローセルを通過する細胞または粒子を検出し、通常、
a． インピーダンスもしくは導電率測定サブシステム、または
b． 光検知サブシステムを有する光学イルミネーションサブシステム
のいずれか一方である、フローセルに連結した測定サブシステムと、
3． 測定サブシステムからの出力信号をコンピュータ処理可能なデータへ変換するための変換サブシステムと、
4． 変換サブシステムによって生成されるデータを解析するためのコンピュータ。

光学イルミネーションサブシステムは、フローセルを通過する流体力学的に絞り込まれた液体ストリームに入射する、コリメートされその後集束される光ビーム、通常、単一波長のレーザ光を提供する。従って、フローサイトメータシステムは
1． 一つもしくは複数のランプ、例えば、水銀もしくはキセノン、
2． 一つもしくは複数の高出力水冷式レーザ、例えば、アルゴン、クリプトン、もしくは色素レーザ、
3． 一つもしくは複数の低出力空冷レーザ、例えば、アルゴン（488 nm）、ヘリウムネオン（赤‐633 nm）、ヘリウムネオン（緑）およびヘリウムカドミウム（UV）、ならびに／または、
４． 一つもしくは複数のダイオードレーザ（青、緑、赤、紫）
を含む一つまたは複数の光源を有する。

光検知サブシステムは、絞り込まれた液体ストリームが光ビームを通過する場所を照準する一つまたは複数の検出器を含む。このような検出器は、
1． 光ビームと同一線上の検出器（前方散乱、即ち、FSC）と、
2． それに垂直な検出器（側方散乱、即ち、SSC）と、
3． 蛍光検出器と、
を含む。

ビームを通過する各懸濁された粒子は光を散乱し、入射光によって励起される粒子の中に存在するまたは該粒子に取り付けられた蛍光材料は、入射光の波長よりも長い波長で発光する。各検出器（蛍光発光の各ピークに対して一つ）において散乱光および蛍光の組み合わせにおける明度の変化を検出し分析することによって、各個別の粒子の物理的および化学的な構造についての様々な種類の情報を導き出すことができる。FSCは細胞の体積と相関する。SSCは、細胞内の内部構成要素の散乱光に起因し、粒子の内部の複雑さ（即ち、核の形状、細胞質顆粒の量および種類、または膜の粗さ）に依存する。一部のフローサイトメータは蛍光検出器を省略して散乱光のみを検出する。他のフローサイトメータは各細胞の蛍光、散乱光、および透過光の像を形成する。

線形または対数のいずれかであり得る一つまたは複数の増幅器を含み得るフローサイトメータシステムの変換サブシステムは、一般に、測定サブシステムの出力信号を、その後コンピュータ処理されるデータに変換するための、一つまたは複数のアナログ−デジタルコンバータ（「ADC」）を含む。

現代のフローサイトメータは、通常、4個以下のレーザおよび多数の蛍光検出器を含む。レーザおよび検出器の数を増やすことによって、いくつかの異なる抗体による細胞標識化が可能になり、標的集団をその表現型マーカーによってより正確に同定することができる。一部の機器は個別の細胞のデジタル画像をさらにキャプチャすることができ、これによって、細胞内部のまたは細胞表面上の蛍光信号位置の分析が可能になる。

サンプルイルミネーション
大部分の機器において、血液細胞またはマイクロスフェアなどの対象の粒子は、流体力学的絞り込みを用いたシースフローによってキュベットまたはジェット流の内部の観察ゾーン内へ運ばれ、集束されたレーザビームによってそこで照射される。この技術は、記録時間窓の外側で発生するバックグラウンドノイズによって邪魔されることなく、対象の粒子を正確に識別し計数する手段を提供する（Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley (2003) ISBN 0471411256（非特許文献1））。検出感度を高めるために、集束されたレーザビームの断面は、通常、フロー方向に沿った短軸を有する楕円形である。閾値の完全性を維持するために、レーザプロファイルは、フロー方向に沿って滑らかなまたは釣鐘状のプロファイルを持つ必要がある。このようなビームを生成するための一般的な一つの方法は、ほぼコリメートされた円形ガウスビームを、プリズムまたは円柱レンズ対から作られたビームエキスパンダによってフロー方向に沿って細長くし、その後、球面レンズによってビームを集束させることである。焦点におけるビームの形状は遠視野におけるビームの空間フーリエ変換であるので、これによってフローに沿った短軸を有するガウス形の楕円形スポットが生成される。

従来のレーザは費用が高く、かさ高く、低出力であった。より最近では、レーザダイオード（「LD」）が利用可能となった。従来のレーザとは異なり、次世代のLDは、費用対効果が高くコンパクトで省電力であり、よって、次世代のコンパクトな生物医学機器の将来は有望である。LDは、LDの接合部に直交した、しばしば高速軸と呼ばれる楕円の長軸と、LDの接合部に平行である、しばしば低速軸と呼ばれる楕円の短軸と、を有する楕円形断面を有する光を放つ。残念なことに、典型的なLDの、とりわけ、その高速軸に沿ったビーム品質は不十分な部分が多々あり、よって、フローサイトメトリ用途での広い採用が阻まれている。

基本的には、LDビームの品質は空間フィルタリングによってかなりの部分で改良が見込まれる。小ピンホールまたはシングルモード光ファイバが、最低次元の空間モードのみを受け取るようにレンズの焦点に位置づけられた場合、ピンホールまたはシングルモード光ファイバを通過するビームは、ほぼ完全なガウス形状を有する。米国特許第5,788,927号（特許文献1）は、そのようなビームを、次いで、コリメートさせ、サイトメータを通るフローの方向に拡大し、最終的に、フロー方向に沿った短軸を有する楕円形のガウスビームへと集束させることができることを開示している。しかしながら、デスクトップ計装の大きさにより、ピンホール径が５ミクロン未満に制約される。可視波長シングルモード光ファイバのコアサイズも同様の寸法を有している。このような精度の高い空間フィルタを製造しその長期的な安定性を維持する試みは、LDベースのレーザシステムのコストを増加させるだけでなく、その信頼度も低減させる。

より最近では、コリメートレンズの制約された開口数のエッジ効果によって起こりうるサイドローブを低減するための努力において、米国特許第6,713,019号（「'019特許」）（特許文献2）は、低速軸がフロー方向に平行になるようにLDを90°回転させることを開示している。その後、円柱凹レンズなどのビーム拡散部分を導入して、コリメートされたビームをフローに直交する方向に拡散させ、次に、球面集束レンズなどのビームスポット形成部分を導入して、サイトメータの粒子観察ゾーン内に楕円形スポットを形成する。'019特許（特許文献2）に詳細に記載されているように、スポット形成部分の後のレーザビームは極めて歪んでいる。具体的には、フローに直交する方向の観察ゾーンにおけるビーム幅は、フロー流路の幅に等しいかまたはこれより広い。これは粒子に入射するレーザエネルギーの量を低減させ、結果的に信号強度も低下させるだけでなく、液体とフローセルの界面からの好ましくないバックグラウンドの散乱を増加させる。LDを回転させる代わりに、米国特許第7,385,682号（特許文献3）および第7,561,267号（特許文献4）は、LDのコリメーションのために大きな開口数の非球面レンズを使用することを開示している。しかしながら、このような設計は、LDのビームプロファイルに固有の干渉縞効果を補正することはできない。したがって、短軸に沿ったほぼガウス形の形状と長軸に沿った幅とを有する集束された楕円形ビームを確実に生成可能な、フローサイトメータに使用するためのシンプルなLDベースの光学システムが現在求められている。

観察ゾーン
顕微鏡対物レンズ
現代のフローサイトメータは、不要なバックグラウンド光がサイトメータの検出器に入るのを回避するために対物レンズの結像位置に配置された、通常、機械的ピンホールまたは大きなコアの光ファイバのいずれかを含む、空間フィルタを含む。粒子は数マイクロ秒の間サイトメータの観察ゾーン内にとどまるので、集光効率を最大化するためには大きな開口数を有する顕微鏡対物レンズを使用する必要がある。米国特許第4,727,020号（特許文献5）に開示されているように、フローサイトメータ内の複数の空間的に分離された励起レーザ光を支持するためには、大きな視野を有する対物レンズを使用することも望ましい。これらの目標を達成するために、米国特許第6,5100,07号（特許文献6）および第7,110,192号（特許文献7）は、複数のメニスカスレンズが後ろに続く、サンプルの最近位にある光学素子としてゲル結合またはエポキシ接合されたほぼ半球のレンズを有する改良されたアポクロマートを使用した対物レンズの設計を開示している。このような顕微鏡対物レンズは満足できる開口数と視野との両方を提供するが、画質を著しく低下させ、それによって、
1． 空間フィルタの効果的な使用を制限し、かつ、
2． バックグラウンド光の区別能力が低い。
さらに、このような屈折顕微鏡対物レンズはかさ高く、製造コストが高く、多くの場合、深刻な色収差を示す。これらの制約を克服するために、特許協力条約（「PCT」）特許出願番号WO 01/27590（特許文献8）は、球面凹面鏡に基づく代替的な対物レンズ設計を開示している。この設計は大きな開口数と光軸に沿った良好な画質を提供する。しかしながら、軸外特性が劣るため、このような設計は複数の空間的に分離されたレーザビームを有するフローサイトメータには不向きであった。

シース液供給
フローサイトメータの性能は、安定したシース液フローに大きく依存する。具体的には、複数の空間的に分離された励起レーザビームを有するかまたは液滴選別を実行するフローサイトメータは、タイミング同期のためにシース液フローの一定速度に依存する。米国特許第5,245,318号（特許文献9）に開示されているように、従来のフローサイトメータは、
1． フローセルを通る流体を押圧するためにシース液リザーバへ一定の空気圧を適用するか、または、
2． 真空ポンプを使ってフローセルを介してシース液リザーバから流体を吸引する
気密流体システムを使うことにより安定したシース液フローを提供する。

これらのシステムは、かさ高く、製造コストも高く、故障しやすい。最近では、米国特許第8,187,888号（特許文献10）が、シース液リザーバからシース液フローを観察ゾーン内へポンプ注入するシース液サブシステムと、観察ゾーンからシース廃液を廃液タンクへポンプ注入するシース廃液ポンプと、を含むことを開示している。開示されているシース液サブシステムは、速度が重要なフローサイトメータにおいて使用されたことはなかったようにみえるが、この特許は、開示されたシース液サブシステムが、従来のシース液フローの安定性に関する欠陥の大部分を、
1． a． シース液ポンプとフローセルとの間に一つの流体コンデンサと、
b． フローセルおよび廃液ポンプの間に別の流体コンデンサと、
を配置することによって、ポンプ脈動を減衰させることによって、および
2． ポンプコントローラの動作がフローセルの入口と出口の間の差圧を測定する圧力センサに応答するポンプコントローラ
によって、克服することを報告している。

開示されているシース液サブシステムには他の制約がある。例えば、フローセルの出口付近に配置された圧力センサは潜在的な汚染源となる可能性がある。

蠕動ポンプ
サンプル液供給
蠕動ポンプは、一組の線形または円形の移動ローラが圧縮性チューブを連続的に圧縮して、チューブを通る流体を推進させる体積ポンプである。蠕動ポンプは、露出したポンプの部品が交差汚染されるのを回避するために清潔な／無菌の流体または攻撃的な流体をポンプによって汲み上げるために特に広く使用される。

従来の蠕動ポンプは、ローラがポンプ出口付近のチューブから離れて転動するたびに、圧縮されたチューブが元の形状に戻るように拡大したときのチューブ体積の一時的な増加が原因で、脈動を示す。脈動は滑らかなフローを必要とする用途には望ましくない。今まで、脈動を低減するために数多くの試みがなされてきた。例えば、米国特許第3,726,613号（特許文献11）および第3,826,593号（特許文献12）は、チューブ拡大を補償するためにチューブへ外圧を同期的に印加するカム式押圧器を導入している。米国特許第4,834,630号（特許文献13）では、セグメント化されたローラに取り付けられた複数のチューブが、個別のチューブからの脈動が平均化によって低減されるように、ポンプの入口と出口においてＴ字型連結器によって共に接合されている。米国特許第7,645,127号（特許文献14）は、ポンプ出口近くのチューブの減圧が入口近くのより大きな体積のチューブの圧縮によって補償されるように、入口の近くで僅かに大きい内径を有するポンプチューブを配置することを提案している。いずれの方法も、蠕動ポンプの複雑性を大幅に増大させるか、または、脈動の影響の回避には至らなかった。

多色蛍光検出
フローサイトメータなどの多くのマルチカラー蛍光検出機器（Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley (2003) ISBN 0471411256（非特許文献1））において、対象のオブジェクトから発せられた蛍光は、
1． 顕微鏡対物レンズによって集光され、
2． 小さなピンホールまたはマルチモード光ファイバを介して再結像され、
3． その後、コリメートされ、複数のカラーバンドに分離され、
4． 光電子増倍管（PMT）、PINフォトダイオードまたはアバランシェフォトダイオード（APD）などの光検出器によって最終的に検出される。

光電子増倍管（PMT）は本質的に特殊なタイプの電子管である。この「半導体以前の時代」の装置はかさ高く、費用も高い。更に、PMTは、近赤外線スペクトル域への生物学上重要な赤色において特に、シリコン系半導体検出器より量子効率が低く、再現可能なスペクトル応答が少なかった。これらの欠点にもかかわらず、PMTは優れたノイズ特性を有している。例えば、典型的な13 mmのPMT（例えば、R9305、Hamamatsu Corporation製、日本）の暗電流はたったの1 nAであった。これに対して、APDの暗電流はその活性領域がPMTの活性領域の20分の1まで低減された場合でも、10倍以上になった。結果的に、PMTは、数多くの市販の蛍光検出フローサイトメータの中でも、事実上、低レベルの光検出器であった。事象率が低く、暗電流が高価な光子計数技術によって区別されうる一部の科学的用途においてのみ、PMTはAPD検出器に置き換えられた（High-Throughput Flow Cytometric DNA Fragment Sizing, A.V. Orden, R.A. Keller, W. P.Ambrose, Anal. Chem., 2000, 72 (1), p 37-41（非特許文献2）を参照されたい）。より最近では、ガイガーモードのAPDアレイもPMTの代替品として奨励されていた。（例えば、Hamamatsu Photonics、日本製のマルチピクセル光子カウンタおよびSensL Inc.、アイルランド製の固体光電子増倍管）。しかしながら、これらの検出器も高い暗電流を有し、高事象率では非線形であった。

APDが広く受容されている唯一の業界は光通信である。APDの活性領域が1 mm²未満まで低減された場合、対応する暗電流がPMTと同じレベルまで低下することが知られている。光通信では、光はシングルモード光ファイバからのレーザビームである。このようなビームは容易にコリメートされ、その後、1 mm²をはるかに下回る面積まで集束される。なお、米国特許第6,683,314号（特許文献15）およびその参考文献に記載されている蛍光検出器において使用されるカラー分離装置は、米国特許第4,482,994号（特許文献16）および第5,786,915号（特許文献17）に記載されている光通信において広く使用されている波長分割マルチプレクサ（WDM）に、その機能およびアーキテクチャがほぼ一致していることに注目されたい。蛍光検出機器における小面積APDの使用を回避する基本的な理由は、周知のエタンデュ保存の定理にある。即ち、ピンホールまたはマルチモード光ファイバを介して出る蛍光は、シングルモード光ファイバからのレーザビームよりも数百倍大きなエタンデュを有する、分散光源である。これによって、図26に示したように、ビーム径をかなり拡大しない限り、長い距離にわたってビームをコリメートすることはできない。残念なことに、ビーム径が大きくなればなるほど、小スポットに集束させるための技術的な課題も克服が難しくなる。効率的なカラー分離は、コリメートされた光ビームによってのみ経済的に達成可能であるので、小面積APDは、マルチカラーの蛍光検出用途には、使用可能であると考えられていなかった。ビーム径を著しく拡大することなくエタンデュの大きな光ビームを長い距離にわたってコリメートすることが可能な技術が明確に切望される。このような技術は、低ノイズの半導体検出器に匹敵する特性を持つ蛍光検出のためのWDMのような装置を実現可能にする。

米国特許第5,788,927号 米国特許第6,713,019号 米国特許第7,385,682号 米国特許第7,561,267号 米国特許第4,727,020号 米国特許第6,5100,07号 米国特許第7,110,192号 WO 01/27590 米国特許第5,245,318号 米国特許第8,187,888号 米国特許第3,726,613号 米国特許第3,826,593号 米国特許第4,834,630号 米国特許第7,645,127号 米国特許第6,683,314号 米国特許第4,482,994号 米国特許第5,786,915号

Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley (2003) ISBN 0471411256 High-Throughput Flow Cytometric DNA Fragment Sizing, A.V. Orden, R.A. Keller, W. P.Ambrose, Anal. Chem., 2000, 72 (1), p 37-41

開示
本開示は、様々な改良された構成要素を含む改良されたフローサイトメータを提供する。

本開示の目的は、短軸に沿ったガウス様強度分布と、長軸に沿ったフローサイトメトリ用途のために最適化された幅と、を有する楕円形断面の集束されたレーザビームを伝送することが可能なシンプルで確実なダイオードレーザベースの光学システムを提供することである。

本開示の目的は、製造が容易であり、作動距離が長く、開口数が大きく、視野が広く、色収差が最小限の、結像品質顕微鏡対物レンズである。

本開示の目的は、確実性が高く、コンパクトで、製造が容易なだけでなく、速度が重要な用途、例えば複数の空間的に分離された励起レーザビームを有する機器におけるまたは液滴選別器における用途を支持することが可能なフローサイトメータのためのシンプルな流体シスムである。

本開示の目的は、非常に望ましい、脈動のない液体フローを提供することができる蠕動ポンプのための単純な設計である。

本開示の目的は、最小限の脈動を有する蠕動ポンプを提供することである。

本開示の目的は、製造も動作も簡単に行われる蠕動ポンプを提供することである。

本開示の目的は、ビーム径を著しく拡大せずに分散光源からの光ビームを長い距離にわたってコリメートすることが可能な装置を提供することである。また、本開示の目的は、光ビームを複数のカラーバンドに分離するために上記装置を使用したWDMシステムを提供することである。更に、本開示の目的は、低ノイズの半導体検出器と適合するそのようなWDMシステムを提供することである。加えて、蛍光プローブの多様性のため、本開示の目的は、再構成可能なそのようなWDMシステムを提供することである。

本明細書において以下を含むフローサイトメータが開示されている：
1． 光ビームを、観察ゾーンを通過する粒子に入射するためのLDベースの光学サブシステムと、
2． 観察ゾーンを通過する粒子から散乱された光または該粒子によって発された蛍光を集光して結像するための複合顕微鏡対物レンズと、
3． 観察ゾーンへシース液フローを供給するための流体サブシステムと、
4． シース液フローと共に観察ゾーンを通過する粒子を担持するサンプル液フローを、シース液フローへ注入するための蠕動ポンプと、
5． 複合顕微鏡対物レンズが集光および結像する観察ゾーンからの散乱光と蛍光を受光するマルチモード光ファイバと、
6． 光ファイバを介して受光した光をカラーバンドに光学的に分離するための波長分割マルチプレクサ。

一般に、フローサイトメータの観察ゾーンを通過する粒子を照射するための本開示によるLDベースの光学サブシステムは
1． 低速軸がフロー方向に平行に向けられているレーザダイオードと、
2． LDからの発散ビームを、フローに直交する長軸を有するコリメートされた楕円形ビームへ変換するコリメートレンズと、
3． 観察ゾーンにおけるレーザビームを、フローに直交する方向において最適の幅まで縮小する集束レンズシステムと、
4． 最後に、円柱形集束素子の軸がフロー方向に直交する、観察ゾーンに近接して配置された高倍率円柱形集束素子と、
を含む。

高倍率円柱形集束素子は、横方向のビームプロファイルを維持しながら、その低速軸に沿ったLDの遠視野プロファイルを、フロー方向に沿った観察ゾーンにおいてそのフーリエ共役へ転位させ、これによって、観察ゾーンにおけるレーザビームプロファイルはフローサイトメトリ用途に最適となる。

本開示による複合顕微鏡対物レンズは、一般に、
1． 凹面球面鏡と、
2． 透明収差補償板と、
を含み、フローサイトメータの観察ゾーンが、前記鏡と前記板との間に配置されている。観察ゾーン内で粒子から放たれる散乱光と蛍光が鏡によって集光され補償板へ向かって後ろに反射される。鏡により生じる光収差は、光が補償板を通過した後に大幅に低減される。本開示の一態様において、観察ゾーンは、中に粒子担持液が流れる小さな矩形流路を有する矩形ガラスキュベットによって提供されるフローセルの内側に配置される。凹面鏡は、内部反射のための凸面上の高反射コーティングを有する平凸形の、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの光学的に透明な材料から作られる。鏡の平面はキュベットの一つの側面にゲルで結合されるかまたは接合されるかのいずれかである。平面非球面補償板は、平面がキュベットの反対側にゲルで結合されるかまたは接合されている、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの透明材料から作られる。また、平凸形の鏡と非球面補償板はキュベットと一体形成することができる。本開示の更に別の態様において、観察ゾーンはジェット流内にあり、凹面鏡と補償板は共に観察ゾーンから独立しており、鏡は、好ましくは、凹面表面鏡である。

本開示による流体システムは、一般に、液体ポンプがシース液を引く、シース液リザーバを含む。その後、シース液は液体ポンプからT字連結器の入口へ流れる。T字連結器の一つの出口アームはバイパスに連結しており、汲み上げたシース液の一部分をシース液リザーバに戻し、戻されたシース液がシース液リザーバ内の空気中に流れる。T字連結器の第2の出口アームはシース経路に連結しており、シース経路は、リザーバカプセルに続いて、粒子フィルタ、次いでフローセルを含む。次に、フローセルを出たシース液は廃液タンクへ流れる。バイパスに沿った流体抵抗はシース経路に沿った流体抵抗を下回るように設計される。これによって、シース液のうちの少量部分のみがフローセルを通過する。フローサイトメトリ用途における典型的なシース流量が毎分数十ミリリットルであることに留意されたい。よって、このバイパスは、それほど高価でなくより信頼度が高いだけでなく、減衰をより簡単にするより高い脈動周波数で動作する、より高流量の液体ポンプの使用を可能にする。バイパス経路の出口は、空気に連通しているので、これは、シース経路に沿って流れるシース液の脈動を大幅に低減させるための大きな流体コンデンサとしても機能する。動作中、フィルタカートリッジの入口部分は空気で充填される。従って、フィルタカートリッジも、フローセルにおけるシース液の脈動を無視できるレベルまで更に低減させるための、流体コンデンサとして機能する。フローセルにおける大きな流体抵抗によって、フィルタカートリッジの入口近くに閉じ込められた空気が圧縮される。液体ポンプが停止した場合、シース液リザーバに向かって押し戻されたフィルタカートリッジ内の圧縮された空気がリザーバカプセル内に格納される。カプセルの大きさは閉じ込められた空気がT字連結器に到達しないように選択される。

一般に、本開示による蠕動ポンプは、筐体の弓形湾曲トラック内でローラを円形状に動かすロータの外周に配置された複数のローラと、これらのローラがトラックに対して圧縮する圧縮性タブと、を含む。本開示の一態様において、蠕動ポンプの筐体のトラックは、一つの凹みを有し、これによって、ローラの一つが凹みを通過して移動する度に、圧縮性チューブは、完全拡大まで連続的に減圧され、次に完全閉口まで圧縮される。凹みの位置と形状は、凹みからポンプの出口までの圧縮性チューブ内の全液体体積が実質的に不変であるように維持する。ローラがポンプ出口を通過して移動するときのチューブ拡大による影響は、ポンプ出口のすぐ上流の異なる他のローラが凹みの圧縮部分内への移動するときのチューブ圧縮によって補償される。本開示の別の態様において、ポンプ筐体のトラックは、複数の凹みを含み、圧縮性チューブに沿った複数の部分におけるチューブ圧縮を連続的に修正するために、ポンプ出口の上流に複数のローラが提供される。複数の凹みの位置と形状は、これらの部分におけるチューブ圧縮の修正がポンプ出口付近のチューブ拡大による影響を実質的に補償するように設計されている。本開示の更に別の態様において、圧縮性チューブは入口および出口部分を除いたローラの下方で完全に閉口されたままである。可変速モータはポンプを駆動するために使用される。ローラが出口部分に到達すると、モータの回転がプログラマブルに加速されてチューブ拡大を補償する。

本開示による波長分割マルチプレクサ（「WDM」）は、一般に、少なくとも二つの光学素子を含む。第1の光学素子は、ピンホールからまたはマルチモード光ファイバからの光などの、分散光源から受光した光ビームをコリメートする。第1の光学素子は、例えばピンホールまたはマルチモード光ファイバのコアによって規定される、分散光源を、第1の光学素子の有効断面と同様の大きさを有する像に拡大し、これによって、第1の光学素子とその像との間にコリメートされた光ビームを生成する。第2の光学素子は前記像の近くに位置づけられ、第1の光学素子を光路下流へ等倍（unit magnification）で中継する。このように、第2の光学素子はコリメートされた光路長を効果的に2倍にする。同じ1:1の像中継構成における追加の光学素子も本開示に含むことができ、コリメートされた光路を更に伸ばすことができる。本開示のカスケード配列された等倍像中継アーキテクチャは、ビームを大きく拡大せずに、大きく伸ばされたコリメートされた光路長を提供する。結果的に、光通信業界において十分に確立されたWDM技術は、蛍光検出のために容易に適合させることができる。具体的には、光ビーム内に存在する複数のカラーバンドは、光路に沿って配置されたダイクロイックフィルタを用いて分離され、分離された光は低ノイズ半導体光検出器と適合する小スポットへと密に集束される。

WDMの一態様において、第1の光学素子はレンズであり、第2の素子は凹面鏡である。しかしながら、他のタイプの屈折性および／または反射性光学構成要素が同じ設計目標を実現するために使用され得ることも当業者に明らかである。光通信におけるその対応物と同様に、本開示のWDMにおける光路はダイクロイックフィルタを使用して折り畳むことができる。本開示の一態様において、光路はジグザグ構成に折り畳まれる。好ましくは、フローサイトメータの確実な再構成を容易にするために、各ダイクロイックフィルタは、フィルタの反射面に対して光学的に平行な基準面を有する機械的ホルダに接合される。結果的に、全てのWDMフィルタは、共通の光学平面に対してフィルタホルダを基準とすることによって光路に沿って正確に位置づけることができる。

本開示の別の態様において、ダイクロイックフィルタを通過するコリメートされたビームは、二次ダイクロイックフィルタを使用して複数のカラーバンドへ更に分岐される。ダイクロイックフィルタは、本開示の中継結像によって得られる細長いコリメートされたビーム経路に沿ったいずれの場所にも挿入することができ、したがって、例えば、米国特許第6,683,314号に記載の星型構成、米国特許第4,727,020号に記載の分岐構成、および光通信業界で幅広く実施されている他の種類のWDM光学構成などの様々な光学構成を用いて、密に集束されたビームを光検出器へ伝送することができることは当業者に明確である。凹面鏡の代わりに、WDMを曲面ダイクロイックフィルタに置き換えて、WDMによって選択されるカラーバンドの数を更に増やすことができる。

[本発明1001]
以下を含むフローサイトメータ（40）：
（a） 粒子を担持するサンプル液が中を流れるフローサイトメータ（40）の観察ゾーン内へ光ビームを方向付けるためのレーザダイオード（「LD」）ベースの光学サブシステム（50）であって、前記サンプル液が、同じく前記観察ゾーンを通って流れるシース液フローによって前記観察ゾーン内で流体力学的に絞り込まれており、光学サブシステム（50）が、
i． LDの端面から発散光ビームを放つためのLDであって、前記発散光ビームが長軸と短軸との両方を有する楕円形断面プロファイルを有している、LDと、
ii． 前記LDから放たれた発散光ビームをコリメートされた楕円形光ビームへ変換するためのコリメートレンズであって、前記コリメートされた楕円形光ビームの短軸が、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して平行に向けられている、コリメートレンズと、
iii． 前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの大きさを縮小するためのビーム圧縮光学素子であって、これによって、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して垂直に向けられた前記楕円形光ビームの長軸の幅がシース液フローの幅より短くなる、ビーム圧縮光学素子と、
v． 円柱形集束素子の軸が、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して垂直に向けられている、前記観察ゾーンに隣接して位置づけられた円柱形集束素子であって、これによって、
（1） 前記光ビームの短軸が前記観察ゾーンにおいて集束され、かつ
（2） 前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの長軸の大きさが本質的に変化しないままである、
円柱形集束素子と、
を含む、光学サブシステム（50）と、
（b） 前記観察ゾーン内に存在している粒子から散乱された光および前記粒子によって発された蛍光を結像するための複合顕微鏡対物レンズ（60）であって、複合顕微鏡対物レンズ（60）が、
i. 散乱光および蛍光が入射する凹面境と、
ii. 光学的に透明な材料から作られた収差補正板であって、前記収差補正板が、
（1） 前記収差補正板が
A. 最も薄く、かつ
B. 負の光学的パワーを有する、
前記収差補正板の中間ゾーンの外側の前記収差補正板の第1のゾーンと、
（2） 正の光学的パワーを有する、前記中間ゾーンの内側の前記収差補正板の第2のゾーンと、
を有する非球面レンズであり、複合顕微鏡対物レンズ（60）から反射した光が前記収差補正板を通過する、収差補正板と
を含み、フローサイトメータ（40）の前記観察ゾーンが前記凹面鏡と前記収差補正板との間に配置されている、複合顕微鏡対物レンズ（60）と、
（c） 脈動がないシース液フローを前記観察ゾーンに供給するための流体サブシステム（70）であって、
1． リザーバから引いた液体を供給するための液体ポンプと、
ii． 少なくとも一つの入口と二つの出口を有するT字連結器であって、
（1） 前記T字連結器の入口が前記液体ポンプから液体を受け、
（2） 前記入口によって受けられた液体の第1の部分が、前記出口のうちの第1の出口とバイパス導管を介して流れて前記リザーバへ戻り、かつ
（3） 前記入口によって受けられた液体の第2の部分が、前記出口のうちの第2の出口と粒子フィルタを介してフローサイトメータ（40）の前記観察ゾーンへ流れる、
T字連結器と、
を含む、流体サブシステム（70）と、
（d） 粒子を担持するサンプル液を供給するための蠕動ポンプ80であって、前記サンプル液がシース液フローによって前記観察ゾーン内で流体力学的に絞り込まれており、蠕動ポンプ80が、
i． ポンプ入口とポンプ出口との間に延在する弓形湾曲トラックが内部に形成されたポンプ筐体と、
ii． ロータに取り付けられた複数のローラであって、前記ローラが、直接隣接している各ローラ対の間に実質的に等しい角度間隔を有しており、前記ロータが、前記ポンプ筐体の内側で前記ロータに取り付けられた前記ローラと共に回転可能である、複数のローラと、
ii． 前記ローラと前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックとの間に挟まれた圧縮性チューブであって、前記弓形湾曲トラックが、
（1） 出口部分であって、ローラが前記出口部分を通って転動する時、前記ローラに隣接する前記圧縮性チューブが、前記出口部分の始まりでの完全閉口状態から、前記ローラが前記圧縮性チューブとの接触が絶たれる前記ポンプ出口での完全開口状態まで、連続的に拡大する、出口部分と、
（2） 前記ポンプ入口と前記ポンプ出口との間の前記弓形湾曲トラックに沿った少なくとも一つのポンプ部分であって、前記圧縮性チューブが前記ローラのうちの少なくとも一つによって完全閉口状態まで圧縮される、少なくとも一つのポンプ部分と、
を含む、圧縮性チューブと、
を含む、蠕動ポンプ80と、
（e） 最初に前記観察ゾーンから放たれ、波長分割マルチプレクサ90（「WDM（90）」）への伝送のために複合顕微鏡対物レンズ（60）によって光ファイバ内へと結像された光ビームを、複数のカラーバンドに分離するためのWDM（90）であって、
i． コリメート光学素子の有効サイズと実質的に同じ大きさの像を生成するように拡大するコリメート光学素子と、
ii． 前記コリメート光学素子と前記像との間に配置された少なくとも一つのダイクロイックフィルタであって、コリメートされた光ビームを二つの特徴的カラーの枝路に分離する、少なくとも一つのダイクロイックフィルタと、
iii． 前記枝路のうちの一つの枝路内に配置された集束光学素子であって、前記集束光学素子によって前記枝路内の光ビームが1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束される、集束光学素子と、
iv． 他方の枝路内の前記コリメート光学素子によって生成される像の付近に配置された像中継光学素子であって、前記コリメート光学素子の像を実質的に等倍（unit magnification）で生成する、像中継光学素子と、
を含む、WDM（90）。
[本発明1002]
キュベットが矩形形状を有しており、フローサイトメータ（40）の前記観察ゾーンが、前記キュベット内に配置された矩形断面を有する流路内に配置されている、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1003]
キュベットが管状断面を有しており、フローサイトメータ（40）の前記観察ゾーンが、前記キュベット内に配置された円形断面を有する流路内に配置されている、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1004]
前記サンプル液と前記シース液フローが、内部にフローサイトメータ（40）の前記観察ゾーンが配置されたジェット流を形成する、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1005]
前記円柱形集束素子が前記矩形キュベットの入射面とオプティカルコンタクトしている、本発明1002のフローサイトメータ（40）。
[本発明1006]
前記円柱形集束素子が前記矩形キュベットから分離されている、本発明1002のフローサイトメータ（40）。
[本発明1007]
前記円柱形集束素子が前記管状キュベットから分離されている、本発明1003のフローサイトメータ（40）。
[本発明1008]
前記円柱形集束素子が前記ジェット流から分離されている、本発明1004のフローサイトメータ（40）。
[本発明1009]
前記コリメートされた楕円形光ビームが通過する偏光調整素子を更に含む、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1010]
前記観察ゾーンの光学像が複合顕微鏡対物レンズ（60）の外側に形成されている、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1011]
前記観察ゾーンが、光学的に透明な材料から作られた矩形キュベット内に含まれたフロー流路内に配置されている、本発明1010のフローサイトメータ（40）。
[本発明1012]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1011のフローサイトメータ（40）。
[本発明1013]
前記平凹裏面鏡の平面が、前記キュベットの平面に光学的に結合されている、本発明1012のフローサイトメータ（40）。
[本発明1014]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1013のフローサイトメータ（40）。
[本発明1015]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1013のフローサイトメータ（40）。
[本発明1016]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1013のフローサイトメータ（40）。
[本発明1017]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1013のフローサイトメータ（40）。
[本発明1018]
前記平凹裏面鏡が前記キュベット手段と一体形成された、本発明1013のフローサイトメータ（40）。
[本発明1019]
前記収差補正板が平面非球面レンズである、本発明1011のフローサイトメータ（40）。
[本発明1020]
前記収差補正板の平面が、前記平凹裏面鏡の反対側の前記キュベットの平面に光学的に結合されている、本発明1019のフローサイトメータ（40）。
[本発明1021]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1020のフローサイトメータ（40）。
[本発明1022]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1020のフローサイトメータ（40）。
[本発明1023]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1020のフローサイトメータ（40）。
[本発明1024]
前記平面非球面レンズが前記キュベットと一体形成されている、本発明1020のフローサイトメータ（40）。
[本発明1025]
前記収差補正板が前記キュベットから離れている、本発明1019のフローサイトメータ（40）。
[本発明1026]
前記観察ゾーンがジェット流の内側にある、本発明1010のフローサイトメータ（40）。
[本発明1027]
前記凹面鏡が表面鏡である、本発明1025のフローサイトメータ（40）。
[本発明1028]
前記観察ゾーンが平らな透明基板の表面上に配置されている、本発明1010のフローサイトメータ（40）。
[本発明1029]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1028のフローサイトメータ（40）。
[本発明1030]
前記平凹裏面鏡の平面が、前記平らな透明基板に光学的に結合されている、本発明1029のフローサイトメータ（40）。
[本発明1031]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1030のフローサイトメータ（40）。
[本発明1032]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1030のフローサイトメータ（40）。
[本発明1033]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1030のフローサイトメータ（40）。
[本発明1034]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1030のフローサイトメータ（40）。
[本発明1035]
前記平凹裏面鏡が前記平らな透明基板と一体形成されている、本発明1029のフローサイトメータ（40）。
[本発明1036]
前記収差補正板が前記平らな透明基板から離れている、本発明1028のフローサイトメータ（40）。
[本発明1037]
前記粒子フィルタが前記T字連結器から液体を受けるための入口を有しており、前記粒子フィルタの前記入口が、空気が前記入口で前記粒子フィルタ内に閉じ込められるように配置されている、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1038]
前記液体ポンプが停止した時に、空気が前記バイパス導管に入ることができない、本発明1037のフローサイトメータ（40）。
[本発明1039]
前記液体ポンプが停止した時に前記粒子フィルタから排出された空気を格納するために、前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と前記粒子フィルタとの間に配置された小型カプセルを更に含む、本発明1038のフローサイトメータ（40）。
[本発明1040]
前記液体ポンプが停止した時に前記粒子フィルタから排出された空気を格納するために、前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と前記粒子フィルタとの間に配置された、ある長さの管を更に含む、本発明1038のフローサイトメータ（40）。
[本発明1041]
前記T字連結器の前記出口のうちの第1の出口と前記リザーバとの間の液体フローを制限するために、前記第1の出口と前記リザーバとの間の前記バイパス導管内に配置された調整弁を更に含む、本発明1038のフローサイトメータ（40）。
[本発明1042]
前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と前記観察ゾーンとの間の液体フローを制限するために、前記第2の出口と前記観察ゾーンとの間に配置された調整弁を更に含む、本発明1038のフローサイトメータ（40）。
[本発明1043]
前記液体ポンプのスループットが調整可能である、本発明1038のフローサイトメータ（40）。
[本発明1044]
前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックが少なくとも二つのポンプ部分を含み、前記弓形湾曲トラックが、前記弓形湾曲トラックに沿って前記ポンプ部分の間に配置された少なくとも一つの凹み部分を更に含み、前記ローラのうちの一つが前記凹み部分を通って転動する時、前記凹み部分における前記圧縮性チューブが、完全拡大まで減圧され、その後、完全閉口状態まで圧縮される、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1045]
前記ポンプ出口の上流の前記弓形湾曲トラックに沿って複数の凹み部分を含む、フローサイトメータ（40）であって、前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の圧縮部と前記弓形湾曲トラックの前記出口部分との間の角度間隔が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1044のフローサイトメータ（40）。
[本発明1046]
前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の前記圧縮部が、前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完する形状を有し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記凹み部分から前記ポンプ出口まで延在する前記圧縮性チューブの部分の内部の全流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1044のフローサイトメータ（40）。
[本発明1047]
複数のポンプ部分の直接隣接している対の間にそれぞれ散在している複数の凹み部分を有している、本発明1044のフローサイトメータ（40）。
[本発明1048]
（a） 凹み部分の隣接している対の間の角度間隔と、
（b） 前記弓形湾曲トラックの前記出口部分と前記出口部分に隣接する凹み部分との間の角度間隔と、
の両方が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1046のフローサイトメータ（40）。
[本発明1049]
前記弓形湾曲トラックの複数の凹み部分の形状が前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記複数の凹み部分と前記出口部分における前記圧縮性チューブの部分の中の流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1047のフローサイトメータ（40）。
[本発明1050]
前記弓形湾曲トラックの前記出口部分付近の前記圧縮性チューブの圧縮変化による、前記圧縮性チューブにおける流体体積の変化率に実質的に反比例して変動するように、前記ロータの速度がプログラマブルに制御される、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1051]
少なくとも一つの追加のダイクロイックフィルタが前記像中継光学素子と前記像中継光学素子によって生成される像との間に配置され、前記ダイクロイックフィルタが特徴的カラーを有する前記光ビームの二つの枝路を生成する、本発明1001のフローサイトメータ（40）。
[本発明1052]
別の集束光学素子が前記枝路のうちの一つの枝路内に配置され、前記枝路内の前記光ビームを1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束させる、本発明1051のフローサイトメータ（40）。
[本発明1053]
前記像中継光学素子、ダイクロイックフィルタ、および集束光学素子の連続的な組み合わせが、前記光ビームの複数のカラーバンドに対して1.0 mm未満の直径を有する追加の集束されたスポットを生成するようにカスケード配列されている、本発明1052のフローサイトメータ（40）。
[本発明1054]
前記ダイクロイックフィルタがオプティカルコンタクトで共に接合された二つの光学的に平らなガラス板を含むテンプレートを用いて組み立てられ、前記テンプレートを用いて前記ダイクロイックフィルタがフィルタホルダに接合され、それにより、前記ダイクロイックフィルタのコーティングされたフィルタ表面が前記フィルタホルダの基準面に対して引っ込めて設けられ、かつ前記基準面に対して光学的に平行になる、本発明1052のフローサイトメータ（40）。
[本発明1055]
前記フィルタホルダの基準面がWDM（90）内に含まれた基準ブロックの光学的に平らな面に支えられており、それにより、WDM（90）内に前記ダイクロイックフィルタを設置する時に一貫した光学的アライメントが提供される、本発明1054のフローサイトメータ（40）。
[本発明1056]
中に粒子が存在している観察ゾーン内へ光ビームを入射するためのLDベースの光学サブシステム（50）であって、
（a） LDの端面から発散光ビームを放つためのLDであって、前記発散光ビームが長軸と短軸との両方を有する楕円形断面プロファイルを有している、LDと、
（b） 前記LDから放たれた発散光ビームをコリメートされた楕円形光ビームへ変換するためのコリメートレンズであって、前記コリメートされた楕円形光ビームの短軸が、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して平行に向けられている、コリメートレンズと、
（c） 前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの大きさを縮小するためのビーム圧縮光学素子であって、これによって、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して垂直に向けられた前記楕円形光ビームの長軸の幅がシース液フローの幅より短くなる、ビーム圧縮光学素子と、
（d） 円柱形集束素子の軸が、前記観察ゾーンを粒子が通過する方向に対して垂直に向けられている、前記観察ゾーンに隣接して位置づけられた円柱形集束素子であって、これによって、
i． 前記光ビームの短軸が前記観察ゾーンにおいて集束され、かつ
ii． 前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの長軸の大きさが本質的に変化しないままである、
円柱形集束素子と、
を含む、光学サブシステム（50）。
[本発明1057]
矩形断面を有するキュベットを更に含む、光学サブシステム（50）であって、前記観察ゾーンが、前記キュベット内に配置された矩形断面を有する流路内に配置されている、本発明1056の光学サブシステム（50）。
[本発明1058]
管状断面を有するキュベットを更に含む、光学サブシステム（50）であって、前記観察ゾーンが、前記キュベット内に配置された円形断面を有する流路内に配置されている、本発明1056の光学サブシステム（50）。
[本発明1059]
サンプル液とシース液フローが、内部に前記観察ゾーンが配置されたジェット流を形成する、本発明1056の光学サブシステム（50）。
[本発明1060]
前記円柱形集束素子が前記矩形キュベットの入射面とオプティカルコンタクトしている、本発明1057の光学サブシステム（50）。
[本発明1061]
前記円柱形集束素子が前記矩形キュベットから分離されている、本発明1057の光学サブシステム（50）。
[本発明1062]
前記円柱形集束素子が前記管状キュベットから分離されている、本発明1058の光学サブシステム（50）。
[本発明1063]
前記円柱形集束素子が前記ジェット流から分離されている、本発明1059の光学サブシステム（50）。
[本発明1064]
前記コリメートされた楕円形光ビームが通過する偏光調整素子を更に含む、本発明1056の光学サブシステム（50）。
[本発明1065]
LDベースの光学サブシステム（50）を用いて楕円形光ビームを伝送するための方法であって、前記光ビームが、中をサンプル液が流れる観察ゾーンに配置された前記光ビームの短軸の焦点において滑らかなプロファイルを有しており、前記サンプル液が、同じく前記観察ゾーンを通って流れるシース液フローによって前記観察ゾーン内で流体力学的に絞り込まれており、前記方法が、
（a） LDの端面から発散光ビームを放つLDを提供する工程であって、前記発散光ビームが長軸と短軸との両方を有する楕円形断面プロファイルを有している、工程と、
（b） 前記LDによって放たれた発散光ビームを、前記LDから放たれた発散光ビームをコリメートされた楕円形光ビームへ変換するためのコリメートレンズへ入射させる工程であって、前記コリメートされた楕円形光ビームの短軸が、サンプル液が前記観察ゾーンを通過する方向に対して平行に向けられている、工程と、
（c） 前記コリメートレンズを通過した後、前記コリメートされた楕円形光ビームを、前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの大きさを縮小するためのビーム圧縮光学素子へ入射させる工程であって、これによって、サンプル液が前記観察ゾーンを通過する方向に対して垂直に向けられた前記楕円形光ビームの長軸の幅が前記シース液フローの幅より短くなる、工程と、
（d） 前記ビーム圧縮光学素子を通過した後、前記光ビームを、前記観察ゾーンに隣接して位置づけられた円柱形集束素子へ入射させる工程であって、前記円柱形集束素子の軸が、サンプル液が前記観察ゾーンを通過する方向に対して垂直に向けられており、これによって、
i． 前記光ビームの短軸が前記観察ゾーンにおいて集束され、かつ
ii． 前記観察ゾーンにおける前記楕円形光ビームの長軸の大きさが本質的に変化しないままである、
工程と、
を含む、方法。
[本発明1066]
前記観察ゾーンが、キュベット内に配置された矩形断面を有する流路内に配置されている、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記観察ゾーンが、キュベット内に配置された円形断面を有する流路内に配置されている、本発明1065の方法。
[本発明1068]
前記観察ゾーンが、ジェット流内に配置されている、本発明1065の方法。
[本発明1069]
前記円柱形集束素子と前記キュベットの入射面との間にオプティカルコンタクトを確立する工程を更に含む、本発明1066の方法。
[本発明1070]
前記円柱形集束素子と前記キュベットとの間に間隔を確立する工程を更に含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
前記円柱形集束素子と前記キュベットとの間に間隔を確立する工程を更に含む、本発明1067の方法。
[本発明1072]
前記円柱形集束素子と前記ジェット流との間に間隔を確立する工程を更に含む、本発明1068の方法。
[本発明1073]
前記コリメートレンズと前記ビーム圧縮光学素子との間に偏光調整素子を挿入して、これによって、前記コリメートされた楕円形光ビームが前記偏光調整素子を通過する工程を更に含む、本発明1065の方法。
[本発明1074]
観察ゾーン内に存在している粒子から散乱された光および前記粒子によって発された蛍光を結像するために適合された複合顕微鏡対物レンズ（60）であって、複合顕微鏡対物レンズ（60）が、
（a） 散乱光および蛍光が入射する凹面鏡と、
（b） 光学的に透明な材料から作られた収差補正板であって、前記収差補正板が、
i． 前記収差補正板が、
（1） 最も薄く、かつ
（2） 負の光学的パワーを有する、
前記収差補正板の中間ゾーンの外側の前記収差補正板の第1のゾーンと、
ii． 正の光学的パワーを有する、前記中間ゾーンの内側の前記収差補正板の第2のゾーンと、
を有する非球面レンズであり、複合顕微鏡対物レンズ（60）から反射した光が前記収差補正板を通過する、収差補正板と、
を含み、前記観察ゾーンが前記凹面鏡と前記収差補正板との間に配置されている、複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1075]
前記観察ゾーンの光学像が複合顕微鏡対物レンズ（60）の外側に形成されている、本発明1074の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1076]
前記観察ゾーンが、光学的に透明な材料から作られた矩形キュベット内に含まれたフロー流路内に配置されている、本発明1075の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1077]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1076の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1078]
前記平凹裏面鏡の平面が、前記キュベットの平面に光学的に結合されている、本発明1077の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1079]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1078の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1080]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1078の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1081]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1078の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1082]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1078の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1083]
前記平凹裏面鏡が前記キュベット手段と一体形成された、本発明1078の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1084]
前記収差補正板が平面非球面レンズである、本発明1076の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1085]
前記収差補正板の平面が、前記平凹裏面鏡の反対側の前記キュベットの平面に光学的に結合されている、本発明1084の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1086]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1085の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1087]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1085の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1088]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1085の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1089]
前記平面非球面レンズが前記キュベットと一体形成されている、本発明1085の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1090]
前記収差補正板が前記キュベットから離れている、本発明1084の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1091]
前記観察ゾーンがジェット流の内側にある、本発明1075の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1092]
前記凹面鏡が表面鏡である、本発明1090の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1093]
前記観察ゾーンが平らな透明基板の表面上に配置されている、本発明1075の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1094]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1093の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1095]
前記平凹裏面鏡の平面が、前記平らな透明基板に光学的に結合されている、本発明1094の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1096]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1095の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1097]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1095の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1098]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1095の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1099]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1095の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1100]
前記平凹裏面鏡が前記平らな透明基板と一体形成されている、本発明1094の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1101]
前記収差補正板が前記平らな透明基板から離れている、本発明1093の複合顕微鏡対物レンズ（60）。
[本発明1102]
以下を含む顕微鏡対物レンズデバイスを用いて微視的種を特徴付けるための方法：
（a） 凹面鏡と、
（b） 光学的に透明な材料から作られた収差補正板であって、前記板手段の厚さが最も薄く、負の光学的パワーを有する、中間ゾーンの外側の前記板手段のゾーンと、正の光学的パワーを有する、前記中間ゾーンの内側のゾーンとを有する非球面レンズである、収差補正板と、
（c） 前記凹面鏡と前記収差補正板との間に配置された観察ゾーン。
[本発明1103]
前記観察ゾーンの光学像が前記デバイスの外側に形成されている、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記観察ゾーンが、光学的に透明な材料から作られた矩形キュベット手段内に含まれたフロー流路内に配置されている、本発明1103の方法。
[本発明1105]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記平凹裏面鏡手段の平面が、前記キュベット手段の平面に光学的に結合されている、本発明1105の方法。
[本発明1107]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1106の方法。
[本発明1108]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1106の方法。
[本発明1109]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1106の方法。
[本発明1110]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1106の方法。
[本発明1111]
前記平凹裏面鏡が前記キュベットと一体形成されている、本発明1106の方法。
[本発明1112]
前記収差補正板が平面非球面レンズである、本発明1104の方法。
[本発明1113]
前記収差補正板の平面が、前記凹面鏡の反対側の前記キュベット手段の平面に光学的に結合されている、本発明1112の方法。
[本発明1114]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1113の方法。
[本発明1115]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1113の方法。
[本発明1116]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1113の方法。
[本発明1117]
前記平面非球面レンズが前記キュベットと一体形成されている、本発明1113の方法。
[本発明1118]
前記収差補正板が前記キュベットから離れている、本発明1112の方法。
[本発明1119]
前記観察ゾーンがジェット流の内側にある、本発明1102の方法。
[本発明1120]
前記凹面鏡が表面鏡である、本発明1119の方法。
[本発明1121]
前記観察ゾーンが平らな透明基板の表面上に配置されている、本発明1102の方法。
[本発明1122]
前記凹面鏡が、光学的に透明な材料から作られた平凹裏面鏡である、本発明1121の方法。
[本発明1123]
前記平凹裏面鏡手段の平面が、前記平らな透明基板に光学的に結合されている、本発明1122の方法。
[本発明1124]
光学接着材料が前記光学的な結合を実現する、本発明1123の方法。
[本発明1125]
屈折率整合ゲルが前記光学的な結合を実現する、本発明1123の方法。
[本発明1126]
屈折率整合流体が前記光学的な結合を実現する、本発明1123の方法。
[本発明1127]
オプティカルコンタクト接合が前記光学的な結合を実現する、本発明1123の方法。
[本発明1128]
前記平凹裏面鏡が前記平らな透明基板と一体形成されている、本発明1122の方法。
[本発明1129]
前記収差補正板が前記平らな透明基板から離れている、本発明1128の方法。
[本発明1130]
脈動のない液体フローを流体サブシステム（70）の出口に供給するための流体サブシステム（70）であって、
（a） リザーバから引いた液体を供給するための液体ポンプと、
（b） 少なくとも一つの入口と二つの出口を有するT字連結器であって、
i． 前記T字連結器の前記入口が前記液体ポンプから液体を受け、
ii． 前記入口によって受けられた液体の第1の部分が、前記出口のうちの第1の出口とバイパス導管を介して流れて前記リザーバへ戻り、かつ
iii． 前記入口によって受けられた液体の第2の部分が、前記出口のうちの第2の出口と粒子フィルタを介して流体サブシステム（70）の前記出口へ流れる、
T字連結器と、
を含む、流体サブシステム（70）。
[本発明1131]
前記粒子フィルタが前記T字連結器から液体を受けるための入口を有しており、前記粒子フィルタの前記入口が、空気が前記入口で前記粒子フィルタ内に閉じ込められるように配置されている、本発明1130の流体サブシステム（70）。
[本発明1132]
前記液体ポンプが停止した時に、空気が前記バイパス導管に入ることができない、本発明1131の流体サブシステム（70）。
[本発明1133]
前記液体ポンプが停止した時に前記粒子フィルタから排出された空気を格納するために、前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と前記粒子フィルタとの間に配置された小型カプセルを更に含む、本発明1132の流体サブシステム（70）。
[本発明1134]
前記液体ポンプが停止した時に前記粒子フィルタから排出された空気を格納するために、前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と前記粒子フィルタとの間に配置された、ある長さの管を更に含む、本発明1132の流体サブシステム（70）。
[本発明1135]
前記T字連結器の前記出口のうちの第1の出口と前記リザーバとの間の液体フローを制限するために、前記第1の出口と前記リザーバとの間の前記バイパス導管内に配置された調整弁を更に含む、本発明1132の流体サブシステム（70）。
[本発明1136]
前記T字連結器の前記出口のうちの第2の出口と流体サブシステム（70）の前記出口との間の液体フローを制限するために、前記第2の出口と流体サブシステム（70）の前記出口との間に配置された調整弁を更に含む、本発明1132の流体サブシステム（70）。
[本発明1137]
前記液体ポンプのスループットが調整可能である、本発明1132の流体サブシステム（70）。
[本発明1138]
脈動のない液体フローを流体サブシステム（70）の出口に供給するための方法であって、
（a） リザーバから引いた液体を供給するための液体ポンプと、
（b） 少なくとも一つの入口と二つの出口を有するT字連結器であって、
i． 前記T字連結器の前記入口が前記液体ポンプから液体を受け、
ii． 前記入口によって受けられた液体の第1の部分が、前記出口のうちの第1の出口とバイパス導管を介して流れて前記リザーバへ戻り、かつ
iii． 前記入口によって受けられた液体の第2の部分が、前記出口のうちの第2の出口と粒子フィルタを介して流体サブシステム（70）の前記出口へ流れる、
T字連結器と、
を含む、方法。
[本発明1139]
正常動作中、ある量の空気が前記フィルタカートリッジ手段の入口部付近に閉じ込められる、本発明1138の方法。
[本発明1140]
前記ポンプ手段が停止した時に前記T字形手段と前記リザーバ手段との間の管の一部が液体でまだ充填されているように、前記リザーバ手段が十分な量の液体を保持して、前記閉じ込められた空気が前記バイパス手段内へ漏れるのを防止する、本発明1139の方法。
[本発明1141]
前記リザーバ手段がカプセルである、本発明1140の方法。
[本発明1142]
前記リザーバ手段が管の一部分である、本発明1140の方法。
[本発明1143]
調整可能なフロー制限器手段が前記バイパス経路内に配置されている、本発明1140の方法。
[本発明1144]
調整可能なフロー制限器手段がシース経路内に配置されている、本発明1140の方法。
[本発明1145]
前記シースポンプのスループットが調整可能である、本発明1140の方法。
[本発明1146]
（a） ポンプ入口とポンプ出口との間に延在する弓形湾曲トラックが内部に形成されたポンプ筐体と、
（b） ロータに取り付けられた複数のローラであって、前記ローラが、直接隣接している各ローラ対の間に実質的に等しい角度間隔を有しており、前記ロータが、前記ポンプ筐体の内側で前記ロータに取り付けられた前記ローラと共に回転可能である、複数のローラと、
（c） 前記ローラと前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックとの間に挟まれた圧縮性チューブであって、前記弓形湾曲トラックが、
i． 出口部分であって、ローラが前記出口部分を通って転動する時、前記ローラに隣接する前記圧縮性チューブが、前記出口部分の始まりでの完全閉口状態から、前記ローラが前記圧縮性チューブとの接触が絶たれる前記ポンプ出口での完全開口状態まで、連続的に拡大する、出口部分と、
ii． 前記ポンプ入口と前記ポンプ出口との間の前記弓形湾曲トラックに沿った少なくとも一つのポンプ部分であって、前記圧縮性チューブが前記ローラのうちの少なくとも一つによって完全閉口状態まで圧縮される、少なくとも一つのポンプ部分と、
を含む、圧縮性チューブと、
を含む、蠕動ポンプ80。
[本発明1147]
前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックが少なくとも二つのポンプ部分を含み、前記弓形湾曲トラックが、前記弓形湾曲トラックに沿って前記ポンプ部分の間に配置された少なくとも一つの凹み部分を更に含み、前記ローラのうちの一つが前記凹み部分を通って転動する時、前記凹み部分における前記圧縮性チューブが、完全拡大まで減圧され、その後、完全閉口状態まで圧縮される、本発明1146の蠕動ポンプ80。
[本発明1148]
前記ポンプ出口の上流の前記弓形湾曲トラックに沿って複数の凹み部分を含む、蠕動ポンプ80であって、前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の圧縮部と前記弓形湾曲トラックの前記出口部分との間の角度間隔が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1147の蠕動ポンプ80。
[本発明1149]
前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の前記圧縮部が、前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完する形状を有し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記凹み部分から前記ポンプ出口まで延在する前記圧縮性チューブの部分の内部の全流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1147の蠕動ポンプ80。
[本発明1150]
複数のポンプ部分の直接隣接している対の間にそれぞれ散在している複数の凹み部分を有している、本発明1147の蠕動ポンプ80。
[本発明1151]
（a） 凹み部分の隣接している対の間の角度間隔と、
（b） 前記弓形湾曲トラックの前記出口部分と前記出口部分に隣接する凹み部分との間の角度間隔と、
の両方が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1149の蠕動ポンプ80。
[本発明1152]
前記弓形湾曲トラックの複数の凹み部分の形状が前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記複数の凹み部分と前記出口部分における前記圧縮性チューブの部分の中の流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1150の蠕動ポンプ80。
[本発明1153]
前記弓形湾曲トラックの前記出口部分付近の前記圧縮性チューブの圧縮変化による、前記圧縮性チューブにおける流体体積の変化率に実質的に反比例して変動するように、前記ロータの速度がプログラマブルに制御される、本発明1146の蠕動ポンプ80。
[本発明1154]
以下を含む蠕動ポンプ80を用いて液体を送達するための方法：
（a） 弓形湾曲トラックを有するポンプ筐体と、
（b） 前記ポンプ筐体の内側で回転可能なロータ手段に取り付けられた複数のローラと、
（c） 実質的に等しい角度間隔で互いから離間されている前記複数のローラと、
（d） 前記ローラと前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックとの間に挟まれた圧縮性チューブと、
（e） 出口部分を含む前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックであって、前記ローラのうちの一つが前記ポンプ出口において前記圧縮性チューブから離れて転動する時、前記圧縮性チューブが完全拡大まで連続的に減圧される、前記弓形湾曲トラックと、
（f） ポンプ入口とポンプ出口との間の前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックに沿った少なくとも一つのポンプ部分であって、前記圧縮性チューブが前記ローラのうちの一つによって完全閉口まで圧縮される、少なくとも一つのポンプ部分。
[本発明1155]
前記ポンプ筐体の前記弓形湾曲トラックが少なくとも二つのポンプ部分を含み、前記弓形湾曲トラックが、前記弓形湾曲トラックに沿って前記ポンプ部分の間に配置された少なくとも一つの凹み部分を更に含み、前記ローラのうちの一つが前記凹み部分を通って転動する時、前記凹み部分における前記圧縮性チューブが、完全拡大まで減圧され、その後、完全閉口状態まで圧縮される、本発明1154の方法。
[本発明1156]
蠕動ポンプ80が、前記ポンプ出口の上流の前記弓形湾曲トラックに沿って複数の凹み部分を含み、前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の圧縮部と前記弓形湾曲トラックの前記出口部分との間の角度間隔が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1155の方法。
[本発明1157]
前記ポンプ出口に隣接する前記凹み部分の前記圧縮部が、前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完する形状を有し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記凹み部分から前記ポンプ出口まで延在する前記圧縮性チューブの部分の内側の全流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1155の方法。
[本発明1158]
複数のポンプ部分の直接隣接している対の間にそれぞれ散在している複数の凹み部分を有している、本発明1155の方法。
[本発明1159]
（a） 凹み部分の隣接している対の間の角度間隔と、
（b） 前記弓形湾曲トラックの前記出口部分と前記出口部分に隣接する凹み部分との間の角度間隔と、
の両方が、直接隣接している各ローラ対の間の前記角度間隔と実質的に同じである、本発明1157の方法。
[本発明1160]
前記弓形湾曲トラックの複数の凹み部分の形状が前記弓形湾曲トラックの前記出口部分の形状を補完し、前記ローラのうちの一つが前記弓形湾曲トラックの前記出口部分から離れて連続的に転動する時に、前記複数の凹み部分と前記出口部分における前記圧縮性チューブの部分の中の流体体積が、実質的に不変であるように維持される、本発明1158の方法。
[本発明1161]
前記弓形湾曲トラックの前記出口部分付近の前記圧縮性チューブの圧縮変化による、前記圧縮性チューブにおける流体体積の変化率に実質的に反比例して変動するように、蠕動ポンプ80の前記ロータの速度がプログラマブルに制御される、本発明1154の方法。
[本発明1162]
放たれた光ビームを複数のカラーバンドに分離するためのWDM（90）であって、
（a） コリメート光学素子の有効サイズと実質的に同じ大きさの像を生成するように拡大するコリメート光学素子と、
（b） 前記コリメート光学素子と前記像との間に配置された少なくとも一つのダイクロイックフィルタであって、コリメートされた光ビームを二つの特徴的カラーの枝路に分離する、少なくとも一つのダイクロイックフィルタと、
（c） 前記枝路のうちの一つの枝路内に配置された集束光学素子であって、前記集束光学素子によって前記枝路内の前記光ビームが1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束される、集束光学素子と、
（d） 他方の枝路内の前記コリメート光学素子によって生成される像の付近に配置された像中継光学素子であって、前記コリメート光学素子の像を実質的に等倍で生成する、像中継光学素子と、
を含む、WDM（90）。
[本発明1163]
少なくとも一つの追加のダイクロイックフィルタが前記像中継光学素子と前記像中継光学素子によって生成される像との間に配置され、前記ダイクロイックフィルタが特徴的カラーを有する前記光ビームの二つの枝路を生成する、本発明1162のWDM（90）。
[本発明1164]
別の集束光学素子が前記枝路のうちの一つの枝路内に配置され、前記枝路内の前記光ビームを1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束させる、本発明1163のWDM（90）。
[本発明1165]
前記像中継光学素子、ダイクロイックフィルタ、および集束光学素子の連続的な組み合わせが、前記光ビームの複数のカラーバンドに対して1.0 mm未満の直径を有する追加の集束されたスポットを生成するようにカスケード配列されている、本発明1164のWDM（90）。
[本発明1166]
前記ダイクロイックフィルタがオプティカルコンタクトで共に接合された二つの光学的に平らなガラス板を含むテンプレートを用いて組み立てられ、前記テンプレートを用いて前記ダイクロイックフィルタがフィルタホルダに接合され、それにより、前記ダイクロイックフィルタのコーティングされたフィルタ表面が前記フィルタホルダの基準面に対して引っ込めて設けられ、かつ前記基準面に対して光学的に平行になる、本発明1164のWDM（90）。
[本発明1167]
前記フィルタホルダの前記基準面がWDM（90）内に含まれた基準ブロックの光学的に平らな面に支えられており、それにより、WDM（90）内に前記ダイクロイックフィルタを設置する時に一貫した光学的アライメントが提供される、本発明1166のWDM（90）。
[本発明1168]
以下を含むWDM（90）を用いて、放たれた光ビームをカラーバンドに分離するための方法：
（a） コリメート光学素子の有効サイズと実質的に同じ大きさの像を生成するように拡大するコリメート光学素子と、
（b） 前記コリメート光学素子と前記像との間に配置された少なくとも一つのダイクロイックフィルタであって、前記コリメートされた光ビームを二つの特徴的カラーの枝路に分離する、少なくとも一つのダイクロイックフィルタと、
（c） 前記枝路のうちの一つの枝路内に配置された集束光学素子であって、前記集束光学素子によって前記枝路内の前記光ビームが1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束される、集束光学素子と、
（d） 他方の枝路内の前記コリメート光学素子によって生成される像の付近に配置された像中継光学素子であって、前記コリメート光学素子の像を実質的に等倍で生成する、像中継光学素子。
[本発明1169]
少なくとも一つの追加のダイクロイックフィルタが前記像中継光学素子と前記像中継光学素子によって生成される像との間に配置され、前記ダイクロイックフィルタが特徴的カラーを有する前記光ビームの二つの枝路を生成する、本発明1168の方法。
[本発明1170]
別の集束光学素子が前記枝路のうちの一つの枝路内に配置され、前記枝路内の前記光ビームを1.0 mm未満の直径を有するスポットに集束させる、本発明1169の方法。
[本発明1171]
前記像中継光学素子、ダイクロイックフィルタ、および集束光学素子の連続的な組み合わせが、前記光ビームの複数のカラーバンドに対して1.0 mm未満の直径を有する追加の集束されたスポットを生成するようにカスケード配列されている、本発明1170の方法。
[本発明1172]
前記ダイクロイックフィルタがオプティカルコンタクトで共に接合された二つの光学的に平らなガラス板を含むテンプレートを用いて組み立てられ、前記テンプレートを用いて前記ダイクロイックフィルタがフィルタホルダに接合され、それにより、前記ダイクロイックフィルタのコーティングされたフィルタ表面が前記フィルタホルダの基準面に対して引っ込めて設けられ、かつ前記基準面に対して光学的に平行になる、本発明1170の方法。
[本発明1173]
前記フィルタホルダの前記基準面がWDM（90）内に含まれた基準ブロックの光学的に平らな面に支えられており、それにより、WDM（90）内に前記ダイクロイックフィルタを設置する時に一貫した光学的アライメントが提供される、本発明1172の方法。
これらの特徴および他の特徴、目的、ならびに利点は、様々な図面および本開示の好ましい態様の以下の詳細な説明によって、当業者により明確に理解されよう。

（a）LDベースの光学イルミネーションサブシステムと、（b）LDベースの光学イルミネーションサブシステムから放たれた光が入射する複合顕微鏡対物レンズであって、そのキュベットの内側に配置された粒子イルミネーション観察ゾーンを有する流体通過流路が中に形成されている、複合顕微鏡対物レンズと、（c）複合顕微鏡対物レンズ中に形成された流体通過流路へ脈動のないシース液フローを供給するための流体システムと、（d）分析される細胞または粒子を担持する脈動のないサンプル液フローを、流体システムによって供給されたシース液フロー内へ導入するための蠕動ポンプと、（e）光ビームをいくつかの異なるカラーバンドに分離するためのジグザグ構成を有する波長分割マルチプレクサ（「WDM」）であって、細胞または粒子が複合顕微鏡対物レンズの流体通過流路を通過し、その内部でLDベースの光学イルミネーションサブシステムから放たれた光によって照射されたときに、細胞または粒子から散乱された光を、光ファイバを介して受光するWDMと、を含む本開示によるフローサイトメータの好ましい態様を概略的に示す図である。 典型的な高出力端面発光LDを概略的に示す図であって、LDから放たれる光の高速軸と低速軸を示す図である。 図2に示したLDチップから放たれるレーザビームについての典型的な遠視野プロファイルを示す。 フローサイトメトリ機器のための従来の先行技術のLDベースの光イルミネーションサブシステムをシステムのフローセルとともに3次元で示す図である。 システムのフローセル内の焦点における図3Aに示したレーザビームを通過する細胞または粒子から散乱する光の典型的な時間依存プロファイルを示す図である。 フローサイトメータシステムの観察ゾーン内の焦点におけるビームプロファイルを改良する他の先行技術のLDベース光学イルミネーションサブシステム構成の、流体通過流路を通って流れる液体を横切る立面図である。 図4Aに示した他の先行技術のLDベース光学イルミネーションサブシステムの流体通過流路を通って流れる液体に沿った平面図である。 図5Aは、図1に示した複合顕微鏡対物レンズの流体通過流路を通って流れる液体を横断する立面図であって、LDの低速軸が液体フローに対して横方向に向けられている。図5Bは、図1に示した複合顕微鏡対物レンズの流体通過流路を通って流れる液体に沿った平面図であって、LDの低速軸が液体フローに対して横方向に向けられている。図5Cは、図1に示した複合顕微鏡対物レンズの流体通流路を通過する細胞または粒子から散乱される光の典型的な時間依存プロファイルを示す。 液体のジェット流が観察ゾーンを通過するフローサイトメータシステムにおいて使用するために適合された本開示によるLDベースの光学イルミネーションサブシステムの他の態様の斜視図である。 観察ゾーンを通過する液体のジェット流をより詳細に示すLDベースの光学イルミネーションサブシステムの他の態様の拡大斜視図である。 図1に示した複合顕微鏡対物レンズの流体通過流路を通って流れる液体の方向に対して平行にLDの低速軸が向けられるフローサイトメータシステムに使用するために適合された本開示によるLDベースの光学イルミネーションサブシステムの他の態様の斜視図である。 図1に示したフローサイトメータシステムに使用するために適合された本開示による複合顕微鏡対物レンズを示す斜視図であって、複合顕微鏡対物レンズは、中に流体通過流路が形成されており、そのキュベットの内側に粒子イルミネーション観察ゾーンが配置されている。 図8のライン9A-9Aに沿った複合顕微鏡対物レンズの立面断面図であって、散乱光および蛍光の伝搬を示す、観察ゾーン内の三つの空間的に分離された位置から対物レンズの像平面までのレイトレースを含む図である。 図9Aに示した三つの空間的に分離された光放出位置に対する図9Aに示した像平面付近のスポットの図である。 本開示による他の態様の複合顕微鏡対物レンズについての図9Aと同様の断面立面図であって、散乱光および蛍光の伝搬を示す、観察ゾーン内の三つの空間的に分離された位置から対物レンズの像平面までのレイトレースを含む図である。 図1に示したフローサイトメータシステムに使用するために適合された本開示による更に別の代替的な態様の複合顕微鏡対物レンズの斜視図であって、代替的な態様の複合顕微鏡対物レンズは、中に流体通過流路が形成されており、そのキュベットの内側に粒子イルミネーション観察ゾーンが配置されている。 図1に示したフローサイトメータシステムに使用するために適合された本開示による更に別の代替的な態様の複合顕微鏡対物レンズの斜視図であって、代替的な態様の複合顕微鏡対物レンズは、図6および図6Aに示されたジェット流の内側に配置されている観察ゾーンために適合されている。 使用のために適合された本開示による更に別の代替的な態様の複合顕微鏡対物レンズの斜視図であって、観察ゾーンが顕微鏡スライドの表面上に配置されている。 フローサイトメータフローセルへ安定したシース液フローを供給するための本開示による流体サブシステムを概略的に示す図であって、流体サブシステムは、1．シース液ポンプとフローセルとの間に配置された小型カプセルと、2．小型カプセルとフローセルとの間に配置された粒子フィルタと、を含み、粒子フィルタと小型カプセルはともにポンプ脈動を減衰させるための空気リザーバを提供する。 空気リザーバを提供するために小型カプセルをある長さの管に置き換えた、図14に示されたものと同様の代替的な態様の流体サブシステムを概略的に示す図である。 粒子フィルタの入口部分が内部に閉じ込められた空気を有するとき（図16A）とシース液ポンプとフローセルとの間の流体サブシステム内に空気がないとき（図16B）のフローセルにおいて測定された粒子飛行時間を比較するヒストグラムである。 本開示による3ローラ蠕動ポンプの斜視図であって、ポンプのローラ、チューブおよび周囲のポンプ筐体を示す図である。 ローラが異なる位置にある、図17に示した3ローラ蠕動ポンプのいくつかの状態を簡単に示した図である。 ポンプのローラによって部分的に圧縮されている蠕動ポンプのチューブを詳細に示す縦断面図である。 図19Aおよび図19Bは、図19のライン19Aおよび19Bに沿って切断した蠕動ポンプのチューブの長さ方向に直交する、ローラによるチューブの部分的な圧縮を詳細に示す断面図である。 蠕動ポンプによって生じる脈動がないことを示しているポンプの円座標に沿って視たときのポンプのローラとチューブを概略的に示す図である。 1．ポンプの出口半分内の全液体体積、および2．ポンプのa．凹み部分と、b．出口部分と、における液体体積の、ローラが圧縮性チューブの出口部分から離れて転動するときのローラの位置に対する関数関係を示すグラフである。 本開示による4ローラ蠕動ポンプを簡略的に示す平面図である。 本開示による6ローラ蠕動ポンプを簡略的に示す平面図である。 図24Aは、本開示による、プログラマブルな速度を有するロータを有する、脈動を最小限にする3ローラ蠕動ポンプのためのローラと圧縮性チューブを示す縦断面図である。図24Bは、本開示による、プログラマブルな速度を有するロータを有する、脈動を最小限にする3ローラ蠕動ポンプを示す簡略的な平面図である。図24Cは、本開示による、プログラマブルなロータ速度を有する、図24Bに示した脈動を最小限にする蠕動ポンプを示すグラフである:1．ローラ位置に対する負の体積変化率、2．ロータ速度、および3．ポンプ流量。 本開示によるジグザグ構成を使用する例示的な6ポート波長分割マルチプレクサ（「WDM」）の光学レイトレーシングを示す図である。 分散光源をコリメートする際の装置の制約を示す先行技術のコリメート装置のレイトレーシングを示す図である。 本開示によるジグザグ構成と分岐構成の組み合わせを用いた6ポートWDMの一態様の斜視図である。 本開示による凹面ダイクロイックフィルタを有するWDMの別の態様の斜視図である。 図29Aおよび29Bは、本開示による再構成可能なWDMのための交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリを構築するための組み立てプロセスを示す斜視図である。図29Cは、図29Aおよび29Bに従って構築された交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリの斜視図である。 本開示によるWDMの斜視図であって、図29Cに示した交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリのWDM内への設置とその取り出しを示す図である。

開示内容の実施のための最良の形態
フローサイトメータ
図1は一般参照符号40によって特定される本開示によるフローサイトメータを示している。フローサイトメータ40は、
1． LDベースの光学サブシステム50と、
2． 複合顕微鏡対物レンズ60と、
3． シース液フローを供給するための流体サブシステム70と、
4． 流体サブシステム70によって供給されるシース液フロー内へ、分析される粒子を含むサンプル液フローを注入するための蠕動ポンプ80であって、シース液フローによって流体力学的に絞り込まれたサンプル液フローは観察ゾーンを通過し、複合顕微鏡対物レンズ60は観察ゾーンにおいて粒子によって散乱される光および／または該粒子によって発される蛍光を集光し結像する、蠕動ポンプ80と、
5． 複合顕微鏡対物レンズ60が集光し結像する、観察ゾーン内の粒子によって散乱される光および／または該粒子によって発される蛍光を受光する光ファイバ852と、
6． 光ファイバ852から受光した散乱光および／または蛍光を光学的に処理するための波長分割マルチプレクサ90（「WDM90」）と、
を含む。

光学サブシステム50
光学サブシステム50は、図2により詳細に示すように、LDの端面から発散光ビームを放つLD501を含む。図2および図2Aにより視覚的に示すように、発散光ビームが長軸、別称高速軸と、短軸、別称低速軸と、の両方を有する楕円形断面プロファイルを有している。LD501から放たれる発散光ビームはコリメートレンズ502に入射し、コリメートレンズ502はLD501によって放たれた発散光ビームを、楕円形断面を有するコリメータされた光ビームへ変換する。必ずしも必須ではないが、光学サブシステム50は、複合顕微鏡対物レンズ60へ向けてコリメートされた楕円形の光ビームを方向付けるために位置づけられた任意の鏡503を含む。複合顕微鏡対物レンズ60の近くに位置づけられた平凸レンズ504はサンプル液とこれを取り囲むシース液が複合顕微鏡対物レンズ60内の観察ゾーンを通って流れる方向に対して垂直に向けられている、楕円形光ビームの長軸を縮小する。観察ゾーンにおいて、楕円形光ビームの幅は
1． サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に対して垂直な幅は、好ましくは、シース液フローの幅よりわずかに短く、一方、
2． サンプル液フロー内の粒子がビーム最大強度で楕円形光ビームのほぼ平らな部分を通過するようになお十分に幅広である。

本開示によれば、平凸レンズ504は、色消しレンズ、または球面レンズ、円柱レンズおよび／もしくはプリズムペアの組み合わせなどの他の種類の光学素子に置き換えることができることは当業者に明らかである。あるいは、鏡503とレンズ504も凹面鏡に置き換えることができる。フローサイトメータ40の偏光感度の高い用途の場合、半波長板などの任意の偏光調整素子もまた、コリメートレンズ502からレンズ504まで延在する光ビームのコリメートされた部分内に配置することができる。最終的に、観察ゾーンを通過する前に、光ビームは観察ゾーンに隣接して位置づけられている高倍率円柱レンズ505を通過する。図1に示したように、円柱レンズ505の軸はサンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に対して垂直に向けられ、円柱レンズ505の焦点距離により観察ゾーンにおいて光ビームの短軸の密な集束が生じる。

従来のLDベースの光学サブシステムと比較した場合の光学サブシステム50の利点は、図2および2Aにその違いがより明確に示されている。フローサイトメータに使用するために適切なほとんどの市販のレーザダイオードはレーザダイオードの端面から光ビームを放つ。図2に示したように、このようなLDチップ510の利得部分509は、矢印511によって示される横断方向に高度に閉じ込められている。これによって、高出力を実現するために、多くの場合、LDの製造者は、特に、矢印511に対して平行の向きである横断方向または高速軸方向に沿ったビーム品質を犠牲にすることがある。図2Aは、LDから放たれる光の特性を示しており、利得閉じ込めに起因する複数の干渉縞512が、放たれた光ビームの短軸方向の遠視野においてはっきりと見ることができる。図2Aの図に見られる干渉縞512は光ビームの全エネルギーのうちの微小量のみを含み、したがって、対応するビームプロファイルの従来のM²特性評価に殆ど影響を与えないことに留意されたい。しかしながら、以下でより詳細に説明するように、干渉縞512は従来のフローサイトメータの性能に悪影響を及ぼす。代替的に、矢印511に対して垂直に向いている、端面発光LDの低速軸方向に沿った利得閉じ込めははるかに緩い。これによって、図2Aに示すように、遠視野ビームプロファイルはLDの光ビームの低速軸に沿ってより滑らかになる。

図3Aは、フローサイトメータのための従来のLDベースの光学サブシステムを示している。図1に示した光学サブシステム50に共通している、図3Aに示したこれらの素子にはプライム（'）記号によって区別された同じ符番が付されている。図3Aに示したように、従来の光学サブシステムは、LD501の高速軸をサンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に対して平行に向ける。その最も簡単な構成において、LD501'の楕円形ビームプロファイルは、球面集束レンズ504'によって、観察ゾーン内へ直接転位される。集束光ビームのための最適なアスペクト比を達成する試みにおいて、種々の異なる従来のLDベースの光学サブシステムは、図3Aに示したものに加えてビーム整形光学素子も含む。

従来の光学サブシステム構成のためのLD501'の高速軸に沿った干渉縞512の悪影響は、図3Bに示した光散乱の時間プロファイルに明確に現れている。散乱光強度または蛍光強度は粒子に入射する局所的なレーザ出力に正比例しているので、サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に沿った光ビームのプロファイルにおけるいかなる微細な構造も、フローサイトメータによって生成される信号の時間プロファイルに表れる。時間プロファイルのこのような構造は小さな粒子によって生成される信号とは区別できず、よってフローサイトメータを誤って作動させ粒子を誤認識させてしまう。更に、干渉縞512によっても、図3Bに示した脈動の面積や幅などの他のサイトメトリパラメータの測定が不正確になる。

図4Aおよび4Bは、先に示した'019特許に開示されているLDベースのフローサイトメトリ用途のための更に別の先行技術の光学サブシステムを示している。図1または図3Aのいずれかに示した光学サブシステム50に共通している、図4Aおよび4Bに示したこれらの素子にはダブルプライム（''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図4Aおよび4Bに示したように、LD501''の低速軸をサンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に対して平行に向けることによって、図4Aおよび4Bに示した光学サブシステムは上述したような干渉縞512によって引き起こされる問題を効果的に克服する。残念ながら、サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に垂直に光ビームを拡散するための、図4Aおよび4Bにおける球面集束レンズ504''の前に配置されたビーム拡散素子513''は、観察ゾーン付近に非点収差の大きな光ビームを生成する。具体的には、観察ゾーンにおけるこの非点収差のある光ビームを、サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に集束させることによって、サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に垂直な光ビームの幅は増加し、そのため、ビームの幅はシースフローと同じかまたはさらにそれより広い幅になる。これによって、図4Aおよび4bに示した光学サブシステムは、観察ゾーンを流れる粒子に入射する光のエネルギーの量を減少させるのみならず、光学サブシステムはシース液フローと複合顕微鏡対物レンズ60の隣接する部分との間の界面からの望ましくない散乱光を増大させる。

図5は'019特許に開示された光学サブシステムと図1に示した光学サブシステム50との主な差異を強調している。図4に示したように、球面ビーム集束レンズ504の前に面外ビーム拡散素子513″を配置する代わりに、円柱平凸レンズとして図5Aおよび5Bに示した高倍率円柱円柱レンズ505が球面ビーム集束レンズ504の後に光ビームに沿って配置され、好ましくは、複合顕微鏡対物レンズ60と並置される。図5Aおよび5Bに示したように、円柱レンズ505は観察ゾーン内で光ビームの短軸を集束し、一方で、光ビームの長軸は本質的に変化しないままである。これによって、図1、図5Aおよび5Bに示した光学サブシステム50は、
1． 組み合わされたサンプル液フローとシース液フローにまたがる密に集束された短軸と、
2． LD501の低速軸に沿った遠視野ビームプロファイルのフーリエ共役である、組み合わされたサンプル液フローとシース液フローの方向の滑らかな短軸プロファイルと、
を有する楕円形である光ビームプロファイルを観察ゾーンにおいて確立する。

一方、図5Bに示したように、面外ビーム幅は円柱レンズ505の影響を受けない。図5Cは、図1、図5Aおよび5Bに示されている光学サブシステム50を用いた、微粒子から散乱する光の測定された時間プロファイルを示している。図5Cに提示される測定を行う際に使用されるLD501は、図3Bに表わされる、微粒子から散乱する光の測定された時間プロファイルを作成する際に使用されるものと同じである。図5Cに示したように、LD501の高速軸に沿った干渉縞512によって生じるサイドローブはもはやフローサイトメータ40の性能に重大な影響を及ぼさない。

図6は、フローサイトメータで使用するために適合された本開示によるさらに別の代替的なダイオードレーザベースの光学サブシステムを示している。図1、5A、5Bに示した光学サブシステム50に共通している、図6および6Aに示したこれらの素子には、トリプルプライム（'''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図6Aおよび6Bに示した光学サブシステム50'''は、ノズル518から放出されるサンプルフローとシースフローとの両方を含むフリーフロージェット流519内に観察ゾーンが生じているため、観察ゾーンが複合顕微鏡対物レンズ60を用いずに生じていること以外は、図1、5A、5Bに示したものとほぼ同じである。これによって、図6Aおよび6Bに示した光学サブシステム50'''の構成の場合、高倍率円柱レンズ505は、ジェット流519内に配置される観察ゾーンから離れている。

図1、5A、5B、6Aおよび6Bに示した本開示の例示的な態様において、LD501の短軸、即ち、低速軸はサンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に対して垂直に向けられている。しかしながら、他の光学的構成を用いて、LD501の長軸、即ち、高速軸を、サンプル液フローが観察ゾーンを通過する方向に垂直になるように向きを変えることができることは当業者に明確であろう。図7は、このような光学素子の別の構成の一例を示している。図1、5A、5B、6Aおよび6Bに示した光学サブシステム50と共通している、図7に示したこれらの素子には4重プライム（''''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図示したように、LD501''''の低速軸はz方向に向けられている。LD501''''から放たれる光ビームはその後、1対の90°反射鏡523aおよび523bによってy方向面内へと回転する。図7において、第1の楕円形光ビームの向きを変える鏡523aに対する法線はx-y平面内にx軸に対して45°に向いており、第2の楕円形光ビームの向きを変える鏡523bに対する法線はy-z平面内にz軸に対して45°に向いている。

複合顕微鏡対物レンズ60
図8は、本開示の一態様による図1、5A、5Bおよび7に示した複合顕微鏡対物レンズ60を示している。図8に示したように、複合顕微鏡対物レンズ60は小フロー流路604内のプリズム形ガラスキュベット603の内側に配置される観察ゾーンを撮像し、好ましくは、小フロー流路604は、粒子を担持する組み合わされたサンプル液フローおよびシース液フローが通過する矩形断面形状を有している。複合顕微鏡対物レンズ60内に含まれる平凹裏面鏡601は、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの、ガラスキュベット603と同様の屈折率を好ましくは有する光学的に透明な材料から作られている。光学的損失を最小限にするために裏面鏡601はプリズム形キュベット603の当接平面に光学的に結合された平らな前面を含む。キュベット603への裏面鏡601の光学的な結合には、屈折率整合ゲル、光学接着剤、または直接的な光学的接合を用いてもよい。あるいは、裏面鏡601はキュベット603と一体形成されてもよい。

また、複合顕微鏡対物レンズ60は、同じく、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの、ガラスキュベット603と同様の屈折率を好ましくは有する光学的に透明な材料から作られる平面非球面補正板602を含む。光学的損失を低減するために、補正板602の平面は、裏面鏡601とは正反対にあるプリズム形キュベット603の面上で、プリズム形キュベット603の当接平面に光学的に結合される。キュベット603への補正板602の光学的な結合には、屈折率整合ゲル、光学接着剤、または直接的な光学的接合を用いてよい。補正板602から最遠位にある補正板602の非球面は光伝送の損失を低減するために反射防止コーティングを有することができるが、そのようなコーティングは、本開示による複合顕微鏡対物レンズ60にとって必須要件ではない。補正板602の非球面形状は、古典的なシュミットカメラ（Schmidt, B., Mitt. Hamburg Sternwart 7 (36) 1932）に類似している。当業者には既知であるように、シュミットカメラの補正板は、補正板が板を通過する光の光線を偏向させない、円形の中間ゾーンを含む。複合顕微鏡対物レンズ60において使用する際、板厚が最薄である補正板602の中間ゾーンの外側では補正板602は負の光学的パワーを有しているが、中間ゾーン内側では、補正板602は正の光学的パワーを有している。非球面補正板602の正確な形状は、当業者によって任意の市販の光学レイトレースツールを使用して容易に得ることができる。フローサイトメータ40において、図1、5A、5Bおよび7に示されている光学サブシステム50によって生成される光ビームは、裏面鏡601または補正板602のいずれにも当接しない、キュベット603の二つの面のうちの一つを通って、フロー流路604に垂直にキュベット603に入射することに留意されたい。

図9Aは、図8に示した複合顕微鏡対物レンズ60の態様についてのレイトレーシングの結果を示す。図9Aに示したように、キュベット603の中心近傍のフロー流路604における三つの空間的に分離した位置からの散乱および蛍光発光は
1． 最初に、裏面鏡601へ向かって伝搬し、裏面鏡601によって内部反射されて、
2． 次に、まずキュベット603を通過し、
3． その後、非球面補正板602を通過し、
4． 最後に、像平面605の近くに三つの異なる像を形成する。

図9Aに示した複合顕微鏡対物レンズ60を横切る光線はほぼ光学的に均一であり、かつキュベット603の中心近傍で放たれる光はほぼ垂直入射で補正板602を横切ることに留意されたい。これによって、複合顕微鏡対物レンズ60は、キュベット603の中心近傍で放たれる光において殆ど色分散を生じさせない。

さらに、シュミットカメラが明るい焦点比とほぼ回折限界の光学性能を有する広視野との比類のない組み合わせを提供することは天体物理学の世界ではよく知られている。従来のシュミットカメラの主要な欠点は像平面が機器内にあることである。複合顕微鏡対物レンズ60の場合、キュベット603の中心近傍の光が従来のシュミットカメラとは逆に伝搬し、したがって、像平面は複合顕微鏡対物レンズ60の外側に存在する。これによって、本開示は、従来のシュミットカメラの制約を受けることなく、シュミットカメラの光学性能の利点のみを十分に利用することができる。図9B1〜9B3は互いから150ミクロン離間されているフロー流路604内の観察ゾーン内の三つの発光位置に対する像平面605の近傍のスポットダイヤグラムを示している。図9B1〜9B3に示された全ての像の直径は35ミクロンを下回っている。

非球面補正板602を横切る図8および9Aに示された複合顕微鏡対物レンズ60のフロー流路604内の観察ゾーンから放たれた光は少量の色収差を受ける。図10は、図1、5A、5B、および7に示した複合顕微鏡対物レンズ60のための代替的な態様を示す。図8および9Aに示した複合顕微鏡対物レンズ60に共通である、図10に示したこれらの素子にはプライム（'）記号によって区別された同一の符番が付されている。図10に示されている裏面鏡601'と収差補正板602'の形状は、フロー流路604'内の観察ゾーン付近の発光位置のコリメートされた無限焦点像を生成するために僅かに変更されている。図10において複合顕微鏡対物レンズ60'も補正板602'と像平面605'との間に挿入された色補正複レンズ609を含む。複レンズ609は、補正板602'から放たれた光を像平面605'に集束させることに加えて、非球面補正板602'によって生じた残存色収差をさらに減少させるのにも役立つ。

補正板602の平らな面は必ずしもキュベット603に光学的に結合されなくてもよい。図11は、本開示の代替的な態様による複合顕微鏡対物レンズ60を示している。図8および9Aに示した複合顕微鏡対物レンズ60に共通である、図11に示したこれらの素子には、ダブルプライム（''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図11は、キュベット603''から光学的に分離された収差補正板602''を示している。複合顕微鏡対物レンズ60''の動作にとって必須ではないが、光透過効率を改良するために、収差補正板602''の両面とキュベット603''の露出平面は反射防止コーティングを有することが可能である。図11に示されている収差補正板602''は、組み合わされた裏面鏡601とキュベット603との固定関係において、図11に示されていない機械的支持体によって保持されていることが理解されよう。図9Aおよび10のそれぞれに示されている複合顕微鏡対物レンズ60および60'と同様に、分離した補正板602''を有する複合顕微鏡対物レンズ60''は、有限焦点距離像、または、色補正複レンズ609を加えることによって、今度は有限距離像平面に集束される無限焦点系のいずれかを提供するように構成することができる。

図12は、本開示の更に別の代替態様による複合顕微鏡対物レンズ60を示している。図8、9Aおよび11に示した複合顕微鏡対物レンズ60に共通している、図12に示したこれらの素子には、トリプルプライム（'''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図12に示した複合顕微鏡対物レンズ60'''はノズル518によって放出されたジェット流519中に担持される細胞または他の微視的粒子からの散乱および蛍光発光を集光するために適合されている。複合顕微鏡対物レンズ60'''は、凹球面状の表面鏡610と収差補正板612から成る。表面鏡610は、ガラスまたは凹面611に高反射性コーティングを有する他の種類の硬質材料から作るか、あるいは研磨された凹面611を有する金属から作ることができる。補正板602と同様に、平面非球面補正板612は、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの透明材料の薄片から作られる。非球面は補正板612のいずれかの面に形成される。好ましくは、補正板612の両面は光透過損失を低減するために反射防止コーティングによってコーティングされるが、このようなコーティングは本開示による補正板612には必須要件ではない。表面鏡610と補正板612は図12に示されていない機械的支持体によって互いに固定関係で保持されていることが理解されよう。ジェット流519の内側の観察ゾーン内で細胞または他の種類の微視的粒子から放たれる散乱光および蛍光は、表面鏡610の凹面611によって反射される。凹面611からの反射による収差は光が補正板612を横切った後に補正板612によって補正される。複合顕微鏡対物レンズ60'''は、図9Aに示されたのと同様の有限焦点像、または、図10に示された複レンズ609と同様の色収差補正複レンズによって複合顕微鏡対物レンズ60'''から有限距離で集束されるコリメートされた無限焦点像のいずれかを提供するように構成されている。

図13は、スライドガラスなどの透明基板の表面に固定された試験片を撮像するための複合顕微鏡対物レンズ60の適合について示している。図8、9Aおよび11に示した複合顕微鏡対物レンズ60に共通である、図13に示したこれらの素子には、4重プライム（''''）記号によって区別された同一の符番が付されている。図13に示した複合顕微鏡対物レンズ60''''は、二つの光学素子である、ガラスまたは光学品質プラスチックなどの透明材料から作られた平凹裏面鏡617、および収差補正板618を含む。図13に示したように、撮像される試験片は、透明な、通常はスライドガラス616の前面615に固定される。スライド616は、好ましくは屈折率整合流体の薄層を使用して、裏面鏡617の平面に光学的に結合されている。試験片によって放たれた散乱光および蛍光は
1． 最初にスライド616と裏面鏡617を通って伝搬し、
2． 裏面鏡617によって内部反射してスライド616を通り、
3． 次に、補正板618を通り、
4． 最後に、補正板618より上に配置された像平面で像を形成する。

流体サブシステム70
図15はシース液リザーバ702と、シース液リザーバ702からシース液を引く液体ポンプ701と、を含む本開示による流体サブシステム70を示している。液体ポンプ701は、ダイヤフラムポンプ、または蠕動ポンプ、またはピストンポンプ、または任意の種類の連続流体ポンプであってよい。液体ポンプ701の出口は、液体ポンプ701からシース液を受けるT字連結器703の入口に連結している。T字連結器703は、二つの出口を有しており、第1の出口が、液体ポンプ701からT字連結器703によって受けられたシース液の一部分をシース液リザーバ702に戻すために、バイパス導管710に連結される。液体ポンプ701からT字連結器703によって受けられたシース液の一部分をシース液リザーバ702に戻すことは、以下の二つの理由から有利である:
1． 図1に示したように、バイパス導管710が周囲の大気に対して開いたままであり、このことは、脈動を効果的に減衰させ、これによって、液体ポンプ701の動作に特有の脈動を大幅に低減させる。
2． 液体ポンプ701からT字連結器703によって受けられたシース液の一部分をシース液リザーバ702に戻すことも、液体ポンプ701のスループットを効果的に低減させ、これによって、フローサイトメータ40において比較的高い流量の低コストのポンプの使用が可能になる。

バイパス導管710のフロー抵抗を「r」で表し、T字連結器703からキュベット603のフロー流路604までの経路のフロー抵抗を「R」で表す。したがって、シースポンプへの出力抵抗は、

となる。

R＞＞rであるため、液体ポンプ701の挙動は、流体力学的特性が温度非感受性であるバイパス導管710の抵抗により支配される。したがって、図15に示した流体サブシステム70の構成はフロー流路604に対して温度非感受性のシース液フローを実現するための単純な機構も提供する。

図15に示したように、T字連結器703の第2の出口は、好ましくは、まず小型リザーバカプセル704を介し、次にフィルタカートリッジ705を介して、キュベット603を通って延在するフロー流路604に連結している。図16に示したように、約4フィート長の管704'は、小型リザーバカプセル704と置き換えられる。流体サブシステム70の初期段階において、いくらかの空気が、図15に示されるようにフィルタカートリッジ705の出口上方に配置されるその入口付近のフィルタカートリッジ705内に閉じ込められる。フィルタカートリッジ705内に閉じ込められた空気は付加的な流体コンデンサとして作用し、フロー流路604内へ放出されるシース液における脈動をごく僅かなレベルまで効果的に低減することができる。フロー流路604における大きな流体抵抗によって、フィルタカートリッジ705内に閉じ込められた空気は圧縮されるようになる。液体ポンプ701が停止すると、フィルタカートリッジ705内に閉じ込められた空気が、排気コンデンサに類似したT字連結器703へ向かって押し戻される。小型リザーバカプセル704がなくても、フィルタカートリッジ705から排出されたいくらかの空気が、その低い流体抵抗によってバイパス導管710に到達し、液体ポンプ701が再び作動すると、該空気は、流体サブシステム70から押し出される。追加の空気の供給がなくても、このようなシナリオは、空気の大部分が流体サブシステム70からパージされてフィルタカートリッジ705が脈動減衰器としてのその有効性を失うまで、反復される。したがって、小型リザーバカプセル704または管704'の目的は、バイパス導管710からフィルタカートリッジ705を隔離するためのリザーバを提供することであり、これによって、フィルタカートリッジ705の内側に閉じ込められた空気が、液体ポンプ701の繰り返される起動停止操作に拘わらず、流体サブシステム70内に残留することを確実とする。

フィルタカートリッジ705の入口付近で閉じ込められた空気の脈動減衰効果は、図16Aおよび16Bに示したヒストグラムにおいてはっきりとわかる。図16Aは、空気のポケットがフィルタカートリッジ705の入口付近で閉じ込められたときにフロー流路604において測定された粒子飛行時間を示している。図16Bは、閉じ込められた空気が流体サブシステム70からパージされたときにフロー流路604において測定された粒子飛行時間を示している。図16Aおよび16Bのヒストグラムに示された結果は、約200μmの間隔で離間された、フロー流路604の中心の近傍に集束された二つのナイフエッジ形レーザビームを使って得られる。図16Aおよび図16Bの横軸は、励起ビームから90°の角度で粒子から散乱した光のピーク到達時間を記録することによって測定される、一方のレーザビームから他方のレーザビームまでに1粒子が掛かる飛行時間である。両方の場合において、粒子が二つのレーザビームを横断するための平均飛行時間は同じである。図16Aに示したように、フィルタカートリッジ705がいくらかの空気を保持する際、全ての粒子が二つのレーザビームを横切るためにほぼ同じ量の時間が掛かる。図16Bに示したように、フィルタカートリッジ705が空気を保持しない場合、飛行時間の分布が広がるだけでなく、二峰性となる。言い換えれば、一部の粒子にはあまり時間がかからないが、他の粒子は二つのレーザビームを横切るのに平均時間より長い時間が掛かる。これは、フロー流路604におけるシース液速度の脈動に容易に帰することができる現象である。

これまで説明してきた本開示の態様において、バイパス導管710に沿った、および、T字連結器703とフロー流路604との間の流体抵抗は調整可能ではない。当業者には明らかであるように、固定された制限器または調整弁711、711'および712、712'などのフロー制限器を、バイパス導管710内、および、T字連結器703とフロー流路604との間に有利に挿入して、フロー流路604を通る流量を調整することができる。あるいは、フロー流路604を通って流れるシース液の速度は、変速ブラシレスDCモータによって駆動される液体ポンプ701を使って調整することもできる。

蠕動ポンプ80
本開示の一態様による蠕動ポンプ80を図17に示す。ポンプは、弓形湾曲トラック808と、筐体809内で回転可能なロータ816に取り付けられた三つのローラ810、811および812と、筐体809の圧縮性チューブ807とローラ810、811および812との間に挟まれた圧縮性チューブ807と、を有する筐体809を含む。図18A〜18Dに概略的に示すように、蠕動ポンプ80のローラ810，811、および812はロータ816の周りで実質的に等しい角距離、離間距離、または間隔で互いから離間されている。分かりやすくするために、以下の説明においてロータ816は反時計回りに回転すると仮定するが、この説明は時計周りに回転するロータを有する蠕動ポンプにも等しく適用されることが理解されるべきである。筐体809の圧縮性チューブ807は、以下のいくつかの部分に分けることができる:
1． 圧縮を受けない、ポイント801とポイント806との間の開口部分と、
2． この部分の上をローラが転動する時に完全閉口状態まで連続的に圧縮される、ポイント801とポイント802との間のポンプ入口部分と、
3． ローラによって完全に閉口する、ポイント802とポイント803との間、および、ポイント804とポイント805との間、の二つのポンプ部分と、
4． ポイント803からポイント813までの凹み部分の拡大部を通ってローラが転動する時に、完全閉口状態から完全開口状態まで連続的に拡大する、ポイント803とポイント804との間の凹み部分と、
5． 次いで、ポイント813からポイント804までの、凹み部分の圧縮部を通ってローラが転動する時に、完全閉口状態まで、連続的に圧縮され、
6． ローラがこの部分を通って転動する時に、完全閉口状態から完全開口状態まで連続的に拡大する、ポイント805とポイント806との間の出口部分。

言い換えれば、ローラが入口ポイント801から出口ポイント806まで、上で反時計回りに転動するとき、内部間隙は
1． ポイント801での完全開口状態から、ポイント802での完全閉口状態まで、連続的に減少し、ポイント803まで閉口したままであり;
2． その後、ポイント813での完全開口状態まで連続的に再び拡大し;
3． その後、ポイント804での完全閉口状態まで連続的に減少し、ローラがポイント805に到達するまで閉口したままであり;
4． 最後に、ポイント806での完全開口状態まで連続的に再び拡大する。

内部の間隙の大きさは、破線の円と固体圧縮性チューブ807との間の間隔として図18A〜18Dに概略的に示されている。図18A〜18Dに示したように、本態様による蠕動ポンプ80において、ポイント801と803との間、ポイント802と813との間、ポイント813と805との間、ならびにポイント804と866との間の角距離、離間距離、または間隔は、互いに隣接するローラ同士の間の角度に一致している。これによって、図18Aから18Bに示したように、ローラ810が、ポイント804〜ポイント805のポンプ部分を通って転動するとき、その相互作用が、蠕動ポンプ80の流体流量を完全に決定する。図18Cに示したようにローラ810がポイント805とポイント806との間の出口部分に到達すると、ローラ810の下方は連続的に拡大し始め、間隙が大きくなり始める。一方、ローラ811は、凹み部分の圧縮部に到達して連続的に圧縮し始める。蠕動ポンプ80において、圧縮性チューブ807に沿ったポイント813とポイント804との間の凹み部分の圧縮部の形状は、ポイント813とポイント804との間の凹み部分の圧縮部内のローラ811下の圧縮によって押し出される液体の体積が、ポイント5とポイント6との間の出口部分内のローラ810下の拡大によって生成された体積を実質的に充填するようなものである。この期間中、圧縮性はローラ810と811との両方の下方で部分的に開口し、ローラ12の下方で完全に閉口されている。これによって、ポンプ作用は主にローラ１２によって実現される。具体的には、設計によって、ポイント13とポイント6との間の部分内の液体の全体積は、この期間中実質的に一定のままであるので、図18Cに示された状態において蠕動ポンプ80の流量は図18Aおよび18Bに示された状態における流量と実質的に同じままである。ローラ810がポイント806を通過すると、ローラ811はポイント804とポイント805との間のポンプ部分に到達する。ローラ810、811、および812の間に物理的な差異がないことから、蠕動ポンプ80の流量はプロセス全体を通して実質的に一定のままであることに留意されたい。

本開示の脈動のない蠕動ポンプのメカニズムは、ローラの動きに従って円座標に沿って視たときにより明確に理解されよう。図19を参照するに、出口から圧縮性チューブ819を塞ぐ最も近いローラ820までの、圧縮性チューブ819の内側の流体の体積、即ち、図19に示した斜線領域818斜線領域818によって表される流体の量が、Vとして表される。明らかに、Vは、ローラ20の角度位置θ、および、他の全ての下流のローラによって加えられるチューブ圧縮量δに依存する。

これによって、蠕動ポンプの流量Fは、以下の式によって、Vcの時間微分に関連付けられる。

ここで、Rはロータの回転速度であり、下付き文字は複数の下流ローラを識別するために使用される。式（2）の右辺の第1項はチューブを塞ぐローラからの寄与を表す。よって、偏導関数

はθに依存しない。総和項は、圧縮性チューブ819を部分的に圧縮する他の全ての下流のローラからの寄与を表す。ここで、ΔSを圧縮性チューブ819の圧縮による断面積変化とし、Lをその断面形状がチューブの圧縮の影響を受けるチューブの長さとする。よって、Lがチューブ圧縮δに比例し、ΔSがその2乗であるδ²に比例していることは当業者に明確である。これによって、ローラによるチューブの圧縮に起因する流体損失の体積ΔVは以下の式（3）で表される。

式中、Dは、圧縮性チューブの内径であり、Gは、図19、19Aおよび19Bに示された最小間隙であり、これは、図18A〜18Dにおいて破線の円と筐体809の固体圧縮性チューブ807との間の間隔によっても示されている。ここで、図20Aおよび20Bを参照するに、円座標系において、図20Aは、図18Aおよび18Bに示したポンプの状態に対応している。この期間中、ローラ810'の下流にローラは存在しないので、式（2）の総和項は消滅する。図20Bは、図18Cに示されたポンプの状態に対応している。ローラ12'によって塞がれ、ローラ810'と811'によって部分的に圧縮される。しかしながら、二つのローラ810'と811'によって引き起こされた体積変化は実質的に互いに打ち消し合う。これによって、式（2）の総和項は同様に消滅する。よって、蠕動ポンプ80の流量は、ローラの位置とは無関係に実質的に一定のままである。

上記の要件を満たす圧縮性チューブ807の形状は式（3）から容易に導くことができる。図18Cを参照するに、ポイント813とポイント804との間の凹み部分の圧縮部における弓形圧縮性チューブ807の間隙G_13,4、および、ポイント805とポイント806との間の出口部分における弓形圧縮性チューブ807の間隙G_5,6が、以下の式:

に従う場合、図21に示したように、これらの二つの部分の全流体体積は実質的に一定のままである。蠕動ポンプ80において、ポンプ筐体809の形状はその中心線に対して対称形であり、これによって、ポンプ筐体809の入口半分は、図17に示したように、筐体809の出口半分の鏡像となる。よって、蠕動ポンプ80は、殆ど脈動のない反時計回りおよび時計回りの回転の両方において動作することができるが、本開示による脈動のない蠕動ポンプを実現するために対称性は必要とされないことは理解されよう。例えば、ポイント13とポイント3との間の部分における弓形圧縮性チューブ807の間隙G_13,3、および、ポイント2とポイント1との間の部分における弓形圧縮性チューブ807の間隙G_2,1が、以下の式（5）:

に従う限り、本開示による蠕動ポンプは、ロータ816が時計回りに回転する際に殆ど脈動を示さない。

図22は、本開示による蠕動ポンプの代替態様を示している。図17に示した蠕動ポンプ80に共通している、図22に示したこれらの要素にはプライム（'）記号によって区別される同じ符番が付されている。蠕動ポンプ80'は2個の凹み820および821を有する圧縮性チューブ807'と、4個のローラ822、823、824および825とを含む。図22に示した態様において、ポンプの出口近傍のチューブ拡大による流体の体積損失は、二つの凹み820および821近傍のローラ822および823による圧縮性チューブの圧縮の複合効果によって補償される。

図23は、本開示による蠕動ポンプのさらに別の代替態様を示している。図17に示した蠕動ポンプ80および図22に示した蠕動ポンプ80′に共通している、図23に示したこれらの要素にはダブルプライム（''）記号によって区別される同じ符番が付されている。蠕動ポンプ80″は6個のローラと、二つの凹み818''および819''を有している弓形圧縮性チューブ807''と、を含む。蠕動ポンプ80''において、ポンプの出口近傍のチューブ拡大による流体の体積損失は、ポンプ出口近傍の一つの凹み818''または819''の直ぐ上流のローラの作用によって補償される。

蠕動ポンプの出口付近の圧縮された圧縮性チューブの拡大に起因する脈動もまた、プログラマブルなロータ速度を有する蠕動ポンプによって克服することができる。図24A〜24Cは、3ローラ蠕動ポンプのための、本開示による蠕動ポンプの脈動を最小限にするための代替態様のメカニズムの関連する局面を示す図である。図24Bに示したように、トラック828はポンプ入口とポンプ出口部分との間で実質的に円形である。これによって、破線の円829とトラック828の実線曲線との間の間隔によって示されたように、圧縮性チューブは、ポンプ入口とポンプ出口との間の、ポンプの3個のローラ826、827および829のいずれか一つによって完全閉口される。図24Aは、図24Bに示した蠕動ポンプについてローラ位置を円座標系で概略的に示している。チューブを塞ぐローラの下流にはローラが1個のみあるので、式（2）はより簡単になる。

ここで、チューブ圧縮δ（θ）はローラ位置θの関数として明示的に表される。括弧内の項はローラ位置に対する流体体積の変化率を表す。第1項は、チューブを塞ぐローラ、即ち図24Aのローラ827からの寄与であり、第2項は、出口部分におけるローラからの寄与である。定義により、体積変化率が負であり、出口部分にローラがない場合は、括弧内の第2項が消滅することに留意されたい。図24Cの点線曲線は、ローラの位置に対する負の体積変化率の代表的プロットである。ローラがポンプ出口の近くでチューブから離れて転動するときのチューブ拡大による曲線に沿った隆起は、一定のロータ速度を有する従来の蠕動ポンプにおいて脈動の原因となる。しかしながら、図24A〜24Cに示された蠕動ポンプの場合、図24Cにおいて破線曲線で示されたロータ速度Rは、ロータ位置と同期して変動し流体体積の変化率に反比例するように設定される。これによって、図24Cの上部に実線で示すように、ロータ速度と流体体積の変化率との積であるポンプの流量は一定のままである。式（6）の括弧内の項がポンプの機械的構造によって一意に求められることに留意されたい。したがって、ロータ速度プロファイルは、式（3）に従ってトラック828の形状から容易に作成することができる。当業者にとって、例えばステッピングモータやDCサーボモータを用いる、プログラマブルなロータを実現するための数多くの方法がある。

WDM装置90
図25は、ジグザグ構成を使用した本開示の例示的な6ポート波長分割マルチプレクサのための光学レイトレースを示している。図25に示したように、ピンホールを通過する、または、図1に示した光ファイバ852などのマルチモード光ファイバの端面から放たれる蛍光は、位置901において分散オブジェクトまたは分散光源、即ち、WDM90の光入力を形成する。オブジェクトの大きさはピンホールの直径またはマルチモード光ファイバのコア径によって規定される。ピンホールまたはマルチモード光ファイバのコア径の実用的な大きさは、マイクロメートル単位で測定されるシングルモード光ファイバの直径とは対照的に、ミリメートル単位で測定されることに留意されたい。これによって、ビームサイズとその発散角との積として定義される蛍光光源のエタンデュ（etendue）は、光通信におけるその対応物よりも何百倍も大きい。エタンデュ保存定理(Julio Chaves, Introduction to Nonimaging Optics, CRC Press, 2008 [ISBN 978-1420054293]）によれば、フラッシュ光からの光と同様に、このような分散光源からの光は、コリメートされた部分の直径が小さい必要がある場合は特に、非常に限定された距離の間でのみコリメートが保たれ得る。

図25に示したように、コリメート光学素子、この場合、色消しレンズ902は、光源901からの光をキャプチャし、最後の集束レンズ905の近傍でオブジェクトの拡大像を投影する。905近傍の像の大きさはコリメート光学素子902の有効サイズとほぼ同じに保たれる。これによって、レンズ902とレンズ905との間を伝搬する光ビームは有効にコリメートされる。図25に示したように、倍率が、例えば約10未満の、小さな倍率に保たれる限り、簡単な単レンズ905を使用して、コリメートされた光ビームを、位置901においてWDM90によって受光される光ビームのスポットよりも小さいスポットへ容易に集束させることができる。光ビームをこのような小さいサイズへ集束させることができるため、効率的な光検出のために集束レンズ905の焦点906に小面積半導体検出器を配置することが可能となる。

傾斜した角度で向けられたダイクロイックフィルタ903がコリメート光学素子902とレンズ905との間のほぼ中間の光路内へ挿入される。ダイクロイックフィルタ903は対象のカラーバンドを通過させ、光ビームの残りのカラーをWDM90内の更なる処理のために反射させる。任意のバンドパスフィルタ904はダイクロイックフィルタ903の後に挿入され、WDM90のカラー分離性能を更に向上させる。

ダイクロイックフィルタ903から反射した光は第2の光学素子907、好ましくは、凹面鏡に入射する。凹面鏡907はコリメート光学素子902と集束レンズ905近傍の像との間の距離にほぼ等しい曲率半径を有している。よって、凹面鏡907は、第2の集束レンズ908近傍にコリメートレンズ902の第2の像を形成する。凹面鏡907とレンズ908における第2の像との間の光ビームは、コリメートレンズ902と集束レンズ905近傍の第1の像との間の光ビームと実質的に同じ直径を有している。よって、中継結像凹面鏡907は、ビーム径を拡大せずに、コリメートされたビーム経路を有効に2倍にすることができる。ここでも、拡張されしかもコリメートされたビームは、901の光源のスポットよりも小さいスポットへ容易に集束されることができる。その後、第2のダイクロイックフィルタ909が、中継結像凹面鏡790と集束レンズ908近傍の第2の像との間のほぼ中間に挿入される。第2のダイクロイックフィルタ909は、位置901においてWDM90によって受光された光ビーム内の別のカラーバンドを通過させ、入射した光ビームの残りを更なる処理のために反射させる。

図25に示したように、追加の中継コリメート光学素子910、911、912、913およびダイクロイックフィルタ914、915、916、917が同様にカスケード配列されて、集束レンズ918、919、920、および921の近傍の複数の像を生成することができ、これらの像の各々は、位置1においてWDM90によって受光された光の特定のカラーバンドに対応している。図25に示したように、本開示の1:1の像中継アーキテクチャにより、集束レンズ906、908、918、919、920および921によって生成される光のスポットは全て、光ビームの光源より小さく、よって、小面積APDによって容易にキャプチャすることができる。

図25は、分散光源からの光ビームのための6ポート波長分割マルチプレクサを示しているが、本開示に従い、異なるポート数を有するWDMを容易に構築できることは当業者に容易に理解されよう。また、WDM90が、好ましくは、第1のコリメート光学素子として色消しを使用するが、集束レンズ906、908、918、919、920および921の前に生成された像が全てほぼ単色であることから、単レンズも使用可能なことも当業者には明らかである。ダイクロイックフィルタから反射した光ビームを中継するために凹面鏡を使用する代わりに、中継素子として屈折光学系を使用して、コリメートされた光ビームの経路を伸ばすことも可能である。しかしながら、WDM90において使用されるジグザグアーキテクチャの明らかな利点はアレイ検出器の使用が可能であることであり、これによって、携帯可能な機器に好適なよりコンパクトなWDMが得られる。

図26は、先行技術のコリメート装置のための光学レイトレースを示している。図26に示した方法は、例えば米国特許第6,683,314号に開示されているような、従来のマルチカラー蛍光機器において広範囲に使用される。図26に示されているように、光ビームは、コリメート光学素子923よって作られる像924を超えて急速に発散する。これによって、マルチカラー装置を構築するための唯一の選択肢はコリメート素子923とその像924との間にダイクロイックフィルタを挿入することである。

エタンデュ保存の制約により、コリメートされたビームの直径は、この部分内の複数のダイクロイックフィルタに対応するようにかなり拡大しなくてはならない。ビームの拡大は、小面積半導体検出器に適した小スポットへコリメートされたビームを再集束させることについて重大な課題をもたらす。これらの困難を克服するために、一部の機器製造業者は、例えば、Becton-Dickinson、Becman CoulterおよびPartecによって製造された主流フローサイトメータ、ならびに、GE AmershamによるMegaBACEシリーズのDNAシーケンサにおいて、蛍光検出だけのためにMtを使用することを選択した。Luminexマルチプレックスビームアナライザなどの他の機器は、既知の明るい蛍光を含む特定のカラーバンドを選択し、選択されたカラーバンド内の光を検出するための大面積APDを使用する。

図27は、ジグザグ構成および分岐構成の組み合わせを用いた6ポートWDM90についての代替態様の斜視図である。設計は、図25に示したジグザグ構成の変更形態である。図27に示した代替態様において、図25のバンドパスフィルタ904はダイクロイックフィルタ904'によって置き換えられている。フィルタ904'は一つのカラーを通過させるように位置づけられ、他のカラーを90°で反射させる。ダイクロイックフィルタ904'を通過する光ビームの光路長と904'から反射される光ビームの光路長は実質的に同じであり、これによって、一方のアームはレンズ905によって、他方のアームはレンズ905'によって、集束位置906および906'において配置された小面積半導体検出器に適合する小スポットへと集束される。図25に示したように、ダイクロイックフィルタ903によって反射された光の残りのカラーは凹面鏡907によって中継結像され、光学素子903，904'、905および905'を含む構成は、さらに2回カスケード配列されて、6ポートWDMを形成する。

図28は8ポートWDM90についての代替態様の斜視図を示している。図27における中継結像凹面鏡907および910を凹面ダイクロイックフィルタ907'および910'と置き換えることによって、図28に示したWDMは図25および27に示したWDMに比較して2つ多いカラーバンドを提供する。

フローサイトメトリに使用するための多数の蛍光プローブが長年にわたって開発されてきた。より最近では、複数の蛍光タンパク質も生物医学研究における重要なツールとなっている。異なる種類の蛍光プローブに対応するため、ユーザの特定のニーズに適したダイクロイックフィルタについてユーザの選択を可能にするために様々な技術が開発されている。交換可能なダイクロイックフィルタに関する重要な課題は、コーティングされたフィルタ面が硬質のフローサイトメータ基準フレームと直接接触することを回避することである。コーティングされたフィルタ面と任意の硬質の基準フレームとの間で反復される直接接触は、交換可能なダイクロイックフィルタを損傷し得る。現在、この問題に対応する従来の解決法のほとんどは、交換可能なダイクロイックフィルタを適正位置に保持するために精密に機械加工された機械的なスペーサを使用する。このような解決法の一例は、米国特許第6,683,314号に開示されている。しかしながら、このような解決法は検出器の活性領域が1.0 mm^２未満の場合は、信頼性に劣る。

図29Aおよび29Bは小面積検出器に好適な図29Cに示された交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934の作製を示している。交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934の組み立ては、その作製のための基準テンプレートの構成を示す図29Aから開始される。基準テンプレートは二つの光学的に平行なガラス板925と926から作られる階段状になっている。二つのガラス板925と926をオプティカルコンタクトで共に接合させることによって、ガラス板925の表面929がガラス板926の表面930に光学的に平行になることを確実にする。その後、交換可能なダイクロイックフィルタ927の前面932がテンプレートの表面929に押圧される。ダイクロイックフィルタ927を緩く嵌合するフィルタホルダ928は、基準面931とフィルタスロット933を含む。交換可能なダイクロイックフィルタの組み立ての間、フィルタスロット933にはエポキシ接着剤が部分的に充填され、フィルタホルダ928の基準面931がテンプレートの表面930に対して押圧され、一方、フィルタホルダ928はダイクロイックフィルタ927に向かって摺動する。エポキシ接着剤がセットされている間は、圧力がダイクロイックフィルタ927とフィルタホルダ928に対して印加されている間、ダイクロイックフィルタ927の一部はフィルタスロット933内に固定されたままである。エポキシ接着剤はUV硬化性または熱硬化性であってもよいし、あるいはA/B混合物の成分をブレンドすることによって作られてもよいことは当業者に明らかであろう。図29Cは図29Aおよび図29Bに示しかつ上述したように作製されたE934〜を示している。図29Aおよび図29Bに示しかつ上述した組み立てプロセスにより、交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934の前面932が基準面931に対して光学的に平行になり、かつガラス板925の厚さによって正確に決定される間隔で基準面931に対して引っ込めて設けられることが確実となる。

図30Aおよび30Bは、上述した交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934が、分散光源からの光ビームを光学的に処理するためにWDM90において使用される本開示の一態様を示している。WDM90の注目すべき特徴は光学的に平らな表面を有しているガラス基準ブロック935である。当業者には明らかであるように、ガラス基準ブロック935は他の材料から作ることができる。図30Bに示したように、ダイクロイックフィルタ927を設置する際、交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934の基準面931はガラス基準ブロック935の平面に対して摺動し、ばね懸架式ネジ936によってこれに接触した状態で保持される。これによって、交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934のコーティングされた前面932は光学的平面に対して光学的に平行に維持され、正確に位置付けられる。一方、基準面931に対する前面932の引っ込みは、フィルタ交換時の任意の物体との物理的接触から基準面931を保護する。

交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934の記載した態様の数多くの変更および変形が可能であることは当業者には明らかである。例えば、本開示の代替態様は、第1および第2の円形光学平面を使用して組み立てた台座である。交換可能なダイクロイックフィルタアセンブリ934を組み立てる際、フィルタホルダの基準面は、第1の光学平面に当接し、ダイクロイックフィルタのコーティングされた面は、第2の光学平面に当接する。その後、エポキシ接合によって、ダイクロイックフィルタのコーティング面は、フィルタホルダの基準面に対して光学的に平行に保持され、しかも、第2の光学平面の厚さによって正確に決定される距離で引っ込めて設けられる。

産業上の利用可能性
フローサイトメトリ用途のためのLDベースの光学系の本開示の一態様を詳細に記載し、ストリームベースのフローサイトメトリ機器について同様に有利な態様も記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の原理および概念から逸脱することなく、上記の教示を考慮して、記載された態様の数多くの変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかであろう。

分散光源からの光ビームを複数のカラーバンドに分離するための波長分割マルチプレクサの本開示の一態様を詳細に記載し、他の同様に有利な態様もいくつか記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の原理および概念から逸脱することなく、上記の教示を考慮して、記載された態様の数多くの変更および変形が可能であることが当業者にとって明らかであろう。

本発明は、現在の好ましい態様について記載されているが、このような開示は専ら例示することを意図しており、本開示を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。よって、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本開示の種々の変更、修正、および／または代替的用途が、前述の開示を読んだ後、確実に、当業者に提示されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の精神および範囲内にある全ての変更、修正、または代替的用途を包含するものとして解釈されることを意図するものである。

Claims (26)

1. フローサイトメータのための光学サブシステムであって、
   光源からの光を受光するように配置されたコリメート光学素子であって、コリメートされたビームを投影するように構成されたコリメート光学素子；
   該コリメート光学素子からの該コリメートされたビームの少なくとも一部を受光するように配置された光学中継素子であって、該コリメート光学素子から受光した該コリメートされたビームの該一部を反射し第1の像を生成するように構成された曲面鏡を含む、光学中継素子；
   該光学中継素子によって反射されたコリメートされたビームの少なくとも一部を受光するように配置された第1の集束光学素子；および
   第1の半導体検出器
   を含み、該第1の集束光学素子が該光学中継素子から受光したコリメートされたビームの該一部を該第1の半導体検出器上に集束させるように構成された、
   光学サブシステム。
2. ピンホールを通過する光またはマルチモード光ファイバの端面から放たれる光を含む前記光源をさらに含む、請求項1記載の光学サブシステム。
3. 前記第1の集束光学素子が、前記光学中継素子から受光した前記コリメートされたビームの一部を直径1mmより小さいサイズに集束させるように構成された、請求項2記載の光学サブシステム。
4. 前記光源がオブジェクトを形成し、前記コリメート光学素子が該オブジェクトの拡大像を投影するように構成され、前記光学中継素子が、該コリメート光学素子と該コリメート光学素子によって投影された該拡大像との間の距離にほぼ等しい曲率半径を有している凹面鏡を含む、請求項2記載の光学サブシステム。
5. 前記コリメート光学素子が色消し複レンズを含む、請求項１記載の光学サブシステム。
6. 前記コリメート光学素子と前記光学中継素子との間に光路に沿って配置された第1の光学フィルタであって、前記コリメートされたビームを第1の枝路と第2の枝路に分離するように構成された第1の光学フィルタをさらに含む、請求項1記載の光学サブシステム。
7. 前記コリメートされたビームが複数の波長の光を含み、前記第1の光学フィルタが該複数の波長の内の第1の波長域の光を反射し該コリメートされたビームの前記第1の枝路を形成するように構成され、前記第1の光学フィルタが該複数の波長の内の第2の波長域の光を通過させ該コリメートされたビームの前記第2の枝路を形成するように構成され、該第1の枝路が前記コリメート光学素子から投影され前記光学中継素子によって受光される該コリメートされたビームの一部を含む、請求項6記載の光学サブシステム。
8. 第2の集束光学素子と第2の半導体検出器をさらに含み、該第2の集束光学素子が前記コリメートされたビームの前記第2の枝路を受光するように配置されかつ該コリメートされたビームの該第2の枝路を該第2の半導体検出器上に集束させるように構成された、請求項7記載の光学サブシステム。
9. 前記光学中継素子によって反射されかつ前記第1の集束光学素子によって受光される、前記コリメートされたビームの一部の直径が、該コリメートされたビームの前記第2の枝路の直径と実質的に同じである、請求項8記載の光学サブシステム。
10. 第2の光学フィルタであって、前記光学中継素子と前記第1の集束光学素子の間に光路に沿って配置され、前記コリメートされたビームの前記第1の枝路中の、前記第1の波長域の一部である第3の波長域の光を該第1の集束光学素子に通過させるように構成された、第2の光学フィルタをさらに含む、請求項8記載の光学サブシステム。
11. 前記コリメートされたビームの多数の波長域の光に関して1mmより小さい直径を有する集束されたスポットを生成するようにカスケード配列された、光学中継素子、光学フィルタ、および集束光学素子の連続的な組み合わせをさらに含む、請求項10記載の光学サブシステム。
12. 前記コリメート光学素子が、第2の像を生成するようにさらに構成され、前記第1の像が該第2の像の再結像である、請求項1記載の光学サブシステム。
13. 前記第1の像が前記コリメート光学素子の像である、請求項1記載の光学サブシステム。
14. フローサイトメータのための光学サブシステムであって、
    光源からの光を受光するように配置されたコリメート光学素子であって、第1の像を含むコリメートされたビームを投影するように構成され、該コリメートされたビームがコリメートされた距離を有する、コリメート光学素子；
    該コリメートされたビームを受光するように配置された光学中継素子であって、該コリメートされたビームの該コリメートされた距離を伸ばすよう構成された光学中継素子；
    を含み、該光学中継素子が、第2の像を生成するように構成された曲面鏡または凹面ダイクロイックフィルタを含む、光学サブシステム。
15. 第2の像と第1の像が実質的に同じサイズである、請求項14記載の光学サブシステム。
16. 前記コリメート光学素子から前記第1の像へのコリメートされたビームが前記光学中継素子から前記第2の像への前記コリメートされたビームと実質的に同じ直径を有する、請求項14記載の光学サブシステム。
17. 前記伸ばされたコリメートされた距離で前記光学中継素子からの前記コリメートされたビームを受光するように配置された第1の集束光学素子であって、該伸ばされたコリメートされたビームを第1の半導体検出器上に集束させるように構成された、該第1の集束光学素子をさらに含む、請求項14記載の光学サブシステム。
18. 前記コリメート光学素子と前記光学中継素子との間に光路に沿って配置された光学フィルタであって、前記コリメートされたビームを第1の枝路と第2の枝路に分割し、該第1の枝路と該第2の枝路が異なる色の光を含み、該光学中継素子が該第1の枝路を受けるように配置された、光学フィルタ；および
    該第2の枝路を受けるように配置された、第2の集束光学素子であって、該第2の枝路を第2の半導体検出器に集束させるように構成された、第2の集束光学素子
    をさらに含む、請求項17記載の光学サブシステム。
19. 前記コリメート光学素子から前記光学中継素子への前記コリメートされたビームの光路の長さが、該光学中継素子から前記第1の集束光学素子への前記コリメートされたビームの光路の長さと実質的に同じである、請求項17記載の光学サブシステム。
20. フローサイトメータのための光学サブシステムであって、
    光源からの光を受光するように配置されたコリメート光学素子であって、第1の像を生成するように構成されたコリメート光学素子；および
    該第1の像の近傍に配置された光学中継素子であって、前記コリメート光学素子からの光を受光し、第2の像を投影するように構成された光学中継素子
    を含み、該第1の像のサイズが該第2の像のサイズと実質的に同じあり、かつ該光学中継素子が曲面鏡または凹面ダイクロイックフィルタを含む、光学サブシステム。
21. 前記コリメート光学素子から前記第1の像までの光学距離が前記光学中継素子から前記第2の像までの光学距離と実質的に同じである、請求項20記載の光学サブシステム。
22. オブジェクトを形成する分散光源を含む光源であって、前記第1の像が該オブジェクトの拡大像である、光源をさらに含む、請求項20記載の光学サブシステム。
23. 前記光源がピンホールを通過する光またはマルチモード光ファイバの端面から放れる光を含む、請求項22記載の光学サブシステム。
24. 前記コリメート光学素子が、前記第1の像と平行の平面内の断面によって規定される有効サイズを有し、前記第1の像のサイズが前記コリメート光学素子の有効サイズと実質的に同じ大きさである、請求項22記載の光学サブシステム。
25. 前記第1の像が前記オブジェクトのサイズの約10倍より小さい、請求項22記載の光学サブシステム。
26. 前記第2の像の近傍に配置された第1の集束光学素子であって、前記光学中継素子からの光を第1の半導体検出器へ前記光源の前記オブジェクトより小さいサイズに集束させるように構成された、第1の集束光学素子をさらに含む、請求項22記載の光学サブシステム。

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