CN204287001U - 采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置，其特征在于，经光栅合束后的多波长激发光耦合进入一根多模光纤；相应的光学系统将多模光纤输出端的多波长激发光以平顶光斑的光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞或粒子上，进行检测，该技术方案使用光学光栅作为多波长激发光的光束合束装置，替代世界上现有主流流式细胞仪中使用的复杂的多个滤光片和分光器组合的激发激光光束集束装置，使仪器在结构和调整上有本质的简单和优化，故障率大为减少，成本大幅度降低；该技术方案使用光学光栅，以逆向色散的工作方式构成多波长激发光的光束合束装置，与现有主流流式细胞仪中相比，激发光能量的损耗降低到最低程度。

Description

采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置

技术领域

本实用新型涉及一种用于医疗检测仪器类流式细胞仪的激发光合束装置，具体涉及一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置及其应用。

背景技术

1、流式细胞术（Flow Cytometry， FCM ) 和流式细胞仪

  流式细胞术（FCM）是在显微镜技术、染色化学、电子学技术和计算机等领域的综和进步的结合下得以发展起来的对处于快速直线流动中的单细胞的特性及其成分，或其他各种微小颗粒（如细菌）及其负载物进行多参数分析和分选的技术，它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析。在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、遗传学、临床检验学、分子生物学、细胞动力学、环境微生物分析等学科中有着广泛的应用。

流式细胞仪是集流体力学、光学和激光技术、电子工程学、生物信息学、生物物理学、荧光化学、标记技术、计算机等学科为一体的新型高科技仪器；用于对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定、分析和分选。细胞内几乎所有能够被荧光染料标记的成分或某种变化都可以用流式细胞仪进行检测。其特点是检测速度快、测量参数多、采集信息量大、分析全面、方法灵活，还能分选出特定细胞群进行深入研究。

  2、流式细胞仪发展简史

从1930年瑞典科学家 Caspersson 和 Thorell 用显微镜研究染色细胞的结构开始，到现今日益完善的大型分析型和台式临床型的各式流式细胞仪的整个进程，充满了半个多世纪来无数的精心研究和辛苦劳动。1934 年，加拿大人 Andrew Moldavan 是首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想,将靜態顯微鏡（static microscopy）轉換成流式系統（flowing system），从此，迈出了从显微镜观察静止细胞向流式细胞术发展的第一步。1936年，Caspersson 等引入显微光度术。1940年，美国人 Albert Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白。 1949年, 美国人Walance H. Coulter 提交了发明专利，并在1953年获得了此项专利 U.S. Pat. No.2656508, “MEANS FOR COUNTING PARTICLES SUSPENDED IN FLUID ”(“悬浮在液体中的粒子计数方法“)。1958年, Walance H. Coulter 和他的弟弟Joseph Coulter, Jr. 共同创建了”库尔特电子公司”，开始销售库尔特血细胞计数仪。从此开启了血细胞计数和分析自动化的新纪元。1959年，B型 Coulter Counter 问世，它就是今日流式細胞仪的前身，因為它具备流式細胞仪的所有特性：能使單一細胞一个接一个的快速通過孔洞、能以电子信号來偵測細胞及具有信号分析的自动化。1953年 Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究，设计了一个流体系统：使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过而其外层则包裹着鞘液，细胞悬液和鞘液都保持着高速层流运动状态，使細胞能在液柱的中央內一个接一个地流动，并依此原理设计出了红细胞光学自动计数器，奠定了现代流式细胞术中流体聚焦技术的基础。1965年，Kamemtsky 等提出两个设想，即用分光光度计定量细胞成分和结合测量值对细胞进行分类。 1967年，Kamemtsky 和 Melamed 在 Moldaven 的方法基础上提出细胞分选的方法。Fulwyler 結合了Coulter technology 及 RG Sweet 給电脑噴墨打印机使用的噴墨技术（ink jet technology）而发展出第一台具有篩选（sorting）功能的流式細胞筛选仪，即现在的 cell sorter 的前身。噴墨技术的基本原理即是利用高頻率振盪的噴嘴（vibration of nozzle），將液柱（stream）分裂成液滴（drop）並使打算筛选的液滴帶上电荷，再利用高压电场使液滴產生偏折而被导入收集管中。後來 Fulwyler 再加以改進，依照 Coulter 仪器測量到的电子信号 ‘Coulter volume’來決定給予含有特定細胞大小的液滴帶相应的电荷，然后利用电场使之偏折，如此即可分离出特定的細胞种类。1969年，Van Dilla 发明第一台荧光检测细胞计。此仪器利用 argon laser 取代传統的显微鏡灯源以激發荧光物质，並結合 hydrodynamic focusing 及 Fulwyler’s sorter 的技术，发展了今日流式細胞仪 FACS（fluorescence activated cell sorter）的前身。不久，以 Stanford 大学 Herzenberg 教授為首的团队发展出类似的仪器，除了上述特点外，还結合 multi-parameter fluorescence、light scatter、coulter volume 及 cell sorting 的功能，确立了现在广为使用的FACS 的架构。当今兩大FACS cytometer 的制造厂商，总部位於美國東岸的Coulter公司（Beckman Coulter）、西岸的 Becton Dickinson （BD），即分別由 Coulter Technology 及与 Stanford 大学研究的技术结合所衍生出來的。

1980年代第一台双激光四色荧光流式细胞仪和第一台商业化分选型流式细胞仪问世。2000年高精度数字化颜色补偿技术ADC (Advanced Digital Compensation)应用于流式平台。单激光五色流式细胞仪FC500/MCL和具有EV参数、同时进行绝对计数和精确测定细胞体积的流式细胞仪Quanta SC于2003年以后相继问世。贝克曼库尔特公司将临床实验室仪器自动化的理念引入流式细胞仪推出了流式细胞仪自动进样（multiple Plate Loading，MPL），实现了24孔、96孔普通和深孔板，24和40支试管自动进样。 Dako公司创建的Moflo和Cyan，能高速、精确分析和分选目标蛋白和细胞。2009年第一台三激光十色荧光的分析型流式细胞仪Gallios/Navios，问世，次年又有了带温控和远程维修系统的Gallios。BD 推出的高速分选型流式细胞仪FACSAria III，使用6 个不同波长的激发激光，可同时探测18色荧光。

3、库尔特原理 ( Coulter Principle) ^<1>

参见图1，一个容器中的微孔池（1-1) 被微孔管（1-2) 分成两个部分, 两个部分仅由一个微孔（1-5）相通连结。两个电极（1-6）、（1-7）分别置于容器的两个部分，于是微孔电流就在通路中形成（1-8)。当悬浮在弱电解质溶液中的一个粒子，如血细胞（1-4）通过微孔时，由于粒子的阻抗比电解质溶液的阻抗大，在微孔（1-5）两端就有一个瞬时的阻抗增加。微孔阻抗改变的区域形成了一个"敏感区"。阻抗的瞬间变化产生一个电脉冲，通常被称为直流 ( Direct Current ) 脉冲，简称DC 脉冲。这一DC 脉冲的幅度与通过微孔（1-5）的粒子的体积成正比。这就是库尔特原理。利用库尔特原理就可以对通过微孔的粒子进行计数并分析粒子的大小，这种方法也被称为直流阻抗法或库尔特阻抗法。库尔特原理可以对各种不同的粒子进行分析，不仅适用于血细胞，还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域，诸如食晶、制药、化工、石化工业等，航空航天工业中同样也用来检测燃料的纯度。

库尔特原理和库尔特阻抗法是血细胞计数及分析的最为经典的原理和方法，自发明一直沿用至今，是任何一台血液分析仪和流式细胞仪所必不可少的组成部分，而其原理和方法几十年来基本上没有什么根本的改变。

 4、血液成分 ^<2>

参见图2，血液由血浆（2-1）(~58%) 和有形细胞成分（2-2）(~42% ) 组成。有形分成主要包括红细胞（2-4）( 每微升4-5 百万个， RBC 为红细胞Red Blood Cell 的简称)、白细胞（2-5）( 每微升5~9 千个， WBC 为白细胞White Blood Cell 的简称) 和血小板（2-3）( 每微升20-40 万个， PLT 为血小板Platelet 的简称) 三大类。

白细胞（2-5）可以粗分为粒性白细胞(Granulocyte)，淋巴细胞（2-9）(Lymphocytes) 和单核细胞（2-10）(Monocyte)。粒性白细胞包括嗜碱粒细胞（2-8）( Basophil) ，嗜酸粒细胞（2-7）(Eosinophil) 和中性粒细胞（2-6）(Neutrophil)。所以白细胞可以细分为五个亚细胞群，即淋巴细胞（2-9）、单核细胞（2-10）、中性细胞（2-6）、嗜酸细胞（2-7）、嗜碱细胞（2-8）。

5、淋巴细胞亚群，淋巴细胞（lymphocyte，L）：属白细胞的一种，由淋巴器官 产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。可分为大淋巴细胞和小淋巴细胞，前者直径在10—15um，占10%，后者直径6—10um，占90%。胞体呈圆形或椭圆形。成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK自然杀伤细胞三种。这三种淋巴细胞又分别存在着许多不同功能的亚群。T淋巴细胞主要杀伤病原体感染细胞及肿瘤细胞。B淋巴细胞是免疫系统中细胞。1、产生的抗体可与抗原起特异性的结合，如中和细菌的外毒素使其失去毒性作用；2、抗体与抗原结合后形成的复合物易被吞噬细菌清除；3、抗体与抗原结合后再结合补体清除病原体。NK自然细胞识别病毒感染细胞表面表达的相应配体，NK细胞一经识别病毒感染细胞后即对之施加杀伤作用。淋巴细胞亚群无法用形态学方法区分，必需使用流式细胞术进行分析。

6、三分类和五分类血细胞分析仪，由于库尔特原理是以粒子通过微孔时电阻抗的变化产生的DC 脉冲的幅度来鉴别不同体积的血细胞，而白细胞中的中性、嗜酸、嗜碱三种细胞的体积很接近，所以仅用库尔特原理制成的血细胞分析仪只能将白细胞分为三类，故称为三分类仪器，即：中性粒细胞(GRN) ，淋巴细胞(LYM) ，和中间细胞群(MID，包括嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞)。能鉴别区分出白细胞中的五种组分(即淋巴、单核、中性、嗜酸、嗜碱细胞) 并分类计数的血细胞分析仪就是通常所称的五分类血细胞分析仪。为了达到五分类的目的，90 年代，激光光散射、射频、化学染色计数等方法相继被应用于对细胞特性的分析，出现了五分类血液分析仪。

7、基于流式细胞仪原理的激光光散射方法，为利用激光光散射，90 年代开始出现基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪，其基本原理可用图3 来说明。其核心部分是通称为流式细胞盒（3-1）(Flow Cell) 的提供液体和粒子通道的小盒，如图4 所示。在一个约4 毫米x 4 毫米x 8 毫米的石英长方柱体沿长轴在中心以某种方法(譬如激光)钻出一条直径约50 微米的直通微孔，然后从直通孔的两端磨出相对对准的两个圆锥（4-3），直至在方柱体的中心留有约70 微米长的微孔，称为微通孔（道）（4-4）(Orifice) ，这就是流式细胞盒。激光束（4-1）从水平方向射入并聚焦在微通孔（4-4）的中心，当粒子沿垂直方向通过微通孔（4-4）的中心时，就会和激光相互作用，产生前向、侧向和后向等各个方向的光散射( Light Scattering，缩写为LS ) ，即前向光散射(forward light scatter，缩写为FLS)， 侧向或90°光散射(side light scatter，缩写为SLS) ，和后向光散射(back light scatter，缩写为BLS) , 以及荧光信号。侧向或90°光散射可由90°光散射或荧光探测装置（3-9）来检测，而前后向光散射和轴向光损失可由前后向光散射和轴向光损失检测装置（3-10）来检测（在参见图3）。（4-2）表示鞘套流束，（4-5）表示样本(粒子)流束。

在图3 所示的仪器中，照明方式是激光光源（3-7）的光束转播方向(图中是水平方向) 与粒子的流动方向 (图中是垂直方向) 相互正交，这里我们称之为垂直照明方式，以便与本发明

中使用的库尔特微孔直接共轴照明方式(如图4a所示)加以区别；（发明专利： 申请号:2010101425015，申请日2010年03月09日，申请人:龚维燕, 发明创造名称:全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法及其分析仪器）。现今世界上所有基于流式细胞仪原理的光散射血细胞分析仪都是用这种垂直照明方式。

为了能使粒子一个一个相继的通过微通孔的中心，除了适当的稀释悬浮粒子的溶液浓度外，还需用鞘流束流体包围含有被测粒子的样本(粒子)流束，通称为流体聚焦法(Hydrodynamic Focusing)。在上下两个圆锥内各安装一个电极（3-3），当粒子通过微（通）孔（3-2）时，就会产生前述的微孔电流（3-4）的变化，即库尔特直流脉冲(DC)。这样，当每一个粒子通过微通孔（3-2）时，就可以同时得到几个信号，如DC 、FLS、 SLS、 BLS及荧光信号。如在上述的两个电极上再加上高频电源，就可以同时多得到一个信号，这也是库尔特先生的另一个重大发明，( US Patent 3502974 ) 称为射频法，简称为(RF) ，即Radio Frequency 的缩写。图3中，（3-1）是流式细胞盒;（ 3-5）是鞘套流束；（3-6）是样本(粒子)流束；（3-8）是表示聚焦透镜；（3-9） 90°光散射或荧光探测装置；（3-10）是前向光散射及轴向光损失检测装置。

对粒子内部组成成分和结构敏感的测试方法有90度光散射(SLS) , 射频法(RF) ，荧光染色技术，后向光散射(BLS)等。其中又以后向光散射最为敏感，只是由于技术上的瓶颈目前还没有解决，至今在市场上的高端血液分析仪器及流式细胞仪，没有一款能探测后向光散射的。它们只利用了其它几种方法，如Coulter MAXM 、STKS等用VCS 技术， 即 Volume (DC) , Conductivity (RF/DC) ，和Scattering( FLS )。Sysmex SE-9000 、XE-2100 等则用了DC 、LS 和荧光染色技术，ABBOTT 则有90度光散射的专利，它的仪器一般用DC 、FLS 和SLS。 在无流式细胞盒的流式细胞仪中（发明专利： 申请号:201210195447X，申请日2012年06月12日，申请人:龚维燕，发明创造名称:一种无流式细胞盒的流式细胞仪装置和方法），则用DC、FLS 和BLS及标记荧光素的特征荧光 ，是迄今世界上第一次把后向光散射应用于商业化的实用流式细胞仪中。

8、后向光散射，在激光散射粒子分析技术中，相对于其它方向的散射，后向散射对粒子的内部结构具有更高的敏感性。1979 年， Kerker M， ^<3>   等指出，只有后向光散射对细胞内部形态和结构最有敏感性，1982年Kerker    从对弹性光散射理论基础的回顾进一步指出 ^<4>   ，有关细胞的形状和内部结构的信息可以最好的从后向的光散射信号来获得。1986 年， Sloot 和Figdor ^<5>  ，在其理论文章中指出，为了最优化的探测混杂在一起的有核血细胞中不同的细胞类型，需要同时探测前向、侧向和后向的散射光。文中的计算表明，后向散射光的强度取决于细胞核对细胞质的比例及细胞核和细胞质的光学密度的变化。文中的分析特别强调了后向散射光的强度与细胞核的透明度之间的直接相关性。2004年Dakota Watson ^<6>   等也对各个方向的光散射强度与细胞形态的关系作了较详细的论述，并作了相应的实验。在以上这些工作的基础上，近年也有一些关于后向光散射的美国专利，如US Patent 6743634 B2 ( Kramer , June 1 , 2004) 和US Patent 6869569 B2 (Kramer , March 22 , 2005) 。这些专利所给出的方法，都是用多根光纤和多个光电倍增管作后向散射光信号的探测，其结构和成本都与实用的商业仪器的要求相距甚远，只能在实验室中做基础研究。

9、现有主流流式细胞仪结构；图 5 是 BD FACSVantage SE 分选型流式细胞仪的光路图。（5-1）是流式细胞盒，（5-2）是分选用偏转板及收集管等分选收集系统，（5-3）是流体监视摄像机，（5-4）是收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜，（5-5）是三台激光器，（5-6）是8个改变光路方向的光学棱镜，（5-7）是接收前向散射光的光电二极管，（5-8）是接收侧向散射光的光电倍增管，（5-9-1）到（5-9-8）是接收荧光信号的8个光电倍增管，（5-10）是其余的分光镜、滤光片、透镜等。可以注意到，不同波长的荧光信号从收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜（5-4）出来时是混合在同一光路中的，凡要分出单一波长的荧光信号，就必须要用至少一个分光镜，一个滤光片（有时还要用多个），图 5 中就有共10个这类镜片，不仅结构复杂，光路难调，而且损耗大。本实用新型的装置只用单个分光色散元件，在结构、调整、损耗和性能上有无可比拟的优越性。参考文献：1．Wallace H. Coulter, US Patent 2656508 "MEANS FOR COUNTING  PARTICLES SUSPENDED IN FLUID” ,  1953；2．Haematology Timetable (1995), Jane Pittaway, Med Lab Prac 1 CXA101, UC Davis.；3．Kerker M, et al., "Light scattering and fluorescence by small particles having  internal structure.", J Histochen Cytochem, 1979 Jan;27(1):250-63；4．Kerker M, “Elastic and inelastic light scattering in flow cytometry ”, Cytometry, 1983 Jul;4(1):1-10；5．P.M.A. Sloot and C.G.Figdor, "Elastic light scattering from nucleated blood cells: rapid numerical analysis", Applied Optics, Vol. 25, Issue 19, pp. 3559-3565 (1986)；6．Dakota et al., "Elastic Light Scattering from Single Cells: Orientational Dynamicsin Optical Trap", Biophysical Journal, Vol. 87, August 2004, pp1298-1306.；7. 发明创造名称: “全功能血液分析仪器中库尔特微孔的共轴照明方法及其分析仪器”申请号或专利号:201010142501.5;  申请人或专利权人: 龚维燕;8.发明创造名称: “一种无流式细胞盒的流式细胞仪装置和方法” 申请号或专利号:201210195447X;  申请人或专利权人: 龚维燕;9. US Patent “Coaxial Illumination Of Coulter Aperture In Full    Function Hematology Analyzer” Application No：12860166    Inventor Name：Weiyan GongFilling Date：20-AUG-2010。

发明内容

本实用新型正是针对现有技术中存在的技术问题，提供一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置，该装置整体结构简单，操作方便，并且解决了现有技术中成本较高，精度低，性价比低的缺陷。

为了实现上述目的，本实用新型采用的技术方案为，一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置，其特征在于，所述装置包括色散元件，激光光源，经光栅合束后的多波长激发光耦合进入一根多模光纤；相应的光学系统将多模光纤输出端的多波长激发光以平顶光斑的光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞或粒子上，进行检测。

作为本实用新型的一种改进，所用激光器是下列任一种或几种组合：液体激光器，气体激光器，如He-Ne 激光器，Ar离子激光器，半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器。该技术方案避免了世界上现有主流流式细胞仪中因聚焦光斑的高斯光束能量分布轮廓所带来测量误差，提高了测量的精度。与世界上现有占市场主导地位的流式细胞仪相比，具有明显的性价比和市场优势。

作为本实用新型的一种改进，所述多波长激发光为紫外光、可见光、红外光中的一种和几种。

作为本实用新型的一种改进，所述激发光源是下列任一种或几种：激光器，LED（发光二极管），气体放电光源。

作为本实用新型的一种改进，当使用的激发光源为激光器时，聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于激光与细胞或粒子相互作用区的沿激光传播的前进方向上的横截面（当使用库尔特微孔的共轴平行照明方法时，激光传播的前进方向与库尔特微孔轴同轴，激光与细胞或粒子相互作用区为整个库尔特微孔，聚焦激光束在焦点处的光腰大小略小于库尔特微孔的直径），而聚焦激光束在焦点处的瑞利范围（Rayleigh Range）则大于几个激光与细胞或粒子相互作用区沿激光传播的前进方向上的长度，（当使用库尔特微孔的共轴平行照明方法时，激光与粒子相互作用区为整个库尔特微孔，聚焦激光束在焦点处的瑞利范围（Rayleigh Range）则大于几个库尔特微孔的长度）。

作为本实用新型的一种改进，所述多波长的激发光的光束组合器（beam combiner)所采用的色散元件，包括平面和凹面反射光栅、平面和凹面透射光栅、多模光纤束，导光管（Lightpipr）、光波导（Lightguide) 等单一色散元件或几个色散元件组合。

作为本实用新型的一种改进，所述当采用光栅的正向色散时，可以用于流式细胞仪中的多波长荧光信号的收集。由于只需用单一色散元件（光栅），与世界上现有主流流式细胞仪中使用的复杂的多个滤光片和分光器组合的多色荧光信号的收集装置相比，在结构和调整上有本质的简单和优化，故障率大为减少，成本大幅度降低。

作为本实用新型的一种改进，可用于流式细胞仪中多波长分色散射光的探测。世界上现有主流流式细胞仪中仅能探测混合波长（如用三激光激发，则所探测的前向和后向散射光都包含有三个激发激光的波长）。世界上现有主流流式细胞仪中只有两个散射光信号通道，这里所述的多波长分色散射光的探测装置和方法，（如用三激光激发，则所探测的散射光经光栅色散后，前向和后向散射光都各有三个通道），使世界上现有主流流式细胞仪中只有两个散射光通道的散射光信号增加到六个散射光通道的散射光信号，为仪器增加了四各可用参数。

作为本实用新型的一种改进，所述装置用于流式细胞仪中或者还可用于其他细胞、动物血细胞、其他微小粒子，及对材料有颗粒度及粒子内部成分有要求的各个工业领域：食晶、制药、化工、石化工业的检测以及航空航天工业中可用来检测燃料的纯度。

作为本发明的一种改进，所述装置应用于任何需要使用包含多波长的单一光束作光源的任何实验室、工业和商业仪器和设备。

作为本实用新型的一种改进，所述多波长光束合束装置接受每一色荧光信号的整个荧光光谱分布，这样不仅增加了信息量，还可大大简化世界上现有主流流式细胞仪中复杂的荧光补偿程序，所述的方法在本人的另一专利“流式细胞仪中多色荧光信号整个荧光光谱分布的探测装置和方法及其在荧光补偿中的应用”中有详细描述。

相对于现有技术，本实用新型的优点如下，1）整体结构简单、操作方便、成本较低；2）该技术方案使用光学光栅作为多波长激发光的光束合束装置，替代世界上现有主流流式细胞仪中使用的复杂的多个滤光片和分光器组合的激发激光光束集束装置，使仪器在结构和调整上有本质的简单和优化，故障率大为减少，成本大幅度降低；3）该技术方案使用光学光栅，以逆向色散的工作方式构成多波长激发光的光束合束装置，与世界上现有主流流式细胞仪中使用的复杂的多个滤光片和分光器组合的激发激光光束集束装置相比，激发光能量的损耗降低到最低程度。4）经光栅合束后的多波长激发光耦合进入一根多模光纤，相应的光学系统将多模光纤输出端的多波长激发激光以平顶光斑的光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞上，避免了世界上现有主流流式细胞仪中因聚焦光斑的高斯光束能量分布轮廓所带来测量误差，提高了测量的精度。

附图说明

图 1：库尔特原理

     1-1    微孔池

1．    微孔管

     1-3    血细胞悬浮液

     1-4    血细胞

     1-5    库尔特微孔

     1-6     外电极

     1-7     内电极

     1-8     微孔电流

     1-9     真空（6“Hg）

图 2：血液的组成成分

2-1           血漿

2-2           血液的有形成分

2-3            血小板

2-4           红血球

2-5            白血球

2-6           中性粒细胞

2-7           嗜酸粒细胞

2-8           嗜碱粒细胞

2-9           淋巴细胞

2-10     单核细胞

图 3：基于流式细胞仪的光散射血分析仪的基本原理

   3-1     流式细胞盒

   3-2     库尔特微孔

   3-3     电极

3-4     微孔电流

3-5     鞘套流束

3-6     样本 (粒子) 流束

3-7    激光光源

3-8    聚焦透镜

3-9    90°光散射或萤光探测

  3-10   前向光散射及轴向光损失

图 4：流式细胞盒

4-1         激光束

4-2         鞘套流束

4-3         园锥

4-4         微通道 (Orifice)

   4-5    样本 (粒子) 流束

图 4a1垂直照明方式粒子与激光的相互作用示意图；

图4a2平行照明方式粒子与激光的相互作用示意图；

图 4a3垂直照明方式整个过程示意图；

图4a4平行照明方式整个过程示意图；

    4a-1     垂直照明中粒子开始进入激光光束时光电探测器开始产生电脉冲

    4a-2     垂直照明中粒子处于激光光束中心时，相应的电脉冲达到峰值

    4a-3     垂直照明中粒子离开激光光束时，电脉冲回到噪音水平

    4a-4     平行照明中粒子刚进入库尔特微孔

    4a-5     平行照明中粒子在库尔特微孔内

    4a-6      平行照明中粒子刚离开库尔特微孔

    4a-7      垂直照明方式

    4a-8      平行照明中激光的光轴，也是库尔特微孔中心轴

    4a-9      平行照明中的激光光束

4a-10     细胞粒子

    4a-11    库尔特微孔片的厚度（300 μm）

4a-12    平行照明中粒子通过库尔特微孔时电脉冲波形

图 5：BD  FACSVatage  SE 流式细胞仪光路图

     5-1     流式细胞盒

     5-2     分选用偏转板及收集管等分选收集系统

     5-3     流体监视摄像机

     5-4     收集荧光和侧向光散射的显微镜物镜

     5-5     三台激光器

     5-6     8个改变光路方向的光学棱镜

     5-7     接收前向散射光的光电二极管

     5-8     接收侧向散射光的光电倍增管

     5-9   （5-9-1）到（5-9-8）是接收荧光信号的8个光电倍增管       

     5-10   其余的分光镜、滤光片、透镜等（共10个这类镜片）

图 5a:  凹面反射光栅色散示意图；

图5a1：凹面反射光栅色散示意图；

图 5b:  以逆向色散方式将凹面反射光栅用作多波长激发激光的光束合束装置

图 6：  激光输出光束耦合到多模光纤；

图 7-1：  SMA接头其输出光束轮廓为平顶均匀光强分布；

图 7-2：  聚焦光斑的光束能量分布轮廓图；

图 8:    用一对柱面透镜对照明激光作光束整形

图 9:   细胞粒子通过照明激光时，激光强度有5％的波动

图 10:  合束装置中罗兰圆成象光学系统

图 11:  合束装置中凹面光栅逆向色散成象光学系统

图 12:  库尔特微孔的同轴平行照明中聚焦激光束的光腰充满库尔特微孔

图 13:  用一对柱面透镜将从出射狭缝来的多色光耦合进入多模光纤

图 14:  交叉型  Czerny-Turner

图 15:  非交叉型  Czerny-Turner。

具体实施方式

为了加深对本实用新型的理解和认识，下面结合附图对本发明作进一步描述和介绍。

、光学光栅多波长激发激光的光束合束装置

   为了实现多波长激发激光的光束合束，本实用新型将单个光学凹面反射光栅以逆向色散的工作方式，将多个波长不同的激发激光束集合为混合波长的单一光束。凹面反射光栅为刻划面或复制面为凹形曲面的反射光栅。兼有色散和聚焦双重作用。凹面光栅（concave grating）又称罗兰光栅（Rolland grating）。它的作用是使光既衍射又聚焦。因而凹面光栅摄谱仪只需光栅、狭缝及感光板(或CCD、光电二极管列阵等光电接收装置）三部分。它可减少吸收现象，只存在光栅面一次反射的光损失，且无色差。可用于远紫外光谱、可见光谱及远红外光谱区域。还有一种利用全息技术获得的凹面光栅，与机刻凹面光栅相比，具有无鬼线、像差小、信噪比高和制作成本低等特点。更有一种消象差非球面平场全息凹面光栅，除可进一步消除部分球差，提高平场光谱仪的分辨率外，由于该种光栅的相对孔径较大，提高了对信号光的收集本领，可使平场光谱仪的结构更为紧凑，以实现光谱仪器的小型化。在口径、相对孔径，以及入射狭缝宽度均相同的情况下，由非球面全息凹面光栅构成的平场光谱仪较由全息凹球面光栅构成的平场光谱仪具有更高的分辨率。

反射凹面光栅用于光谱仪的色散原理示意图如图 5a 所示。与上述色散装置相反，以逆向色散方式将凹面反射光栅用作多波长激发激光的光束合束装置，如图5b所示。图5b显示了三种波长不同的激发激光（红，绿，紫）。然后把此单一光束耦合进入一根多模光纤，相应的光学系统将多模光纤输出端的多波长激发激光以平顶光斑的光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞上，避免了世界上现有主流流式细胞仪中因聚焦光斑的高斯光束能量分布轮廓所带来测量误差，提高了测量的精度。

、单块凹面反射光栅多波长激发激光的光束合束装置。

   如背景技术8中所述，(见图5)  5-5(1-3)是三台不同波长的激发激光器，为了将这3个波长不同的激发激光束集合为混合波长的单一光束，共用了8个改变光路方向的光学棱镜5-6(1-8)。本实用新型采用单块凹面反射光栅（concave reflecting grating），它的作用是使光既衍射又聚焦，并以逆向色散方式将凹面反射光栅用作多波长激发激光的光束合束装置，如图5a所示。然后再把此然后再把此一包含多波长的单一光束集束耦合到一根多模光纤中。

、单根多模光纤的输出用聚焦光学系统以平顶光斑光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞或粒子上。

 有多种方法可以对单根多模光纤的输出激光光束进行整形，现略举一二。一家意大利公司 “Bright Solutions”(www.brightsolutions.it ,中国代理“德龙激光”）有 Flat Top Beam Profile （平顶光束轮廓）的光纤耦合激光器产品。该技术方案利用最简单的光纤耦合激光器，其输出光束轮廓为平顶均匀光强分布。Olympus公司技术文章 “Laser Systems for Confocal Microscopy” （“共焦显微镜的激光系统”，作者：Kenneth R. Spring - Scientific Consultant, Thomas J. Fellers and Michael W. Davidson ）中指出，多模光纤允许多个模在光纤中传播，并且不限于单一波长。其内核直径在100 μm 至1.2 mm 的范围，比单模光纤内核直径大。多模光纤的输出光能量具有平顶轮廓（通常称为 top-hat profile）。 该技术方案使用SMA接头，其输出光束轮廓为平顶均匀光强分布。SMA 接头由于其有限的固定精度，故仅适用于多模光纤，并具有的平顶轮廓的输出。

对世界上现有主流流式细胞仪中因聚焦光斑的高斯光束能量分布轮廓所带来测量误差分析如下。传统流式细胞仪中, 与细胞粒子相互作用的照明激光强度并不是一个常量。这在经典的流式细胞仪教科书中都有论及。如“Practical Flow Cytometry” by Howard M. Shapiro, M.D. 和 “Flow Cytometry：Instrumentation and Data  Analysis” by Marvin A. Van Dilla et al., Academic Press, 1985。兹引用上述第二篇中的两个图来加以说明：      

注意图 8中照明激光用了一对柱面透镜，使光束在水平和垂直方向有不同的尺寸(水平方向尺寸120μm --200μm, 垂直方向尺寸约25μm), 其作用在下图中阐述。                  

    传统流式细胞仪中，粒子一个个通过光束汇聚的探测敏感区域, 由于流体聚焦的波动性，细胞粒子不可能精确的在流式细胞盒微通道的中心轴，一般有+/- 5 μm 相对于微通道的中心轴线的偏差。因为激光光束的强度分布为高斯分布，为了保证细胞粒子流过微通道时，激光强度的变化保持在5%以内，照明激光用了一对柱面透镜，把其中一个方向的光束尺寸增加到120μm~200μm 的范围，如图9所示。本实用新型使用的平顶均匀光强分布照明光束，可使这一个5％的误差减少到最低程度，从而提高了检测的精度。

4、逆向色散工作方式的凹面反射光栅及相应光学系统的特殊设计。

    罗兰光学系统在微小型光谱仪的设计中有着很大的应用价值, 是最简单的凹面光栅光学成像系统,如图 10 所示。多色激发激光分别置于罗兰圆上相应的位置，经凹面光栅衍射和聚焦后，成像于出射狭缝处，再经光学系统耦合到多模光纤中去。图 11 中凹面光栅逆向色散成象光学系统的设计，需统筹考虑出射和入射狭缝宽度、激发激光进入罗兰圆前的光束整形光学透镜组的设计（要求激发激光能充满整个凹面光栅的反射面），要求光纤中心、狭缝中心、光栅转轴中心和激发激光进入罗兰圆的位置都在(距底板，图11 中未示出）同一个高度（h)上。需沿Y 轴平移光栅以保证出射狭缝与光栅中心的距离为设计值 D1等。          

本实用新型的实施主要是采用了反射凹面光学光栅，以逆向色散的工作方式构成多波长激发激光的光束集束装置。以图 5b 中凹面光栅逆向色散成象光学系统来具体实现的。库尔特微孔的同轴平行照明中聚焦激光束的光腰充满库尔特微孔,如图 12所示。凹面反射光栅为刻划面或复制面为凹形曲面的反射光栅。兼有色散和聚焦双重作用。它可减少吸收现象，只存在光栅面一次反射的光损失，且无色差。可用于远紫外光谱到远红外光谱区域。本发明利用全息技术获得消象差非球面凹面光栅，与机刻凹面光栅相比，具有无鬼线、像差小、信噪比高和制作成本低等特点。除可进一步消除部分球差，提高分辨率外，由于该种光栅的相对孔径较大，提高了对光的收集本领，可使仪器的构更为紧凑，以实现仪器的小型化。

本实用新型使用了激发激光耦合到多模光纤后可聚焦为平顶光斑的光束能量分布轮廓，聚焦到待检测的细胞上，提高了仪器的检测精度。具体是用一对柱面透镜来实现的，如图 13 所示。       

图14、图15是本实用新型·提供的两个具体实施例的示意图，它们是在图9的基础上，采用 Czerny-Turner 型系统以减小像差和实现小型化。可用于本发明的实施例。

需要说明的是上述实施例，并非用来限定本实用新型的保护范围，在上述技术方案的基础上所作出的等同变换或替代均落入本实用新型权利要求所保护的范围。

Claims (2)

1.一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置，其特征在于，所述装置包括色散元件，激光光源，经光栅合束后的多波长激发光，耦合进入一根多模光纤；相应的光学系统将多模光纤输出端的多波长激发光以平顶光斑的光束能量分布轮廓聚焦到待检测的细胞或粒子上，进行检测，所述多波长激发光为紫外光、红外光中的一种和几种，所述激发光源是下列任一种或几种：激光器，LED，气体放电光源，所用激光器是下列任一种或几种组合：液体激光器，气体激光器，He-Ne 激光器，Ar离子激光器，半导体激光器，光纤藕合半导体激光器，固体激光器，光纤藕合固体激光器，半导体激光泵浦固体激光器，可调谐激光器，光纤激光器。

2. 如权利要求1所述的一种采用光栅逆向色散的多波长光束合束装置，其特征在于，所述多波长激发光的光束组合器所采用的色散元件，包括平面和凹面反射光栅、平面和凹面透射光栅、多模光纤束，导光管、光波导单一色散元件或几个色散元件组合。