CN111044435B - 一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统 - Google Patents

一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统，其包括激光器Ⅰ、激光器Ⅱ、激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ、2个以上的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ、聚光镜、带通滤光片、长或短通滤光片；本发明在传统流式细胞仪基础上进行改进，使得哺乳动物xy精子在识别性别的同时，对精子质量多个指标进行同步检测，使分选精子的质量得到大幅度提高。

Description

一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统
技术领域
本发明属于哺乳动物生殖细胞分选技术领域，具体涉及一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统。
背景技术
流式细胞术（FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。
流式细胞仪集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种先进的检测仪器。是进行细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学等研究的重要工具，它由液流系统、光学系统、分选系统和数据处理系统等所组成，能够定量测定精子等多种单个细胞的细胞膜、胞浆以及核内的多种物质，而且具有测定快速、精确、多参数的特点。与传统的荧光显微镜相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴下方配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入指定的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
流式细胞高速分选术是被生产的后代证实有效的性别控制技术，可以获得高纯度的X、Y精子。利用流式细胞分离仪分离哺乳动物XY精子的性别控制技术，是根据哺乳动物X精子的DNA 含量比Y精子多的原理。利用Hoechst 33342该种特异性的活细胞荧光染料，将精子的DNA染色，被 355 nm 的紫外光激发后发出450 nm 的蓝色荧光。Hoechst 33342 选择性结合DNA双链中的小沟，更倾向于富含腺嘌呤/胸腺嘧啶(A/T)的序列。X、Y精子在DNA含量上的差异使其结合的荧光染料量也有差异，当他们被激光照射时，所释放出的荧光信号强弱也有差异（X 精子较强），此信号通过仪器的计算机系统扩增和识别，当含有精子的液体离开激光系统时，变成含精子的微液滴并被充上正（X精子）或负（Y精子）电荷，借助偏斜板（电场）把X或Y精子分别引导到2个收集管中，分辨不清的精子被抛弃。准确分辨X和Y精子的关键在于正确定位、染色等。检索主要依靠头部染料结合后荧光信号的强弱来判断。哺乳动物精子头部扁平，激光从不同角度照射所激发的荧光强度差异很大（精子的扁平面向着检测器时荧光低，边缘向着检测器时高），很容易掩盖X、Y精子DNA差异带来的微弱的荧光强度差异。当精液通过检索系统时，定位正确的精子被准确分离，不正确的和分辨不清的被丢弃。用 Hoechst 33342染色结合流式分选，可以区别DNA含量差别＜3%的细胞，即可通过流式细胞仪将X精子和Y精子分离开。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统，该系统在进行哺乳动物XY精子性控检测分选的同时，还可以对精子的多个指标进行检测，如精子的顶体完整性，精子表面膜蛋白特性，可在分选过程中精确选择高质量的精子，有利于后续研究工作的开展，并为精确育种提供技术保障。
本发明用于流式细胞仪的多指标检测光路系统包括激光器Ⅰ、激光器Ⅱ、激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ、2个以上的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ、聚光镜、带通滤光片、长或短通滤光片，其中激光器Ⅰ发出的激光与激光器Ⅱ发出的激光在水平面的投影夹角呈30°，激光器Ⅰ发出的激光依次经过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ，激光器Ⅱ发出的激光依次经过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ；激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ与激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ成90°夹角，激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ与激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ成90°夹角，激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发出的激光与流式细胞仪的喷嘴发出的液流垂直相交；经过液流后的光路依次通过聚光镜、长或短通滤光片、带通滤光片到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ，经过液流后的光路依次通过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ，聚光镜均设置在遮光镜筒内。
所述激光器Ⅰ发射的激光波长为561nm，激光器Ⅱ发射的激光波长为355nm。
所述激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发射功率≥150mw。
所述激光器Ⅰ发射的激光首先与液流相交，激光器Ⅱ发射的激光在激光器Ⅰ发射激光与液流交点下方与液流相交。
本发明所述的检测器为光信号检测器（光电倍增管）。
本发明系统采用两路不同波长激光对同一细胞进行同步检测，通过获得的多项指标对细胞状态进行分析；激光器Ⅰ发出的激光用于识别液体里的有效精子细胞和精子性别以外的特征，通过激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ和激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ配合，通过散射光将液体中的精子细胞和其它杂质区分开；通过激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ和后续检测器，接收标记在精子细胞上荧光物质的发射光，识别精子性别外的其它特征，如顶体完整性等；激光器Ⅱ发出的激光用于激发识别精子细胞性别特征的荧光标记物，通过激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ和激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ配合，从互成90°两个不同角度识别与精子遗传物质结合的荧光染料Hoechst 33342的发射光，实现x精子与y精子的分辨工作；进行常规流式检测实验时，该系统可检测提供双前向双侧向信号，提高小颗粒和异型细胞检测精度；两路激光入射角度相差30°，在激发后聚光镜前设置遮光镜筒，避免激光和发射光的相互干扰。
附图说明
图1为本发明系统光路俯视结构示意图；
图2为两激光光路与液流相交及相应光路检测器Ⅰ位置示意图；
图3为哺乳动物XY精子检测全图，圈出部分为检测到的xy精子；
图4为哺乳动物XY精子局部识别图，上部圈出的为x精子，下部圈出的为y精子；
图5为哺乳动物XY精子质膜完整性检测图；
图中：1-激光器Ⅰ；2-激光器Ⅱ；3-激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ；4-激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ；5-激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A；6-激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B；7-激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C；8-激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ；9-聚光镜；10-带通滤光片；11-长通滤光片；12-激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D；13-液流；14-遮光镜筒。
具体实施方式
下面通过和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：如图1-2所示，本实施例用于流式细胞仪的多指标检测光路系统包括激光器Ⅰ1、激光器Ⅱ2、激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ3、激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ4、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6、激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ8、聚光镜9、带通滤光片10、长通滤光片11，其中激光器Ⅰ发射的激光波长为561nm，激光器Ⅱ发射的激光波长为355nm，下述聚光镜均设置在遮光镜筒14内，激光器Ⅰ1发出的激光与激光器Ⅱ2发出的激光在水平面的投影夹角呈30°，激光器Ⅰ1发出的激光依次经过聚光镜、带通滤光片（561nm/20）到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ3，激光器Ⅱ2发出的激光依次经过聚光镜9、带通滤光片10（355nm/20）到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ4；激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ3与激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5成90°夹角，激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6、并排设置；激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发出的激光与流式细胞仪的喷嘴发出的液流13垂直相交且相交点距离约1mm；激光器Ⅰ发出激光与液流相交，激发液流中的检测目标上标记的荧光物质发光，荧光物质发出的发射光光依次通过聚光镜、第一个短通滤光片11（575nmsp）、带通滤光片（560nm/20）波长选择到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A5，到达第一个短通滤光片11，波长在575nm-600nm的光通过第二个长通滤光片（600nmlp）反射、带通滤光片（586nm/15）选择到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B6；激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ4与激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ8成90°夹角，经过液流后的光依次通过聚光镜、带通滤光片（460nm/20）到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ8。
上述方案中将聚光镜均设置在遮光镜筒14内，遮光罩减少两路激光的相互干扰，聚光镜将需检测的光信息集中到检测器位置，提高检测效率；激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发射功率≥150mw。
使用荧光素标记的花生凝集素（Isothiocyano-fluoresceinated peanutArachis hypogaea agglutinin；PNA-PE）和赫斯特33258（Hoechst 33258）双重荧光染色技术对精子进行染色，是可对精子顶体反应分析和授精效率进行评价的最常用的方法。首先使用赫斯特33258染色，激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ8前带通滤光片设置为460nm/20，用于接收荧光染料Hoechst 33258发出的荧光，分析精子活力，荧光强度高者为死亡精子，荧光强度低者为基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特点，受到活体精子细胞（包括游动性和非游动性精子）的排斥，而容易进入死亡精子细胞。激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B6接收PNA-PE使用荧光素标记的花生凝集素染料发出的荧光，PNA-PE与顶体外膜糖蛋白上的半乳糖残基的结合，显示检测顶体完整性顶体，同时可以应用于受精时的精卵反应。双染的作用，以帮助区分生理性反应性顶体缺失或病理性退行性顶体缺失。通过常用的荧光显微镜便可清晰观察到红色顶体状态。
实施例2：本实施例光路系统结构同实施例1，不同在于还包括激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D 12，这两个检测器位于激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6光路后；激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7与激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6并排设置；到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6前长通滤光片的波长600nm-720nm的光通过长通滤光片再经过激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7前长通滤光片（720nmlp）反射、带通滤光片(650nm/20)选择到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C7；激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D 12与激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5成90°夹角，通过长通滤光片（720nmlp）的光通过激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D 12前长通滤光片、带通滤光片到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D12；
在流式细胞仪的喷嘴下方靠近喷嘴处，选用功率大于150nw波长为561nm的激光作为第一激发光，常规流式细胞仪采用488nm激光器作为第一激发光，因为488nm激光器的激发光与精子性别筛选必须的hoechst33342荧光染料发射波长（峰值460nm）接近，容易产生相互干扰，因故改成561nm激光器；
（1）将561nm激光的激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ2（前向检测器）和激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5（侧向检测器）前的带通滤光片设为561nm/20带通滤镜，分别获取检测样本的前向信号和测向信号，可判断样品单个细胞体积大小和折光率信息，用以将样本和液体中的杂质分辨开；
（2）561nm激光光路的激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ2（前向检测器）和激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5（侧向检测器）夹角呈90度，从两个方向获取检测细胞的相关指标；
（3）561nm激光光路的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A 5、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6、激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7之前的长通滤光片11和带通滤光片设为可更换模式，根据实际检测需求进行更换；在本实施例中，激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-A5前短通滤光片设置为580nmSP，带通滤光片设置为561nm/15，激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6前长通滤光片设置为600nmLP，带通滤光片设置为586nm/15，用于接收荧光染料Annexin V-pe、 PE或类似波长荧光染料被激发发射的荧光；激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7前长通滤光片设置为720nmLP，带通路光片设置为650nm/20，用于接收荧光染料7-aad、PE-cy5或类似波长荧光染料被激发发射的荧光；激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D 12前带通路光片设置为760nm/20，用于接收荧光染料PE-cy7或类似波长荧光染料被激发发射的荧光；
（4）在561nm激光与液流交点下方约1mm处设置功率大于150nw、波长为355nm的第二激光光路，两路激光在水平面的投影夹角为30°；两激光投影30°可减少两激光检测光路的相互干扰，也不会因为布置光路遮挡正面检修窗口的原因导致喷嘴无法维护；
（5）355nm激光光路检测的荧光信号检测精子性别差异；哺乳动物含X染色体的精子比含Y染色体的精DNA含量多（可识别物种差异多在3%-4%），用DNA荧光染料（Hoechst33342）对精子进行染色后，用355nm激光充分激发荧光染料，从90°的两个方向分别获取染料的荧光强度，结合软件分析可识别出X、Y精子；激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ4和激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ8夹角呈90°，从两个方向获取检测细胞的遗传物质量的荧光指标，第一方向信号确认精子通过液流的方向，第二方向信号确认精子遗传物质量的差异，综合两个信号共同确认精子的性别信息（图3、4）；
（6）通过561nm激光激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ3获得检测细胞前向信号，光路检测器Ⅱ-A 5获得检测细胞侧向信号，这两个信号配合确认检测目标，并排除掉液流里的其它杂质、状态不好细胞和成团细胞；561nm激光的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-B 6接收标记在细胞上荧光染料Annexin V-pe的发射光、561nm激光的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-C 7接收标记在细胞上荧光染料7-aad的发射光，Annexin V-pe荧光的强弱反映细胞凋亡的情况，7-aad荧光的强弱反映细胞死亡的情况；激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ-D 12获取精子顶体及其它膜蛋白信号（图5）；
（7）355nm激光器光路获得的精子性别信息，通过计算延时与561nm激光的检测信号统一，多指标同时反映同一检测目标信号；在分选时可以通过逻辑选框对精子质量好的特定性群落进行选定，提高了分选出精子的质量；也可通过该系统进行不同药物处理对不同性别精子活力的影响的研究，研究生存环境变化带来的生殖问题。

Claims (3)

1.一种用于流式细胞仪的多指标检测光路系统，其特征在于：包括激光器Ⅰ、激光器Ⅱ、激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ、2个以上的激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ、激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ、聚光镜、带通滤光片、长或短通滤光片，其中激光器Ⅰ发出的激光与激光器Ⅱ发出的激光在水平面的投影夹角呈30°，激光器Ⅰ发出的激光依次经过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ，激光器Ⅱ发出的激光依次经过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ；激光器Ⅰ光路检测器Ⅰ与激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ成90°夹角，激光器Ⅱ光路检测器Ⅰ与激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ成90°夹角，激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发出的激光与流式细胞仪的喷嘴发出的液流垂直相交；经过液流后的光依次通过聚光镜、长或短通滤光片、带通滤光片到达激光器Ⅰ光路检测器Ⅱ；经过液流后的光依次通过聚光镜、带通滤光片到达激光器Ⅱ光路检测器Ⅱ，聚光镜均设置在遮光镜筒内;
所述激光器Ⅰ发射的激光波长为561nm，激光器Ⅱ发射的激光波长为355nm。
2.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的多指标检测光路系统，其特征在于：激光器Ⅰ、激光器Ⅱ发射功率≥150mw。
3.根据权利要求1所述的用于流式细胞仪的多指标检测光路系统，其特征在于：激光器Ⅰ发射的激光首先与液流相交，激光器Ⅱ发射的激光在激光器Ⅰ发射激光与液流交点下方与液流相交。
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