CN102645397A - 基于流式细胞术的精子质量评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以透膜的核酸荧光染料及不透膜的核酸荧光染料与待检标本共同染色，然后以荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育，进行流式细胞检测，得出最终检测结果，所述荧光标记单克隆抗体能与精子顶体膜反应，所述荧光标记单克隆抗体与透膜核酸荧光染料、不透膜的核酸荧光染料的激光激发光波长差距均为100～200nm，荧光散射波长差距均为75～150nm。本发明通过一次检测可同时获得多个参数结果，得出精子凋亡率、质膜完整率和成活率，降低检测工作强度，能满足临床对大批量样本检测的需要。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及基于流式细胞术的精子质量评估方法。
背景技术
精子质量评估是评判男性生育能力的一项很重要的指标。传统的精子质量评估技术，是采用相差显微镜和专用的血细胞计数板，用肉眼进行观察，主要对精子数量、精子活力和精子形态进行评估和分析。近二十年来，随着计算机技术的不断进步，临床上出现了采用专门的分析软件结合高分辨率的图像采集装置，对精子质量进行评估分析。主要评估的指标与传统精子质量评估方法相同。虽然计算机辅助精子质量评估方法（CASA）减轻了肉眼评估的工作强度，尤其对精子活力的评估较传统方法更加准确，但在精子细胞计数方面，精子和杂质的区分仍然需要人工进行校正。近十年来，又出现了采用荧光显微镜和计算机技术相结合的荧光CASA技术，其优点是采用吖啶橙核酸荧光染料对精子DNA染色，可以很好地将精子细胞和杂质区分开来，提高了精子细胞计数的准确性。无论是传统的精子质量评估方法还是计算机辅助精子质量评估方法（包括荧光CASA），都不可能对全部的精子进行质量评估。用这些方法评估精子质量的统计学数量为400个精子细胞。
采用流式细胞术（FSM）对精子质量进行评估分析，是近几年来刚刚兴起的一项新技术。国外已经有了相关的报道，但仍停留在研究的水平，检测指标比较单一，缺乏标准化，也未见专门的精子多指标联合检测试剂产品或方法出现，使得该技术至今仍无法替代传统的精子质量评估方法，无法在临床上得到广泛的应用。传统的检测精子质量的流式细胞术是采用一个透膜的核酸探针和一个不透膜的核酸探针进行联合检测，这种方法检测精子质量的一个指标容易，但同时检测多个指标较难，如检测精子质膜完整性一个指标比较容易，但是再加入荧光标记物同时检测精子顶体的完整性就比较困难，这涉及到这三种荧光相互之间干扰，使得流式细胞仪的检测不稳定，很难重复。具体地讲，流式细胞术检测细胞是通过激光激发荧光，通过检测细胞的散射荧光强度来评估细胞的性状。如果要检测细胞的多个性状，则需要采用多个荧光标记物，但如果多个荧光标记物的波长比较接近，则流式细胞仪无法区分各个不同波长的荧光强度，造成荧光散射信号的相互干扰重叠。
因此，现有技术存在的缺点如下：（1）统计学分析的数量有限，分析结果的真实性不够；（2）人为因素对结果的影响较大，分析结果的准确性不够；（3）由于分析的统计学数量过少，为确保结果的准确性和重复性，对检测前的实验操作要求很高，工作强度较大；（4）评估分析的实验参数过于笼统，大都为精子细胞的外在表述，缺乏精子细胞内在理化性质的科学判断。
发明内容
本发明的目的在于提供基于流式细胞术的精子质量评估方法。
本发明所采取的技术方案为：
基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以透膜的核酸荧光染料及不透膜的核酸荧光染料与待检标本共同染色，然后以荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育，进行流式细胞检测，得出最终检测结果，所述荧光标记单克隆抗体能与精子顶体膜反应，所述荧光标记单克隆抗体与透膜核酸荧光染料、不透膜的核酸荧光染料的激光激发光波长差距均为100～200nm，荧光散射波长差距均为75～150nm。
优选的，荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育后，加入荧光微球，再进行流式细胞检测。
优选的，所述透膜核酸荧光染料为Syto16，不透膜的核酸荧光染料为7-AAD，荧光标记单克隆抗体为APC标记CD46单克隆抗体。
优选的，基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以核酸荧光染料Syto16和7-AAD与待检标本共同进行染色，然后以APC标记CD46单克隆抗体与染色后的待检标本进行孵育，最后加入荧光微球，进行流式细胞检测，得出最终检测结果。
优选的，上述方法包括如下步骤：
1) 取液化的精液标本，洗涤，制成细胞悬液；
2) 向细胞悬液中依次添加终浓度均为2～5 mM的Syto16、7-AAD，37℃下染色，洗涤；
3) 加入终浓度为1～3 mM的APC标记CD46单克隆抗体，37℃下孵育，洗涤；
4) 加入荧光微球，重悬，上流式细胞仪检测，根据检测数据，得出最终检测结果。
优选的，荧光微球的直径为10 μm。
优选的，步骤2）孵育时间为2～5 min。
优选的，步骤3）孵育时间为20～30 min。
优选的，步骤1）细胞悬液的细胞数为(1～5)×106个。
本发明通过透膜与不透膜的核酸荧光染料对精子进行活力评估，所述透膜是指能透过细胞膜，能同时检测出质膜完整的活力精子细胞、死亡精子细胞及正在凋亡的活力精子细胞。本发明采用荧光标记单克隆抗体，能对精子细胞群进行特异性反应，从而评估精子顶体形态的完整性。
本发明采用的荧光标记抗体与核酸荧光染料之间的激光激发光波长和荧光散射波长差距大，避免了荧光标记抗体和核酸荧光染料之间的荧光相互之间的干扰，其荧光散射波长间相互不重叠、不干扰，能有效地将荧光标记抗体和核酸荧光染料区分和识别。
本发明用直径10μm的标准荧光微珠作为精子计数的标准品，推算标本中精子的浓度，比传统计数板更加准确；用Syto16和7-AAD核酸荧光染料来检测精子质膜完整性，替代传统的精子活力指标，现有活力分级无法区分死亡精子和凋亡精子；用APC标记CD46单克隆抗体来检测精子顶体的完整性，替代传统的精子形态学分析；以上四种物质同时加入一个反应管中，进行一次性三个参数指标检测。
本发明通过Syto16和7-AAD核酸荧光染料对精子进行活力评估，Syto16和7-AAD都属于核酸型核酸荧光染料，7-AAD不能透过细胞膜，所以只能染细胞膜通透的精子细胞（即死亡细胞），Syto16分子量小具有透膜性。于是设门后的精子细胞群分为三个象限，Syto16Low/7-AAD+为死亡精子细胞，Syto16High/7-AAD—为质膜完整的活力精子细胞，Syto16Low/7-AAD—为正在凋亡的活力精子细胞。
本发明根据流式细胞检测数据，进行精子质量评估计算公式如下：
精子凋亡率= Syto16Low/7-AAD—精子群数量/7-AAD—所有精子群数量
活力精子顶体完整率= APC-CD46—/7-AAD—精子群数量/7-AAD—所有精子群数量
精子存活率= Syto16Low/7-AAD+精子群数量/检测的精子群总数量
精子浓度=（NS x FC）/NF
其中，公式中的NS为设门后检测的精子数量；FC为荧光微球标准浓度；NF为检测的荧光微球数量。
本发明采用流式细胞术（FSM）对精子质量进行评估分析的统计学数量至少为10000个精子细胞。
本发明的有益效果是：
本发明通过一次检测可同时获得多个参数结果，得出精子凋亡率、质膜完整率和成活率，降低检测工作强度，能满足临床对大批量样本检测的需要。本发明分析的统计学数量增多，一次至少能检测10000个精子细胞，确保了结果的真实性。本发明设立了阴性样本，减少了人为因素对检测结果的影响，确保了检测结果的准确性。
本发明的将流式细胞术精子质量评估分析的指标进行有效融合，实现多参数联合检测，提高了质量评估的自动化水平，从而替代现有的精子质量评估方法，为广大生殖医学工作者提供更科学可靠的精子质量评估标准，适用范围广，适用于各种哺乳动物。
具体实施方式
基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以透膜的核酸荧光染料及不透膜的核酸荧光染料与待检标本共同染色，然后以荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育，进行流式细胞检测，得出最终检测结果，所述荧光标记单克隆抗体能与精子顶体膜反应，所述荧光标记单克隆抗体与透膜核酸荧光染料、不透膜的核酸荧光染料的激光激发光波长差距均为100～200nm，荧光散射波长差距均为75～150nm。
优选的，荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育后，加入荧光微球，再进行流式细胞检测。
优选的，所述透膜核酸荧光染料为Syto16，不透膜的核酸荧光染料为7-AAD，荧光标记单克隆抗体为APC标记CD46单克隆抗体。
本发明APC标记CD46单克隆抗体中的APC为别藻青蛋白（Allophycocyanin，APC），为最常用免疫荧光标记。CD46单克隆抗体能与精子顶体膜进行特异性反应，从而评估精子顶体形态的完整性。
本发明Syto16、7-AAD的激光激发波长均为488nm，荧光散射波长分别为585nm和530nm，彼此荧光散射干扰和重叠为最低，方便流式细胞仪检测。采用的APC标记CD46单克隆抗体（以下简称APC-CD46）的激光激发光波长为635nm，荧光散射波长为661nm，能非常有效地与Syto16、7-AAD两种核酸荧光染料区分和识别。
优选的，上述方法包括如下步骤：
1) 取液化的精液标本，洗涤，制成细胞悬液；
2) 向细胞悬液中依次添加终浓度均为2～5 mM的Syto16、7-AAD，37℃下染色，洗涤；
3) 加入终浓度为1～3 mM的APC标记CD46单克隆抗体，37℃下孵育，洗涤；
4) 加入荧光微球，重悬，上流式细胞仪检测，根据检测数据，得出最终检测结果。
优选的，荧光微球的直径为10 μm。
优选的，步骤2）孵育时间为2～5 min。
优选的，步骤3）孵育时间为20～30 min。
优选的，步骤1）细胞悬液的细胞数为(1～5)×106个。
本发明通过特殊的设门技术，及采用Syto16、7-ADD、APC-CD46三种荧光的特性进行荧光补偿，很好地解决了因为多种荧光相互之间干扰使流式细胞仪的检测不稳定、难重复的问题。
本发明通过流式细胞仪产生的向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC）对精子细胞进行设门，将精液中需要评估的精子细胞与杂质和其他细胞区分开来，再通过计数专用的荧光微球（与精子细胞大小相同，直径10μm）对标本的精子数量进行准确的测定。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
Syto16、7-AAD均购自Invitrogen公司；
APC标记鼠抗人CD46抗体购自Thermo公司；
荧光微球购自美国贝克曼库尔特生物有限公司，产品名为Flow-Count fluorospheres，荧光微球的已知浓度为1016个/μl ；
BSA-PBS缓冲液：BSA与PBS按1g：10ml的比例配比。
实施例1
基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：
1) 取新鲜液化的人类精液标本，用BSA-PBS缓冲液洗涤，在反应试管中调整精子细胞数为106个，重悬成200μL的细胞悬液；
2) 向上述反应试管中依次加入终浓度均为2 mM的核酸荧光染料Syto16、7-AAD， 37℃下孵育3min，用PBS缓冲液洗涤；
3) 向上述反应试管中加入终浓度为1 mM的APC标记鼠抗人CD46抗体，37℃下孵育30min，用PBS缓冲液洗涤；
4) 向上述反应试管中加入10 μL直径为10 μm的荧光微球，用PBS缓冲液重悬至200ul，在流式细胞仪上采用FSC/SSC设门，进行检测读数，计算最终的检测结果数据。
实施例2
基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：
1) 取新鲜液化的人类精液标本，用BSA-PBS缓冲液洗涤，在反应试管中调整精子细胞数为3×106个，重悬成200μL的细胞悬液；
2) 向上述反应试管中依次加入终浓度均为5 mM的核酸荧光染料Syto16、7-AAD， 37℃下孵育2min，用PBS缓冲液洗涤；
3) 向上述反应试管中加入终浓度为3 mM的APC标记鼠抗人CD46抗体，37℃下孵育30min，用PBS缓冲液洗涤；
4) 向上述反应试管中加入10 μL直径为10 μm的荧光微球，用PBS缓冲液重悬至200ul，在流式细胞仪上采用FSC/SSC设门，进行检测读数，计算最终的检测结果数据。
实施例3
基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：
1) 取新鲜液化的人类精液标本，用BSA-PBS缓冲液洗涤，在反应试管中调整精子细胞数为5×106个，重悬成200μL的细胞悬液；
2) 向上述反应试管中依次加入终浓度均为3 mM的核酸荧光染料Syto16、7-AAD， 37℃下孵育5min，用PBS缓冲液洗涤；
3) 向上述反应试管中加入终浓度为2mM的APC标记鼠抗人CD46抗体，37℃下孵育25min，用PBS缓冲液洗涤；
4)向上述反应试管中加入10 μL直径为10 μm的荧光微球，用PBS缓冲液重悬至200ul，在流式细胞仪上采用FSC/SSC设门，进行检测读数，计算最终的检测结果数据。
Claims (8)
1.基于流式细胞术的精子质量评估方法，包括如下步骤：首先以透膜的核酸荧光染料及不透膜的核酸荧光染料与待检标本共同染色，然后以荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育，进行流式细胞检测，得出最终检测结果，所述荧光标记单克隆抗体能与精子顶体膜反应，所述荧光标记单克隆抗体与透膜核酸荧光染料、不透膜的核酸荧光染料的激光激发光波长差距均为100～200nm，荧光散射波长差距均为75～150nm。
2.根据权利要求1所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：荧光标记单克隆抗体与染色后的待检标本孵育后，加入荧光微球，再进行流式细胞检测。
3.根据权利要求1所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：所述透膜核酸荧光染料为Syto16，不透膜的核酸荧光染料为7-AAD，荧光标记单克隆抗体为APC标记CD46单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)取液化的精液标本，洗涤，制成细胞悬液；
2)向细胞悬液中依次添加终浓度均为2～5 mM的Syto16、7-AAD，37℃下染色，洗涤；
3)加入终浓度为1～3 mM的APC标记CD46单克隆抗体，37℃下孵育，洗涤；
4)加入荧光微球，重悬，上流式细胞仪检测，根据检测数据，得出最终检测结果。
5.根据权利要求4所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于： 荧光微球的直径为10 μm。
6.根据权利要求4所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：步骤2）孵育时间为2～5 min。
7.根据权利要求4所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：步骤3）孵育时间为20～30 min。
8.根据权利要求4所述的基于流式细胞术的精子质量评估方法，其特征在于：步骤1）细胞悬液的细胞数为(1～5)×106个。
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