CN110426339A - 一种评估公猪精子质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种评估公猪精子质量的方法，具体步骤为：首先采集精液，然后将精液洗涤去除精浆，再离心得到精子，然后将精子稀释，最后分别对稀释的精子的外在指标和内在指标进行检测，所述内在指标的检测方法为FCM流式细胞术。所述方法分别对精子的外在指标和内在指标进行检测，解决了现有检测技术对检测猪精子质膜完整性、顶体膜完整性、线粒体活性、氧化力不足的问题，建立了一种全面评估猪精子质量的方法。
Description
技术领域
本公开涉及医疗检测技术领域，具体涉及一种评估公猪精子质量的方法。
背景技术
公猪精子质量是影响母猪受胎率的主要因素，精子质量的检测是评估精液受精能力的基本手段，对于公畜精液在稀释、保存等处理过程中品质变化的监控及高繁殖力公畜的选育具有重要意义。目前应用于公畜精子质量检测的手段主要是精液常规分析(routinesperm analysis，RSA)和计算机辅助精液分析(computer-assisted sperm analysis，CASA)系统。RSA分析不育症组和正常生育组的精液分析结果具有广泛重叠，分析效率低，且易受检测者技术熟练程度和主观因素影响；CASA系统分析局限在精子密度、活力、畸形率和直线运动等外在动态参数，无法对精细胞的内在特性进行分析，因而无法获取较为全面的精子质量评估结果。
发明内容
本公开的目的是提供一种评估公猪精子质量的方法，以提高精子质量检测的全面性。
为实现上述目的，技术方案如下：
一种评估公猪精子质量的方法，其具体步骤包括：首先采集精液，然后将精液洗涤去除精浆，再离心得到精子，然后将精子稀释，最后分别对稀释的精子的外在指标和内在指标进行检测，所述内在指标的检测方法为FCM(Flow cytometry)流式细胞术。
所述精液洗涤是利用磷酸缓冲液或BWW培养液洗涤，所述离心为4℃850rpm/min离心5min，所述精子的稀释浓度为0.2-0.5亿/ml，所述精子的稀释液为葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液。
所述方法中的精子外在指标的检测是利用CASA系统进行检测。
所述方法中的精子外在指标分别为密度检测、活力检测和畸形率检测。
所述方法中的精子检测内在指标分别为：
(1)精细胞质膜的完整性检测；
(2)精细胞中线粒体的活性检测；
(3)精细胞的氧化力检测；
(4)精细胞顶体的完整性检测；
(5)细菌的浓度检测。
所述精细胞质膜完整性检测的步骤为：使用EASYKIT 1viability andconcentration荧光剂对精子进行标记，然后通过流式细胞仪进行检测。
所述精细胞中线粒体活性检测的步骤为：首先使用EASYKIT 2Mitochondrialactivity荧光剂对精细胞中的中端线粒体部位进行染色，然后通过流式细胞仪进行检测。
所述精细胞氧化力检测的步骤为：首先用0.8-5mmol/L H2O2处理精细胞，然后使用EASYKIT 3Oxidation molecule D荧光剂对处理后的精细胞进行标记，最后通过流式细胞仪进行检测。
所述精细胞顶体完整性检测的步骤为：使用EASYKIT 5viability和acrosomeintegrity两种荧光剂对精细胞顶体膜进行标记，然后通过流式细胞仪进行检测。
所述细菌浓度的检测的步骤为：首先过滤细菌，然后使用EASYKIT 6Bacterialconcentration荧光剂进行标记，最后通过流式细胞仪进行检测。
本公开的有益效果是：提供了一种评估公猪精子质量的方法，所述方法分别对精子的外在指标和内在指标进行检测，解决了现有检测技术对检测猪精子质膜完整性、顶体膜完整性、线粒体活性、氧化力不足的问题，建立了一种全面评估猪精子质量的方法。
附图说明
图1为精细胞质膜完整性检测图。
图2为精细胞线粒体活性检测图。
图3为精细胞氧化力检测图。
图4为精细胞顶体完整性检测图。
图5为细菌浓度检测图。
图6为精子内在指标随储存时间变化趋势图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1精子内在指标的检测
首先采集精液，然后利用磷酸缓冲液对精液进行洗涤，然后4℃(低温可增加精子的存活率)，850rpm/min离心5min，去除精浆(去除精浆可提高精子的存活率)，得到精子，然后进行稀释，将原精稀释液(0.25亿/ml)摇匀后每个样品用10ml大EP管留样8ml左右，每大管样品再次摇匀后用2ml小EP管分装5管，每管分装1.5ml左右，再放入17℃保存，1-5天检测时同一样品每天只拿1小管出来进行检测。
稀释液为葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液(低温保存)，具体组分及配比为：
基础液：柠檬酸钠0.5g；葡萄糖5g；蒸馏水100mL；
稀释液：基础液97mL；卵黄3mL；青霉素1000IU/mL；链霉素1000微克/mL。
1.质膜完整性检测
使用EASYKIT 1viability and concentration(上海冠东生物科技有限公司提供)包含的两种细胞核荧光染色剂对精子进行标记：质膜完整的精子头部将染成绿色，视为活精；质膜损坏的精子头部将染成红色，视为死精；而同时被两种染剂着色的则被认为是死精或处于垂死状态，通过guava easyCyte HT流式细胞仪进行检测。其中1个样本的检测结果如图1所示：Viable区域的精子是质膜完整的活精，Dead区域的精子是质膜破损的死亡或垂死精子。
2.线粒体活性检测
使用EASYKIT 2Mitochondrial activity(上海冠东生物科技有限公司提供)包含的两种荧光将线粒体膜电位极化(线粒体活性高)的精子和线粒体膜电位去极化(线粒体活性低)的精子的中端线粒体部位染成橙色和绿色，通过guava easyCyte HT流式细胞仪进行检测。其中1个样本的检测结果如图2所示：Polarized区域精子为线粒体极化精子，Depolarized区域精子为线粒体去极化精子。
3.氧化力检测
使用EASYKIT 3Oxidation molecule D(上海冠东生物科技有限公司提供)包含的两种荧光同时对添加一定浓度H2O2处理精子的ROS水平和存活状态进行标记，高ROS水平的精子会被绿色荧光标记，质膜破损严重的死精头部则会被红色荧光标记，最终标记出4种颜色的精子，通过guava easyCyte HT流式细胞仪进行检测。检测结果如图3所示：ROS+活精(A区域)、ROS-活精(B区域)、ROS+死精(C区域)、ROS-死精(D区域)；其中ROS-活精为ROS低水平抗氧化精子，ROS+活精为氧化潜力精子，死精则为无效精子。
4.顶体完整性检测
使用EASYKIT 5viability和acrosome integrity(上海冠东生物科技有限公司提供)包含的两种荧光染剂同时对精子的顶体膜完整状态和存活状态进行标记，顶体膜破损的精子其顶体会染成绿色，质膜破损的死精头部则会染成红色，最终标记出4种精子，通过guava easyCyte HT流式细胞仪进行检测。其中1个样本的检测结果如图4所示：顶体完整的活精(A区域)、顶体不完整的活精(B区域)、顶体完整的死精(C区域)、顶体不完整的死精(D区域)；其中顶体完整的活精为高效精子，顶体不完整的活精则会因为顶体酶的泄露而难以完成顶体反应，死精则为无效精子。
5.细菌浓度的检测
通过13mm Disposable Filter过滤出细菌，使用EASYKIT 6Bacterialconcentration(上海冠东生物科技有限公司提供)包含的荧光染料将其标记成绿色以便于进行计数。通过guava easyCyte HT流式细胞仪进行检测。其中1个样本的检测结果如图5所示：M2区域为细菌，其他的为未过滤完全的精细胞及残骸。
6.精子内在指标随存储时间的变化趋势
质膜完整性随存储时间变化趋势如图6-A所示，质膜完整率随存储时间延长几乎呈直线下降的趋势。线粒体活性随存储时间变化趋势如图6-B所示，线粒体极化率在1-4天时趋向平稳，在4-5天时则开始急剧下降。氧化力随存储时间变化趋势如图6-C、图6-D所示：ROS+活精在1-4天随存储时间上升，在4-5天则急剧降低；ROS-活精的占比则随储存时间上下浮动。顶体完整性随存储时间变化趋势如图6-E所示，顶体完整活精在1-2天时变化平稳，2-5天则几乎呈直线下降。细菌浓度随存储时间变化趋势如图6-F所示，细菌浓度呈类S曲线变化，1-4天细菌浓度不断增加，4-5天则开始下降。
7.精子内在指标间的相关性分析结果
对精子样本1-5天的质膜完整率、线粒体极化率、ROS+活精、ROS-活精、顶体完整活精和细菌浓度进行双变量皮尔逊相关性分析，分析结果如表1所示，质膜完整率与线粒体极化率和顶体完整率均极显著(P＜0.01)正相关，与细菌浓度则呈负显著(P＜0.05)相关；线粒体极化率与ROS+活精呈显著(P<0.05)正相关，与顶体完整活精呈极显著(P＜0.01)正相关；ROS+活精与ROS-活精呈极显著(P＜0.05)负相关；顶体完整活精与细菌浓度呈显著(P＜0.05)相关。
表1精子各项内在指标间的相关性
Claims (10)
1.一种评估公猪精子质量的方法，其特征在于，具体步骤为：首先采集精液，然后将精液洗涤去除精浆，再离心得到精子，然后将精子稀释，最后分别对稀释的精子的外在指标和内在指标进行检测，所述内在指标的检测方法为FCM流式细胞术。
2.根据权利要求书1中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精液洗涤是利用磷酸缓冲液或BWW培养液洗涤，所述离心的温度为4℃，离心转速为850rpm/min，离心时间为5min，所述精子的稀释浓度为0.2-0.5亿/ml，所述精子的稀释液为葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液。
3.根据权利要求书1中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精子外在指标的检测是利用CASA系统进行检测。
4.根据权利要求书1中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精子外在指标分别为密度检测、活力检测和畸形率检测。
5.根据权利要求书1中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精子检测内在指标分别为：
(1)精细胞质膜的完整性检测；
(2)精细胞中线粒体活性检测；
(3)精细胞的氧化力检测；
(4)精细胞顶体的完整性检测；
(5)细菌的浓度检测。
6.根据权利要求书5所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精细胞质膜完整性检测的步骤为：使用EASYKIT 1 viability and concentration荧光染料对精子进行标记，然后通过流式细胞仪进行检测。
7.根据权利要求书5中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精细胞中线粒体活性检测的步骤为：首先使用EASYKIT 2 Mitochondrial activity荧光染料对精细胞中的中端线粒体部位进行染色，然后通过流式细胞仪进行检测。
8.根据权利要求书5中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精细胞氧化力检测的步骤为：首先用0.8-5mmol/L H2O2处理精细胞，然后使用EASYKIT 3 Oxidationmolecule D荧光染料对处理后的精细胞进行标记，最后通过流式细胞仪进行检测。
9.根据权利要求书5中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述精细胞顶体完整性检测的步骤为：使用EASYKIT 5 viability和acrosome integrity两种荧光染料对精细胞顶体膜进行标记，然后通过流式细胞仪进行检测。
10.根据权利要求书5中所述的评估公猪精子质量的方法，其特征在于，所述细菌浓度的检测的步骤为：首先过滤细菌，然后使用EASYKIT 6 Bacterial concentration荧光染料进行标记，最后通过流式细胞仪进行检测。
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