CN107290265A - 超宽光谱多通道激光流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超宽光谱多通道激光流式细胞仪，由多波段半导体激光器组、可调谐白光激光器、光学发射准直器、样品测试碗、气流发生器、光学接收系统、光栅分光器、光电探测器阵列、图像信息处理器和综合显示器组成。多波段半导体激光器组和可调谐白光激光器为激光发射源，光学发射准直器将488nm‑2200nm激光投射到样品测试碗内的样品上；光学接收系统收集由样品反射/散射/发射的激光与荧光信号，经光栅分光器和光电探测器阵列接收后送至图像信息处理器，经处理与计算后得到样品的激光散射强度、被激发标志物的荧光强度和样品粒子的几何参数，呈现在综合显示器上。本发明适用于生物医学检测与大气环保监测等领域。

Description

超宽光谱多通道激光流式细胞仪

技术领域

本发明属于光电测量技术领域。超宽光谱多通道激光流氏细胞仪同时兼有宽光谱激光粒度仪与多通道流式细胞的主要功能，适用于生物医学检测与大气环保微粒实时监测等领域。

背景技术

流式细胞仪是目前在基础医学、临床医学与生物医学工程研究中最常用的检测设备之一，主要用于对细胞物理参量和激光激发生物标志物荧光信息的检测，通过对细胞散射激光强度的检测，获得被检细胞的几何参数，通过对细胞在激光照射下被激发产生的荧光强度检测，获得所关注细胞的数量，及在细胞总量中的比例，为评估细胞病变状态提供定量分析依据。

目前广泛应用的流式细胞仪多由一个或数个不同波长的半导体、准分子或染料激光器等作为照射光源，激光照射波长的数目直接决定着流氏细胞仪的用途与成本。多采用鞘液流动系统包裹细胞，依次以单细胞形式通过激光照射光束，测试样品散射的激光信号及被激光激发的特征荧光信号进入接收通道后，由不同波长的滤光片和分光片逐一分离，分别被放置其后的光电倍增管接收，最终经处理后得到样品的几何参数与生物医学信息。这类流式细胞仪的照射激光波长是分立的对一个细胞只有一次照射机会；探测通道的光机结构复杂，调整精度要求高；滤光片逐级分光造成的信号损失大，需使用高灵敏光电倍增管，价格昂贵。总之，一个通道就要对应一整套接收部件，进一步扩展检测通道数的难度很大。

通过对现有流式细胞仪技术体制及对今后增加通道、提高速度和适应大尺度粒子检测迫切需求的调研，看到现有技术赶不上应用需求的迅速发展，该领域目前面临着诸多技术挑战。例如

从相对细胞计数到绝对细胞计数测试与分析。以前的方法是对混合细胞群中的亚细胞进行计数，然后以相对百分比统计数据表示。但由于百分比只能代表每种细胞在混合细胞群中所占比例，而不能体现在单位体积血液中的绝对数量(如艾滋病要求)，因此需要寻找更有效的绝对测量方法。如T淋巴细胞亚群的绝对计数技术近期已在国外实验室成为常规检查项目；干细胞技术发展也提出了对造血干细胞进行绝对数量分析的要求，因此绝对细胞计数将成为一种重要的常规检查项目在临床上广泛采用。

从定性分析到定量分析。在医学分析中，通过对单细胞的抗原或受体的定量分析，可为细胞生物学、分子生物学和免疫学研究提供一种更为精确的手段。目前在对白血病、强直性脊柱炎和艾滋病等的检测中，希望能够通过对特定细胞的XX分子表达量和参考检测分子量之间的定量比较，获得可评判与诊断的结果。为此提出对绝对定量分析的需求，可采用的方法如定量抗体微球法和定量荧光素分子微球法，即在特制微球上包覆已知分子数的抗体或荧光素；将包覆有不同分子数的抗体或荧光素的微球混合在一起；将上述微球与待测样品(包覆荧光素)在同一条件下测荧光强度；最后通过一套算法求出每个细胞上平均抗原分子数或平均荧光素，故此提出由单一粒子扩展到复杂粒子团的测试要求。

从单色荧光到多色荧光、从细胞膜到细胞内成份、从小细胞到大分子表型的分析。在对淋巴细胞亚群和白血病免疫表型的分析中，目前已经提出了3-6色，甚至等多荧光检测通道的需求，因为提高荧光通道的数目，有助于提高对细胞亚群的识别、分选与评估能力；若从现有流式细胞仪对细胞膜免疫表型特征研究到对细胞浆或细胞内成分进行分析，如通过对急性髓系白血病性原始细胞浆内的髓过氧化物酶的检测，获得系列标志信息与功能变化特征；检测分子细胞中的特异性核酸系列和特异性细胞异常，用于艾滋病病程检测、治疗反应与预后判断等。由此可见，加快扩展检测波段范围和检测通道的数目，已成为对多样化样品实施精细分析的必然所趋。

对液体中的可溶性成分分析。在传统的流式细胞仪测试方法中，通常只是针对细胞及其成分进行分析，而无法对液体中的可溶性成分进行分析。但实际上，如果将液体中的可溶性成分也结合成为一种类似于细胞大小的乳胶颗粒，也可对其实施分析，称之为流式微球分析技术。如目前对同时测定血清或细胞培养液中的多种细胞因子就提出了这类需求，该方法与其他细胞因子检测方法(靶细胞功能分析法等)相比，灵敏度高达2pg/ml，且能同时测定单个样品中的多种细胞因子。如将包覆有某种抗原成份的微球与待测液体样品中的相应成份发生反应，由此形成一种抗原复合物；然后再加入荧光素标记的第二抗体，如果微球上结合的待测抗原与荧光强度成线性关系，就可对液体中与微球包覆抗原进行定性或定量分析。由此可见，需要发展适用于多成分微粒混合物的测试新方法。

综上所述，随着近年来细胞类型和品种的迅速扩展，要求检测的通道数从几通道发展到十通道，甚至百通道；检测速度从万个/秒提高到数万个/秒。但若想进一步增加现有流式细胞仪的通道数，不仅取决于激光器的数量，更是取决于接收的通道数。实际上，即使不计成本和系统规模，也难于从根本上实现宽波段覆盖和甚多通道的应用需求。

激光粒度仪是一种可用于材料制备、气体监测和环境保护等领域的基本测试设备，也是利用激光照射被测微粒，通过检测微粒对照射激光的前向、后向或侧向散射的激光强度，经统计计算得到微粒的尺寸、浓度及在被测样品中所占的百分比。它也面临着急需扩展激光波长和工作波段范围，适应对大粒子和大、小粒子混合物精确测量的需求。

本发明就是针对上述流氏细胞仪的新应用需求，以及激光粒度仪的波段扩展难题而提出的一种新技术方案。

发明内容

本发明目的是发展一种适用于微粒或细胞的超宽光谱多通道流氏细胞仪技术。其发明思路主要出于以下几点：

1、现有流式细胞仪为实现对单细胞的逐一测量，设置了单细胞依次通过激光照射通道的光学系统与鞘液流动系统，以及相应的多通道光机探测接收通道。但经对处理数据的结果与显示方式可见，流氏细胞仪为判断细胞的病变程度，最终给出的并不是单一细胞的参数，而是不同类型/波长细胞数的总和、所占细胞总数的百分比，及细胞的几何尺寸等参数，即给出的是一组统计的数据结果。由此想到，若采用激光粒度仪对粒子团的测量与统计方法，并将不同光谱波段的粒子分开，同样也应可获得不同波段和尺寸微粒的几何参数。

2、现有流氏细胞仪为定量检测细胞标记物产生的多波段荧光信号，采取的方法是从接收通道上将多光谱的荧光信号一一分开，构成各自独立的检测通道，其方法虽然可提高检测精度，降低串扰，但由此也导致随着荧光波段数的增加，探测通道数目也随之增加，很难适应今后对上百路检测的需求。由此想到，若能将激光散射信号和所激发的荧光信号按照光谱从空间角度上精确分离开来，并利用一套阵列探测器同时接收，就有可能实现检测通道数的方便扩展。

3、现有流氏细胞仪采用的是一种单一细胞的鞘液流动系统，不仅单位时间内测量的细胞数目受限，测试精度取决于激光对每个微粒的一次性照射机会，而且流过测试通道的细胞也不能二次利用。由此设想，若将快速、一次性流动的细胞测试方法改为由样品测试碗承载样品，提供被激光多次、并以不同角度被照射的机会，一则可有效提高测试的粒子数和测试速度；二则可以多角度测量微粒的不同截面，提高对不规则形状微粒的检测精度。

发明内容

本发明涉及一种超宽光谱多通道激光流氏细胞仪，由多波段半导体激光器组、可调谐白光激光器、光学发射准直器、样品测试碗、气流发生器、光学接收系统、光栅分光器、光电探测器阵列、图像信息处理器和综合显示器组成。激光细胞仪根据被测样品的类型与尺寸不同，可选用多波段半导体激光器组中的一支或多支波长激光，或选用可调谐白光激光器全光谱或调谐其中一支波长作为激光源；经光学发射准直器出射后被引导进入样品测试碗，照射到被检样品表面上；气流发生器发出的气流进入样品测试碗，令碗内被测样品运动起来，分布变得均匀，并可在运动中以不同的截面对向照射光束；光学接收系统收集被测样品的反射和散射激光，及样品被照射激光而激发的荧光信号；然后将激光与荧光的混合宽谱光束投射到光栅分光器上，不同波长的光束按不同的空间角度被分离开来；被放置在其后的光电探测器阵列所接收，探测器阵列上的每个探测器同时接收不同波长的光信号，然后将其光电转换后送至图像信息处理器；经处理后得到被样品的激光散射信号强度、样品的几何尺寸与浓度等物理参数；同时经处理后得到被测样品在激光照射下激发产生的荧光信号强度，及所占百分比等生物医学信息。

多波段半导体激光器组的工作波段为488nm-640nm，主要包括488、514、525、640nm等；可调谐白光激光器的工作波段为600-2200nm，可宽光谱同时输出，也可根据检测对象要求选择至少一个波长激光输出；两台激光器同时工作时，输出488nm-2200nm的可见光-短波红外宽光谱激光。

光学发射系统包括两套光学透镜组、光纤耦合器和传导光纤，分别实现对多波段半导体激光器组和白光激光器输出光束的整形、光纤耦合与光束传输，将激光束送入到样品测试碗。

样品测试碗的形状、尺寸、材质和开口结构可有多种选择方式。样品测试碗的形状有矩形、圆形或椭圆形；样品测试碗的尺寸可大、可小，根据被测样品多少选择；样品测试碗的材质可为玻璃、金属或其他材料。样品测试碗的开口处为一个三通道输入窗口，中间一路为照射激光传导光纤的插入口，传导光纤距测试样品的距离上下可手动调节；旁侧一路为气流发生器的气流输入口，通过调控射入气流的强度与流速，可使样品测试碗内的被测样品运动起来，使之在碗内分布均匀，并可以不同角度朝向照射激光，提高激光对不同形状或尺寸样品的测试精度；旁侧另一路为光学接收系统的接收通道，通过改变光学接收系统的视场或调节与被测样品之间的距离，可改变所接收到的散射激光或荧光信号的范围和强度。

光栅分光器可由2块以上不同波段或不同光谱分辨率的子光栅模块组成。两个以上子光栅模块并行使用时，可实现不同波段的相互衔接，拼接为宽波段光栅；两个以上子光栅模块串行使用时，前后子光栅模块具有梯次增加的光谱分辨率，有助于大幅提高光栅分光器的光谱分辨率。

光电探测器阵列的工作波段可根据所发射的激光与被激发的荧光波段加以选择；类型如硅光电二极管阵列、雪崩光电二极管阵列或CCD探测器阵列；光电探测器阵列上的每个探测器单元都有独立的光电转换信号输出抽头，将各探测单元获得的光信号一并同时送出，由此实现多光谱通道信息的同时检测。

本发明超宽光谱多通道激光流氏细胞仪的优点是：

1、本发明由两台激光器组合构成一套具有可见光-短波红外波段的宽谱激光发射源，较现有流氏细胞仪和激光粒度仪的发射激光波长数量多、覆盖的激光谱段宽，并可调谐选择特定激光波长输出；

2、采用光栅分光器与光电阵列探测器的联合工作方式，构成一套宽光谱覆盖、光谱分辨率高，及多通道并行实时处理的接收系统方案，再与宽波段激光发射源相结合，实现通道数极具扩展潜力的一种微粒检测新方法。

附图说明

图1超宽光谱多通道激光流氏细胞仪组成框图

图2光栅分光器与光电探测器阵列联合工作结构示意。图中分光器a和分光器b并行组合，可覆盖宽光谱波段；分光器a、分光器c和分光器d串行组合，可逐级提高光谱分辨率。

具体实施方式

超宽光谱多通道激光流氏细胞仪由多波段半导体激光器组1、可调谐白光激光器2、光学发射准直器3、样品测试碗4、气流发生器5、光学接收系统6、光栅分光器7、光电探测器阵列8、图像信息处理器9和综合显示器10组成(附图1)。

激光细胞仪根据被测样品的类型与尺寸不同，可选用多波段半导体激光器组1中的一支或多支波长激光，或选用可调谐白光激光器2全光谱或调谐其中一支波长作为激光源。其中，多波段半导体激光器组1的工作波段为488nm-640nm，主要包括488、514、525、640nm等；白光激光器2的工作波段为600-2200nm，可宽光谱同时输出，也可根据检测对象要求选择至少一个波长激光输出；两台激光器同时工作时，输出488nm-2200nm的可见光-短波红外宽光谱激光。一方面可覆盖流氏细胞仪现有、再研和今后希望扩展的宽波段光谱；另一方面可用于对纳米、微米，甚至更大尺寸粒子的几何参数测量，适应生物医学、环境监测与其他多种测量需求。

光学发射准直器3由两套光学透镜组、光纤耦合器和传导光纤组成，分别对应多波段半导体激光器组1和可调谐白光激光器2，对其输出光束实施整形、与传输光纤的耦合，及激光束的光纤传输，将两台激光器的照射光束引入样品测试碗4，照射到被检样品表面上。

气流发生器5为一小型气泵，利用所产生的气流搅动样品测试碗4内的被测微粒，使其分布更加均匀，并使被测微粒可以多种不同截面朝向照射光束，一方面有助于提高对测试样品激光散射信号的接收概率，另一方面可提高对不规则微粒形状的测量精度。

样品测试碗4为承载被测样品的容器，其形状、尺寸、材质和开口结构可有多种选择方式。其形状可为矩形、圆形或椭圆形；其尺寸可大、可小，根据被测样品的多少进行选择；其材质可选用玻璃、金属或其他材料，便于重复使用与消毒。在样品测试碗4的顶部设置一个输入/输出窗口，窗口处可分为三个通道，中间一路为照射激光传导光纤的插入口，传导光纤插入到样品测试碗4内，输出光纤距离测试样品的距离可手动上下调节；旁侧一路为气流发生器5的气流输入口，可通过调控射入气流的强度与流速，使样品测试碗4内的被测样品运动起来，使之在碗内分布比较均匀，并可以不同的角度朝向照射激光，提高激光对不同形状或尺寸样品的测试精度；旁侧另一路为光学接收系统的接收通道，通过改变光学接收系统 6的接收视场，或调节接收光学窗口与被测样品之间的距离，可改变接收散射激光或荧光信号的范围或强度。

光学接收系统6为一大口径光学会聚透镜组，其接收物镜被放置在样品测试碗4的窗口内或其附近，尽可能收集被测样品的反射和散射激光，及样品被照射激光而激发的荧光信号；然后将激光与荧光的混合宽谱光束准直平行投射出去，照射在放置其后的光栅分光器7上。

光栅分光器7由一个或多个子光栅模块组成，通过一次或多次分光，将所需检测的激光和荧光按不同的空间角度分离开来。若两个以上子光栅模块a、b各自具有不同的光谱覆盖范围，两块并行使用时，拼接为一个宽波段光栅，可实现不同分光波段的相互衔接；若两个以上光谱分辨率递增的同波段子光栅a、c、d几个模块串行使用，则可利用前后子光栅模块各自具备的光谱分辨率，分级提高光栅分光器7的总体光谱分辨率(附图2)。为降低光栅分光器7的整体尺寸与厚度，也可利用先进光刻技术，在一块基片上分层刻划初具有不同光谱分辨率的层状光栅结构。

光电探测器阵列8放置在光栅分光器7后的适当位置，令探测器阵列上每个探测器单元分别接收不同波长的光信号。该阵列的工作波段可根据所发射的激光与被激发的荧光波段加以综合选择；其阵列类型有如硅光电二极管阵列、范围和雪崩光电二极管阵列或CCD探测器阵列；在光电探测器阵列8上的每个探测器单元后都设有独立的光电转换信号输出抽头，以便将各探测单元输出的电信号分别同时送出，实现对多光谱多通道信息的同时检测。

光电转换信号被送至图像信息处理器9；经处理后得到被样品的激光散射信号强度，进而计算得出样品的几何尺寸与浓度等物理参数；经处理后也可得到被测样品在激光照射下激发产生的荧光信号强度，及所占百分比等生物医学信息，在综合显示器10上以散点图、质方图或其他方式显示出来。

Claims (6)

1.本发明涉及一种超宽光谱多通道激光流氏细胞仪，由多波段半导体激光器组、可调谐白光激光器、光学发射准直器、样品测试碗、气流发生器、光学接收系统、光栅分光器、光电探测器阵列、图像信息处理器和综合显示器组成。多波段半导体激光器组和可调谐白光激光器可独立使用或联合使用，共同用作激光细胞仪的照射光源；每次测试可根据受试样品的需求从中选择一类激光器，输出其中的一支或多支波长，或者两台激光器同时发射，覆盖波长范围488nm-2200nm；两台激光器的输出光束经光学发射准直器后，通过各自对应的传导光纤同时或分时照射到样品测试碗内的测试样品上；气流发生器发出的气流进入样品测试碗，令碗内被测样品运动起来，分布变得均匀，并可在运动中以不同的截面对向照射光束；光学接收系统收集被测样品的反射和散射激光，及样品被照射激光而激发产生的荧光信号；并将其准直为平行光投射到光栅分光器上，不同波长的光束按不同的空间角度被分离开来；被放置在其后的光电探测器阵列所接收，探测器阵列上的每个探测器单元同时接收不同波长的光信号，然后将其光电转换后送至图像信息处理器；经图像信息处理器处理和计算后得到：每类样品对特定波长照射激光的后向散射强度、被激发的不同波长的荧光强度、被测样品的几何参数、不同波长的粒子数，及不同尺寸粒子数占样品总量的百分比等，覆盖了现有激光粒度仪和流氏细胞仪所能获得的主要信息；上述信息在综合显示器上以散点图、质方图或其他方式显示出来。

2.权利要求1中，多波段半导体激光器组的工作波段为488nm-640nm，主要包括488、514、525、640nm等；可调谐白光激光器的工作波段为600-2200nm，可宽光谱同时输出，也可根据被测的对象要求选择至少一个波长激光输出；两台激光器同时工作时，覆盖488nm-2200nm的可见光-短波红外激光。

3.权利要求1中，光学发射系统由两套光学透镜组、光纤耦合器和传导光纤组成，分别对应多波段半导体激光器组和可调谐白光激光器，分别实现对两类激光器输出光束的整形、光纤耦合与光束传输，将照射激光传输导入到样品测试碗。

4.权利要求1中，样品测试碗的形状、尺寸、材质和窗口结构有几种选择方式。如样品测试碗的形状有矩形、圆形或椭圆形；样品测试碗的尺寸可大、可小，根据被测样品多少选择；样品测试碗的材质可为玻璃、金属或其他材料；样品测试碗的窗口处为一个三路输入口，中间一路为照射激光传导光纤的插入口，传导光纤距测试样品的距离可手动上下调节；旁侧一路为气流发生器的气流输入口，通过调控射入气流的强度与流速，可改变样品测试碗内被测样品的运动状态，使之在碗内分布均匀，并可以不同角度朝向照射激光，有助于提高激光对不同形状或尺寸样品的检测精度；旁侧另一路为光学接收系统的接收窗口，通过改变光学接收系统的视场或调节与被测样品之间的距离，改变对样品散射激光和荧光信号的接收范围与强度。

5.权利要求1中，光栅分光器包括2块以上不同波段或不同光谱分辨率的子光栅模块。将两个以上子光栅模块并行排列，相互衔接拼成一个宽波段光栅；将两个以上子光栅模块串行排列，前后相邻子光栅模块具有梯次增加的光谱分辨率，可提高光栅分光器的总体光谱分辨率。

6.权利要求1中，光电探测器阵列为收集信号的光电接收器，其工作波段可根据所发射的激光波段和被激发的荧光波段进行选择；类型有如硅光电二极管阵列、雪崩光电二极管阵列或CCD探测器阵列等；光电探测器阵列上的每个探测单元都有独立的光电转换信号输出抽头，将所有探测单元获得的光电转换信号一并送出，实现对多光谱多通道信息的同时接收与处理。